JPH07163351A - リンホカインの生産および精製 - Google Patents

リンホカインの生産および精製

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Abstract

(57)【要約】 【目的】 霊長類動物の増血系前駆細胞の発育と分化を
刺激する作用を有する蛋白質を生産すること。 【構成】 ＣＳＦ-Thr、ＣＳＦ-IleまたはＣＳＦ-Ｇの
アミノ酸配列を有する霊長類ＧＭ−ＣＳＦ蛋白質をコー
ドする遺伝子またはそのアレルもしくは他の官能的に均
等な変異体を含む組換ベクター。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
【０００２】この発明は、霊長類動物の増血系前駆細胞
の発育と分化を刺激する作用を有する蛋白質の生産に関
するものであり、より詳細にはコロニー形成刺激因子
(ＣＳＦ)の生産に関するものである。この発明の１つの
目的は、ＣＳＦ蛋白質発現遺伝子を含んだベクターを生
産し、このベクターを微生物および細胞系に導入し、Ｃ
ＳＦ蛋白質を生産する組換え体ＤＮＡ技術によってＣＳ
Ｆ蛋白質を生産する方法を提供することにある。更に、
この発明の第２の目的は、天然または組換え体の何れを
問わず、供給源からＣＳＦ蛋白質を単離・精製する方法
を提供し、それによって、従来報告されたものより優れ
た純度の活性水準とを保有する精製ＣＳＦ蛋白質を提供
することにある。
【０００３】
【発明の背景技術】血液中に見い出される多数の細胞系
は、何れも多分化能性造血幹細胞に由来する。幹細胞は
２つの機能を有し、(１)幹細胞自身を再生し、それによ
って生体内の幹細胞数を維持し、(２)任意の成熟血球系
へと分化方向の定められた子孫細胞を提供する。特定の
造血径路に沿って分化方向が定められた細胞を前駆細胞
と呼ぶ。Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、顆粒球、赤血球、血
小板、および好酸球の前駆細胞、および種々の成熟血球
系に独立して発生することがある更に初期の前駆細胞に
ついて、イン・ビボ(生体内)およびイン・ビトロ(試験
管内)の双方で実験的に研究が行なわれた[デキスター
(１９８３年)、ジャーナル・オブ・パソロジー、１４１
巻、４１５〜４３３頁]。イン・ビトロで、各前駆細胞
系の増殖および／または分化は、様々な供給源に由来す
るそれぞれ特異的な「因子」に依存していることが判明し
た。例えば、赤血球の後期前駆細胞はエリスロポイエチ
ンと呼ばれる因子を必要とする。成熟好中性顆粒球、単
球および成熟マクロファージを生成する分化方向に定め
られた骨髄前駆細胞の生存、増殖および分化に必要な因
子は、コロニー形成刺激因子群(ＣＳＦ群)と呼ばれる。
【０００４】ＣＳＦ活性はマウスで詳細に研究されてい
る。大部分の成熟マウス組織はＣＳＦ活性を産生する。
しかし、種々の組織から様々な方法で入手したＣＳＦ活
性を含有する組成物は、その生化学的特性を異にしてい
るようである。即ち、異なった因子間の構造的関連性
は、なお未知のままである。また、ＣＳＦ活性は顆粒球
およびマクロファージ発生における１つ以上の段階で作
用するようでもあり、一方、観察される活性がすべて単
一の因子によって生じるのか、あるいは各段階毎に異な
った因子が作用するのかも明確ではない[バージエスお
よびメトカルフ(１９８０年)、ブラッド、５６巻、９４
７〜９５７頁]。
【０００５】ヒトＣＳＦ活性体は、胎盤、ある種の胎児
組織、マクロファージ、刺激されたＴ細胞から得られて
いる。１またはそれ以上の強力なＣＳＦ活性体を産生す
るＴ細胞系(Ｍo)が、Ｔ細胞変異型毛状細胞白血球(白血
病性網内増殖症)の１患者から証明された[ゴールドら
(１９７８年)、ブラッド、５２巻、１０６８〜１０７２
頁]。
【０００６】ＣＳＦ活性の顆粒球およびマクロファージ
産生に対する刺激能から、これらの(骨髄性)血球系の産
生増加を必要とする状態に対して、ＣＳＦ活性を有する
医薬組成物が臨床上有用であるということが判明した。
事実、明らかに正規循環内の顆粒球値が極めて高い数人
の患者で、これらがＣＳＦ産生過剰を伴う腫瘍を有して
いることが示された。腫瘍を外科的に除去することによ
って、１例で顆粒球が急速に下降し正常値へ近付いたこ
とは、循環顆粒球数の調節にＣＳＦが有用であろうとい
うことを強く示唆している[ホッキング、グッドマン、
ゴールド、ブラッド、６１巻、６００頁(１９８３
年)]。殊に、ＣＳＦ組成物は、癌の化学療法または放射
線処置によって生じた骨髄抑制の処置に対し臨床上有用
である。また、ＣＳＦは顆粒球数および／または単球数
を増加および／または賦活化するので、ＣＳＦ組成物は
重篤な感染症の処置に有用である。
【０００７】様々な異なった形のＣＳＦ活性体が知られ
ており、顆粒球・ＣＳＦ(Ｇ．ＣＳＦ)、マクロファージ
・ＣＳＦ(Ｍ．ＣＳＦ)、顆粒球・マクロファージ・ＣＳ
Ｆ(ＧＭ．ＣＳＦ)および多重型ＣＳＦがこれに含まれ
る。この発明は特にＧＭ−ＣＳＦに関する。この発明は
特に霊長類動物のＣＳＦに関するものであり、より詳細
には、ヒトＣＳＦおよびサルＣＳＦに関するものであ
る。ＣＳＦ活性を有する組成物の生物学的・生化学的な
特性決定および臨床段階におけるこれらの組成物の検討
は、今日間で、ヒトおよび／またはその他の霊長類動物
のＣＳＦ組成物が希少で、また純粋でないことによって
妨げられてきた。ＣＳＦ活性に係る蛋白質または蛋白質
群を同定することが如何に望ましいことであったかとい
うことは、よく理解できる。更に、生物学的・生化学的
な特性決定を行ない、治療剤として使用するのに十分な
量および純度をもってＣＳＦ蛋白質を容易に供給し得る
霊長類動物のＣＳＦ供給源、好ましくはヒトＣＳＦ供給
源を得ることが望ましい。
【０００８】最近開発された分子クローニングの技術に
より、蛋白質を暗号化しているヌクレオチド配列をクロ
ーニングし、好適な宿主−ベクター系を用いてその蛋白
質を大量に生産することができる(マニアティス、モレ
キュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュア
ル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、
コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９
８２年)。次いで、既知の分離・精製技術によって蛋白
質を分離することができる。今日まで用いられているク
ローニングの方法は、(１)蛋白質構造に関する知識、例
えばアミノ酸配列に基づいて行なう方法、(２)その蛋白
質に特異的な抗体を用いてクローン化した遺伝子によっ
て発現された蛋白質の同定に基づいて行なう方法、およ
び(３)翻訳すると、興味ある遺伝子によって暗号化され
た蛋白質または活性体を生成することができるＲＮＡ種
の同定に基づいて行なう方法の３つの一般的な範疇に分
けることができる。
【０００９】これらの分野に属する各方法は、ＣＳＦ遺
伝子のように、対象とする遺伝子が極めて少量しか入手
できない場合、適用が困難である。即ち、十分量の精製
蛋白質の入手が困難であると、アミノ酸配列ばかりでな
く、蛋白質の部分配列でさえ決定が困難である。同様
に、発現蛋白質の抗体結合による同定は、単一特異性多
クローン性高力価抗血清を使用して実施されることが多
い。そのような抗血清は、純粋な蛋白質(抗体)が十分量
存在しないと得ることができない。別の解決法が単クロ
ーン性抗体によって提供されるが、これに必要な抗体も
また、好適な抗体が存在しない場合は入手困難であり、
それに、そのような単クローン性抗体は、入手可能な組
換え体宿主−ベクター系によって蛋白質が発現される形
態では、その蛋白質と反応することができない。結局、
ＲＮＡ種の翻訳が同定可能な蛋白質または活性体を生成
するためには、ＲＮＡ供給源中に、当のＲＮＡが、確実
な蛋白質または活性体シグナルを十分与え得るだけ豊富
に存在していることが必要である。特定の蛋白質を暗号
化しているＲＮＡの相対的な豊富さは、その蛋白質の豊
富さと平行しており、従って希少な蛋白質は、通例、希
少なmＲＮＡによって暗号化される。
【００１０】Ｍo細胞系はヒトＣＳＦ類の精製と、対応
するメッセンジャーＲＮＡ類の同定との双方のための出
発物質として使用されてきた。しかし、この比較的良好
なＣＳＦ活性供給源でさえ、構造研究に必要な蛋白質を
十分に単離することは極めて困難であることが証明され
た。
【００１１】ＣＳＦのように希少な蛋白質を暗号化して
いるヌクレオチドを、前記の方法でクローニングするの
に付随する固有な問題を克服するため、新規な方法を開
発した。この方法では、遺伝子生産物またはその活性を
確実に測定できることだけが必要である。ＣＳＦ測定の
好適な方法は、本明細書の実施例２に記載する。第２の
態様では、組換え体または天然の何れを問わず、供給源
からＣＳＦ蛋白質を、従来可能であったよりもはるかに
高い純度と活性水準で単離・精製できる精製方法を開発
した。
【００１２】
【本発明に係る組換え体ＤＮＡ法の要約】この発明の第
１の態様は、先行技術の問題を克服し、組換え体ＤＮＡ
技術を使用してＣＳＦ活性を有する使用可能な蛋白質を
提供することである。この発明において、ＣＳＦ活性の
検定だけが必要である新規クローニング技術を、ＣＳＦ
活性を有する蛋白質を暗号化しているcＤＮＡをクロー
ニングするのに利用する。このようにして、この発明は
ＣＳＦ活性を有する蛋白質を暗号化しているcＤＮＡ(即
ち、ＣＳＦ／cＤＮＡ)、ＣＳＦ／cＤＮＡのような組換
え体ベクターを導入する微生物または細胞系、および微
生物または細胞系を培養することによってこのＣＳＦ／
cＤＮＡを発現することにより、ＣＳＦ蛋白質を生産す
る方法を提供する。この発明では、クローンからＣＳＦ
蛋白質を生産するのであるから、これがＣＳＦ活性を有
する蛋白質であることは間違いない。この発明は、更に
ＣＳＦ／cＤＮＡを含有している形質転換ベクターを調
製・単離する方法を含んでいる。この方法は、ＣＳＦを
生産する細胞からＲＮＡを作成し、このＲＮＡからポリ
アデニル化メッセンジャーＲＮＡを作成し、このメッセ
ンジャーＲＮＡから１本鎖cＤＮＡを作成し、この１本
鎖cＤＮＡを２本鎖cＤＮＡへ変換し、この２本鎖cＤＮ
Ａを形質転換ベクターに挿入し、このベクターで細菌を
形質転換してコロニーを形成し、それぞれ２００〜５０
０コロニーのプールを拾い、各プールからプラスミドＤ
ＮＡを単離し、このプラスミドＤＮＡを、ＣＳＦ蛋白質
の発現に好適な宿主細胞にトラスフェクション(導入)
し、トラスフェクションした細胞を培養し、その上清の
ＣＳＦ活性を検定し、ＣＳＦ陽性プールを選出して、プ
ール作成に使用したコロニーをスクリーニングし、ＣＳ
Ｆ活性を有するコロニーを同定することから成る。
【００１３】この発明におけるＣＳＦ蛋白質は、骨髄系
細胞に対する発育および分化ホルモンである。これら
は、例えば骨髄抑制の臨床的処置に適用され、特に、癌
の化学療法または放射線処置に伴う(症候的な)顆粒球減
少症の臨床的処置に適用される。
【００１４】この発明において、ＣＳＦ蛋白質を暗号化
したＤＮＡ配列を第１図に示す。このＤＮＡ配列は、Ｃ
ＳＦ−Ｔhrと呼ばれるヒトＣＳＦの１変異体の暗号を完
全に示している。もう１つの対立遺伝子は１００番目の
位置のＴhrをＩleに置換えた以外は同一な生産物(ＣＳ
Ｆ−Ｉle)を暗号化している。上記のヒト配列に対する
変化は、ギボンＣＳＦ(ギボンザルのＣＳＦ)(ＣＳＦ−
Ｇ)を暗号化したＤＮＡ配列における差異を示す。ま
た、これから推論されるアミノ酸配列を示す。
【００１５】第２図はプラスミドpＡdＤ２６ＳＶpＡ
(３)からプラスミドpＴＰＬを作成する概略の説明、第
３図は、第２図からの概説の続きで、プラスミドpＴＰ
Ｌからプラスミドp９１０２３を作成する説明、第４図
は、第３図からの概説の続きで、プラスミドp９１０２
３(Ｂ)の説明である。第６図はベクターpＴＡＬＣ−１
８５Ｒの模式表示、第７図はベクターＡＪ−１４の模式
表示である。
【００１６】
【操作の詳細な説明】事例の理解を容易にするために下
記の定義を設ける。下記の定義は、当該技術分野で流通
している意味から定義の異なる範囲まで支配する。増幅
とは、細胞が、その染色体ＤＮＡ内で遺伝子を反復生産
するプロセスをいう。ＣＳＦとは、本明細書に記載の検
定により規定される生物学的活性である。ＣＳＦ蛋白質
は、ＣＳＦ活性を有する霊長類動物供給源から得られる
蛋白質である。この発明の目的のため、ＣＳＦ蛋白質の
語は、ＭＥＴ残基によって先行されるＣＳＦ蛋白質、Ｃ
ＳＦ蛋白質の対立遺伝性変異体および修飾ＣＳＦ蛋白質
を含んでいる。
【００１７】下流とは、ヌクレオチド配列の３'末端の
方へ向かう方向をいう。エンハンサーとは、遺伝子に対
するエンハンサーの位置または配列の配向に関係なく、
遺伝子の転写を促進することができるヌクレオチド配列
をいう。
【００１８】遺伝子は、与えられた蛋白質を暗号化して
いるデオキシリボヌクレオチド配列である。この発明の
目的から、遺伝子にはＲＮＡ転写開始シグナル、ポリア
デニル酸付加部位、プロモーター、またはエンハンサー
のように翻訳されないフランキング領域を含まないこと
とする。
【００１９】連結(ライゲーション)は、２個のＤＮＡ鎖
の５'終末と３'終末との間のホスホジエステル結合を形
成するプロセスである。これは、Ｔ４リガーゼによる平
滑末端の連結を含む幾つかの公知の酵素技術によって達
成することができる。
【００２０】配向とは、ＤＮＡ配列におけるヌクレオチ
ド類の順序をいう。逆方向のＤＮＡ配列とは、その配列
が得られたＤＮＡを対照点として比較したとき、他の１
配列との関係で５'から３'への順序が逆になっている配
列をいう。そのような対照点としては、供給源ＤＮＡ中
の他の特定のＤＮＡ配列の転写方向またはその配列を含
んでいる複製可能なベクター複製起源のそれを含むこと
ができる。
【００２１】転写とは、ＤＮＡ鋳型からＲＮＡを合成す
ることである。形質転換とは、外来性ＤＮＡを細胞にと
り込むことによって細胞の遺伝子型を変えることであ
る。ある場合には、形質転換は細胞表現型の変化によっ
て検出できる。形質転換以前の細胞を親細胞という。
【００２２】翻訳とは、メッセンジャーＲＮＡからポリ
ペプチドを合成することである。コロニー形成刺激因子
活性(ＣＳＦ)は末梢血単核球から得た調整培地、肺およ
び胎盤組織、および骨髄、貧血患者の尿、血清、Ｔリン
パ球および単核食細胞系列の正常および新生物細胞を含
む多数の細胞供給源から誘導することができる。ＣＳＦ
を生産する１細胞系は、ＡＴＣＣに寄託され、ＣＲＬ８
０６６のコード番号で利用することができるＭo細胞系
である。この細胞系によって生産されたＣＳＦは顆粒球
−マクロファージＣＳＦ(ＧＭ−ＣＳＦ)として知られて
おり、これは言うまでもなくヒトＣＳＦである。ギボン
ＣＳＦの１供給源はＵＣＤ・ＭＬＡ−１４４と名付けら
れたＴ細胞系であって、１９８３年９月２９日にＡＴＣ
Ｃに寄託され、ＨＢ９３７０のコード番号で利用するこ
とができる。
【００２３】この発明において、ＣＳＦクローンを単離
するために、ＣＳＦ活性の検定技術だけを必要とする新
規方法を使用した。先ず、Ｔリンパ球細胞(または、先
に示したようなその他の供給源)のようなＣＳＦ活性を
生産する細胞を同定する。次いで、この細胞のmＲＮＡ
を回収する。好ましくは、Ｔリンパ球細胞を使用する。
そのような場合、リンホカインに対するmＲＮＡを含有
している膜結合型mＲＮＡを、細胞内の遊離mＲＮＡから
分離する。この分離によって、採取されたmＲＮＡはリ
ンホカイン配列に対して５〜１０倍強化されるものと確
信され、従って、所望のＣＳＦクローンの確認を含む労
力が軽減される。次いで、オリゴdＴセルロースを用い
るクロマトグラフィーによってポリアデニル化したメッ
センジャーＲＮＡを作成する。
【００２４】宿主にトランスフェクションして、ＣＳＦ
活性を有する所望の蛋白質を発現するのに好適なベクタ
ーを使用し、このmＲＮＡからcＤＮＡライブラリーを作
成する。上に作成したmＲＮＡを用い標準的方法によっ
て第１鎖cＤＮＡを作成する。次いで、このＲＮＡ／cＤ
ＮＡハイブリッドを２本鎖cＤＮＡ形に変換する。次い
で、このcＤＮＡを好適なベクターへ挿入することがで
きる。
【００２５】ＣＳＦクローンの単離に好ましい宿主−ベ
クター系は、ＣＳＦ／cＤＮＡを好適な形質転換ベクタ
ーに発現することに基づいている。好適な形質転換ベク
ターは、哺乳類細胞へＤＮＡを一過性に導入することに
よって期待できる[メロン、パーカー、グルツマン、マ
ニアティス(１９８１年)、セル、２７巻、２７９〜２８
８頁]。所望のＣＳＦ形質転換体を単離するために、集
団(ポピュレーション)細胞のすべてが、所望のＣＳＦ生
産物を発現する外来性遺伝子を必ず保有している必要は
ない。細胞の副次集団(サブポピュレーション)が数日間
にわたって所望の生産物を発現するよう、一過性に外来
性遺伝子を該副次集団へ導入することが可能である。こ
の発明方法では、ＤＮＡトランスフェクションおよび発
現系における形質転換ベクターに選択マーカーを置く必
要がないから、外来性ＤＮＡは１〜２週間にわたる細胞
発育期間の際に消失して終う。但し、好適な場合は、哺
乳類細胞のトランスフェクション後、２、３日は、所望
の生産物の合成が見られ、検出することができる。
【００２６】最もよい宿主−ベクター系は、複製起点を
欠くＳＶ４０のＤＮＡ分子を導入したサルのＣＶ−１細
胞系の開発に基づいている[グルツマン、セル、２３
巻、１７５〜１８２頁(１９８１年)]。欠損ＳＶ４０Ｄ
ＮＡを含んでいるＣＯＳと名付けられたサルの形質転換
ＣＶ−１細胞は、ＳＶ４０ゲノムの完全なコピーを含ん
でいないが、高濃度の巨大Ｔ抗原を生産し、またＳＶ４
０／ＤＮＡ複製を許容する。また、これらは初期領域お
よびＳＶ４０の複製起点を含んでいる細菌性プラスミド
の欠失を有するＳＶ４０の複製を効率よく支持する[マ
イヤーズ、ツジャン(１９８０年)、プロシーディング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
ズ・オブ・ザ・ユー・エス・エー、７７巻、６４９１〜
６４９５頁]。このように、この系は、外来性ＤＮＡか
ら発現されたmＲＮＡおよび蛋白質の濃度を高めるた
め、ＳＶ４０によるＤＮＡ複製を介して、トランスフェ
クションした外来性ＤＮＡを増幅する手段を提供する。
但し、他の類似の系もまた使用できる。
【００２７】ＣＳＦ発現に使用するベクター類は、典型
的に下記に記載のように、エンハンサー、プロモータ
ー、イントロン、ポリアデニル化部位、３'−非暗号化
領域および翻訳活性化領域のような種々の要素を含んで
いる。
【００２８】ベクター類はエンハンサーを含むことがで
きる。エンハンサーは機能的にプロモーターと区別され
るが、プロモーターと協調して作動するようである。細
胞レベルにおけるその機能はよく判っていないが、その
特異な性能は位置または配向に関係なく転写を活性化ま
たは増強する働きである。プロモーターは遺伝子の上流
に存在する必要があるが、エンハンサーは上流、即ち、
プロモーターから５'−上流の遺伝子内にイントロンと
して、または遺伝子から下流、遺伝子とポリアデニル化
部位との間またはポリアデニル化部位から３'−下流に
存在することができる。逆方向のプロモーターは機能し
ないが、逆方向のエンハンサーは機能する。エンハンサ
ーはシスに作用する。即ち、プロモーターが同一ＤＮＡ
鎖上にある場合だけ、エンハンサーはプロモーターに影
響を与える。エンハンサーに関する一般的な論考につい
ては、コーリーら、セル、３３巻、３１３〜３１４頁
(１９８３年)を参照。
【００２９】哺乳類細胞に使用する好ましいエンハンサ
ーは、シミアン・ウイルス４０、ポリオーマ・ウイル
ス、ウシ乳頭腫ウイルス、レトロウイルスまたはアデノ
ウイルスから得られる。理想的には、エンハンサーは宿
主が許容するウイルス、即ち、宿主型細胞に普通に感染
するウイルスから得るべきである。ウイルス性エンハン
サーは公的に利用可能なウイルス類から容易に得ること
ができる。２、３のウイルス、例えばラウス肉腫ウイル
スおよびシミアン・ウイルスのエンハンサー領域はよく
知られている[ルシウら、セル、３３巻、７０５〜７１
６頁(１９８３年)]。公開された当面のウイルスの制限
酵素地図に基づいてこれらの領域を切り出し、必要なら
ば、該エンハンサーを所望のベクターへ挿入し得るよう
その部位を修飾することは、分子生物学において日常行
なわれることである[例えば、カウフマンら、ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、１５９巻、６
０１〜６２１頁(１９８２年)、およびモレキュラー・セ
ル・バイオロジー、２巻(１１号)、１３０４〜１３１９
頁(１９８２年)を参照にせよ]。別法として、エンハン
サーを配列データから合成することもできる。ウイルス
性エンハンサーの大きさ(一般に、約１５０bpより小さ
い)は、合成を実際に達成し得る程度に十分小さい。
【００３０】ベクター組立て体内に存在すべきもう１つ
の要素はポリアデニル化切り継ぎ(スプライシング)(ま
たは付加)部位である。この部位は遺伝子の翻訳領域か
ら僅か下流に位置しているＤＮＡ配列であり、転写が停
止した所から交代に、アデニン・リボヌクレオチドが付
加し、メッセンジャーＲＮＡの３'−末端にポリアデニ
ン・ヌクレオチド尾部を形成する。ポリアデニル化は、
メッセンジャーＲＮＡ濃度を低下し、それによって蛋白
質生産物濃度を低下するメッセンジャーＲＮＡの細胞内
分解という問題発生に対しメッセンジャーＲＮＡを安定
化するのに重要である。
【００３１】真核性ポリアデニル化部位はよく知られて
いる。真核遺伝子には一致した配列が存在している。ポ
リアデニル化が始まる所かから１１〜３０ヌクレオチド
に５'−ＡＡＵＡＡＡ−３'の６ヌクレオチドが見い出さ
れる。ポリアデニル化部位を含んでいるＤＮＡ配列は、
公知文献に従ってウイルスから得ることができる。例示
的には、ポリアデニル化文献はマウス・ベーターグロブ
リンから得られ、またシミアン・ウイルス４０の初期ま
たは後期領域遺伝子から得ることができる。但し、ウイ
ルス性ポリアデニル化部位の方が好ましい。これらの配
列は既知であるので、イン・ビトロで合成し、通常の手
法によりベクターと連結できる。
【００３２】翻訳停止コドンからポリアデニル化部位を
隔離する部位は、好ましくは非促進真核遺伝子のような
翻訳されないＤＮＡ配列である。そのような配列および
遺伝子はプロモーターを賦与されないので、発現されな
いはずである。この配列は停止コドンからポリアデニル
化部位まで、約１０００塩基程度までのかなりの鎖長で
あるべきである。この３'の翻訳されない配列は、一般
に生産物収量の増加を招来する。ベクターは一致したポ
リアデニル化配列から約３０bp下流から終結することが
できるが、野性型環境においてポリアデニル化部位から
下流に見い出される３'−配列を保持していることが望
ましい。このような配列は典型的にはポリアデニル化部
位から下流に、約２００〜６００塩基対の鎖長である。
【００３３】ベクターの翻訳されずに転写される部分に
イントロンが存在すると、生産物収量を増加することが
できる。そのようなイントロンは宿主細胞や遺伝子供給
源以外の供給源から得ることができる。例えば、アデノ
ウイルスの３分節系リーダーの第２イントロンからの
５'−接合部位、およびアデノウイルス主後期プロモー
ターの転写開始部位から下流を挿入した免疫グロブリン
遺伝子からの３'−接合部位を含んでいる雑種イントロ
ンは生産物収量を増加する結果を生じる。
【００３４】ＣＳＦクローニングおよび発現ベクターの
好ましい態様には、翻訳活性化遺伝子がある。翻訳活性
化遺伝子とは、所望のメッセンジャーＲＮＡの翻訳に影
響を与える蛋白質またはＲＮＡ生産物を暗号化している
遺伝子である。最良の例はアデノ随伴ウイルス(ＶＡ)遺
伝子(ＶＡＩ)であって、このものは転写されて短いＲＮ
Ａ断片となり、アデノウイルス主後期mＲＮＡの５'の翻
訳されない領域にある配列と相互に反応する[シンマツ
パヤら、(１９８２年)、セル、３巻、５４３頁]。ＶＡ
のＲＮＡによって翻訳活性化されるのに必要な配列はア
デノウイルス後期mＲＮＡ３分節系リーダー内にある。
アデノウイルス３分節系リーダーは、アデノウイルス・
ゲノムの隣接していない領域と接合し合い、アデノウイ
ルスの主後期転写体５'終末に存在している。ＶＲのＲ
ＮＡは３分節系リーダー配列を含んでいるmＲＮＡと反
応し合って、その翻訳を活性化することができる。従っ
て、好ましいcＤＮＲクローニングと発現ベクターは、
３分節系リーダーとアデノウイルスＶＡ遺伝子との切り
継ぎ(スプライス)形を含んでいる。
【００３５】これらのベクター類は、当該技術分野の専
門家にとって公知の手法により合成できる。エンハンサ
ー、プロモーター等のようなベクター要素は、天然供給
源または、前記のように合成された供給源より入手でき
る。基本的にはそれらの要素が、例えばウイルス機能に
見られる要素のように大量に入手可能なＤＮＡ内に見い
出される場合、あるいは、例えばポリアデニル化部位の
ように合成できる場合は、制限酵素の公的な使用によっ
て、供給源微生物を単純培養し、そのＤＮＡを好適なエ
ンドヌクレアーゼで消化し、ＤＮＡ断片を分離し、興味
ある要素を保有しているＤＮＡを同定し、これと同一の
ものを再生することによって、大量のベクターを得るこ
とができる。通常、形質転換ベクターは少量が組み立て
られ、次いで、原核性プラスミドまたはファージのよう
に好適な自律複製を行なう合成ベクターと連結されるは
ずである。多くの場合、pＢＲ３２２プラスミドが使用
できる(カウフマンら、前掲)。
【００３６】合成ベクターは、例えばそれを許容する原
核微生物のトランスフェクションによって、多数の合成
ベクターのコピーを複製し、細胞溶解によって合成ベク
ターを回収し、細胞残屑から合成ベクターを分離する通
常の手法に従い、連結した形質転換ベクターをクローニ
ングするのに使用する。
【００３７】ＣＳＦ活性を生産する細胞からcＤＮＲを
含有しているベクターを調製し、次いで、これをエシエ
リキア・コリに導入し、ペトリ皿の１皿当たり約２００
０コロニーの割合となるように、これを培養する。コロ
ニーをニトロセルロース・フィルターに採取し、フィル
ターを新たに平板に移し、これをマスター(基準標本)と
して保存する。コロニーが発育した後、レプリカを作成
し、レプリカ・フィルターの切片がマスター平板の対応
部分と合成し得るように、注意深くこれに印を入れるこ
とにより、切片を基準標本と対応させる。
【００３８】各レプリカ・フィルターを裁断し、あらか
じめ１枚当たり一定数のコロニーを含ませてある切片
(好ましくは、１切片当たり約２００〜５００コロニー)
を作成する。各切片からコロニーをＬ−ブロスのような
培地に播種し、遠心によって菌を捕集し、プラスミドＤ
ＮＡを分離する。各切片毎に得られたプラスミドＤＮＡ
を、蛋白質発現に好適な宿主へと導入(トランスフェク
ション)する。ここにおいて、好ましい合成ベクター
は、真核細胞に有害な配列を欠失しているエシエリキア
・コリの変異株プラスミドpＢＲ３２２である(カウフマ
ンら、前掲参照)。この変異株を使用することによっ
て、導入に先立ち、プラスミド残基を欠失させる必要が
なくなった。導入を行なった細胞を発育させた後、培地
のＣＳＦ活性を検定する。陽性検定の場合は、ＣＳＦ／
cＤＮＲを保有しているコロニーが、フィルターの特定
切片に存在することを示している。
【００３９】基準マスター・フィルター切片の、どのク
ローンがＣＳＦ／cＤＮＲを含んでいるのかを決定する
ために、フィルター切片上の各クローンをそれぞれ採取
し、これを発育させる。次に、この培養を１つのマトリ
ックスに配置する。マトリックスの横の各行および縦の
各列毎に１つづつプールを作る。プールした各培養毎に
ＤＮＡ試料を作成し、これらを発現用宿主細胞へそれぞ
れ導入する。これらのプールから採取した上清のＣＳＦ
活性を検定する。ある縦の列のプールと、ある横の行の
プールがＣＳＦ活性を生産したとする。これら２つのプ
ールに共通するクローンにＣＳＦ／cＤＮＲが含まれて
いるはずである。もし、マトリックスに１個以上の陽性
クローンが含まれていたら、１個より多くの縦列および
横の行が陽性であるはずである。このような場合には、
更に、少数のクローンでのスクリーニングが必要である
かも知れない。
【００４０】制限酵素によってクローンからＣＳＦ／c
ＤＮＲを切り出し、既知の手法によりその配列を決定す
ることができる。ここに記載した方法が、ＣＳＦ／cＤ
ＮＲを任意の供給源から得るのに使用できることは容易
に理解できよう。第１図に、この発明によるＣＳＦ／c
ＤＮＲの完全なＤＮＡ配列と、それを翻訳したＣＳＦ蛋
白質生産物の予測されるアミノ酸配列とを併記して示
す。
【００４１】この発明によるＣＳＦ活性を備える蛋白質
を暗号化した第１図に示すようなＤＮＡ配列を、通常の
方法によって修飾し、記載した検定試験でなおＣＳＦ活
性を保有している目的のＣＳＦ蛋白質の変異形を作成す
ることができる。例えば、１個、２個、３個、４個また
は５個のアミノ酸を他のアミノ酸と置換することができ
る。その一部を引用して説明の一部とするベルギー特許
第８９８０１６号には、システインを例えばセリンに置
換するそのような技術の代表例を開示している。
【００４２】この発明のＣＳＦ／cＤＮＲには、ＡＴＧ
コドンによって先行される本来のＣＳＦ／cＤＮＲ遺伝
子と、ＣＳＦ蛋白質の対立遺伝子性変異形を暗号化して
いるＣＳＦ／cＤＮＲが包含される。１つの対立遺伝子
を第１図に示す。この発明者が発見したもう１つの対立
遺伝子は、第１図に示した３６５番目の位置のシトシン
残基の代わりにチミジン残基を有する。この発明のＣＳ
Ｆ蛋白質は、ＣＳＦ蛋白質のl−メチオニン誘導体(Ｍet
−ＣＳＦ)およびＣＳＦ蛋白質の対立遺伝子性変異形を
包含する。第１図の配列で示される成熟ＣＳＦ蛋白質
は、Ａla・Ｐro・Ａla・Ａrg……の配列で始められ、そ
の開始の位置は第１図の５９番目のヌクレオチドの後の
矢印で示される。Ｍet−ＣＳＦはＭet・Ａla・Ｐro・Ａ
la・Ａrg……の配列で始まる。第１図に示した対立遺伝
子性変異形は１００番目のアミノ酸残基にＴhrを有し
(矢印の後のＡlaで始まる)、ＣＳＦ(Ｔhr)として示すこ
とができる。もう１つの変異形は、１００番目にＩle残
基を有するものでＣＳＦ(Ｉle)として示される。この発
明の精製ＣＳＦ蛋白質は、ヒト骨髄細胞で検定すると、
蛋白質１mg当たり少なくとも１０7単位／mgの比活性を
有し、好ましくは少なくとも４×１０7単位／mgの比活
性を有する。
【００４３】ＣＳＦの発現に用いる宿主−ベクター系は
原核系でも真核系でもよいが、ＣＳＦの複雑さから、好
ましい発現系は哺乳類系のものである。発現は、好適な
ＣＳＦベクターを原核細胞または真核細胞に導入するこ
とによって、容易に達成される。前記の方法により得ら
れたＤＮＡ配列は、好適なプロモーターの支配下に哺乳
類細胞へ直接発現できる。当該技術分野の専門家に周知
の外来性プロモーターを使用することができる。原核細
胞または酵母細胞へＣＳＦを発現するためには、先導配
列(または分泌配列)を除去しなければならない。第１図
に成熟ＣＳＦ蛋白質のＮ末端コドンの位置を示してあ
る。これは、当該技術分野の専門家に周知の標準的な手
法を用いて実施することができる。一旦、所望のＣＳＦ
／cＤＮＲが得られれば、既知の好適な手技を用いて、
ＣＳＦ蛋白質を発現する。例えば、ＣＳＦ／cＤＮＲを
好適なベクターに挿入し、好適な宿主細胞へベクターを
導入し、形質転換された細胞を選択し、これらの形質転
換体を培養して、ＣＳＦ活性を発現する。好適な宿主細
胞としては、細菌(例えば、エシエリキア・コリ)、酵
母、哺乳類細胞(例えば、ＣＨＯ)および昆虫細胞が挙げ
られる。このようにして生産されたＣＳＦ蛋白質は、蛋
白質のＮ末端にメチオニン基を有することができる(こ
れをＭet−ＣＳＦと呼ぶ)。原核細胞または真核細胞に
よって生産される成熟蛋白質は、原核細胞生産物が天然
生産物と同程度、もしくはある程度の差をもってグリコ
シル化され得る点を除けば、同じアミノ酸配列を示す。
下記の実施例において、ＣＳＦ蛋白質を得るため通常用
いる各種の方法を説明する。その他の方法、または材料
(例えば、ベクター)については、実施例および下記の記
載に基づけば当該技術分野の専門家に容易に明白となろ
う。
【００４４】好適な原核または真核細胞に発現したＣＳ
Ｆ蛋白質は、当該技術分野の専門家に周知の精製・分離
手法によって再生することができる。但し、明示したよ
うに、この発明はまた、組換え体または天然の何れの供
給源からでもＣＳＦ蛋白質を高純度で、しかも高活性で
入手できる精製方法を提供する。
【００４５】
【本発明の精製方法の要約】この発明は先行技術の諸問
題を克服してＣＳＦ活性を有する蛋白質を精製する方法
を提供する。この発明によるＣＳＦ蛋白質は、ヒト骨髄
検定法によって検定すると、蛋白質１mg当たり、少なく
とも約１×１０7単位の比活性を有し、好ましくは少な
くとも約２×１０7単位、一層好ましくは少なくとも約
約４×１０7単位の比活性を有する。
【００４６】この発明におけるＣＳＦ蛋白質の精製方法
は、下記の通り行なう。蛋白質を８０％飽和硫酸アンモ
ニウムで沈澱させ、ＣＳＦ蛋白質を含有するペレットを
作成する。該ペレットをpＨ約６〜約８の範囲の緩衝液
に再懸濁させる。ＣＳＦを含有する該緩衝液をクロマト
グラフィー・カラムに掛け、塩化ナトリウムを含有する
緩衝液で溶出し、ＣＳＦ活性を有する画分を捕集する。
活性画分をプールし、これをＣ４で逆相カラムに掛け、
０→９０％アセトニトリル勾配で溶出して、活性画分を
採取する。
【００４７】
【精製方法に関する図面の簡単な説明】第５図に精製Ｃ
４蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【００４８】
【精製方法の詳細な説明】この発明によって精製するＣ
ＳＦ蛋白質は、前記の組換え体ＤＮＡ処理の出発供給源
として使用した、例えばＭo細胞系またはＵＣＤ、ＭＬ
Ａ−１４４ギボン細胞系等の任意の天然供給源から誘導
することができる。別法として、この発明の組換え体Ｄ
ＮＡ技術を使用してＣＳＦ蛋白質を作成することができ
る。
【００４９】何れの供給源からのＣＳＦであれ、この発
明方法によって精製することが可能である。ＣＳＦ蛋白
質の任意の供給源から得た調整培地を、好ましくは１ml
当たり少なくとも、蛋白質約０．１mgの蛋白質濃度ま
で、限外濾過によって濃縮する。次いで、これに８０％
飽和硫酸アンモニウムを加えることにより、蛋白質を沈
澱させる。得られたペレットをpＨ約６〜約８の範囲に
調節した緩衝水溶液に再懸濁させる。好適な緩衝液の例
としてはトリス−塩酸、ＨＥＰＥＳ、クエン酸ナトリウ
ム等が挙げられる。
【００５０】緩衝溶液をカラム・クロマトグラフィーに
より分別する。クロマトグラフィー・カラムに充填する
好適な材料はオクチルセファロース、ＤＥＡＥ−ウルト
ロゲル、ＡcＡ４４−ウルトロゲル、ＡＣＡ５４−ウル
トロゲル等である。１またはそれ以上のこれらの材料を
連続使用することによって、一層高い純度を得ることが
できる。
【００５１】各カラム毎の画分を採取し、ＣＳＦ活性を
検定する。活性画分をプールし、トリフルオロ酢酸(Ｔ
ＦＡ)、ヘプタフルオロ酢酸(ＨＦＢＡ)等で希釈しＣ４
逆相カラムに掛ける。次いで、ＴＦＡまたはＨＦＢＡ
中、０→９０％アセトニトリル勾配を用い、プール画分
をカラムに適用するのに何れの酸を使用したかによっ
て、それぞれ好ましくは０．１０％または０．１５％
(容積／容積)の濃度で、ＣＳＦ活性を溶出する。
【００５２】ＣＳＦ活性を有する画分はＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動によって分析する[ラムリ、
ネーチャー、２２７巻、６８０頁(１９７０年)の記載の
通り、１３．５％ゲル]。前記のクロマトグラフィー・
カラム材料を使用して追加的処理を行なえば、ＣＳＦ蛋
白質を更に同質性に精製することができる。
【００５３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分別した精製Ｃ
ＳＦ蛋白質は約１５０００〜約２６０００ダルトンの範
囲の見掛けの分子量を示し、非同質的なＣＳＦ蛋白質の
挙動を呈した。見掛けの大きさのこの異質性はこの蛋白
質の著しいグリコシル化に起因しており、糖蛋白質に共
通した像である。調整培地Ｍo細胞から更に純度の低い
試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ(非還元的条件で)によって分別
し、ゲルから溶出した蛋白質を検定すると、見掛けの分
子量が約２８０００〜３００００まＣＳＦ活性を有する
第２の蛋白質の存在が明らかになった。
【００５４】ＣＳＦ活性をオクチルセファロース、ＤＥ
ＡＥ−ウルトロゲルに結合させ、Ｃ４逆相カラムから溶
出する。Ｃ４活性のおよひ６０％がＣon−Ａ(コンカナ
バリンＡ)セファロースに結合し(４０％は通過する)、
α−メチルマンノシドで溶出する。
【００５５】組換え体ＣＳＦの低塩分ゲル濾過による分
子量分析から、活性の約３０％は１９０００の推定分子
量で溶出したが、物質の７０％は約３８０００の分子量
に相当する位置で溶出し、２量体として挙動した。も
し、このカラムに１Ｍ−ＮaＣl溶液を含ませると、すべ
ての活性は約１９０００ダルトンに幅広いピークを示し
て溶出する。
【００５６】精製ＣＳＦは、４Ｍ−グアニジン塩酸塩、
１０mＭ歩ＥＤＴＡ、１０mＭ−２−メルカプトエタノー
ル、３０％(v／v)エタノール中、４℃(pＨ７．４)でイ
ンキュベートすると、少なくとも１６時間安定である。
またＣＳＦ活性は、０．１％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)
(pＨ２．０)および０．１％ＴＦＡ＋２５％(v／v)アセ
トニトリル中で安定である。
【００５７】既述のように、この発明のＣＳＦ蛋白質
は、例えば癌の化学療法または放射線処置によって生じ
る顆粒球減少症(症候性の)のような骨髄抑制の処置に適
用される。また、この幅広さのＣＳＦ蛋白質は重症感染
症の処置に使用することを適応とする。このような適用
では、患者１当たり約２００〜１０００μgの投与量が
指示される。ＣＳＦ蛋白質は、好ましくは好適な薬理学
的担体に溶解し、経静脈的な患者に注射する。そのよう
な担体の例は、薬理学的食塩水およびヒト血清アルブミ
ン−食塩水である。
【００５８】この発明のＣＳＦ蛋白質はまた、他の活性
および用途を有する。例えば、ネズミ類のＣＳＦは好中
球を賦活する。従って、この発明の霊長類動物ＣＳＦも
また、好中球を賦活することが期待される。それ故にＣ
ＳＦの生理学的機能は数倍にも達し得る。このリンホカ
インは、骨髄では宿主防御に働くエフェクター細胞の増
殖を分化を刺激し、一方、末梢では、新生および既存の
細胞を賦活することができる。ＣＳＦの局所的な免疫応
答として、ＣＳＦは炎症領域または炎傷から離れた部位
で、好中球の循環を維持することができる。好中球の不
適切な局在化および／または賦活は、リウマチ様関節炎
のような種々の免疫を介する障害の機能変化とみなすこ
とができる。
【００５９】下記の諸例を説明することによって、更に
この発明の理解を深めることができよう。但し、これら
は単に例示的な説明を意図するものであって、これによ
ってこの発明の請求の範囲が制限されるものではない。
特に明記しない限り、実施例において温度は℃で示す。
【００６０】制限エンドヌクレアーゼ酵素は、商業的な
提供先の勧告による条件および操作方法に従い使用す
る。連結(ライゲーション)反応は、この発明に引用して
説明の一部とするマニアティスらの記載(前掲、２４５
〜６頁)により、その２４６頁に記載の緩衝液を使用
し、１〜１００μg／mlのＤＮＡ濃度を用いて、平滑末
端ＤＮＡの場合は２３℃、「付着末端」ＤＮＡの場合は１
６℃の温度で実施する。電気泳動は９０mＭトリス−ホ
ウ酸、１０mＭ ＥＤＴＡを含有する０．５〜１．５％
アガロースゲルで行なう。放射性標識ＤＮＡは、すべ
て、標識手段の何れを問わず32Ｐで標識した。「迅速調
製」とは、たとえばマニアティスらの記載(前掲、３６５
〜３７３頁)のように、バクテリオファージまたはプラ
スミドＤＮＡの迅速、小規模生産をいう。
【００６１】
【実施例Ａ】
【第１段階】 Ｍo細胞系培養 Ｍo細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ８０６６)は、通常通り、２
０％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)、２mＭ−グルタミン、１０
０単位／mlストレプトマイシン、１００μg／mlペニシ
リンを含有するα(６％ＣＯ2)、またはイスコーブ(１０
％ＣＯ2)培地に発育させた。細胞は４〜５日毎に植継ぎ
培養すべきである。細胞を計数し、フアルコンＴ−１７
５フラスコで１００〜１５０mlの培地に、３〜４×１０
5／cmの密度で播種する。細胞は、２０％ＦＣＳ中で４
〜７日後に倍になる。増殖速度は一定でなく、細胞は時
に増殖を停止したように見え、次いで、一挙に増殖を始
める。Ｍo細胞は無血清培地に発育できる。細胞をＦＣ
Ｓから無血清培地へ移す場合、洗浄しない方がはるかに
細胞の生存がよい。無血清培地(ＳＦ)における細胞の最
適密度は５×１０5細胞／mlである。細胞は無血清培地
中で３日間僅かに増殖し(少なくとも一定数を維持し)、
次いで、少なくとも４日間、２０％ＦＣＳを加えて養育
すべきである。ＳＦ培地が必要ならば、細胞に明らかな
害を与えることなく、数カ月間、この増殖日程(ＳＦ３
日間、２０％ＦＣＳ４日間)を週単位で繰り返すことが
できる。
【００６２】
【第２段階】 ＣＳＦ活性の検定 Ａ．骨髄検定法 新鮮な骨髄を入手する。２０番、２２番、次いで２５番
ゲージの注射針を通すことによって、骨片を破砕する。
滅菌したリン酸緩衝食塩溶液(ＰＢＣ)で１:１に希釈し
(室温)、フィコール・パーク(６mlフィコールの上に約
３０mlＢＭ−ＰＢＳを重ねる)を重層する。１５００rpm
で４０分間(室温)遠心する。脂肪とＰＢＣを除去して棄
てる。低密度層をピペットで除去する。ＰＢＣで２回洗
浄し、計数する。細胞をＲＰＭＩ(ギブコ社から、ＲＰ
ＭＩ１６００として購入)＋１０％ＨＩＦＣＳ(熱処理不
活性化ＦＣＳ)で３時間培養し、付着細胞を採取する。
【００６３】培養培地(その都度、新たに調製): ２０％ＦＣＳ ０．３％寒天(水に溶解し、４０℃に冷却) ２Ｘイスコーブ(Ｉsocove)(寒天と１:１の割合) １％Ｐ／Ｓ(最終濃度: ストレプトマイシン１００単位
／ml、ペニシリン１００μg／ml) １０-4Ｍ−α−チオグリコレート(１０-2Ｍ−予製品か
ら２Ｘイスコープで調製) 寒天を約４０°に冷却し他の成分と混合する。水浴で３
７〜３８°に冷却し、この温度に保つ。
【００６４】３時間後、付着細胞できないものをピペッ
トで除去する。遠心し、計数する。２×１０5細胞／ml
の培養培地を添加し、水浴温度を３７〜３８°調節して
維持する。マイクロ滴定板のウェル(穴)の第１横列に試
料を２穴づつ加える(例えば、トランスフェクションし
た細胞からの培地。通常、１０μl試料)。細胞懸濁液１
００μlづつ、各ウェルに加える。更に細胞懸濁液５０
μlづつを、第１横列の各ウェルに追加する。完全に混
合し、第１横列から、溶液５０μlを次の横列に移す。
このようにして、平板上、１:３の希釈となるまで順次
希釈を続ける。平板をパラフィルムで包む。十分な加温
環境中で、１０％ＣＯ2、３７℃で１０〜１４日間、イ
ンキュベートし、コロニー数を計算する。
【００６５】コロニー数の計数は、各ウェル毎に発育し
たコロニーの全数を数える。各検定毎に、数個づつ試料
を加えないでウェルを培養し(ブランク)、バックグラウ
ンド・コロニー数を得る。試料を含んでいる各ウェルか
ら得られたコロニー数から、ブランク・ウェルの平均発
育コロニー数を差し引く。ＣＳＦ濃度がほぼ飽和した状
態の場合、ＣＳＦの１単位は、ヒト骨髄細胞数１０5当
たりのバックグラウンド(１０5細胞／mlで培養)に対し
て、更に１コロニー多く生成を刺激する量に相当する。
ほぼ飽和した濃度は、希釈により、種々の希釈度におけ
るコロニー数を比較し、飽和濃度から直ぐ下の濃度を見
い出すことにより決定する。
【００６６】この検定によって、顆粒球、単球またはそ
の双方の血球系が計数される。コロニーにおける血球の
型は、そのコロニーを採集し、独立した細胞を染色する
ことによって決定する。
【００６７】Ｂ．ＫＧ−１細胞検定 ＫＧ−１細胞[ブラッド、５６巻、３号、(１９８０年)]
は、イスコープ培地＋１０％ＦＣＳに１週間当たり２回
継代し、各継代毎に２×１０5細胞／mlを播種して発育
させる。３０〜３５継代の細胞だけを検定に使用する。
検定は、前記の骨髄の場合と同じ方法で行ない、但しＫ
Ｇ−１細胞の場合、寒天混合物に４×１０3細胞／mlで
培養する。
【００６８】各ウェルに発育するコロニー数を算定し、
前記の骨髄検定の場合のようにバックグラウンド数を差
し引く。１ＫＧ−１ＣＳＦ単位／mlは、発育するＫＧ−
１コロニーの最高数(飽和)の半分の発育を刺激するＣＳ
Ｆ濃度である。最高数は、数個のウェルでＣＳＦの飽和
濃度を含むことによって得られる。
【００６９】
【第３段階】 ベクターp９１０２３(Ｂ)の組立て 形質転換ベクターは、カウフマンらの記載[モレキュラ
ー・セル・バイオロジー、２巻、１１号、１３０４〜１
３１９頁(１９８２年)]のpＡdＤ２６ＳＶpＡ(３)であ
る。このベクターは第２図に示す構造を有する。即ち、
このプラスミドはアデノウイルス２(Ａd２)の主後期プ
ロモーターの転写調節に支配されているマウス・ジヒド
ロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)cＤＮＡ遺伝子を含んで
いる。５'−接合部位はアデノウイルスＤＮＡに含まれ
ており、免疫グロブリン遺伝子から誘導された３'−接
合部位はＡd２主後期プロモーターとＤＨＦＲ暗号配列
との間に介在している。ＳＶ４０の初期ポリアデニル化
部位はＤＨＦＲ暗号配列の下流に存在する。pＡdＤ２６
ＳＶpＡ(３)の原核系誘導部分はpＳＶＯdに由来してお
り[メロン、パーカー、グルツマン、マニアティス、(１
９８１年)、セル、２７巻、２７９〜２８８頁]、ヒトの
細胞で複製を阻害することが知られているpＢＲ３２２
配列を含んでいない[ラスキーおよびボッチャン(１９８
１年)、ネーチャー(ロンドン)、２９３巻、７９〜８１
頁]。
【００７０】第２図にしめしたよに、pＡdＤ２６ＳＶp
Ａ(３)をプラスミドpＣＶＳＶＬ２へ変換する。pＡd−
Ｄ２６ＳＶpＡ(３)にある２つのＰst１部位の１個を欠
失することによってpＡdＤ２６ＳＶ−pＡ(３)をプラス
ミドpＡdＤ２６ＳＶpＡ(３)(d)へ変換する。これは、Ｐ
st１で部分消化し[１個のＰst１部位だけを切断した線
状プラスミドの副次集団(サブポピュレーション)を得る
ことができるよう、不足した酵素活性を使用する]、次
いで、クレノウで処理し、連結してプラスミドを再び環
状に戻し、エシエリキア・コリに導入して、ＳＶ４０ポ
リアデニル化配列の３'の位置にあるＰst１部位の欠失
をスクリーニングすることによって達成される。
【００７１】第２図に示したように、アデノウイルスの
３分節系リーダーおよびウイルス随伴遺伝子(ＶＡ遺伝
子)をpＡdＤ２６ＳＶpＡ(３)(d)へ挿入した。先ずＰvu
ＩＩでpＡdＤ２６ＳＶpＡ(３)(d)を切断し、３分節系リ
ーダーを含んでいる３つのうちのに１番目の要素の３'
−位で開裂した線状分子を作成した。pＬＡＷ４３[ザイ
ンら(１９７９年)、セル、１６巻、８５１頁]をＸhoＩ
で消化し、クレノウで処理し、ＰvuＩＩで消化し、アク
リルアミド・ゲルで電気泳動することによって[６％ト
リス−ホウ酸緩衝液:マニアティスら(１９８２年)、前
掲]、第２リーダーと第３リーダーの１部とを含有して
いる１４０塩基対の断片を単離した。次いで、この１４
０bp断片を、先にＰvuＩＩで消化したpＡdＤ２６ＳＶp
Ａ(３)(d)へ連結した。この連結生産物を使用して、こ
れをテトラサイクリン耐性エシエリキア・コリに導入
し、グランシュタイン−ホグネスの方法により、１４０
bp断片にハイプリッド形成した32Ｐ標識プローブを使用
してコロニーをスクリーニングした。ハイプリッド化陽
性のコロニーからＤＮＡを調製し、再構築されたＰvuＩ
Ｉ部位が、アデノウイルスの第２および第３後期リーダ
ーに特有な挿入された１４０塩基対の５'であるか、３'
であるかを試験した。ＰvuＩＩ部位の正しい配向は、１
４０bp挿入体の５'側である。このプラスミドを、第２
図でpＴＰＬと命名した。
【００７２】ＳＶ４０ ＤＮＡをＡvaＩＩで消化し、そ
の末端をＰolＩのクレノウ断片で平滑化し、ＸhoＩリン
カーをこの断片に連結し、ＸhoＩで消化してＸhoＩ部位
を開裂し、ゲル電気泳動によって４番目に大きい(Ｄ)断
片を単離することによって、ＳＶ４０エンハンサー配列
を含んでいるＳＶ４０のＡvaＩＩ Ｄ断片を得た。次い
で、この断片をＸhoＩ断片pＴＰＬに連結して、プラス
ミドpＣＶＳＶＴＬ２−ＴＰＬを得た。pＣＶＳＶＴＬ２
−ＴＰＬなおけるＳＶ４０ Ｄ断片の配向は、ＳＶ４０
の後期プロモーターがアデノウイルス主後期プロモータ
ーと同一の配向となるようにした。
【００７３】pＣＶＳＶＬ２−ＰＴＬヘアデノ随伴ウイ
ルス(ＶＡ)遺伝子を導入するため、先ず、アデノウイル
ス２型ＨindＩＩＩＢ断片を含んでいるプラスミドpＢＲ
３２２を組み立てた。アデノウイルス２型ＤＮＡをＨin
dＩＩＩで消化し、ゲル電気泳動を行なってＢ断片を単
離する。次いで、この断片を、予めＨindＩＩＩで消化
したpＢＲ３２２へ導入する。エシエリキア・コリをア
ンピリシン耐性に転換し、組換え体をＨindＩＩＩＢ断
片の挿入についてスクリーニングし、挿入体の配向を制
限酵素消化によって決定した。pＢＲ３２２−ＡdＨind
ＩＩＩＢはアンピリシン２型ＨindＩＩＩＢ断片を第３
図に示した配向で含んでいる。
【００７４】第３図に示したように、ＶＡ遺伝子は、プ
ラスミドpＢＲ３２２−ＡdＨindＩＩＩＢから、これを
ＨpaＩで消化し、ＥcoＲＩリンカーを加え、ＥcoＲＩで
消化し、１．４Ｋb断片を回収することによって次ごう
よく得られる。次いで、ＥcoＲＩ接着末端を有する断片
をpＴＲＬのＥcoＲＩ部位(予めＥcoＲＩで消化した)へ
連結する。エシエリキア・コリＨＢ１０１に導入し、テ
トラサイクリン耐性について選択した後、コロニーをフ
ィルター・ハイブリダイゼーションによってスクリーニ
ングし、ＶＡ遺伝子に特異的であるＤＮＡプローブを得
る。ＤＮＡはハイブリダイゼーション陽性のクローンか
ら調製し、制限エンドヌクレアーゼ酵素消化によって形
質決定を行なう。生産物プラスミドをp９１０２３と命
名する。
【００７５】p９１０２３にある２つのＥcoＲＩ部位を
除去するるp９１０２３をＥcoＲＩで完全に切り出す
と、２つのＤＮＡ断片が生じる。１つは約７kbで、他方
は１．３kbの共にＶＡ遺伝子を含んでいる断片である。
ＰolＩのクレノウ断片を用いて２つの断片の末端を平滑
化し、次いで２つの断片、即ち１．３kbおよび７kbを互
いに再連結する。ＶＡ遺伝子を含んでp９１０２３と類
似し、但し２つのＥcoＲＩ部位を欠失しているプラスミ
ドp９１０２３(Ａ)は、ＶＡ遺伝子断片でクセランシュ
タイン・ホグネス・スクリーニング、および通常の制限
部位分析によって同定される。
【００７６】次いで、p９１０２３(Ａ)にただ１つだけ
あるＰstＩ部位を除去し、ＥcoＲＩ部位で置き換える。
p９１０２３(Ａ)をＰstＩで完全に切断し、これをＰol
Ｉのクレノウ断片で処理すると平滑末端を生じる。この
p９１０２３(Ａ)のＰstＩ平滑末端部位にＥcoＲＩリン
カーを連結する。ＰstＩ平滑末端部位にＥcoＲＩが結合
した線状p９１０２３(Ａ)を、連結しなかったリンカー
から分離し、ＥcoＲＩで完全消化し、次いで再連結す
る。プラスミドp９１０２３(Ｂ)を回収した。このプラ
スミドはp９１０２３(Ａ)と近似した構造を有するが、
但しＰstＩ部位であった位置にＥcoＲＩ部位が導入され
ていることを確かめた。
【００７７】［第４段階］ｃＤＮＡライブラリーの作成 Ｍｏ細胞をＰＨＡおよびＰＭＡで１６〜２０時間誘導す
ると、リンホカイン産生が高まった。細胞を２０％ＦＣ
Ｓ、０.３％（ｖ／ｖ）ＰＨＡおよび５ｎｇ／ｍｌＴＰ
Ａを含有するイソコーブ培地に５×１０5細胞／ｍｌの
密度で培養した。遠心により細胞を回収した。ペレット
とした細胞を氷冷した細胞溶解緩衝液２０ｍｌ［ＲＳＢ
緩衝液：０.０１Ｍ−トリス−塩酸（ｐＨ７.４）、０.
０１Ｍ−ＫＣｌ、０.００１５Ｍ−ＭｇＣｌ2、１μｇ／
ｍｌシクロヘキサイミド、５０単位／ｍｌＲＮＡｓｉ
ｎ、５ｍＭ−ジチオトレイトール］に再懸濁させた。氷
上で５分間細胞を膨化させ、次いで固く密着したドーン
ス（dounce）・ガラス・ホモジナイザーで１０回転し
て、機械的にこれを粉砕した。このホモジネートを低速
回転で遠心し（ベックマンＪ６型遠心機、２０００ＲＰ
Ｍ）、核および未分解の細胞を除去した。上清を氷上に
保存し、核ペレットをもう一度ＲＳＢ１０ｍｌに懸濁
し、低速回転で遠心した。２回目の上清を１回目の上清
とプールし、プールした上清を低速で遠心し、残存して
いる核および未分解細胞の混入を除去した。
【００７８】遠心によって得た上清に２Ｍ−ＫＣｌを加
えて０.１５Ｍ−ＫＣｌの濃度にし、これを高速回転で
遠心して（ベックマンＳＷ２８型ローター、２５０００
ＲＰＭ、３０分間）、細胞膜をペレット化した。細胞膜
ペレットを冷ＲＳＢで注意深く洗浄し、次いでこれを、
２Ｍ−蔗糖および１.１５Ｍ−ＫＣｌを含有するＲＳＢ
１２ｍｌに再懸濁させた。ベックマンＳＭ４１遠心チュ
ーブに、２.５Ｍ−蔗糖および０.１５Ｍ−ＫＣｌを含有
するＲＳＢ２ｍｌを加え、その上に細胞膜液の２Ｍ−蔗
糖液６ｍｌを重層し、２層の不連続勾配を作成した。チ
ューブの最上層に、更に１.３Ｍ−蔗糖と０.１５Ｍ−Ｋ
Ｃｌを含有するＲＳＢ２.５ｍｌを充填した。この勾配
を４℃で２７０００ＲＰＭで４時間回転した（ベックマ
ンＳＷ４１型ローター）。１８番ゲージの注射針と注射
筒で、細胞膜層（２.０Ｍおよび１.３Ｍの蔗糖層間の境
界面）を側壁から注意深く採取した。
【００７９】２つの勾配からの膜画分をプールし、これ
を蒸留水１容積で希釈し、次いでトリトンＸ−１００お
よびデヒドロコール酸ナトリウムをそれぞれ０.５％と
なるように加え、等容積のフェノールで抽出した。更
に、水層をフェノールおよびクロロホルムの１：１混合
物で抽出し、最後に等容積のクロロホルムで抽出した。
次にＮａＣｌを０.２５Ｍと冷エタノール２.５容積とを
加えて、−２０℃で１夜インキュベートすることによ
り、細胞膜に結合しているＲＮＡを沈澱させた。沈澱し
たＲＮＡを遠心によって捕集し（ベックマン、Ｊ−６遠
心機、４０００ＲＰＭ、１０分間）、これを蒸留水１ｍ
ｌに再懸濁させた。２×１０9個の細胞からＲＮＡ約１
ｍｇが得られた。０.５ｍｌオリゴｄＴ−セルロース・
カラムを通してクロマトグラフィーを行ない、総・ＲＮ
ＡからメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離した。
【００８０】即ち、ＲＮＡを７０℃で５分間加熱した
後、氷上で急速に冷却し、次いで、室温の結合緩衝液
［０.５Ｍ．ＬｉＣｌ、０.０１Ｍ−トリス−塩酸（ｐＨ
７.４）０.００２Ｍ−ＥＤＴＡ、０.１％ＳＤＳ］でこ
の液を５倍に希釈した。このＲＮＡ−結合緩衝液溶液
を、結合緩衝液で飽和したオリゴｄＴ−セルロース・カ
ラムに室温で通過させた。カラムを結合緩衝液５ｍｌで
洗浄した後、更に、０.１５Ｍ−ＬｉＣｌ、０.０１Ｍ−
トリス−塩酸（ｐＨ７.４）、０.００２Ｍ−ＥＤＴＡお
よび０.１％ＳＤＳから成る溶液５μｌで洗浄した。
【００８１】最後に、０.０１Ｍ−トリス−塩酸（ｐＨ
７.４）、０.００２Ｍ−ＥＤＴＡおよび０.１％ＳＤＳ
から成る溶液２ｍｌでｍＲＮＡを溶出した。ＮａＣｌを
０.２５Ｍまで加え、２.５容積のエタノールを加えて−
２０℃に１夜インキュベートすることにより、ｍＲＮＡ
が沈澱した。遠心により、沈澱したｍＲＮＡを捕集した
（ベックマン、ＳＷ５５型ローター、３００００ＲＰ
Ｍ、３０分間）。注意深くチューブから上清を除去し、
得られたｍＲＮＡのペレットを再び水５０ｍｌに懸濁し
た。ｍＲＮＡの懸濁液にＮａＣｌを加えて０.２５Ｍと
し、次いでフェノールおよびクロロホルムの１：１混合
液で１回抽出し、次いでクロロホルムで３回抽出した。
２.５容積のエタノールを加えることにより、ｍＲＮＡ
が沈澱した。ドライアイス／エタノール浴で凍結・融解
を数回繰り返し、次いでエッペンドルフ遠心機で１５分
間遠心した。チューブを注意深く傾斜して上清を除き、
ｍＲＮＡペレットを蒸留水２０μｌに懸濁させた。最終
収量はｍＲＮＡ約３０μｇであった。
【００８２】標準的方法を用いた第１鎖ｃＤＮＡを作成
した。すなわち、細胞膜ｍＲＮＡ１０μｇをｃＤＮＡ合
成反応混合液１００μｇ［３００ｍＭ−トリス（ｐＨ
９.４）、１４０ｍＭ−ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ−β−メル
カプトエタノール、各５００μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ、プライマーとしてオリゴ
−ｄＴ５μｇ（燐酸化、平均サイズ１２〜１８個）、32
ＰｄＣＴＰ１５０μＣｉ（４００Ｃｉ／ミリモル）、リ
ボヌクレアーゼ・インヒビターＲＮＡｓｉｎ２０単位、
含有］に希釈した。逆転写酵素１００単位を添加して反
応を開始し、４２℃で３０分間インキュベートした。Ｅ
ＤＴＡを４０ｍＭまで加えて反応を停止し、ＲＮＡを
０.２Ｍ−ＮａＯＨ中で６５℃で２０分間インキュベー
トすることによって分解した。２Ｍ−トリス（ｐＨ７.
４）２０μｌを加えて塩基を中和した。
【００８３】反応混合物をフェノール／クロロホルムで
抽出し、これを１０ｍＭ−トリス５０μｌ（ｐＨ７.
５）、１ｍＭ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）で逆抽出して、水層を
プールした。第１鎖ＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼＩのク
レノウ断片と反応液１００μｌ［５０ｍＭ−燐酸カリウ
ム（ｐＨ７.４）、２.３ｍＭ−ＤＴＴ、２−メルカプト
エタノール、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ2、各１５０マイクロ
モルづつの４種の三燐酸デオキシヌクレオチド、32Ｐ−
ｄＣＴＰ２５μＣｉ、含有］中で１２時間１６℃でイン
キュベートすることにより、２本鎖ｃＤＮＡに変換し
た。フェノール／クロロホルムで抽出することによって
反応を停止し、水層を１ｍｌのセファデックスＧ−５０
カラムに通すことにより組込まれなかった三燐酸エステ
ルを除去した。溶出した画分をプールし、エタノールで
沈澱させた。
【００８４】ｃＤＮＡペレットを冷エタノールで洗浄
し、次いでこれを、２０ｍＭトリス（ｐＨ８.０）、１
ｍＭ−ＥＤＴＡ、８０μＭ−Ｓ−アデノシルメチオニ
ン、ＥｃｏＲ１メチラーゼ３００単位の反応液２００μ
ｌに再懸濁して３７℃で６０分間インキュベートした。
フェノール／クロロホルム抽出によって反応を停止し、
メチル化されたｃＤＮＡをエタノール沈殿により捕集し
た。
【００８５】ｃＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗
浄し、これをＳ１緩衝液（マニマテイスら）２００μｌ
に懸濁し、Ｓ１−ヌクレアーゼ２００単位と３０℃で３
０分間インキュベートした。フェノール／クロロホルム
抽出によって反応を停止し、エタノール沈殿によりｃＤ
ＮＡを捕集した。２本鎖にしたｃＤＮＡを２５単位のク
レノウと２０ｍＭ−トリス（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ−
ＮａＣｌ、１０ｍＭ−２−メルカプトエタノール、各５
００μＭづつの４種の三燐酸デオキシヌクレオチドから
なる反応液１００μｌ中で３０分間室温でインキュベー
トすることにより、平滑化した。フェノール／クロロホ
ルム抽出によって反応を停止し、エタノール沈殿により
ｃＤＮＡを捕集した。
【００８６】Ｔ４リガーゼ緩衝液５０μｌ（マニエスタ
ら）中で、ｃＤＮＡとＲ１リンカー（ニュ・イングラン
ド・バイオラボから購入）（配列：ＰＣＧＧＡＡＴＴＣ
ＣＧ）５００ピコモルとを、Ｔ４リガーゼ２０００単位
を用いて１夜１６℃でインキュベートして連結した。７
０℃、２０分間インキュベートすることによって反応を
停止し、次いで、その最終濃度が０．１Ｍ−ＮａＣｌ、
１０ｍＭ−ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ−トリス−Ｃｌ（ｐＨ
７．４）となるように、この液を３００μｌに希釈し
た。次いでＥｃｏＲＩ７００単位でｃＤＮＡを２分間３
７℃で消化した。フェノール／クロロホルム抽出によっ
て反応を停止し、エタノール沈殿によりｃＤＮＡを捕集
した。そのペレットを再びＴＥ５０μｌに懸濁し、５ｍ
ｌのＣｌ−４Ｂカラムを通過させた。溶出する画分をプ
ールし、エタノールで沈殿させた。沈殿したｃＤＮＡの
トリス−酢酸緩衝液を臭化エチジウム１μｇ／ｍｌの存
在下に１％アガロース・ゲルで電気泳動した。標準的な
ガラス粉末法を用いて、５００〜４０００塩基対の大き
さのｃＤＮＡをゲルから単離した。溶出したｃＤＮＡを
フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿を
行い、得られたペレット（エタノール洗浄後）をＴＥ５
０μｌに再懸濁した。最終収量はｃＤＮＡ１００〜５０
０ｎｇであった。
【００８７】発現ベクターｐ９１０２３（Ｂ）の作成は
先に記載した。ＥｃｏＲ１で消化し、ホスファターゼ処
理をした該ベクター（５００ｎｇ）を１００ｎｇのｃＤ
ＮＡと反応液（標準Ｔ４リガーゼ反応液）１００μｌ中
で１６℃で１夜インキュベートして連結させた。フェノ
ール／クロロホルム抽出によって反応を停止し、ｔＲＮ
Ａ５μｇをキャリヤーとして添加後、エタノール沈殿に
より連結されたｃＤＮＡを捕集した。
【００８８】エタノールで沈殿させたｃＤＮＡを７０％
エタノールで洗浄した後、これをＴＥ１００μｌに懸濁
させた。このＤＮＡのアリコート４μｌを使用して、エ
シエリキア・コリＭＣ１０６１の形質転換を行った（１
００μｌの形質転換に４μｌを使用）。それぞれ１％寒
天、−ブロス、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを含有
する１５０ｍｍのペトリ皿（Ｔｅｔ平板）に、各２５個
づつの形質転換を塗布し、３７℃で１夜インキュベート
した。各平板毎に約２０００個のコロニーが発育し、合
計約５００００コロニーを得た。コロニーの直径が約
０．５ｍｍに達した後、平板表面に乾燥フィルターを注
意深く載せ、次いでこれをフィルターから静かに剥がす
ことにより、コロニーをニトロセルロース・ディスク
（１３７ｍｍ）へ移す。平板上のすべてのコロニーをフ
ィルターへ移したら、新たに調製したＴｅｔ平板へこの
フィルターを置く（コロニー側を上にして）。コロニー
を数時間発育させた後、各フィルター毎に、新しく濡ら
したフィルターを正確に元のフィルターに重ね、互いに
圧しつけた後、これを剥がして、各フィルターを新たに
調製Ｔｅｔ平板に戻し、平板を３７℃で１夜インキュベ
ートすることにより、各１枚づつのレプリカを作成し
た。各レプリカは、元のフィルターと再度揃えることが
できるように注意深く印をした。
【００８９】[第５段階]プラスミドＤＮＡプールの作成 ２５枚の各レプリカ・フィルターは、外科用メスを使用
して注意深く裁断し、元のマスター・フィルターに対す
る各方向を注意しながら８組の断片に分けた。各断片か
らコロニーを１０ｍｌのＬ−ブロスに塗布した。遠心に
よって菌を捕集し（ベックマンＪ−６型遠心機、３００
０ＲＰＭ、１０分間）、これを２５％蔗糖、５０−トリ
ス−塩酸（ｐＨ８．０）から成る溶液０．６ｍｌに再浮
遊させ、これに５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム０．１２ｍｌ
を加えて、氷上で５〜１０分間インキュベートすること
によりプロトプラストに変換させた。次ぎに、該プロト
プラストを室温で１０分間インキュベートした後、０．
５Ｍ−ＥＤＴＡ０．１２５ｍｌを加え、更に、１０％の
ＳＤＳの５０ｍＭ−トリス−塩酸（ｐＨ８．０）溶液
０．１２ｍｌを加えて、これを溶菌した。溶菌物を静か
に混合し、室温で１５分間インキュベートした後、５Ｍ
−ＮａＣｌ０．３ｍｌを加えて蛋白質および染色体ＤＮ
Ａを沈殿させた。氷上で１５分間インキュベート後、溶
菌物をエッペンドルフ遠心機で冷時３０分間遠心した。
【００９０】上清を注意深く除去すると粘着性のＤＮＡ
／蛋白質ペレットが残るので、これに水２．５ｍｌを加
えて希釈した。混合物を１ｍｌのフェノールで抽出し、
遠心により層別し（ソルボールＳＳ−３４型ローター、
１０Ｋ、１０分間）、水層を新しいチューブに採った。
５Ｍ−ＮａＣｌ０．５ｍｌおよび冷エタノール７．５ｍ
ｌを加え、ドライアイス／エタノール浴で混合物を数回
凍結することにより、ＤＮＡを沈殿させた。遠心によっ
て沈殿を捕集し（ソルボールＳＳ−３４型、１０Ｋ、１
５分間）、これを０．３Ｍ−酢酸ナトリウム０．３ｍｌ
に再懸濁し、エタノール１ｍｌを加えて再沈殿させた
（エッペンドルフ・チューブ中で行う）。ドライアイス
／エタノール浴に１０〜１５分間放置後、沈殿したＤＮ
Ａを遠心によって捕集し（エッペンドルフ、５分間）、
目的とするペレットを滅菌ＴＥ［１０ｍＭ−トリス（ｐ
Ｈ８）、１ｍＭ−ＥＤＴＡ］１００μｌに再懸濁した。
代表的な作成例から、５〜１０μｇのプラスミドＤＮＡ
が得られた。各試料は、元のフイルターの２００〜５０
０コロニーからのＤＮＡを含んでいた。２５枚のフィル
ターから合計２００個のＤＮＡ試料が作成された。
【００９１】［第６段階］ＣＳＦクローンの単離 第５段階で得られた各ＤＮＡ試料は、下記の記載のよう
に、それぞれ個別にサルＭ６ＣＯＳ細胞へ導入した。Ｍ
６細胞を、１０％加熱失活処理ウシ胎児血清（ＨＩＦＣ
Ｓ）を含有するダルベッコの修飾によるイーグル培地
（ＤＭＥ、ギブコ社より入手）に常法通り発育させ、１
週間に２回、１：６の希釈で分割する。Ｍ６細胞は、
１：６に分割して２４時間後がトランスフェクションし
易い。導入する２４時間前に、１.２×１０8個のＭ６細
胞（１：６分割）を、ＤＭＥ＋１０％ＨＩＦＣＳ液１.
５ｌから成るセル・ファクトリー（ヌンク社から入手）
へ播種する。トランスフェクション直前に、平板を吸引
し、血清を含んでいない（ＳＦ）ＤＭＥ７ｍｌで２回洗
浄する。ＤＮＡを０.１Ｍ−トリス（ｐＨ７.３）に溶解
し、２ｍＭ−グルタミン、ストレプトマイシン１００μ
ｇ／ｍｌ、ペニシリン１００単位／ｍｌおよびＤＥＡＥ
−デキストラン０.２５ｍｇ／ｍｌを含有するＤＭＥ培
地をこれに加えてトリス−ＤＮＡ溶液の全容量が４ｍｌ
となるように調製する。溶解したＤＮＡを含有している
培地４ｍｌを、Ｍ６ＣＯＳ細胞を含有する平板に加え１
２時間インキュベートする。
【００９２】インキュベーション終了後、ＳＦ−ＤＭＥ
７ｍｌで細胞を１〜２回洗浄する。これに１０％ＨＩ−
ＦＳＣ、ペニシリン１００単位／ｍｌ、ストレプトマイ
シン１００μｇ／ｍｌ、２ｍＭ−グルタミンおよび０.
１ｍＭ−クロロキンを含有するＤＭＥ５ｍｌを加え、細
胞を２ １／２時間インキュベーションした。２ １／
２時間後、ＳＦ−ＤＭＥで１回洗浄し、次いで、平板１
枚当たりＤＭＥ＋１０％ＨＩＦＣＳ１０ｍｌを加える。
３０時間後、培地を吸引し、次いで平板１枚当たりＤＭ
Ｅ＋１０％ＨＩＦＣＳ４ｍｌを追加する。更に２４〜２
６時間インキュベーション後、調整培地を回収する。
【００９３】トランスフェクションした各培地は、ＫＧ
−１検定を用いてＣＳＦ活性を検定した。ＣＳＦ活性が
陽性の場合は、試料毎に対応するマスター・フイルター
のクローンを確認しなければならない。例えば、ＣＳＦ
活性の形質導入陽性が１つあれば、このトランスフェク
ションＤＮＡが誘導された元のマスター・フイルター切
片のすべてのコロニーを拾い上げた。これらのコロニー
の３２０個を、ブロス＋テトラサイクリン１０μｇ／ｍ
ｌから成る培地３ｍｌへ拾い上げた。３２０個のコロニ
ーを１８×１８のマトリックスに配置した。各横の行お
よび縦の列毎に１つづつプールを作成した（合計３６プ
ール）（但し、最後の横の行は１４個である）。プール
した各培養からＤＮＡ試料を作成し、これを使用してＣ
ＯＳ細胞へ導入した。これらのトランスフェクシヨンの
上清について、ＫＧ−１・コロニー検定を用い、検定し
た。このトランスフェクシヨンの組合せから、２つの陽
性試料が得られた。その１つは縦の列であり、もう１つ
は横の行であった。この２つのプールに共通している培
養はＣＳＦクローンを含んでいる。
【００９４】この培養から１２個の独立したクローンを
単離し、先に記載の通り、Ｌ−ブロスの１０ｍｌ培養か
ら小規模生産ＤＮＡを作成した。これらの標品から得た
１０μｌのＤＮＡ試料をＥｃｏＲ１で消化し、得られた
ＤＮＡ断片をアガロース・ゲル電気泳動により分析し
た。１２個のクローンのうち９個に、共通した約７５０
塩基対の挿入体があった。これらのクローンの４個から
得たＤＮＡと、残りの３個のクローンのＤＮＡを、前記
のようにＭ６ＣＯＳへ導入した。これらのトランスフェ
クシヨンの上清について、ＫＧ−１および骨髄によるＣ
ＳＦ検定を用いて検定を行なった。何れの検定でも、７
５０ｂｐ断片を含んでいる４個のクローンは、すべてＭ
６ＣＯＳ細胞によって高濃度のＣＳＦ活性を発現される
が、一方、他の３個のクローンでは発現されないことが
明らかになった。従って、ＣＳＦの暗号領域は７５０ｂ
ｐの挿入体内に位置しているに相違ない。
【００９５】陽性クローンをＥｃｏＲ１で消化すること
により、ＣＳＦを暗号化しているＤＮＡを形質転換ベク
ターから脱離し、この断片をＭ１３にサブクローンし、
標準的なジデオキシ配列決定法を用いて配列決定を行な
い、図１に示した配列を得た。ＣＯＳ細胞において、Ｃ
ＳＦ発明を指示することが最初に解明されたプラスミド
ｐ９１０２３（Ｂ）−ＣＳＦをｐＣＳＦ−１と命名し
た。このプラスミドは、エシエリキア・コリのＭＣ１０
６１株として、寄託番号ＡＴＣＣ３９７４のもとに１９
８４年７月２日、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（ＡＴＣＣ）に寄託された。
【００９６】［第７段階］ＣＳＦ蛋白質の発現 第６段階で単離した、ＣＳＦ／ｃＤＮＡを含有している
ベクターｐ９１０２３（Ｂ）を導入したサルのＭ６ＣＯ
Ｓ細胞を、第６段階の記載のように培地に発育させ、Ｃ
ＳＦ蛋白質を生産させた。
【００９７】即ち、このＤＮＡ（ｐＣＳＦ−１）の１ｍ
ｇを０.１Ｍ−トリス（ｐＨ７.３）１ｍｌに溶解し、こ
れに２ｍＭ−グルタミン、１００単位／ｍｌストレプト
マイシン、１００μｇ／ｍｌペニシリン（Ｐ／Ｓ）、
０.２５ｍｇ／ｍｌＤＥＡＥ−デキストラン（分子量５
０００００、ファルマシア社製）を含有するＤＭＥ６０
０ｍｌを加えた。６００ｍｌのＮＤＡ−ＤＥＡＥ−デキ
ストラン溶液をセル・ファクトリー内でＭ６ＣＯＳ細胞
に加え、３７°で１２時間インキュベーションした。イ
ンキュベーション後、細胞をＳＦ−ＤＭＥ９００ｍｌで
１回洗浄し、次いで０.１ｍＭ−クロロキン、１０％Ｈ
ＩＦＣＳ、２ｍＭ−グルタミンおよびＰ／Ｓを含有して
いるＤＭＥ６００ｍｌと２.５時間インキュベートす
る。クロロキンを含有している培地を吸引後、細胞をＳ
Ｆ−ＤＭＥで洗浄し、新たに１０％ＨＩＦＣＳを含有す
るＤＭＥ１５００ｍｌを加えて培養する。３０時間後、
細胞をＳＦ−ＤＭＥで洗浄し、培地をＳＦ−ＤＭＥ８０
０ｍｌと置き換え、この培地で２４時間３７℃で放置し
てコンデショニングする。調整培地を吸引し、新たにＳ
Ｍ−ＤＭＥ８００ｍｌと置き換える。細胞を２４時間放
置して、この培地でコンデショニングし、次いで調整培
地を捕集する。できるだけ回収した後、アミコン２.５
ｌチェンバーでＹＭＳメンブランを使用し、加圧限外濾
過によって、この調整培地試料を２０倍に濃縮する（分
子量５０００でカットオフ）。
【００９８】［第８段階］組換え体ＣＳＦの精製 濃縮した調製培地２００ｍｌ（第７段階、原材料４ｌか
ら）に固体塩化アンモニウムを加えて、３０％飽和濃度
とし、沈澱する蛋白質を遠心によって捕集した。更に、
その上清に固体塩化アンモニウムを追加して、８０％飽
和濃度とし、沈澱する蛋白質を遠心により捕集した。ペ
レットを１Ｍ−ＮａＣｌ含有の２０ｍＭ−クエン酸ナト
リウム（ｐＨ６.１）５ｍｌに再懸濁した。溶解した蛋
白質を、これと同じ緩衝液で飽和したウルトロゲルＡｃ
Ａ５４の１.６×１００ｃｍカラムに掛けた。見掛けの
分子量が１９Ｋダルトンまたは溶出液が約９０ｍｌとな
った後、ＣＳＦ活性をカラムから溶出した。ゲル濾過を
低いイオン強度で行なうとカラムから溶出するＣＳＦ活
性は約１９Ｋダルトンと３８Ｋダルトンの２つの見掛け
分子量の位置に現われ、ＧＭ−ＣＳＦが２量体を生成し
易いことを示している。活性画分をプールし、０.１５
％ＴＦＡ濃度とし（１０％ＴＦＡを加えることによっ
て）、これを０.１％ＴＦＡで飽和したビダックＣ４カ
ラム（０.４６×２５ｃｍ）へ掛けた。カラムをアセト
ニトリル０→９０％の濃度勾配の０.１％ＴＦＡで展開
した（１ｍｌ／分、全量３４０ｍｌ）。
【００９９】ＣＳＦ活性はアセトニトリル濃度３９〜４
３％（画分１６〜２０）で溶出した画分１９の試料２０
ｍｌをＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によっ
て分析した［ゲル濃度１３.５％、ラミリ、ネーチャ
ー、２２７巻、６８０頁（１９７０年）］。見掛けの分
子量１８〜２６Ｋダルトンの単一な蛋白質の幅広いバン
ドが観察された。ＣＳＦのこのやや幅広いサイズ幅は糖
蛋白質に共通した像であって、広範囲に変化する炭水化
物の付加によるものである。１９画分の蛋白質は、応用
生物系微量アミノ酸気相分析装置によりエドマン分解を
うける。約２０μｇの蛋白質を適用し、最初の１６個の
アミノ酸配列は（Ａ−Ｐ−Ａ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｓ−Ｐ−Ｓ
−Ｔ−Ｑ−Ｐ−Ｗ−Ｅ−Ｈ）であった。高収量で得られ
るこの単一な蛋白質のアミノ酸配列から、１９画分のＣ
ＳＦ蛋白質は同質性に生成されていることが示唆され
る。生物検定で、１９画分はＡ280の吸収１単位当たり
３×１０7単位であった。標準品蛋白質の水溶液では、
蛋白質１ｍｇ当たりの吸光度Ａ280における吸収は０.８
〜１.２単位であるから、ヒトの骨髄細胞によって検定
した精製蛋白質の比活性は約１×１０7〜約４×１０7単
位／ｍｇである。
【０１００】［実施例Ｂ］ギボンＣＳＦのクローン形成 ［第１段階］ギボンＴ細胞からｍＲＮＡの作成 ＵＣＤ−ＭＬＡ１４４という名のギボンＴ細胞系試料
を、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含んでいるＲＰＭ
Ｉ１６４０（ギブコ社から購入）で全細胞数が１×１０
9となるまで数週間培養した。ＲＰＭ Ｉ１６４０＋１
％ＦＣＳ１ｍｌ当たりに、１２−０−テトラデカノイル
ホルボール−１３−アセタート（ＴＰＡ）１０ｎｇの存
在下に細胞を２４時間賦活し、高濃度のＣＳＦを生産す
るよう誘導した。遠心によって細胞を回収し（１０００
ＲＰＭ、１５分間）、燐酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で１回
洗浄し、更に延伸して細胞を捕集した。実施例Ａに記載
したＭｏ細胞ＲＮＡの作成と同じ方法を用いて、これら
の細胞から、細胞膜に結合しているポリソーム（ＭＢ
Ｐ）ｍＲＮＡを作成した。
【０１０１】［第２段階］第１鎖ｃＤＮＡ反応 ＭＢＰ−ｍＲＮＡ（第１段階）６μｇを合成反応混合液
（実施例Ａ、第４段階、参照）５０μｌに希釈し、逆転
写酵素を添加して反応を開始した。４２℃で３０分間イ
ンキュベーションした後、ＥＤＴＡを５０ｍＭまで加え
ることにより反応を停止し、水を加えて１００μｌとな
るよう希釈した。混合物をフェノール／クロロホルム、
次いでクロロホルムで抽出した。２ｍｌのセファロース
ＣＬ−４Ｂカラムでクロマトグラフィーを行ない組込ま
れなかった三燐酸エステルからｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブ
リッドを分離した。溶出画分をプールし、エタノール沈
澱によりハイブリッドを捕集した。最終収量５７０ｎｇ
であった。
【０１０２】［第３段階］第２鎖ｃＣＮＡ反応 第１鎖ｃＤＮＡペレット（第２段階）を水５０ｍｌに懸
濁し、エシエリキア・コリ・ポリメラーゼＩ、エシエリ
キア・コリ・リガーゼ、およびリボヌクレアーゼＨを含
んだ標準反応混合液を用いて第２鎖合成を実施した。反
応液を１６℃で１夜インキュベートし、次いで３７℃で
１時間インキュベートした。ＥＤＴＡを加えて反応を停
止し、フェノール／クロロホルムで抽出した。セファロ
ースＣＬ−４Ｂカラムでクロマトグラフィーを行ない組
込まれなかった三燐酸エステルからｃＤＮＡを分離し、
溶出画分をプールし、エタノール沈澱によりｃＤＮＡを
捕集した。
【０１０３】［第４段階］組換え体ｃＤＮＡ作成 ｃＤＮＡペレット（第３段階）を水７５μｌに懸濁し
た。末端転移酵素を含んでいる標準反応液２５μｌへ、
このｃＤＮＡ溶液を加え、３０℃で５分間インキュベー
トすることによってｃＤＮＡの末端にホモポリマー性Ｃ
「尾部」を付加した。ＥＤＴＡを４０ｍＭ加え、６８℃
で１０分間加熱して失活させることによって反応を停止
した。尾部化を行なったこのｃＤＮＡ１０ｎｇに、１０
ｍＭ−トリス（ｐＨ７.５）、１ｍＭＥＤＴ、１００ｍ
Ｍ−ＮａＣｌから成る液１０μｌ中でＧ尾部化ｐＢＲ３
２２（ネン社より購入）をアニーリングした。アニーリ
ング反応は６８°で１０分間、次いで５７°で２時間イ
ンキュベートすることによって行なった。
【０１０４】［第５段階］細菌の形質転換 エシエリキア・コリＭＣ１０６１株をＬ−プロスに発育
させ、氷上で冷却し、遠心して回収し、形質転換に用い
るためＣａＣｌ2で処理した。次いで、アニーリング反
応を行なったｃＤＮＡ５μｌをＣａＣｌ2処理細菌２０
０μｌとインキュベートした。アニーリングをしたｃＤ
ＮＡをすべて使用して、そのような形質転換を１５回行
ない、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを含有した１５
ｃｍの１％寒天Ｌ−ブロス平板上に、これらを拡げた。
各平板に、それぞれ約１０００コロニーが発育した。
【０１０５】［第６段階］レプリカ培養 形質転換によって得られた１００００個のコロニーを、
それぞれつま揚子で拾い上げ、新たに調製した平板に移
し（１平板当たり５００個、碁盤目状に）、３７℃で１
夜発育させた。乾燥したニトロセルロース・フィルター
を平板表面上にしっかりと圧しつけることによって、各
プレートからコロニーを拾い上げた。このマスター・フ
ィルター１枚から、それぞれ２枚づつのレプリカ・フィ
ルターを作成した。マスター・フロルターは４℃で貯蔵
し、一方、レプリカ・フィルターは塩基で処理し、焙焼
してハイブリッド形成用に調製した。
【０１０６】［第７段階］32Ｐ−標識ハイブリダイゼー
ション・プローブの作成 制限酵素ＥｃｏＲ１による制限消化と、トリス酢酸およ
び臭化エチジウムを用いたアガロース・ゲル電気泳動に
よって、ｐＣＳＦ−１からｃＤＮＡ挿入体を単離した。
ゲルから、ｃＤＮＡ断片を含んでいるバンドを切り出
し、ガラス粉末法により精製した。ｃＤＮＡ断片３００
ｎｇを１０×Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液［０.３３
Ｍ−トリス酢酸（ｐＨ７.９）、０.６６Ｍ−酢酸カリウ
ム、０.１Ｍ−酢酸マグネシウム、１０ｍＭ−ジチオト
レイトール］１μｌおよびＴ４ＤＮＡポリメラーゼ３単
位（ニュー・イングランド・バイオラブズ）へ加え、こ
れを水１０μｌで希釈した。３７℃で５〜１０分間イン
キュベートした後、この混合物を１０×Ｔ４ＤＮＡポリ
メラーゼ緩衝液１μｌ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ
の各２ｍＭ溶液１μｌづつ、32Ｐ−ｄＡＴＰ１０μｌ
（１０μＣｉ／μｌ、３０００Ｃｉ／ミリモル）、Ｔｒ
ＤＮＡポリメラーゼ３単位と混合した。３７℃で２０分
間インキュベートして反応を行なった。次いで２ｍＭ−
ｄＡＴＰ１μｌを加え、更に１０分間３７℃で反応液を
インキュベートした。
【０１０７】セファデックスＧ１００カラムを用いたク
ロマトグラフィーによって、組込まれなかった三燐酸エ
ステルを標識ｃＤＮＡから分離した。下試の配列： ＡＴＣ ＴＣＧ ＣＴＧ ＣＡＣ ＡＧ を有する合成オリゴヌクレオチドから第２のプローブを
作成した。この配列はＣＳＦ暗号領域のアミノ末端と相
補的である。このオリゴヌクレオチドは、標準的なポリ
ヌクレオチドキナーゼ反応によってその５'−末端に32
Ｐ−ｄＡＴＰを標識した。
【０１０８】［第８段階］ＣＳＦ−ｃＤＮＡクローンの
単離 標準的なハイブリダイゼーション・スクリーニング手法
によって、４５個のクローンをＴ４標識ｐＣＳＦ−１
ｃＤＮＡでハイブリダイゼーションした。これらのう
ち、約２０個は更にハイブリダイゼーションしてオリゴ
ヌクレオチド標識プローブとした。これらのうちの１個
について、その暗号領域の配列決定を行なった。その配
列データから、多くの塩基置換が見受けられ、その幾つ
かは発現蛋白質におけるアミノ酸の相違を生じる。図１
において、実施例ＡでクローニングしたヒトＣＳＦ遺伝
子のＤＮＡ配列の上にこれらの差異を示した。
【０１０９】［実施例Ｃ］末梢血リンパ球ｍＲＮＡから
のＣＳＦクローニング［第１段階］末梢血リンパ球から
のｍＲＮＡ調製 ４本のプラズマフェレーゼ（血漿搬出）副産物（赤十字
から購入）をフイコール／ハイパーク濃度勾配法によっ
て分別し、末梢リンパ球を調製した。５％ウシ胎児血
清、０.１７％フイトヘマグルチニンおよび１０ｎｇ／
ｍｌホルボール・ミリステート・アセテート（ＰＭＡ）
の存在下に、低密度ＲＰＭＩ−１６４０が２×１０6細
胞／ｍｌの密度で得られた（合計６×１０9細胞）。細
胞を遠心によって捕集し（１０００ＲＰＭ、５分間）、
燐酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で１回洗浄し、もう一度遠心
によって捕集した。細胞を冷トリトン細胞溶解緩衝液５
０ｍｌ［１４０ｍＭ−ＮａＣｌ、１.５ｍＭ−ＭｇＣ
ｌ2、１０ｍＭ−トリス（ｐＨ８.６）、０.５％トリト
ンＸ−１００］に懸濁させ、１０ｍＭ−ジチオトレイト
ール（ＤＴＴ）および５０単位／ｍｌＲＮＡ ｓｉｎ
（バオテック社より購入）で行なう緩和な溶解手法によ
って細胞質ＲＮＡを調製した。
【０１１０】この分解物を２等分し、それぞれ２０％蔗
糖を含有している溶解緩衝液１０ｍｌの層の上に重層し
た。細胞核は冷時、遠心によって除去した（４℃、４０
０ＲＰＭ、５分間）。上層（細胞質抽出分）を注意深く
捕集し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を最終濃度
が１％となるように添加した。この溶液を等容積のフェ
ノール／クロロホルム混合物（１：１）で２回抽出し、
冷エタノール２.５容積を加えてＲＮＡを沈澱させた。
沈澱したＲＮＡを遠心によって捕集し（４０００ＲＰ
Ｍ、１５分間）、更にこれを０.１５Ｍ−トリス（ｐＨ
７.５）、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、０.２５Ｍ−ＮａＣｌ（Ｔ
Ｅ緩衝液＋０.２５Ｍ−ＮａＣｌ）に再懸濁し、冷エタ
ノール２.５容積を加えて再沈澱させた。最後に、遠心
によってＲＮＡを捕集し、水５ｍｌに懸濁した。最終収
量７.５ｍｇであった。
【０１１１】オリゴｄＴセルロースで選び出すことによ
って、全細胞質ＲＮＡからメッセンジャーＲＮＡを単離
した。全ＲＮＡ２.５ｍｇを６５°で５分間加熱した。
０.５ＭとなるようにＮａＣｌを加え、ＲＮＡが室温に
戻るまで放冷した。このＲＮＡをＴＥ＋０.５Ｍ−Ｎａ
Ｃｌ（結合緩衝液）で飽和した１ｍｌのオリゴｄＴセル
ロースに通過させた。結合緩衝液でカラムを十分に洗
い、結合していないＲＮＡを除去した。結合しているメ
ッセンジャーＲＮＡは水３ｍｌで溶出し、４Ｍ−ＮａＣ
ｌ０.２ｍｌおよび２.５容積の冷エタノールを加えるこ
とによって沈澱させた。沈澱したｍＲＮＡを遠心によっ
て捕集した（２５０００ＲＰＭ、３０分間）。最終ペレ
ット（約１００μｇ）は水５０μｌに懸濁した。
【０１１２】［第２段階］第２鎖ｃＤＮＡ反応 ＰＢＬ（末梢血リンパ球）のｍＲＮＡ２０μｇをｃＤＮ
Ａ合成反応液５０μｌ［１００ｍＭ−トリス（ｐＨ８.
４）、１４０ｍＭ−ＫＣｌ、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ2、１
０ｍＭ−２−メルカプトエタノール、ｄＡＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰそれぞれ４００μＭ、プライマ
ーとしてオリゴｄＴ５μｇ（平均サイズ１２〜１８
個）、32Ｐ−ｄＣＴＰ２５μＣｉ（４００μ・Ｃｉ／ミ
リモル）およびリボヌクレアーゼ・インヒビターＲＮＡ
ｓｉｎ ２０単位、含有］に希釈した。３７℃で逆転写
酵素６０単位を添加することによって反応を開始し、４
２℃で３０分間インキュベートした。４０ｍＭとなるま
でＥＤＴＡを加えることによって反応を停止し、フェノ
ールを飽和した等溶積の水で抽出した。フェノール層を
ＴＥ緩衝液５０μｌで逆抽出した。水層をプールした。
プールした水層は、ＴＥを飽和したセファロースＣＬ−
４Ｂ（シグマ社より購入）の５ｍｌカラムを通過させる
ことによって、組込まれなかった三燐酸エステルからｃ
ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを分離した。カラムから溶
出する画分をプールし、ＮａＣｌを加えて２５０ｍＭと
し、２.５容積を冷エタノーを加えて核酸を沈澱させ
た。遠心によりハイブリッドを捕集した（４００００Ｒ
ＰＭ、３０分間）。最終ペレット（ｃＤＮＡ２.５μ
ｇ）は水５０μｌに懸濁した。
【０１１３】［第３段階］第２鎖ｃＤＮＡ反応 エシエリキア・コリＤＮＡポリメラーゼ、エシエリキア
・コリＤＮＡリガーゼおよびエシエリキア・コリＲＮＡ
ｓｅＨの各酵素の組合わせ作用により、第２鎖ｃＤＮＡ
を合成した。反応混合液（５０μｌ）は、２０ｍＭ−ト
リス（ｐＨ８.０）、４ｍＭ−ＭｇＣｌ2、１.２ｍＭ−
ＥＤＴＡ、２５μＭ−ＮＡＤ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、ｄＴＴＰそれぞれ１００μＭづつ、および32Ｐ
−ｄＣＴＰ５０μＣｉ（３０００Ｃｉ／ミリモル）を含
んでいる。ＤＮＡポリメラーゼＩ３単位、ＤＮＡリガー
ゼ０.５単位、ＲＮＡｓｅＨ０.７５単位を添加し、１６
°で１８時間、次いで３７°で１時間インキュベートす
ることによって反応を行なった。ＥＤＴＡを加えて４０
ｍＭとして反応を停止し、等容積のフェノールを加えて
抽出を行なった。フェノール層をＴＥ５０μｌで逆抽出
し、水層をプールし、前記（第１鎖反応）で記載のよう
にセファロースＣＬ−４Ｂカラムを用いるクロマトグラ
フィーによって、組込まれなかった三燐酸エステルから
ｃＤＮＡを分離した。32Ｐの取り込みに基づき、第１鎖
ｃＤＮＡは定量的に２本鎖の形態に変換された。
【０１１４】［第４段階］組換え体ｃＤＮＡ作成 ｃＤＮＡ４００ｎｇを反応混合液５０μｌ［１ｍＭ−２
−メルカプトエタノール、１ｍＭ−ＣＯＣｌ2、および
ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラ
ーゼ９単位、含有］中で、３０℃で５分間緩和に加熱す
ることにより、ｃＤＮＡの末端にホモポリマーＣ「尾
部」を付加した。４０ｍＭまでＥＤＴＡを加え、６０℃
で１０分間加熱することによって反応を停止した。反応
液１００μｌ［１０ｍＭ−トリス（ｐＨ７.５）、１ｍ
Ｍ−ＥＤＴＡ、１００ｍＭ−ＮａＣｌ］中で、この尾部
化を行なったｃＤＮＡ２００ｇにＧ−尾部化ｐＡＴ１５
３（アマーシャム社より購入）５００ｎｇをアニーリン
グした。アニーリング反応は、予備的に６８℃で５分間
インキュベートした後、５７℃で２時間行なった。
【０１１５】［第５段階］細菌の形質転換 ｃＤＮＡアニリング反応生産物を使用し、直接これをエ
シエリキア・コリＭＣ１０６１株に導入した。細菌細胞
の新鮮なコロニーを用いてＬ−ブロス５０ｍｌに播種
し、５５０ｎｍにおける光学密度が０.２５となるま
で、数時間発育させた。細胞を氷上で冷却し、遠心によ
り回収した（２０００ＲＰＭ、１０分間）。そのペレッ
トを冷０.１Ｍ−ＣａＣｌ2溶液１０ｍｌに懸濁し、氷上
で１０分間静置した。細胞を遠心によって捕集し（２０
００ＲＰＭ、５分間）、再び０.１Ｍ−ＣａＣｌ2 ２.
５ｍｌに懸濁した。次いで、ｃＤＮＡのアニーリング反
応物１０μｌとＣａＣｌ2処理細菌２００μｌとを氷上
で３０分間、次いで３７℃で２分間インキュベートし、
次にＬ−ブロス０.８ｍｌを加えて最終的に３７℃で３
０分間インキュベートした。
【０１１６】アニーリングしたｃＤＮＡをすべて使用
し、このような形質転換を２０回行なった。各形質転換
混合物を、それぞれテトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを
含有する１％寒天Ｌ−ブロス平板（直径１５ｃｍ）に拡
げた。２０個の形質転換から、合計２０個のそのような
平板を作成し、これらを３７℃で１夜インキュベートし
た。各平板に平均約１５００個の細菌コロニーが発育
し、合計３００００コロニーであった。
【０１１７】［第６段階］レプリカ培養 感想した１３７ｍｍのニトロセルロース・フイルターを
コロニーの表面部に押しつけ、これを平板から持ち上げ
ることによって、各平板に増殖した元のコロニーをニト
ロセルロースに移した。標準的なレプリカ培養方法によ
ってこのフイルターから、それぞれ２枚の同じレプリカ
を作成した。即ち、元となる各フイルターを正方形のガ
ラス片上に静置した正方形の滅菌濾紙（ワットマン３Ｍ
Ｍ）上に、コロニー側を上にして注意深く置く。あらか
じめ湿らせた新しいニトロセルロース・フイルターを、
注意深くマスター・フイルターの上に揃え、第２の正方
形の滅菌濾紙をその上にかぶせ、完全にサンドイッチに
したものを、更に第２のガラス片を載せてしっかり押さ
えつけた。サンドイッチにしたフイルターに番号を付
し、また、将来それらを正しく揃えることができるよ
う、各フイルターの非対称の位置に３個のピンホールを
あけた。レプリカをマスター・フイルターから除き、テ
トラサイクリンを含有している新しいＬ−プロス寒天板
にコロニー側を上にして置いた。同様の方法で、すみや
かに第２のレプリカを作成した。各マスター・フイルタ
ーを平板に戻し、すべての平板は、細菌コロニーの直径
が１ｍｍに達するまで、数時間３７°でインキュベート
した。元となるマスター・フイルターは、４℃で貯蔵
し、レプリカは下記のハイブリッド形成用として、使用
した。
【０１１８】［第７段階］ハイブリダイセーション用フ
イルターの調製 ０.５Ｍ−ＮａＯＨ、１.５Ｍ−ＮａＣｌに浸した濾紙
（ワットマン３ＭＭ）の上に各レプリカ・フイルター
（第６段階）をコロニー側を上にして７分間載せた。フ
イルターを、１Ｍ−トリス（ｐＨ７.５）、１.５Ｍ−Ｎ
ａＣｌに浸した中和濾紙に２分間移し、次いで第２の中
和濾紙のセットに５〜１０分間移した。最後に、フイル
ターをＳＳＣ緩衝液［０.０１５Ｍ−クエン酸ナトリウ
ム、０.１５Ｍ−ＮａＣｌ（ｐＨ７.４）］に浸したフイ
ルター上に５分間放置し、自然乾燥し、真空で８０℃で
１〜２時間ベイクした。
【０１１９】［第８段階］ＣＳＦ／ｃＤＮＡクローンの
単離 前記の実施例Ｂに記載のように、複製フイルターから放
射性標識ｐＣＳＦ−１／ｃＤＮＡ挿入体でプローブを作
成した。そのうち約２０個のコロニーがｃＤＮＡでハイ
ブリッドを形成した。これらのうち１２個をマスター・
フイルターから拾い、更に分析を行なうため、Ｌ−ブロ
スで１夜発育させた。これらのクローンから得られたＤ
ＮＡ試料（迅速調製）の制限酵素（Ｐｓｔ１）による消
化物のうちの３個は、ほとんど完全な鎖長を有してい
た。これらのうちの１個について配列決定を行なった。
このクローンの、ＣＳＦ暗号領域配列はｐＣＳＦの対応
する配列と同一であった［即ち、３６５の位置にＴを有
するＣＳＦ（Ｉｌｅ）］。
【０１２０】［実施例Ｄ］ Ｍｏ細胞系からのＣＳＦの精製 Ｍｏ細胞系に随伴するＨＴＬＶ−ＩＩウイルスを失活さ
せるために、血清を含んでいないＭｏ調整培地（４０
ｌ）を５５℃で３０分間インキュベートした。１０００
０分子量をカット・オフするメンブラン・フロルタＰＴ
ＧＣ［０.１３９平方米（１.５平方フィート）］を有す
るペリコン・カセットを使用する加圧式限外濾過によ
り、この培地を濃縮した。更に、硫酸アンモニウム沈澱
（８０％飽和）により蛋白質を濃縮した。最終蛋白質ペ
レット（８００ｍｇ）を２０ｍＭ−トリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン塩酸塩トリス−塩酸）（ｐＨ７.
４）１００ｍｌに再懸濁し、これと同じ緩衝液で透析し
た（各回４ｌづつ、３回変える）。透析した蛋白質を、
これと同じ緩衝液で飽和したＤＥＡＥ［（ジエチルアミ
ノエチル）−ウルトロゲル］２.５×１０ｃｍのカラム
に掛けた。カラムを２０ｍＭ−トリス−塩酸（ｐＨ７.
４）８００ｍｌで洗浄し、次いで０.１２Ｍ−ＮａＣｌ
を含有した２０ｍＭ−トリス−塩酸（ｐＨ７.４）８０
０ｍｌでＣＳＦ活性を溶出した。１０ｍｌ画分を捕集
し、ＣＳＦを検定した。
【０１２１】活性画分（３）をプールし、加圧式限外濾
過（アミコンＹＭＳメンブラン、５０００分子量でカッ
ト・オフ）により６倍（５ｍｌ）に濃縮した。ＤＥＡＥ
カラムで濃縮した試料を、２０ｍＭ−Ｎ−２−ヒドロキ
シエチルピベラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（ＨＥ
ＰＥＳ）（ｐＨ７.５）、５０ｍＭ−ＮａＣｌ、０.０１
％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−８０００）で飽和
したＡｃＡ４４ウルトロゲル（１０〜１３０Ｋダルトン
の分別能を有するアクリルアミド・アガロース・ウルト
ロゲル）の１.６×１００ｃｍカラムに掛けた。ＣＳＦ
活性は見掛けの分子量３０Ｋダルトンでカラムから溶出
した。活性画分をプールし、１０％トリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ）を加えることによって０.１５％ＴＦＡ濃度
（Ｖ／Ｖ）とし、これをビダックＣ４逆相カラム（１×
２５ｃｍ）に掛けた。
【０１２２】０.１％ＴＦＡ（Ｖ／Ｖ）中、アセトニト
リル０→９０％の直線勾配で、４ｍｌ／分の速度でカラ
ムを展開した（合計１０００ｍｌ）。アセトニトリル約
４７％（Ｖ／Ｖ）の濃度でＣＳＦ活性が溶出された。
０.１５％（Ｖ／Ｖ）ヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）
をプールした活性画分の１／２容積加えることによって
０.０５％（Ｖ／Ｖ）ＨＦＢＡ濃度とし、０.１５％（Ｖ
／Ｖ）ＨＦＢＡで飽和したビダックＣ４カラム（０.４
６×２５ｃｍ）に掛けた。０.１５％（Ｖ／Ｖ）ＨＦＢ
Ａ中、アセトニトリル０→９０％（Ｖ／Ｖ）の直線勾配
で、１ｍｌ／分の速度でカラムを展開した（合計３４０
ｍｌ）。ＣＳＦ活性はアセトニトリル約５３％（Ｖ／
Ｖ）の濃度で溶出された。画分３７〜４４（各１ｍｌ）
で活性が認められた。
【０１２３】画分４０の０.１５ｍｌを４倍に濃縮し
（サバント・スピード・バック濃縮機使用）、２×ＳＤ
Ｓゲル試料緩衝液［０.１２５Ｍ−トリス−塩酸（ｐＨ
６.８）、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０.０４％
ブロムフェノール・ブルー］４０μｌを加えた。これら
の試料を２分間沸とうさせ、１３.５％ＳＤＳゲルに適
用した［ラムリ、ネーチャー、２２７巻、６８０頁（１
９７０年）］（図２参照）。測定の結果、画分（＃４
０）は１１００００骨髄ＣＳＦ単位／ｍｌであった。こ
れはＡ280吸収単位当たり、約３.０×１０7単位に相当
する。代表的な蛋白質は１ｍｇ当たり、０.８〜１.２Ａ
280単位の吸光係数を有するので、骨髄検定で、精製し
たＣＳＦは約１×１０7〜約４×１０7単位／ｍｇの比活
性を示した。精製したＧＭ−ＣＳＦの試料１μｇで応用
生物系微量アミノ酸気相配列決定装置を有するエドマン
分解を行なった。残基３から５までの配列はＡｌａ Ａ
ｒｇＳｅｒと決定した。
【０１２４】［実施例Ｅ］文献記載のようにプロトプラ
スト融合により［サンドリ・ゴールディンら、モレキュ
ラー・セル・バイオロジー、１巻、７４３〜７５２頁
（１９８１年）］、ＣＨＯ細胞におけるＣＳＦ配列、プ
ラスミドｐ９１０２３（Ｂ）−ＣＳＦの同時形質転換
（コトランスホーメーション）および増幅をＤＨＦＲ欠
乏ＣＨＯ細胞ＤＵＫＸ−Ｂ１１［チェージンおよびアー
ラウブ、プローシーディング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、
７７巻、４２１６頁（１９８０年）］へ導入した。ＣＨ
Ｏ細胞の発育および維持に関しては、カウフマンおよび
シャープ［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー、１５０巻、６０１〜６２１頁（１９８１年）］の
記載がある。プロトプラスト融合のために、ｐ９１０２
３（Ｂ）−ＣＳＦ−１をエシエリキア・コリＨＢ１０１
株に導入し、０.５％カザミノ酸、０.４％グルコース、
０.０１２％ＭｇＳＯ4、５μｇ／ｍｌチアミンおよび１
０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有しているｍ９塩５
０ｍｌに細菌を発育させ、６００ｎｍの吸光度０.６を
示すまで増殖した。
【０１２５】クロラムフェニコールを加えて２５０μｇ
／ｍｌとし、プラスミド・コピー数を増幅するため、培
養を更に１６時間３７℃でインキュベートした。細胞を
４℃で、３０００×ｇ、１０分間遠心し、２０％蔗糖を
含有した冷５０ｍＭ−トリス−Ｃｌ（ｐＨ８.０）２.５
ｍｌにペレットを懸濁させた。リゾチームを加え［０.
２５Ｍ−トリス−Ｃｌ（ｐＨ８.０）の５ｍｇ／ｍｌ溶
液０.５ｍｌ］、混合物を５分間氷上に放置した。ＥＤ
ＴＡ［０.２５Ｍ−ＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）１ｍｌ］を加
え、更に５分間氷上に置き、次いで０.０５Ｍ−トリス
−Ｃｌ（ｐＨ８.０）１.０ｍｌを徐々に加えた。菌がプ
ロトプラストに変化するまで、懸濁液を３７℃で１５分
間インキュベートした。次いで、１０％蔗糖および１０
ｍＭ−ＭｇＣｌ2を含有したあらかじめ温めてある培地
２０ｍｌで、この懸濁液を徐々に希釈し、これを１５分
間３７℃で保った。
【０１２６】６穴（ウエル）プレートで、プロトプラス
ト溶液（約１０9／ｍｌ）をＣＨＯ細胞（ＤＨＦＲ結合
ＤＵＫＸ−Ｂ１１）（１ウエル当たり、約１×１０6細
胞）に約１〜２×１０4プロトプラスト／細胞の割合で
加え、ＩＥＣ Ｋ型遠心機の回転微量滴定盤ローターで
遠心し（２０００ＲＰＭ、８分間）、プロトプラストを
細胞上にペレットした。遠心後、吸引によって上清を除
去した。ＰＥＯ−１４５０（ベーカー・ケミカル・カン
パニー）のポリエチレングリコール溶液５０ｇを５０ｍ
ｌに含有している培地２ｍｌづつを、６穴プレートの各
ウエルに加えた。細胞を再び２０００ＲＰＭで９０秒間
遠心してポリエチレングリコール溶液を除去し、プレー
トを各ウエル毎に４ｍｌの培地で３回洗浄した。次い
で、細胞をトリプシン化し、１０％ウシ胎児血清含有培
地１０ｍｌに懸濁し、円錐チューブに入れ、臨床検査用
遠心機で５００ＲＰＭの回転により遠心した。３個のウ
エルからペレットとした細胞をプールして、１０ｃｍの
組織培養皿へ播種した。
【０１２７】カナマイシン、チミジン、アデノシン、デ
オキシアデノシン、ペニシリン、ストレプトマイシン１
００μｇ／ｍｌおよび１０％ウシ胎児透析血清を含有し
ている新たに調製した培地を各プレートに加えた。プロ
トプラストに変化して残存している細胞の発育を阻止す
るためには、カナマイシンが含まれる。２日後、１０％
ウシ胎児透析血清、ペニシリン、およびストレプトマイ
シンを含み、但しヌクレオシドを含有してないα培地へ
１：１５の割合で細胞を植え継いだ。次いで、４〜５日
後に、これと同じ選択培地（但し、ヌクレオシドを含有
しない）を補給して細胞を培養した。
【０１２８】コロニーは選択培地に植え継いで１０〜１
２日後に発現した。メトトレキサート（ＭＴＸ）選択お
よび増幅には、下記の２通りの態様がある。第１の態様
では、単一で独立した形質転換クローン体をＤＨＦＲ発
現を基準にして単離し、次いで外来性ＤＮＡのコピー数
を増幅する条件、即ちメトトレキサート濃度を増加した
発育条件下で各クローンを増殖した。第２の態様では、
多種類の各独立した形質転換体のプールをＤＨＦＲ発現
を基準にして単離し、外来性ＤＮＡを増幅する条件、即
ちメトトレキサート濃度を増加した発育条件下で一緒に
増殖した。次いで、集団選択したクローン集団から個々
の独立した複数個のクローンを単離し、これについてそ
れぞれＧＭ−ＣＳＦ発現を分析した。高水準のＧＭ−Ｃ
ＳＦ発現を示すクローン類は、更に外来性ＤＮＡを増幅
する（即ち、培地内のメトトレキサート濃度を増加した
発育）条件下で再び発育させた。
【０１２９】１つの実験において、ＤＨＦＲ+の７個の
形質転換体を、ヌクレオシド類を欠除しているα培地へ
プールして培養した。これらの細胞を、ＭＴＸ濃度０.
０２μＭから始め、次いで０.１、０.５および２.０μ
ＭとＭＴＸを逐次段階的に増加した濃度内で発育させ
た。ＫＧ−１細胞検定でＧＭ−ＣＳＦ活性を検定する
と、これらの細胞は１ｍｌ当たり３０００〜１２０００
単位の活性を生産していた。選ばれた集団を０.５μ
Ｍ．ＭＴＸでクローニングし、２.０μＭ．ＭＴＸでク
ローニングした。０.５μＭ．ＭＴＸで得られたクロー
ン（０１０、Ｄ２およびＢ６）を、続いて２.０μＭ．
ＭＴＸの培地内での発育によって選び出した。ＫＧ−１
細胞検定でＧＭ−ＣＳＦ活性を検定すると、これらのク
ローン細胞系は１ｍｌ当たり１５０００〜３００００単
位のＧＭ−ＣＳＦ活性を生産した。本実施例に従って生
産されたＧＭ−ＣＳＦは、図１においてＣＳＦ−Ｔｈｒ
で示されるアミノ酸配列を有する。
【０１３０】［実施例Ｆ］ エシエリキア・コリにおけるＧＭ−ＣＳＦの発現 図６に模式的に説明を加えたベクターｐＴＡＬＣ−１８
５Ｒから、ＧＭ−ＣＳＦをエシエリキア・コリに発現し
た。ＧＭ−ＣＳＦの遺伝暗号配列は、合成的配列ＡＴ
Ｇ．ＣＣＡ．ＣＣＡ．ＣＣＴ．ＣＣＴ．ＴＣＴ．ＣＣ
Ａ．ＴＣＴ．ＣＣＡ．ＴＣＴ．ＡＣＴで始まり、これは
成熟ＧＭ−ＣＳＦの最初の１１個のアミノ酸残基を決定
する。ｐＴＡＬＣ−１８５Ｒにある残りのＧＭ−ＣＳＦ
の暗号配列はｐＣＧＦ−１の配列、ヌクレオチド９４−
４４７と同一であり、それにＴＡＲ．ＴＡＲ．ＴＡＧ配
列が続いている。３連のターミネーターの直後に続いて
ｐＵＣ−１８ポリリンカーがある。ｐＵＣ−１８ポリリ
ンカーから１００塩基下流に、ｐＢＲ３２２からのテト
ラサイクリン耐性遺伝子が、ＣＳＦ遺伝子とは反対の配
向性で挿入された。テトラサイクリン耐性遺伝子はそれ
自身のプロモーターを保有している。時計の針と反対方
向を持続したままで、次にβ−ラクタマーゼの遺伝子が
あり、その後には複製のｐＵＣ−１８（ＣｏＬＥ１）起
源が続く。
【０１３１】ＣＳＦ配列へ回帰する前のプラスミドの最
終構造の特徴はＰＬ−プロモーターである。スカッツマ
ンおよびローゼンバーグ［「モレキュラー・クローニン
グ、ア・ラボラトリー・マニュアル」（１９８２年）、
マールド・スプリング・ハーバー、４１９頁］の記載の
ように、このプロモーターは最も重要である。ＣＳＦ発
現は、熱誘導後、このＰＬ−プロモーターによって好適
なエシエリキア・コリ宿主株に推進される。すべての株
組立に用いられる親株はＷ３１１０１ａｃＩ0Ｌ８であ
る［ブレントおよびプタシュネ、プロシーディング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
・ザ・ＵＳＡ、７８巻（１９８１年）、４２０４〜４２
０８頁］。
【０１３２】λ−ＤＮＡの断片（λ−ヌクレオチド３４
４９９−３８２１４）は、Ｗ３１１０ｌａｃＩ0Ｌ８の
染色体のｌａｃＺ座位に組込まれた。この組込みは、ｐ
ＢＲ３２２の複製起源と共にクロラムフェニコールおよ
びアンピシリン耐性遺伝子を保有しているｐＢＲ３２２
５配列を構成する組込みベクターを使用して行なわれた
［ボリバー、ジーン、４巻、（１９７８年）、１２１〜
１３６頁］。λＤＮＡは、それ自身がＬａｃＩのＢｓｔ
Ｅｉｌ部位からｌａｃＺの下流にあるＴｔｈｉｌｌＩ
部位まで伸長している断片としてプラスミドに存在して
いるｌａｃＺへ挿入される。
【０１３３】ｌａｃＺ染色体コピーへのλ−ＤＮＡの組
込みは相同組換えによって達成され、ｌａｃ+、アンピ
シリン感受性、クロラムフェニコール耐性のコロニーが
見出された。挿入されたλ−ＤＮＡを除くすべてのプラ
スミド外配列の除去を誘導する第２の組換え反応現象
は、ラクトース−マツコンキー培養平板でスクリーニン
グした。第２の組換え反応現象に伴って、最初のｌａｃ
+、ａｍｐS、ｃａｍR表現型はｌａｃ-、ａｍｐS、ｃａ
ｍS表現型に変化した。得られた株はＧＬ４００と命名
し、３０°でλR、４２°でλSであった。この表現型は
ＣＩ857の対立遺伝子の官能染色体コピーの存在を証明
している。
【０１３４】ＧＬ４００は、ＳＧ２０２５２株に生成し
た溶菌物からのＰＬ形質導入によってｌｏｎ-を表わし
た（ｌａｃ△ｕ１６９、ａｒａ△１３９、ｒｐｓｌ ｌ
ｏｎ▲１００）。Ｔｎ１０は選択培地でＴｅｔSについ
てスクリーニングすることによって元へ戻った［マロ
イ、ヌン、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、１４
５巻（１９８１年）、１１１０〜１１１２頁］。最終の
宿主株をＧＩ４１３と命名とした［ｌａｃＩ0Ｌ８、ｌ
ａｃＺ△（λＣＩ、ＲＥＸ、Ｎ）、ｌｏｎ△１００］。
【０１３５】ｐＴＡＬＣ−１８５ＲをＧＩ４１３へ導入
した。この株を１夜培養し、テトラサイクリン７μｇ／
ｍｌを含有している誘導培地５ｍｌに３０°で発育させ
た。誘導培地は１ｌ当たり、下記の成分を含有する。 カザミノ酸 ２０ ｇ Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ ｇ ＫＨ2ＰＯ4 ３ ｇ ＮａＣｌ ０.５ ｇ ＮＨ4Ｃｌ １ ｇ グリセリン １ ％ ビタミンＢ1 ２ｍｇ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ２ｍｇ ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０.２ ｇ １夜培養した培養１２５μｌを、テトラサイクリン７μ
ｇ／ｍｌを含有しているこの培地（２５ｍｌ）に播種
し、培養がＡ550 ０.５の密度に達するまで水浴中で３
０℃で振盪した。その後、すみやかに４０°の水浴に移
し、更に２時間振盪して、ＧＭ−ＣＳＰを合成させた。
細胞を回収し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気
泳動によって、そのＣＳＦ含量を検定した。この条件下
においてＧＭ−ＣＳＦは、細胞蛋白質の約５％となっ
た。
【０１３６】［実施例Ｇ］ サッカロミセス・セレビシアエにおけるＧＭ−ＣＳＦの
発現 Ａ．ベクターの組立て ウラシル生合成経路に含まれている１酵素遺伝子（ＵＲ
Ａ３）を選択遺伝子とし、複製の２μ起源として含有し
ているプラスミドを組立てた。このプラスミドは、酵母
の２ミクロン・プラスミドからの複製起源を含んだ断片
を付加することにより、Ｙ１ｐ５［ボトスタインら、ジ
ーン、８巻、１７〜２４頁（１９７９年）］から誘導し
た。
【０１３７】Ｂ．グリセルアルデヒド燐酸デヒドロゲナ
ーゼ（ＧＰＤＨ）遺伝子の単離 酵母からＧＰＤＨの２個の遺伝子を単離した（ホランド
およびホランド、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー、２５５巻、２５９６〜２６０５頁（１９
８０年）］。開示されている配列から合成したオリゴヌ
クレオチド・プローブを、酵母ゲノムＤＮＡのプラスミ
ド・ライブラリーから標準的な方法でＧＰＤＨ遺伝子を
単離するのに使用した。完全なＧＡＰ４９１遺伝子を含
んでいるプラスミドは、以前に寄託してある（ＡＴＣＣ
Ｎｏ．３９７７７）。
【０１３８】Ｃ ．異種遺伝子（ヘテロローガス・ジー
ン）発現のためのグリセルアルデヒド燐酸デヒドロゲナ
ーゼ・プロモーターの作成 所望の異種構造遺伝子の始めから、自然に間隔をおいて
ＧＰＤＨプロモーターを入れたプラスミドを組立てた。
これはＧＰＤＨ構造遺伝子のイニシエーター・メチオニ
ン・コドンに直ぐ隣接してＫｐｎＩ部位を導入すること
によって達成された。このプロモーター「カセット」を
酵母発現ベクターＹＯｐ１に挿入した。
【０１３９】Ｄ．α因子遺伝子の単離 フェロモンを交配するα因子の遺伝子は酵母から単離さ
れている［カージャンおよびハースカウイツ、セル、３
０巻、９３３〜９４３頁（１９８２年）］。この配列か
ら合成された１オリゴヌクレオチド・プローブを、酵母
ゲノムＤＮＡのプラスミド・ライブラリーから標準的な
方法で単離するのに使用した。
【０１４０】Ｅ．ＣＳＦ発現プラスミドの作成 上記の諸要素およびヒトＣＳＦ遺伝子から、発現ベクタ
ー（ＡＪ１４、図７）を標準的な方法により組立てた。
このベクターにおいて、ＣＳＦの天然の先導配列は除去
され、成熟ＣＳＦを暗号化している配列はα因子のプレ
−プロ配列に隣接して挿入されている。ＧＰＤＨプロモ
ーター、α因子のプレ−プロ配列および成熟ＣＳＦ配列
間の接合部を要約し（下記）、ジデオキシヌクレオチド
配列決定法により確かめられた。ＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡ
ＡＡＴＧ．ＣＧＴＴＴＴＣＣＴＴＣＡ……ＡＡＡ ＡＧ
Ａ ＧＡＧ ＧＣＧ ＧＡＡ ＧＣＴ．ＧＣＡ ＣＣＣ
ＧＣＣ ＣＧＣ ＴＣＧ……
【０１４１】Ｆ．ＧＭ−ＣＳＦの発現 プラスミドＡＪ１４をサッカロミセス・セレビシアエの
１株に導入した。細胞を培養し、ＣＳＦが生産された。
以上の説明により、下記に示すこの発明の特殊態様が一
般に着想され、この発明を構成する。
【０１４２】１．ＣＳＦを生産する細胞からＲＮＡを作
成し、このＲＮＡからポリアデニル化したメッセンジャ
ーＲＮＡを作成し、このメッセンジャーＲＮＡから１本
鎖ｃＤＮＡを作成し、この１本鎖とｃＤＮＡを２本鎖ｃ
ＤＮＡに変換し、この２本鎖ｃＤＮＡを形質転換ベクタ
ーへ挿入し、このベクターで細菌を形質転換して、コロ
ニーを生成し、それぞれ２００〜５００個のコロニーの
プールを拾い、各プールからそれぞれプラスミドＤＮＡ
を単離し、ＣＳＦ蛋白質を発現するために、このプラス
ミドＤＮＡを好適な宿主細胞へ導入し、導入した細胞を
培養して、その上清のＣＳＦ活性を検定し、ＣＳＦ陽性
のプールを選び、そのプールの作成に使用したコロニー
をスクリーニングしてＣＳＦ活性を有するコロニーを同
定することを含んで成るＣＳＦ／ｃＤＮＡを含有してい
る形質転換ベクターの作成および単離方法。
【０１４３】２．ＣＳＦを生産する細胞がＴリンパ球で
ある第１項記載の方法。 ３．第１項記載の方法によって作成された発現ベクター
によって形質転換された細胞であって、蛋白質を分泌す
る真核細胞。 ４．第５項記載の細胞が哺乳細胞であることから成る細
胞。 ５．第１項記載の方法において、更に、ＣＳＦ活性を有
するコロニーからＣＳＦ蛋白質を暗号化しているＤＮＡ
を単離し、ＣＳＦを暗号化しているこのＤＮＡを、該Ｃ
ＳＦ／ＤＮＡと異種のプロモーターを保有する発現ベク
ターへ挿入することを含んで成る第１項記載の方法。 ６．第５項記載の方法によって作成された発現ベクター
により形質転換された細胞。 ７．細胞が原核細胞である第６項記載の細胞。 ８．細胞が真核細胞である第６項記載の細胞。 ９．ＣＳＦを暗号化しているｃＤＮＡ。
【０１４４】１０．図１に示したヌクレオチド配列を有
しているｃＤＮＡ。 １１．ＣＳＦを暗号化したｃＤＮＡを含んでいる発現ベ
クター。 １２．図１に示したヌクレオチド配列を含んでいる発現
ベクター。 １３．第１１項記載の発現ベクターまたはその対立遺伝
子性変異体を含んでいる形質転換細胞。 １４．第１２項記載の発現ベクターを含んでいる形質変
換細胞。 １５．その細胞が原核細胞である第１３項記載の細胞。 １６．その細胞が原核細胞である第１４項記載の細胞。 １７．その細胞が真核細胞である第１３項記載の細胞。 １８．その細胞が真核細胞である第１４項記載の細胞。 １９．その細胞が酵母細胞である第１７項記載の細胞。
【０１４５】２０．その細胞が酵母細胞である第１８項
記載の細胞。 ２１．その細胞が哺乳類細胞である第１７項記載の細
胞。 ２２．その細胞が哺乳類細胞である第１８項記載の細
胞。 ２３．その細胞が昆虫細胞である第１７項記載の細胞。 ２４．その細胞が昆虫細胞である第１８項記載の細胞。 ２５．ＣＳＦを暗号化しているｃＤＮＡを発現すること
によって形質転換細胞中に作成されるＣＳＦ蛋白質。 ２６．その細胞が原核細胞である第２５項記載の蛋白
質。 ２７．その細胞が真核細胞である第２５項記載の蛋白
質。 ２８．その細胞が酵母細胞である第２７項記載の蛋白
質。 ２９．その細胞が哺乳類細胞である第２７項記載の蛋白
質。
【０１４６】３０．その細胞が昆虫細胞である第２７項
記載の蛋白質。 ３１．事実上、天然起源の蛋白質を含んでいないＣＳＦ
蛋白質。 ３２．事実上、ヒト起源の蛋白質を含んでいないＣＳＦ
蛋白質。 ３３．事実上、グリコシレーションを含んでいないＣＳ
Ｆ蛋白質。 ３４．形質転換された真核細胞中でＣＳＦ蛋白質を暗号
化したｃＤＮＡの発現によりグリコシル化されたＣＳＦ
蛋白質。 ３５．その真核細胞が哺乳類細胞または昆虫細胞である
第３４項記載のＣＳＦ蛋白質。 ３６．図１に示したヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡ
を発現することによって作成されたＣＳＦ蛋白質。 ３７．その細胞が原核細胞である第３６項記載の蛋白
質。 ３８．その細胞が真核細胞である第３６項記載の蛋白
質。 ３９．その細胞が酵母細胞である第３８項記載の蛋白
質。
【０１４７】４０．その細胞が哺乳類細胞である第３８
項記載の蛋白質。 ４１．その細胞が昆虫細胞である第３８項記載の蛋白
質。 ４２．事実上、図１に示したアミノ酸配列またはその対
立遺伝子性変異体を有するヒトＣＳＦ蛋白質。 ４３．そのＣＳＦがＣＳＦ（Ｔｈｒ）である第４２項記
載のＣＳＦ蛋白質。 ４４．そのＣＳＦがＣＳＦ（Ｉｌｅ）である第４２項記
載のＣＳＦ蛋白質。 ４５．そのＣＳＦがＭｅｔ−ＣＳＦである第４２項記載
のＣＳＦ蛋白質。 ４６．そのＣＳＦがＣＳＦとＭｅｔ−ＣＳＦとの混合物
である第４２項記載のＣＳＦ蛋白質。 ４７．薬理学的な担体中にＣＳＦ蛋白質の骨髄抑制処置
量を含有している骨髄抑制の処置に用いる治療用組成
物。 ４８．ＣＳＦ蛋白質で哺乳類を処置することを含んで成
る骨髄抑制を罹患している哺乳類の処置方法。 ４９．薬理学的な担体中にＣＳＦ蛋白質を含んで成る治
療用組成物を該哺乳類動物に静脈注射することをその処
置手段に含んでいる第４８項記載の方法。
【０１４８】５０．ＣＳＦ蛋白質の有効量で哺乳類を処
置することを含んで成る、顆粒性循環白血球数を増加さ
せる哺乳類の処置方法。 ５１．事実上、図１に示したアミノ酸配列またはその対
立遺伝性変異体を有するギボンＣＳＦ。 ５２．そのＣＳＦがＣＳＦ（Ｔｈｒ）である第５１項記
載のＣＳＦ蛋白質。 ５３．そのＣＳＦがＣＳＦ（Ｉｌｅ）である第５１項記
載のＣＳＦ蛋白質。 ５４．そのＣＳＦがＭｅｔ−ＣＳＦである第５１項記載
のＣＳＦ蛋白質。 ５５．そのＣＳＦがＣＳＦとＭｅｔ−ＣＳＦとの混合物
である第５１記載のＣＳＦ蛋白質。 ５６．水性媒質に懸濁した蛋白質類の混合物からＣＳＦ
蛋白質を精製する方法であって、８０％飽和硫酸アンモ
ニウムにより蛋白質を沈澱させて、ＣＳＦ蛋白質を含有
したペレットを作成し、ｐＨ約６〜約８の範囲に緩衝し
た溶液にそのペレットを再懸濁させ、ＣＳＦを含有する
緩衝溶液をクロマトグラフィー−カラムに掛け、塩化ナ
トリウムを含有する緩衝溶液でＣＳＦ活性を溶出し、Ｃ
ＳＦ活性を保有する画分を捕集し、活性画分をプール
し、プールした画分をＣ４逆相カラムに掛け、アセトニ
トリルの０→９０％の濃度購買によってＣＳＦ活性を溶
出し、ＣＳＦ活性を含んでいる画分を捕集することを含
んで成るＣＳＦ蛋白質の精製方法。 ５７．その緩衝液をトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン塩酸塩、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ−２−エタンスルホン酸、およびクエン酸ナトリウム
の中から選ぶ第５６項記載の方法。 ５８．クロマトグラフィー・カラムにオクチルセファロ
ース、ジエチルアミノエチルウルトロゲルまたはアクリ
ルアミド−アガロース・ウルトロゲルを充填する第５６
項記載の方法。 ５９．プールした画分をＣ４カラムへ掛ける前にそれぞ
れ先ず、トリフルオロ酢酸溶液またはヘプタフルオロ酪
酸溶液中におけるアセトニトリルの濃度勾配で、プール
した画分を処理する第５６項記載の方法。
【０１４９】６０．トリフルオロ酢酸またはヘプタフル
オロ酪酸の溶出液濃度がそれぞれ０.１０％または０.１
５％（Ｖ／Ｖ）である第５９項記載の方法。 ６１．ＣＳＦ蛋白質を含有している水性媒質を、先ず３
０％飽和硫酸アンモニウムで処理して蛋白質を沈澱さ
せ、その上清を残りの段階に用いる第５６項記載の方
法。 ６２．第５６項の方法において、硫酸アンモニウムで蛋
白質を沈澱させてペレットを作成する段階の後、そのペ
レットをトリス−塩酸溶液に再懸濁し、得られた溶液を
透析し、透析した溶液をＤＥＡＥ−ウルトラゲルのカラ
ムに掛け、このカラムを少なくとも０.１Ｍ−ＮａＣｌ
を含有しているトリス−塩酸溶液で溶出し、ＣＳＦ活性
を含有する画分を捕集し、活性画分をプールし、プール
した画分をＮａＣｌおよびポリエチレングリコールを含
有しているＨＥＰＥＳ溶液で飽和したＡＣＡ４４−ウル
トロゲルを充填したカラムに掛け、ＮａＣｌおよびポリ
エチレングリコールを含んだＨＥＰＥＳ溶液でカラムを
溶出し、ＣＳＦ活性を含有する画分を捕集し、ＣＳＦ活
性を含有する画分をプールし、プールした画分をトリフ
ルオロ酢酸で処理し、トリフルオロ酢酸で処理したプー
ル分をＣ４逆相カラムに掛け、トリフルオロ酢酸溶液中
におけるアセトニトリルの０→９０％濃度勾配で溶出
し、ＣＳＦ活性を含有する画分を捕集し、ＣＳＦ活性を
含有する画分をプールし、プールした画分をヘプタフル
オロ酪酸で処理し、処理した溶液を第２のＣ４逆相カラ
ムに掛け、第２のＣ４逆相カラムをヘプタフルオロ酪酸
中におけるアセトニトリルの０→９０％濃度勾配で溶出
して、ＣＳＦ活性を有する画分を捕集することを含んで
成る第５６項記載の方法。 ６３．第５６項の方法において、硫酸アンモニウムで蛋
白質を沈澱させてペレットを作成する段階の後、そのペ
レットをＮａＣｌを含有しているクエン酸ナトリウム溶
液に再懸濁させ、これと同じ緩衝液で飽和したアクリル
アミド−アガロース・ウルトラゲルを充填したカラムに
この溶液を掛け、カラムをクエン酸ナトリウムおよびＮ
ａＣｌの溶液で溶出し、ＣＳＦ活性を有する画分を捕集
し、ＣＳＦ活性を有する画分をプールし、トリフルオロ
酢酸で処理し、処理溶液をＣ４逆相カラムに掛け、この
カラムをトリフルオロ酢酸溶液中におけるアセトニトリ
ルの０→９０％濃度勾配で溶出し、ＣＳＦ活性を有する
画分を捕集することを含んで成る第５６項記載の方法。 ６４．骨髄検定において、少なくとも約１×１０7単位
／ｍｇの比活性を有するＣＳＦ蛋白質。
【０１５０】６５．約１５０００〜約２６０００ダルト
ンの分子量を有する第６４項記載のＣＳＦ蛋白質。 ６６．骨髄検定において、蛋白質１ｍｇ当たり少なくと
も約４×１０7単位の比活性を有する第６４項記載のＣ
ＳＦ蛋白質。 ６７．ＣＳＦをＭｏ細胞調整培地から精製する第５６項
記載の方法。 ６８．発現可能なＣＳＦ遺伝子を含んでいる組換え体ベ
クターでトランスフェクションした細胞の培養によって
得られた培地からＣＳＦを精製する第５６項記載の方
法。 ６９．ｐ９１０２３（Ｂ）−ＣＳＦでトランスフェクシ
ョンしたＣＯＳ細胞の培養によって得られた培地からＣ
ＳＦを精製する第５６項記載の方法。 ７０．霊長類動物細胞のコロニー形成刺激因子（ＣＳ
Ｆ）蛋白質を暗号化している遺伝子を好適なベクターへ
挿入し、その遺伝子を挿入した該ベクターを真核または
原核性宿主細胞へ導入し、そのＣＳＦ蛋白質を発現し、
単離することを含んで成る霊長類動物ＣＳＦ蛋白質の生
産方法。 ７１．そのＣＳＦ蛋白質が顆粒性白血球（顆粒球）−マ
クロファージＣＳＦである第７０項記載の方法。 ７２．ＣＳＦ蛋白質が図１のＣＳＦ−ｔｈｒで示された
アミノ酸配列を有する第７０項記載の方法。 ７３．ＣＳＦ蛋白質が図１のＣＳＦ−ｉｌｅで示された
アミノ酸配列を有する第７０項記載の方法。 ７４．ＣＳＦ蛋白質がギボンザルの顆粒性白血球−マク
ロファージＣＳＦである第７０項記載の方法。
【０１５１】７５．ＣＳＦ蛋白質が図１のＣＳＦ−Ｇで
示されたアミノ酸配列を有する第７０項記載の方法。 ７６．ＣＳＦ蛋白質が天然産ＣＳＦのアミノ酸配列と一
致しており、但し、天然ＣＳＦの生物学的活性に事実上
影響することなく、１またはそれ以上のアミノ酸を追加
し、置換し、または除去した蛋白質である第７０項記載
の方法。 ７７．ＣＳＦ蛋白質が天然産ＣＳＦのアミノ酸配列と一
致しており、但し、１またはそれ以上のシスティン残基
を他のアミノ酸残基で置換したものである第７６項記載
の方法。 ７８．ＣＳＦ蛋白質が天然産ＣＳＦのアミノ酸配列を有
し、但し、その配列がメチオニン残基により先行される
第７７項記載の方法。 ７９．成熟形の第４２、４３、４５、４６項記載のＣＳ
Ｆ蛋白質。 ８０．シグナル・ポテンシェーター開始領域を含んでい
る第４２、４３、４５、４６項記載のＣＳＦ蛋白質。 ８１．１２７個のアミノ酸を有するＣＳＦ蛋白質。 ８２．ＡＴＣＣ３９７５４の番号でＡＴＣＣに寄託され
ているエシエリキア・コリＭＣ１０６Ｉを発現すること
によって得ることができるＣＳＦ蛋白質、またはＡＴＣ
Ｃに寄託されているプラスミドｐ９１０２３（Ｂ）−Ｃ
ＳＦの１２７アミノ酸のＣＳＦ暗号化ヌクレオチド配
列。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるＣＳＦ／ｃＤＮＡのＤＮＡ配列と
これを翻訳したＣＳＦ蛋白質生産物のアミノ酸配列を示
す図。
【図２】プラスミドｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡからプラスミ
ドｐＴＰＬを作成する概略説明図。
【図３】プラスミドｐＴＰＬからプラスミドｐ９１０２
３を作成する概略説明図。
【図４】プラスミドｐ９１０２３（Ｂ）の説明図。
【図５】精製ＣＳＦ蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示
す図。
【図６】ベクターｐＴＡＬＣ−１８５Ｒの模式的表示
図。
【図７】ベクターＡＪ−１４の模式的表示図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 5/10 // Ａ６１Ｋ 35/12 7431−4Ｃ 35/74 Ｚ 7431−4Ｃ 38/16 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/04 (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ランダル・ジェイ・カウフマン アメリカ合衆国マサチューセッツ02116、 ボストン、マールボロ・ストリート111番 (72)発明者 ゴードン・ジー・ウォング アメリカ合衆国マサチューセッツ02138、 キャンブリッジ、マサチューセッツ・アベ ニュー1137番 (72)発明者 エリザベス・エー・ウァング アメリカ合衆国マサチューセッツ017419、 カーリスル、ウォルフ・ロック・ロード 136番

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記のアミノ酸配列を有する霊長類ＧＭ
    −ＣＳＦ蛋白質をコードする遺伝子またはそのアレルも
    しくは他の官能的に均等な変異体を含む組換ベクター： ＣＳＦ-Thr: Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu MET Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu MET Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr MET MET Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Thr Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu または ＣＳＦ-Ile: Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu MET Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu MET Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr MET MET Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu または ＣＳＦ-Ｇ: Ala Pro Ser Arg Ser Pro Ser Pro Ser Arg Gln Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Ile Asn Glu Thr Val Glu Val Val Ser Glu MET Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr MET MET Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Gly。
  2. 【請求項２】 官能的に均等な変異体が、ＣＳＦ−Th
    r、ＣＳＦ−IleおよびＣＳＦ−Ｇのいずれかのアミノ酸
    配列において１つもしくはそれ以上のアミノ酸が付加、
    置換または除去されているものをコードしている遺伝子
    である、請求項１記載の組換ベクター。
  3. 【請求項３】 官能的に均等な変異体が、ＣＳＦ−Th
    r、ＣＳＦ−IleおよびＣＳＦ−Ｇのいずれかのアミノ酸
    配列において１つのアミノ酸が付加、置換または除去さ
    れているものをコードしている遺伝子である、請求項２
    記載の組換ベクター。
  4. 【請求項４】 ヒトＧＭ−ＣＳＦ蛋白質をコードする遺
    伝子を含む、請求項１記載の組換ベクター。
  5. 【請求項５】 コードされているヒトＧＭ−ＣＳＦ蛋白
    質が、アミノ酸配列において天然ヒトＧＭ−ＣＳＦ蛋白
    質に対応するものである、請求項４記載の組換ベクタ
    ー。
  6. 【請求項６】 ＣＳＦ−ThrまたはＣＳＦ−Ileをコード
    する遺伝子を含む、請求項１記載の組換ベクター。
  7. 【請求項７】 ＣＳＦ−Ileの１つのアミノ酸が置換さ
    れた蛋白質をコードする遺伝子を含む、請求項１記載の
    組換ベクター。
  8. 【請求項８】 ＣＳＦ−Thr、ＣＳＦ−IleおよびＣＳＦ
    −Ｇのいずれかのアミノ酸配列に、更にそのＮ−末端に
    次のシグナル配列が付加している蛋白質をコードする遺
    伝子またはそのアレルもしくは他の官能的に均等な遺伝
    子を含む、請求項１記載の組換ベクター： MET Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile Ser。
  9. 【請求項９】 ＣＳＦ−Thr、ＣＳＦ−IleおよびＣＳＦ
    −Ｇのいずれかのアミノ酸配列に、更にそのＮ−末端に
    メチオニンが付加している霊長類ＧＭ−ＣＳＦ蛋白質を
    コードする遺伝子またはそのアレルもしくは他の官能的
    に均等な遺伝子を含む、請求項１記載の組換ベクター。
  10. 【請求項１０】 組換ベクターで形質転換させた宿主細
    胞を霊長類ＧＭ−ＣＳＦタンパク質の発現可能な条件下
    で培養し、それによって産生された霊長類ＧＭ−ＣＳ蛋
    白質を採取することから成る、霊長類ＧＭ−ＣＳＦ蛋白
    質の製造法で使用する、請求項１記載の組換ベクター。
  11. 【請求項１１】 下記のアミノ酸配列を有する霊長類Ｇ
    Ｍ−ＣＳＦ蛋白質をコードする遺伝子またはそのアレル
    もしくは他の官能的に均等な変異体を含む組換ベクター
    で形質転換させた宿主細胞： ＣＳＦ-Thr: Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu MET Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu MET Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr MET MET Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Thr Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu または ＣＳＦ-Ile: Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu MET Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu MET Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr MET MET Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu または ＣＳＦ-Ｇ: Ala Pro Ser Arg Ser Pro Ser Pro Ser Arg Gln Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Ile Asn Glu Thr Val Glu Val Val Ser Glu MET Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr MET MET Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Gly。
  12. 【請求項１２】 官能的に均等な変異体が、ＣＳＦ−Th
    r、ＣＳＦ−IleおよびＣＳＦ−Ｇのいずれかのアミノ酸
    配列において１つもしくはそれ以上のアミノ酸が付加、
    置換または除去されているものをコードしている遺伝子
    である、請求項１１記載の宿主細胞。
  13. 【請求項１３】 官能的に均等な変異体が、ＣＳＦ−Th
    r、ＣＳＦ−IleおよびＣＳＦ−Ｇのいずれかのアミノ酸
    配列において１つのアミノ酸が付加、置換または除去さ
    れているものをコードしている遺伝子である、請求項１
    ３記載の宿主細胞。
  14. 【請求項１４】 ヒトＧＭ−ＣＳＦ蛋白質をコードする
    遺伝子を含む、請求項１１記載の宿主細胞。
  15. 【請求項１５】 コードされているヒトＧＭ−ＣＳＦ蛋
    白質が、アミノ酸配列において天然ヒトＧＭ−ＣＳＦ蛋
    白質に対応するものである、請求項１４記載の宿主細
    胞。
  16. 【請求項１６】 ＣＳＦ−ThrまたはＣＳＦ−Ileをコー
    ドする遺伝子を含む、請求項１１記載の宿主細胞。
  17. 【請求項１７】 ＣＳＦ−Ileの１つのアミノ酸が置換
    された官能的に均等な変異体をコードする遺伝子を含
    む、請求項１１記載の宿主細胞。
  18. 【請求項１８】 ＣＳＦ−Thr、ＣＳＦ−IleおよびＣＳ
    Ｆ−Ｇのいずれかのアミノ酸配列に、更にそのＮ−末端
    に次のシグナル配列が付加している蛋白質をコードする
    遺伝子またはそのアレルもしくは他の官能的に均等な遺
    伝子を含む、請求項１１記載の宿主細胞： MET Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile Ser。
  19. 【請求項１９】 ＣＳＦ−Thr、ＣＳＦ−IleおよびＣＳ
    Ｆ−Ｇのいずれかのアミノ酸配列に、更にそのＮ−末端
    にメチオニンが付加している霊長類ＧＭ−ＣＳＦ蛋白質
    をコードする遺伝子またはそのアレルもしくは他の官能
    的に均等な遺伝子を含む、請求項１１記載の宿主細胞。
  20. 【請求項２０】 原核性のものである、請求項１１記載
    の宿主細胞。
  21. 【請求項２１】 大腸菌である、請求項１１記載の宿主
    細胞。
  22. 【請求項２２】 真核性のものである、請求項１１記載
    の宿主細胞。
  23. 【請求項２３】 酵母菌である、請求項２２記載の宿主
    細胞。
  24. 【請求項２４】 哺乳類細胞である、請求項２２記載の
    宿主細胞。
  25. 【請求項２５】 ＣＨＯ(チャイニーズハムスターオー
    バリー)細胞である、請求項２４記載の宿主細胞。
  26. 【請求項２６】 宿主細胞を霊長類ＧＭ−ＣＳＦ蛋白質
    の発現可能な条件下で培養し、それによって産生された
    霊長類ＧＭ−ＣＳＦ蛋白質を採取することから成る、霊
    長類ＧＭ−ＣＳＦ蛋白質の製造法で使用する、請求項１
    １記載の宿主細胞。
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