HU208711B - Method for preparing gm-csf and transformation vector containing csf/cdna, also a methold for purifying the csf protein - Google Patents

Description

Ez a találmány a főemlős hematopoézis őssejtek növekedésének és differenciálódásának stimulálására képes fehérje, elsősorban a telepstimuláló faktor (Colony stimulating factor, CSF) előállítására vonatkozik. A találmány tárgya egyrészt eljárás CSF fehérje előállítására rekombináns DNS technikákkal, valamint az említett fehérje kifejeződésére szolgáló géneket tartalmazó vektorok, az említett vektorokkal transzformált mikroorganizmus és sejtvonalak előállítására, másrészt eljárás a CSF fehérje izolálására és tisztítására akár természetes, akár rekombináns forrásokból. Az így tisztított CSF fehérje tisztaságának mértéke és aktivitásának szintje jóval felette van bármely eddig közölt tisztasági és aktivitási értéknek.

A vérben található különböző típusú sejtek a több irányban fejlődésképes, hematopoetikus őssejtekből származnak. Az őssejtek két feladatot hajtanak végre: (1) reprodukálják önmagukat, ezáltal fenntartanak egy őssejt-populációt a testben, és (2) utód-sejteket szolgáltatnak, amelyek az érett vérsejt típusokká differenciálódnak. Azt a sejtet, amelyből egy speciális hematopoézis-út mentén végbemegy a differenciálódás, progenitor sejtnek nevezzük. A T-limfocitákhoz, B-limfocitákhoz, granulocitákhoz, vörös vérsejtekhez, vérlemezkékhez és eozinofilekhez szolgáló progenitor sejteket, valamint azokat a korai progenitor sejteket, amelyek egyedileg képesek létrehozni több éret sejttípust, kísérletileg mind in vivő, mind in vitro tanulmányozták [Dexter, T. M.: J. Pathology, 141, 415-433 (1983)]. In vitro meghatározták, hogy az egyes progenitor típusok sejtburjánzása és/vagy differenciálódása speciális faktoroktól függ, amelyek különböző forrásokból származnak. így például a vörösvérsejtek késői progenitor sejtjei az eritropoetinnek nevezett faktort igénylik. A mieloid progenitor sejtek, amelyekből az érett neutrofil granulociták, monociták és érett makrofágok képződése végbemegy, túlélésükhöz, sejtburjánzásukhoz és differenciálódásukhoz a telepstimuláló faktoroknak (CSF) nevezett faktorokat igénylik.

A CSF aktivitást alaposan tanulmányozták egérben. A legtöbb felnőtt egér szerv termel CSF aktivitású anyagot. A CSF aktivitást tartalmazó kompozíciók azonban, amelyeket különböző szövetekből és különböző módszerekkel nyertek, úgy tűnik, különböznek biokémiai jellemzőikben. így a szerkezeti kapcsolatok a különböző faktorok között ismeretlenek. Ezenkívül, úgy tűnik, a CSF aktivitás a granulocita- és makrofágkifejlődés több lépésére hat, és az is bizonytalan, vajon egyetlen faktor felelős az összes megfigyelt aktivitásért, vagy különböző faktorok tevékenykednek az egyes lépéseknél [Burgess, A. és Metcalf, D.: Blood, 56, 497-957 (1980)].

Aktív humán CSF-et nyertek placentából, bizonyos embriószövetekből, makrofágokból és stimulált T-sejtekből. Egy T-sejtvonalat (Mo), amely egy vagy több jelentős CSF aktivitású anyagot termel, alakítottak ki egy olyan betegből, aki bolyhos sejt leukémia (leukémiás retikuloendoteliózis) egy T-sejt variánsával rendelkezett [Golde és munkatársai: Blood, 52,168-1072 (1978)].

A CSF aktivitású anyagoknak az a képessége, hogy stimulálják a granulocita- és makrofág-termelést, jelezte, hogy a CSF aktivitású gyógyászati kompozíciók klinikailag hasznosak olyan helyzetekben, ahol ezeknek a (mieloid) sejttípusoknak a megnövekedett termelése szükséges. Ugyanakkor számos betegről, akik a látszólag normálisan keringő granulociták rendkívül magas szintjével rendelkeztek, kimutatták, hogy tumoruk van, amely CSF túltermelést idéz elő. Egy esetben, a tumor sebészeti eltávolításával a granulocitaszám gyorsan csökkent a normális szint irányában, ami arra utal, hogy a CSF hasznos lehet a keringő granulociták számának szabályozásában (Hocking, W., Goodman, J„ és Golde, D.: Blood, 61, 600 (1983)]. A CSF kompozíciók klinikailag különösen hasznosak a rák kemoterápiás vagy besugárzásos kezelése által okozott mielo-szuppresszió kezeléséhez. Ezenkívül a CSF kompozíciók hasznosak súlyos fertőzések kezelésében is, mivel a CSF növelheti és/vagy aktiválhatja a granulociták és/vagy a monociták számát.

A Natúré 298, 75-77 helyen Lusis és munkatársai cikke GM-CSF tisztításával foglalkozik. Az izolált anyag fajlagos aktivitása azonban csupán 3,5xlO⁶ egység/mg (humán csontvelő vizsgálattal mérve). Ezenkívül az izolált termék nem homogén, és valószínűleg kevesebb, mint 40% CSF-et tartalmaz.

A Natúré 309, 763-761 helyen Gough és munkatársai cikke izolált cDNS kiónokat ismertet, amelyek a rágcsáló granulocita makrofág telepstimuláló faktorra jellemzőek. Ezt a hematopoetikus növekedési faktort egyetlen gén kódolja, amely egy 1200 nukleotid hoszszúságú mRNS-t, illetve egy 118 aminosav méretű polipeptidet határoz meg.

A Natúré 307, 233-23Ί helyen Fung és munkatársai cikke egy, a rágcsáló interleukin-3-hoz, a hematopoezist szabályozó telepstimuláló faktorok egyikéhez tartozó cDNS-szekvenciát ismertet. A cDNS egy 166 aminosav méretű polipeptidet kódol, amely magában foglal egy vélt szignálpeptidet is.

A rágcsáló GM-CSF - miközben természetesen egerek esetén alkalmas granulocita és makrofág termelésének stimulálására (azaz GM-CSF aktivitással rendelkezik) - nem alkalmas ilyen célra főemlősök esetén.

Az US 4 438 032 sz. szabadalmi leírás a Mo sejtvonalak által termelt különféle proteinek előállítási eljárását ismerteti. A kiválasztott proteinek egyike egy telepstimuláló faktor, amely a granulocita és makrofág progenitor sejtek in vitro szaporodását és differenciálódását eredményezi. A glikozilezett protein molekulatömege mintegy 34 kD. A faktor 3,5xl0⁶ egység/mg-ig terjedő koncentrációban nyerhető. Egy aktivitás-egység azt a mennyiséget jelöli, amennyi 10⁵ különálló humán csontvelősejtben egy kolóniát stimulál. A dokumentum tehát részben a GM-CSF tisztításával foglalkozik. Az izolált anyag fajlagos aktivitása azonban csupán 3,5xl0⁶ egység/mg (humán csontvelő vizsgálattal mérve). Ezenkívül az izolált termék a szerzők állítása szerint nem

HU 208 711 Β homogén, és valószínűleg kevesebb, mint 40% CSFet tartalmaz.

Sokféle különböző ismert CSF aktivitás létezik, beleértve a granulocita CSF-et (G-CSF), makrofágCSF-et (M-CSF), granulocita-makrofág CSF-et (GMCSF) és multi-CSF-et. A jelen találmány elsősorban a GM-CSF-re vonatkozik. A CSF fehérjék ismertek különböző állati forrásokból. A jelen találmány azonban főleg a főemlős CSF-ekre vonatkozik, még pontosabban a humán CSF-re és emberszabású majom CSF-re.

A CSF aktivitással bíró kompozíciók biológiai és biokémiai jellemzését és klinikai tanulmányozását mostanáig nem lehetett megoldani a humán és más főemlős CSF kompozíciók hiánya és szennyezettsége miatt. Kívánatos lenne tehát a CSF aktivitásért felelős fehérjét vagy fehérjéket azonosítani. Ezen kívül szükség lenne az ilyen CSF-hez egy főemlős, előnyösen emberi forrásra, amely könnyen tudná szolgáltatni ezeket a fehérjéket megfelelő mennyiségben és olyan tisztaságban, amely megfelelő a biológiai és biokémiai jellemzéshez és terápiás szerként való alkalmazáshoz.

A molekuláris klónozás nemrégiben kifejlesztett technikái lehetővé teszik egy olyan nukleotid szekvencia klónozását, amely egy fehérjét kódol, valamint ennek a fehérjének az előállítását megfelelő mennyiségben, megfelelő gazda-vektorrendszert alkalmazva [Maniatis, T.: Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)]. A fehérjét azután ki lehet nyerni ismert elkülönítési és tisztítási technikákkal. A klónozó módszereket, amelyeket eddig használtunk, három fő kategóriába lehet csoportosítani: (1) a fehérje szerkezetének, például aminosav-szekvenciájának ismeretére alapozott módszerek; (2) a klónozott gén által kifejezett fehérje azonosítására alapozott módszerek, a fehérjére fajlagos antitestet alkalmazva; és (3) annak az RNS fajtának az azonosítására alapozott módszerek, amelyeket transzlációnak lehet alávetni, hogy a szóbanforgó gén által kódolt fehérjét vagy aktivitást termeljük.

A fenti módszerek gyakorlati alkalmazása nehézségekbe ütközik, ha a szóbanforgó fehérje, mint például a CSF fehérje, igen kis mennyiségben áll rendelkezésre. így ha nehéz alkalmas mennyiségű tisztított fehérjét nyerni, akkor nehéz meghatározni az aminosav-szekvenciát vagy akár a fehérje részleges szekvenciáit is. Hasonlóképpen egy kifejezett fehérje antitestkötéssel történő azonosítását előnyösen nagy titerű monospecifikus poliklonális antiszérummal hajtják végre. Ilyen antiszérumot nem lehet nyerni a tiszta fehérje (antigén) megfelő mennyiségének hiányában. Egy monoklonális antitest egy alternatív megközelítést nyújt, de szükséges antitestet szintén nehéz nyerni megfelelő antigén hiányában, és az ilyen monoklonális antitest esetleg nem reagál a fehérjével olyan formában, ahogyan a fehérje a rendelkezésre álló rekombináns gazda-vektorrendszerek révén kifejeződik. Végül egy RNS fajtának egy azonosítható fehérje vagy aktivitás termelésére történő transzlációjához szükséges, hogy a szóban forgó RNS megfelelő fölöslegben legyen jelen az RNS forrásban, hogy megfelelő fehérje- vagy aktivitás jelet adjon. Egy szóban forgó fehérjét kódoló RNS relatív fölöslege általában párhuzamban van a fehérje fölöslegével, így egy ritka fehérjét általában egy ritka mRNS kódol.

A találmány szerinti megoldásban az Mo sejtvonalat használtuk mind kiindulási anyagként humán CSF-ek tisztításához, mind a megfelelő hírvivő RNSek azonosításához. Még ezzel a viszonylag jó CSF aktivitás forrással is rendkívül nehéznek bizonyult azonban elég fehérjét izolálni a szerkezet tanulmányozásához.

Abból a célból, hogy kiküszöböljük azt a problémát, amely egy olyan ritka fehérjét, mint a CSF-et kódoló nukleotid szekvencia klónozásában fellép a fentebb leírt módszereket alkalmazva, új módszert fejlesztettünk ki. A módszerhez csupán az szükséges, hogy a gén-terméket vagy annak aktivitását valósan tudjuk mérni. A CSF méréshez megfelelő módszereket írunk le a 2. példában. Másrészt olyan tisztítási módszert fejlesztettünk ki, amely lehetővé teszi, hogy a CSF fehérjét - akár rekombináns, akár természetes forrásból - sokkal nagyobb tisztasággal és aktivitással izoláljuk és tisztítsuk, mint ahogyan korábban lehetséges volt.

A találmány szerinti megoldással tehát kiküszöböljük a technika jelenlegi állásának problémáit, és rekombináns DNS technikával CSF aktivitású fehérje forrást alakítunk ki. A találmány értelmében új klónozási technikát alkalmazva, amely csupán a CSF aktivitás meghatározását igényli, egy CSF aktivitással bíró fehérjét kódoló cDNS-t klónozunk. így a találmány szerint egy CSF aktivitással bíró fehérjét kódoló cDNS-t (azaz CSF/cDNS-t), egy ilyen CSF/cDNS-t tartalmazó rekombináns vektorral transzformáit mikroorganizmust vagy sejtvonalat, valamint CSF fehérjét állítunk elő az említett CSF/cDNS-t egy mikroorganizmus vagy sejtvonal tenyésztésével kifejezve. Mivel a CSF fehérjét egy klónból a találmány szerinti eljárással állítjuk elő, biztosak lehetünk abban, hogy ez olyan fehérje, amelynek CSF aktivitása van. A találmány kiterjed továbbá egy CSF/cDNS-t tartalmazó transzformáló vektor előállítására és izolálására, az említett módszer magában foglalja:

- RNS előállítását valamilyen CSF-et termelő sejtből;

- az említett RNS-ből poliadenilezett hírvivő RNS előállítását;

- az egyszálú cDNS átalakítását kétszálú cDNS-sé

- a kétszálú cDNS beiktatását transzformáló vektorba, és a baktérium transzformálását az említett vektorral telepek képzése érdekében;

- 200-500 telepből álló készletek összegyűjtését, és plazmid DNS izolálását az egyes készletekből;

- a plazmid DNS transzformálását megfelelő gazdasejtekbe a CSF fehérje kifejeződéséhez;

HU 208 711 Β

- a transzformált sejtek tenyésztését és a felülúszó vizsgálatát CSF aktivitásra; és

- a CSF pozitív készletek kiválasztását és a készlet elkészítéséhez felhasznált telepek átvizsgálását, hogy azonosítsunk egy CSF aktivitással bíró telepet.

A találmány szerinti CSF fehérjék a mieloid rendszer sejtjeinek növekedési és differenciálódási hormonjai. Ezek a fehérjék klinikailag alkalmazhatók a mielo-szuppressziós betegségek, különösen a (szimptomatikus) granulocitopénia kezelésére, amely rák kemoterápiás vagy besugárzásos kezelését követi.

Az 1. ábra azokat a DNS szekvenciákat mutatja be, amelyek a találmánnyal összhangban CSF fehérjét kódolnak. A bemutatott DNS szekvencia a humán CSF egyik variációját, a CSF-Thr-t kódolja teljes egészében. Egy másik alléi egy csaknem azonos terméket kódol azzal az eltéréssel, hogy a 100. helyen lévő Thr Ile-vel van helyettesítve (CSF-Ile). A humán szekvencia fölött jelölt változások a gibbon CSF-et (a gibbon-majom CSF-jét) (CSF-G) kódoló DNS szekvenciában lévő különbségeket jelzik. A kikövetkeztetett aminosav-szekvenciákat szintén bemutatjuk.

A 2. ábra sematikusan mutatja be a pTPL plazmid előállítását a pAdD26SVpA(3) plazmidból.

A 3. ábra a 2. vázlatos folytatása, és a p91023 plazmid pTPL plazmidból történő előállítását illusztrálja.

A 4. ábra a 3. ábra vázlatos folytatása és a p91023(B) plazmidot mutatja be.

Az 5. ábra a tisztított CSF fehérje SDS-PAGE elemzését mutatja.

A 6. ábra a pTALC-185R vektor vázlatos bemutatása.

A 7. ábra az AJ-14 vektor vázlatos bemutatása.

A 8. ábra a pTALC-185R plazmid DNS szekvenciáját mutatja be.

A 9. ábra a pCIN-5 integráló vektor vázlatos képét mutatja be.

A 10. ábra a YOpl plazmid vázlatos képét és készítésének vázlatát mutatja be.

All. ábra az érett GM-CSF kódoló szekvenciájának készítését mutatja be.

A 12. ábra az érett GM-CSF 5’ kapcsolódási helyének szekvenciáját mutatja be.

A13. ábra az AG619 plazmid készítésének vázlatát mutatja be.

A 14. ábra az érett GM-CSF 5’ kapcsolódási szekvenciáját mutatja be élesztő plazmidban.

A 15. ábra a GM-CSF élesztő kifejező vektor készítésének vázlatát mutatja be.

A következőkben megadjuk a leírásunkban használt kifejezések rövid definícióját.

Amplifikálás azt a folyamatot jelenti, amelynek segítségével a sejtek kromoszomális DNS-ükön belül gén-ismétlődéseket termelnek.

CSF biológiai aktivitás, amely aktivitást az alább leírtak szerint határozzuk meg.

CSF fehérje egy valamilyen főemlős-forrásból származó fehérje, amely CSF aktivitást mutat. A találmány esetében a CSF fehérje kifejezésbe beleértjük a módosított CSF fehérjét, a CSF fehérje alléi variációit és a kezdő Met gyököt tartalmazó CSF fehérjét is.

A „lefelé” kifejezés azt az irányt jelzi, amely a nukleotid szekvencia 3’ vége felé irányul.

Fokozó: olyan nukleotid szekvencia, amely képes előidézni egy, a fokozó helyzetétől független gén átírását, a független helyzetet mind a gén elhelyezkedésével, mind a szekvencia orientációjával kapcsolatban értve.

Gén: olyan dezoxiribonukleotid szekvencia, amely egy adott fehérjét kódol. Az itt alkalmazott célra a gén nem foglal magában le nem fordított szegélyező területeket, mint például RNS átírási indító jeleket, a poliadenilezés többlet helyeit, promotorokat és fokozókat.

Ligálás: foszfodiészter kötés képzése két DNS szál 5’ és 3’ végei között. Ezt számos jól ismert enzimes technikával végre lehet hajtani, beleértve a tompa-vég ligálást T4 ligázzal.

Orientáció: a nukleotidok sorrendjére vonatkozik valamely DNS szekvenciában. Egy DNS szekvencia fordított orientációja olyan orientáció, amelyben a szekvencia 5’ - 3’ sorrendje a másik szekvenciához képest fordított, amikor egy referenciaponthoz hasonlítjuk egy DNS-ben, amelyből a szekvenciát nyertük. Ilyen referencia-pontok például a más, meghatározott DNS szekvenciák átírásának iránya a DNS forrásban vagy a szekvenciát tartalmazható replikálható vektorok replikációs origója.

Transzkripció: RNS szintézist jelenti egy DNS templátból.

Transzformáció: egy sejt genotípusának változását jelenti exogén DNS sejten belüli felvétele révén. A transzformációt bizonyos esetekben ki lehet mutatni a sejt fenotípusában történő változások segítségével. A transzformált sejteket transzformánsoknak hívjuk. A transzformálás előtti sejteket szülősejteknek nevezzük.

Transzláció: egy polipeptid szintézise a hírvivő RNS-ről.

A telep-stimuláló faktor aktivitás (CSF) egy sor sejtforrásból származhat, beleértve a perifériás vér mononukleáris sejtjeiből származó kondicionált közeget, a tüdő- és placentaszövetet, csontvelőt, anémiás betegek vizeletét, szérumot, és T-limfocita és mononukleáris fagocita származású neoplasztikus sejteket. Egy CSF-etermelő sejtvonal, a Mo sejtvonal ATCC CRL8066 számon deponálva hozzáférhető. Az ezzel a sejtvonallal termelt CSF granulocita makrofág CSF-ként (vagy GM-CSF-ként) ismeretes, és ez természetesen humán CSF. Egy gibbon CSF forrás a UCD-MLA-144 jelű T-sejtvonal, amely ATCC HB 9370 számon (1983. szeptember 29-én) deponálva hozzáférhető.

A találmány értelmébe CSF klón izolálására új eljárást alkalmaztunk, amely csupán a CSF aktivitás mérését igényli. Először olyan sejtet azonosítunk, amely

HU 208 711 Β

CSF aktivitást termel, mint például a T-limfocita sejtek (vagy más források, amint azt fentebb leírtuk). Azután kinyerjük a sejt mRNS-ét. Előnyösen T-limfocita sejteket alkalmazunk. Ilyen esetben a membránhoz kötött mRNS-t, amely a limfokinekhez szolgáló mRNS-t tartalmazza, elkülönítjük a sejtben lévő szabad mRNStől. Ez az elkülönítés mintegy 5-10-szeresére dúsítja a limfokin-szekvenciákhoz tartozó mRNS-t, és így könnyebb a kívánt CSF kiónt azonosítani. A poliadenilezett, hírvivő RNS-t azután oligo dT cellulózon kromatográfiával különítjük el.

Az mRNS-ből cDNS könyvtárat állítunk elő egy gazdaszervezetbe való átfertőzéshez alkalmas vektort alkalmazva, hogy kifejezzük a CSF aktivitással bíró kívánt fehérjét. Először cDNS szálat képzünk standard módszereket és a fentebb előállított mRNS-t alkalmazva. Az RNS-cDNS hibridet azután átalakítjuk kétszálú cDNS-formává. A cDNS-t azután beiktatjuk megfelelő vektorba.

CSF klón izolálásához az előnyös gazda-vektor rendszer a megfelelő transzformáló vektorban a CSF cDNS kifejeződésén alapszik. A megfelelő transzformáló vektor a DNS emlős sejtekbe történő átmeneti bevezetésén alapszik [Mellon, P„ Parker, V., Gluzman, Y., Maniatis, T.: Cell, 27, 279-288 (1981)]. A kívánt CSF transzformánsok izolálása érdekében nem szükséges, hogy a populáció minden sejtje stabilan tartalmazzon olyan exogén géneket, amelyek kifejezik a kívánt CSF terméket. Lehetséges, hogy az exogén géneket átmenetileg vezetjük be sejtek szubpopulációjába úgy, hogy a szubpopuláció a kívánt terméket néhány napos időtartamon át fejezi ki. Mivel a találmány értelmében a DNS átfertőzéshez és kifejező rendszerhez szelektálható marker nem szükséges a transzformáló vektorban, az exogén DNS eltűnhet a sejtek 1-2 hetes növekedése során. A megfelelő emlőssejt átfertőzése után 2-3 nappal azonban a kívánt termék szintetizálódik és kimutatható.

A kiválasztott gazdasejt-vektor rendszer egy replikációs origó-hiányos SV40 DNS molekulával transzformáit 6V-1 majom-sejtvonal kifejlesztésén alapul [Gluzman, Y.: Cell, 23, 175-182 (1981)]. A hiányos SV40 DNS-t tartalmazó transzformáit majom CV-1 sejtek, amelyeket COS-nak (CV-1, origó-hiányos, SV40) jelölünk, nem tartalmazzák az SV40 genom teljes kópiáját, de nagy mennyiségben termelnek nagy T antigént és megengedik az SV40 DNS replikáciőját. Ezek hatásosan támogatják a korai területben deléciókat tartalmazó SV40 replikáciőját és az olyan bakteriális plazmidok replikációját, amelyek tartalmazzák a replikáció SV40 origóját [Myers, R.

M., Tjian, R.: PNAS 77, 6491-6495 (1980)]. így ez a rendszer átfertőzött exogén DNS-nek SV40-nel közvetített DNS replikáció útján történő amplifikálása eszközét jelenti, abból a célból, hogy növeljük az mRNS mennyiségét és a protein kifejezését az exogén DNS-ről. Más hasonló rendszerek szintén alkalmazhatók.

A CSF kifejezéséhez alkalmazott vektorok, tartalmaznak különböző tipikus elemeket, mint például fokozókat, promotorokat, intronokat, poliadenilezési helyeket, 3’-nemkódoló területeket és transzlációs aktivátorokat, amint ezeket később leírjuk.

Az alkalmazott vektorok tartalmazhatnak fokozókat. A fokozok funkcionálisan eltérnek a promotoroktól, de azokkal összhangban működnek. Sejtbeli funkcióik még nem eléggé ismertek, de egyedülálló az a képességük hogy aktiválják vagy felerősítik az átírást anélkül, hogy hely- vagy orientációfüggőek lennének. A promotoroknak a génen „felfelé” kell lenniük, miközben a fokozok lehetnek a promotortól „felfelé” (5’ felé); a génen belül intronként vagy a géntől „lefelé” a gén és egy poliadenilezési hely között, 3’ felé a poliadenilezési helytől. A fordított promotorok nem funkcionálnak, viszont a fordított fokozok igen. A fokozok „cisz”-működésűek, vagyis a promotorokra csupán akkor hatnak, ha azok azonos DNS szálon vannak jelen. A fokozók (enhancerek) általános tárgyalásával kapcsolatban lásd: Khoury és munkatársai: Cell, 33, 313— 314(1983).

Az emlős sejtekhez előnyös fokozók az állati vírus eredetű fokozók, mint például majom-vírus 40-ből (SV40), polióma vírusból, szarvasmarha papilloma vírusból, retrovírusból vagy adenovírusból származó fokozók. Ideálisan a fokozó olyan vírusból származik, amely a gazdaszervezettől nem idegen, vagyis amely normálisan fertőzi a gazdasejteket. Vírus fokozókat könnyen lehet nyerni a szakirodalom szerint hozzáférhető vírusokból. A fokozó területek sok vírusnál, például a Rous-szarkóma vírusnál és a majom vírus 40nél, jól ismertek, lásd például Luciw és munkatársai: Cell, 33, 705-716 (1983). Egy rutinos molekuláris biológus ezeket a területeket a szóban forgó vírushoz tartozó, publikált restrikciós térkép alapján egyszerűen kivághatja, és szükség esetén módosíthatja a végeket, a fokozók és a vektor összekapcsolása céljából. Lásd például Kaufman és munkatársai: J. Mól. Bioi. 159, 601-621 (1982) és Mól. Cell. Bioi. 2 (11), 1304-1319 (1982). Eljárhatunk úgy is, hogy a fokozót a szekvencia-adatokból szintetizáljuk; a virális fokozók mérete (általában kisebb mint kb. 150 bázispár) megfelelően kicsiny ahhoz, hogy ez a módszer gyakorlatban is végrehajtható legyen.

Egy másik elem, amelynek jelen kell lennie a vektorban, egy poliadenilezési kötő hely. Ez egy olyan DNS szekvencia, amely a gén transzlatált területétől „lefelé” helyezkedik el, és amelytől kevéssel „lefelé” átírási stop-jelek és adenin ribonukleotidok helyezkednek el, hogy egy poliadenin nukleotid farkat alakítsunk ki a hírvivő RNS 3’ végénél. A poliadenilezés fontos a hírvivő RNS stabilizálásában a sejtben történő elbomlás ellen, ami csökkenti a hírvivő RNS mennyiségét és ezáltal a fehérje-termék mennyiségét is.

Az eukarióta poliadenilezési helyek jól ismertek. Egy „konszenzus” szekvencia van az eukarióta gének között: az 5-’AAUAAA-3’ hexanukleotid 11-30 nukleotid távolságra található a poliadenilezés kezdőhelyétől. Poliadenilezési helyeket tartalmazó DNS szekven5

HU 208 711 Β ciákat vírusokból ismert módszerekkel nyerhetünk. Például poliadenilezési szekvenciákat egér béta-globinból és majom-vírus 40 késői vagy korai terület génekből állíthatunk elő, a vírus poliadenilezési helyek előnyösek. Mivel ezek a szekvenciák ismertek, in vitro szintetizálhatjuk és hagyományos módon vektorokhoz ligái hatjuk.

A poliadenilezési helyet a transzlációs stop kodontól előnyösen egy le nem fordított DNS szekvencia, mint például egy promotor nélküli eukarióta gén választja el. Mivel az ilyen szekvenciák és gének nincsenek ellátva promotorral, ezek nem fejeződnek ki. A szekvencia jelentős távolságra terjedhet ki, akár 1000 bázis nagyságrendig terjedő távolságra a stop kodontól a poliadenilezési helyig. A 3’ le nem fordított szekvencia általában a termék kitermelésének növekedését eredményezi. A vektor a konszenzus poliadenilezési szekvenciától mintegy 30 bázispárral „lefelé” fejeződhet be, de a vad-típusú környezetben a poliadenilezési helytől „lefelé” található 3’ szekvenciák előnyösen megmaradnak. Ezek a szekvenciák tipikusan 200-600 bázispárig terjednek, a poliadenilezési helytől „lefelé”

Intronok jelenléte a vektor le nem fordított, átírt részében növelheti a termék kitermelését. Ilyen intronokat a gazdasejttől vagy a gén-forrásoktól eltérő forrásokból nyerhetünk, így például egy, az adenovírus háromrészes vezetőjének második intronjából származó 5’ összeillesztő helyet és az adenovírus nagyobb késői promotorjába az átírási kezdőhelytől „lefelé” beiktatott immunglobulin-génből származó 3’ összeillesztő helyet tartalmazó hibrid intron megnövekedett termék-kitermelést eredményez.

A CSF klónozó és kifejező vektor előnyös kiviteli formájában található egy transzlációs aktivátor gén. A transzlációs aktivátorok olyan gének, amelyek fehérjét vagy RNS-t kódolnak, amelyek azután a kívánt mRNS transzlációjára hatnak. A legjobb példa eme az adenovírussal összekapcsolt (VA) gén (VAI), amely egy rövid RNS fajtába van átírva, amely együttműködik az adenovírus nagyobb késői mRNS-ek 5’ át nem íródó területében lévő szekvenciákkal [Thimmappaya és munkatársai: Cell, 3,5432 (1982)]. A VA RNS-sel való transzlációs aktiváláshoz szükséges szekvenciák az adenovírus késői mRNS háromrészes vezetőjén belül fekszenek. Az adenovírus háromrészes vezető egybeilleszkedik az adenovírus genom nem-hatásos területeivel és az adenovírus nagyobb késői átiratainak 5’ végén van jelen. A VA RNS képes az olyan mRNS-ek transzlációját aktiválni, amelyek háromrészes vezető szekvenciát tartalmaznak. így az előnyös cDNS klónozó és kifejeződő vektor tartalmazza a háromrészes vezető összeillesztett formáját és az adenovírus VA géneket.

Ezeket a vektorokat ismert módon lehet szintetizálni. A vektorok komponenseit, mint a fokozókat, promotorokat és hasonlókat természetes forrásból nyerhetjük vagy szintetizálhatjuk, amint ezt fentebb leírtuk. Alapvetően, ha a komponensek nagy mennyiségben rendelkezésre álló DNS-ben találhatók, mint például vírus-funkciók komponensei, vagy ha ezeket szintetizálni lehet, mint például a poliadenilezési helyeket, akkor restrikciós enzimek megfelelő alkalmazásával nagy mennyiségű vektort lehet nyerni egyszerűen, a forrás-organizmus tenyésztésével, DNS-ének megfelelő endonukleázzal végzett emésztésével, a DNS fragmensek elkülönítésével, a szóban forgó elemeket tartalmazó DNS-ek azonosításával és kinyerésével. A szokásos módon egy transzformációs vektort kis mennyiségben állítunk össze, majd a megfelelő autonóm módon replikálódó szintézis vektorhoz, mint például prokarióta plazmidhoz vagy fághoz ligáljuk. A pBR322 plazmidot alkalmazhatjuk a legtöbb esetben, lásd Kaufman idézett munkáját.

A szintézis-vektorok segítségével a ligáit transzformációs vektorokat hagyományos módon klónozzuk, például egy alkalmas prokarióta organizmus átfertőzésével, a szintézis-vektor nagy példányszámban történő replikációjával és a szintézis vektorok kinyerésével a sejt lízise és a szintézis vektor elkülönítése révén a sejttörmelékből.

A CSF aktivitást előállító sejtekből készített cDNS-t tartalmazó vektorokat azután E. coli-ba átfertőzzük, és Petri-csészében mintegy 2000 telep/lemez mennyiségben szélesztjük. A telepeket átemeljük nitrocellulóz szűrőre, és a szűrőt új lemezre visszük át, amelyet mint alapmintát fenntartunk. Miután ezek a telepek kinőttek, replika-lemezeket készítünk, és az eredetivel azonosítjuk, gondosan bejelölve olyan módon, hogy a replika lemezek szekciói az alapminta lemez megfelelő részével azonosíthatók legyenek.

A replika-lemezeket szekciókra vágjuk úgy, hogy a szekciók előre meghatározott telepszámot tartalmazzanak, előnyösen 200-500 telepet szekciónként. Az egyes szekciókról a telepeket valamilyen tápközegbe, például L-tápközegbe kaparjuk, és a baktériumokat centrifugálással összegyűjtjük, és a plazmid DNS-t elkülönítjük. Az egyes szekciókból származó plazmid DNS-t megfelelő gazdaszervezetbe fertőzzük át fehérje kifejeződéséhez. Szintézis-vektorként előnyösen egy E. coli pBR322 plazmid mutánst alkalmazunk, amelyben hiányoznak azok a szekvenciák amelyek károsak az eukarióta sejtek számára, lásd Kaufman idézett munkáját.

Ennek a mutánsnak az alkalmazásával szükségtelenné válik, hogy a plazmidból az átfertőzés előtt részeket töröljünk. Az átfertőzött sejtek kinövése után a tápközeg CSF aktivitását mérjük. Pozitív eredmény azt jelzi, hogy van egy CSF/cDNS-t tartalmazó telep a szűrő ennek megfelelő részén.

Annak meghatározására, hogy az eredeti alapminta szűrő szekciójának melyik kiónja tartalmaz CSF/cDNS-t, a szűrőszekció minden egyes kiónját felszedjük és növesztjük. A tenyészeteket ezután mátrixhálózatra helyezzük. A mátrix mindegyik vízszintes sorból és függőleges oszlopából tenyészetgyűjteményt készítünk. A tenyészetgyűjteményekből DNS mintákat készítünk és a gazdasejtbe fertőzzük át kifejeződés céljából. A tenyészetgyűjteményekből származó felülúszók CSF aktivitását megmérjük. Egy függőleges oszlop és egy vízszintes sor tenyészetgyűjteménye termelhet CSF aktivitást. Ezekben a közös kiónok tartalmaz6

HU 208 711 Β nak CSF/cDNS-t. Ha a mátrix több mint egy pozitív kiónt tartalmaz, több mint egy oszlop és sor lesz pozitív. Ilyen esetben kisszámú klón további átvizsgálása lehet szükséges.

A klónokból restrikciós enzimekkel kihasítjuk a CSF/cDNS-t, és ismert technikákkal meghatározhatjuk a szekvenciáját. Belátható, hogy az itt leírt eljárást bármilyen forrásból származó CSF/cDNS kinyerésére lehet használni. A találmány szerint CSF/cDNS teljes DNS szekvenciáját az 1. ábrán mutatjuk be a transzlatált CSF fehérje-termék megjósolt aminosav-szekvenciájával együtt.

E találmány szerinti, CSF aktivitást mutató fehérjét kódoló DNS szekvenciát, például az 1. ábrán bemutatott szekvenciát hagyományos technikákkal módosítani lehet, variációkat állítva elő a végső CSF fehérjében, amelyek az itt leírt vizsgálati eljárás szerint mérve még rendelkeznek CSF aktivitással. így például egy, két, három, négy vagy öt aminosavat lehet más aminosavakkal kicserélni. A 898016 lajstromszámú belga szabadalmi leírás ilyen tipikus technikát ismertet cisztein helyettesítésére például szerinnel.

A jelen találmány értelmében a CSF/cDNS magában foglalja a természetes CSF/cDNS gént, amelyet egy ATG kodon előz meg, valamint a CSF fehérje alléi variációit kódoló CSF/cDNS-eket. Egy alléit az

1. ábrán mutatunk be. Kutatásaink során találtunk egy másik alléit, amely a 365. helynél az 1. ábrán mutatott citozín helyett timidint tartalmaz. A találmány szerinti CSF fehérje magában foglalja a CSF fehérje 1-metionin származékát (Met-CSF) és a CSF fehérje alléi variációit. Az 1. ábrán bemutatott szekvencia szerinti érett CSF fehérje Ala-Pro-Ala-Arg... szekvenciával kezdődik, amelynek kezdete egy nyíllal van megjelölve az 1. ábrán az 59. számú nukleotidnál. A Met-CSF a Met-Ala-Pro-Ala-Arg.„ szekvenciával kezdődik.

Az 1. ábrán bemutatott alléi variáció a 100. aminosav helynél (az Ala-nál kezdve a nyíl után) Thr-t tartalmaz, ezt CSF(Thr)-nek nevezzük. Egy másik variáció Ile-t tartalmaz a 100. helynél, ezt CSF(Ile)-nek nevezzük. A találmány szerinti tisztított fehérje legalább 10⁷ egység/mg fehérje és előnyösen legalább 4xl0⁷ egység/mg fehérje fajlagos aktivitást mutat, amikor humán csontvelő-sejtekkel mérjük.

A CSF kifejeződéséhez a gazda-vektor rendszer lehet prokarióta vagy eukarióta, de a CSF komplexitása miatt előnyös az emlős gazda-vektor rendszer. A kifejeződést könnyen végre lehet hajtani a prokarióta vagy eukarióta sejtek megfelelő CSF vektorral végzett transzformálásával. A fentebb leírt eljárással nyert DNS szekvenciát közvetlenül ki lehet fejezni emlős sejtekben megfelelő promotor szabályozása alatt. Ehhez ismert heterológ promotorokat alkalmazhatunk. A CSF prokarióta vagy élesztő sejtekben történő kifejezéséhez a vezető szekvenciát (vagy kiválasztó szekvenciát) el kell távolítani. (Az érett CSF fehérje N-terminálisához szolgáló kodon helyzetét az

1. ábrán bejelöltük). Ezt ismert technikákkal lehet elvégezni. Ha a kívánt CSF/cDNS kiónt megkaptuk, ismert és alkalmas módon kifejezzük a CSF fehérjét, például beiktatás egy megfelelő vektorba, és a vektor átfertőzése a megfelelő gazdasejtbe, a transzformált sejtek szelektálása és ezeknek a transzformánsoknak a tenyésztése CSF aktivitás kifejezésére. Megfelelő gazdasejtek például a baktériumok, például E. coli, élesztő, emlős sejtek, például CHO sejtek, és rovarsejtek. Az így előállított CSF fehérje metionint tartalmazhat a fehérje N-terminálisánál (ezt hívjuk MetCSF-nek). A prokarióta és eukarióta sejtek által termelt érett fehérje egyébként aminosav összetételben azonos, de az eukarióta termék glikozilezve lehet a természetessel azonos vagy attól eltérő mértékben. A CSF fehérje különböző hagyományos kinyerési módszereit az alábbi példákban mutatjuk be. Szakember számára nyilvánvaló, hogy más módszerek vagy anyagok, például vektorok is használhatók.

A megfelelő prokarióta vagy eukarióta sejtekben kifejezett CSF fehérjét ismert tisztítási és elkülönítési technikákkal lehet kinyerni. Amint jeleztük azonban, a találmány tárgykörébe tartozik egy tisztítási eljárás is, amely lehetővé teszi, hogy a CSF fehérjét - akár rekombináns, akár természetes forrásból ered - nagy tisztasággal és aktivitással kaphassuk meg.

A találmány tárgya tehát - a technika jelenlegi állásának problémái kiküszöbölése mellett - eljárás CSF aktivitású fehérje tisztítására. A találmány szerinti CSF fehérje legalább lxlO⁷ egység/mg fehérje, előnyösen 2xl0⁷ egység/mg fehérje, még előnyösebben legalább 4xl0⁷ egység/mg fehérje aktivitással rendelkezik, amikor a humán csontvelő méréssel mérjük.

A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a CSF fehérjét 80%-os telítésig adagolt ammóniumszulfáttal kicsapjuk, így a CSF fehérjét tartalmazó üledéket képezünk; az üledéket mintegy 6-8 pH tartományban levő pufferolt oldatban újra szuszpendáljuk; a CSF-et tartalmazó pufferolt oldatot kromatografáló oszlopra visszük; nátrium-kloridot tartalmazó pufferolt oldattal eluáljuk, és a CSF aktivitással rendelkező frakciókat összegyűjtjük; az aktív frakciókat egyesítjük, C4 fordított fázisú oszlopra visszük, 090% acetonitril gradienssel eluáljuk és az aktív frakciókat összegyűjtjük.

Az 5. ábra a tisztított CSF fehérje SDS (nátriumdodecilszulfát) - PAGE elemzését mutatja.

A találmány szerinti eljárással tisztítandó CSF fehérje bármilyen fentebb leírt természetes forrásból, mint a rekombináns DNS eljáráshoz szolgáló kiindulási forrásból, például a Mo sejtvonalból vagy az UCD MLA-144 gibbon sejtvonalból származhat.

Eljárhatunk úgy is, hogy a CSF fehérjét a találmány szerinti rekombináns DNS technikákkal állítjuk elő.

Bármilyen forrásból származó CSF-et lehet tisztítani a találmány szerinti eljárással. A CSF-fehérje forrásból származó közeget előnyösen ultraszűréssel legalább 0,1 mg fehérje/ml koncentrációra koncentráljuk. A fehérjét azután kicsapjuk úgy, hogy a koncentrátumhoz ammónium-szulfátot adunk 80%-os telítettségig. Az így létrejött üledéket mintegy 6-8 pH-jú vizes,

HU 208 711 Β pufferolt oldatban újra szuszpendáljuk. Az erre alkalmas pufferok lehetnek például a Tris-HCl, HEPES, nátrium-citrát pufferok stb.

A pufferolt oldatokat oszlopkromatográfiával frakcionáljuk. A kromatográfiás oszlopban való alkalmazáshoz megfelelő anyagok az oktil-szefaróz, DEAE-ultrogél, AcA44 ultrogél, AcA-54 ultrogél és hasonlók. Ezekből az anyagokból egyet vagy többet egymás után is lehet alkalmazni, hogy nagyobb tisztaságot érjünk el.

Az egyes oszlopokról származó frakciókat összegyűjtjük és CSF aktivitásra megvizsgáljuk. Az aktív frakciókat egyesítjük és trifluor-ecetsavval (TFA), heptafluor-vajsavval (HFBA) vagy hasonlókkal hígítjuk, és C4 fordított fázisú oszlopra visszük fel. A CSF aktivitású anyagokat ezután FRA-ban vagy HFBA-ban lévő 0-90% acetonitril-gradienssel eluáljuk, előnyösen 0,10%, illetve 0,15% (térf./térf.) koncentrációnál, attól függően, milyen savat alkalmaztunk az egyesített frakciók felviteléhez az oszlopra.

A CSF aktivitással rendelkező frakciókat SDS poliakrilamid gél elektroforézissel elemezzük [13,5% gél, amint ezt Laemmli, U. leírta: Natúré, 227, 680 (1970)]. A fentebb említett kromatográfiás oszlop anyagok segítségével végzett további kezelésekkel homogenitás szempontjából tovább tisztítható a CSF fehérje.

Az SDS-PAGE-vel frakcionált tisztított CSF fehérje egy mintegy 15 000-26000 dalton látszólagos molekulatömeggel bíró heterogén CSF fehérje. Ez a látszólagos méret-heterogenitás a fehérje erőteljes glikozilezésének tulajdonítható és ez a glikoproteinek közös vonása. A Mo sejtek tenyésztési közegéből származó kevésbé tisztított minták frakcionálása és a gélből eluált fehérjék mérése egy második, CSF aktivitással bíró fehérjét mutat, amelynek látszólagos molekulatömege mintegy 28 000-30000.

A CSF aktivitás kötődik és eluálódik oktil-szefarózról, DEAE-ultrogélről és a C4 fordított fázisú oszlopról. A CSF aktivitás durván 60%-a kötődik Con-A-szefarózhoz (40% keresztülhalad) és alfa-metil-mannoziddal lehet eluálni.

Rekombináns CSF-ek gélszűréssel, alacsony sókoncentrációnál végzett molekulatömeg elemzése azt mutatja, hogy az aktivitás 30%-a mintegy 19000 becsült molekulatömeggel eluálódik, de az anyag 70%-a dimerként viselkedik, amely a mintegy 38 000 molekulatömegnek megfelelő helyen eluálódik. Ha 1 mól/literes NaCl is van az oszlopban, a teljes aktivitás széles csúcsban, mintegy 19 000 daltonnái eluálódik.

A tisztított CSF legalább 16 órán át stabil, amikor 4 °C hőmérsékleten, pH = 7,4-nél inkubáljuk 4 mól/literes guanidin-hidrokloridban, 10 mmól/liter EDTAban, 10 mmól/liter merkapto-etanolban és 30% (térf./térf.) etanolban. A CSF aktivitás stabil 0,1% trifluor-ecetsavban (TFA) (pH = 2,0) és 0,1% TFA + 25% (térf./térf.) acetonitrilben is.

Amint fentebb említettük, a találmány szerinti eljárással előállított CSF fehérje a mielo-szuppresszió, például a rák kemoterápiás vagy besugárzásos kezelése által okozott (szimptomatikus) granulocitopénia kezelésében alkalmazható. Ezenkívül a találmány szerinti eljárással előállított CSF fehérje súlyos fertőzések kezelésében való felhasználáshoz is javallható. Ilyen alkalmazás esetében a tipikus dózis előnyösen 200-1000 pg/beteg. A CSF fehérjét megfelelő gyógyászati hordozóval együtt előnyösen intravénás injekció formájában adagoljuk. Ilyen hordozó például a farmakológiai fiziológiás sóoldat, és a humán szérum albumin fiziológiás sóoldatban.

Ezenkívül a találmány szerinti CSF fehérjék más aktivitásokkal és alkalmazási lehetőségekkel is rendelkeznek. így például kimutatták, hogy a rágcsáló CSF-ek aktiválják a neutrofileket. így elvárható, hogy a jelen találmány szerinti főemlős CSF-ek szintén aktiválják a neutrofileket. Ennek megfelelően a CSF sokféle fiziológiai funkciót mutathat. A csontvelőben a limfokin stimulálhatja az effektor sejtek burjánzását és differenciálódását a gazdaszervezet védelmére, míg a perifériás területeken az új és meglévő sejtek aktiválódhatnak. Egy lokalizált immunológiai válaszban a CSF fenntarthatja vagy távol tarthatja a cirkuláló neutrofileket a gyulladásos területeken. A neutrofilek nem megfelelő lokalizálódása és aktiválódása szerepet játszhat az immun-közvetített rendellenességek, mint például a reumatoid artritisz patofiziológiájában.

A találmány szerinti megoldást a következő példákkal szemléltetjük a korlátozás szándéka nélkül.

A példákban, hacsak másképpen nem jelezzük, a hőmérsékleteket °C-ban adjuk meg.

A restrikciós endonukleázokat olyan körülmények között és olyan módon használjuk, ahogyan ezt kereskedelmi forgalmazója ajánlja. A ligálási reakciókat olyan módon hajtjuk végre, amint ezt Maniatis és munkatársai leírták fentebb idézett munkájukban a 245246. oldalon, azt a puffért alkalmazva, amely az idézett munka 246. oldalán található, és 1-100 pg/ml DNS koncentrációt alkalmazva, 23 °C hőmérsékleten a „tompa” végű DNS-nél és 16 °C hőmérsékleten a „ragadós” végű DNS-nél. Az elektroforézist 0,5-1,5%-os agaróz gélben végezzük, amely 90 mmól/liter Trisz-borát puffért és 10 mmól/liter EDTA-t tartalmaz. Minden radioaktívan jelzett DNS-t ³²P-vel jelzünk, bármilyen jelölési technikát alkalmazunk.

A „gyors preparátum” a bakteriofág vagy plazmid DNS gyors, kis mennyiségű előállítását jelenti, például ahogyan ezt Maniatis és munkatársai leírták a fentebb idézett munkájukban a 365-373. oldalon.

A) példa

1. lépés

Mo-sejtvonal-tenyészetek

Mo sejteket (ATCC CRL 8066) növesztünk szokásos módon Alpha (6% CO₂) vagy Iscove (10%) tápközegben, amely 20% borjúembrió szérumalbumint (FCS), 2 mmól/liter glutamint, 1000 egység/ml sztreptomicint és 100 pg/ml penicillint tartalmaz. A sejteket

4-5 naponként új tápközegre oltjuk át. A sejteket meg8

HU 208 711 B számoljuk, és Falcon T-175 palackokba, 100-150 ml tápközegbe 3-4xl0⁵ sejt/ml sűrűséggel átoltjuk. A sejtek 20% FCS-ben 4-7 naponként megduplázódnak. A növekedési sebesség nem állandó, és úgy tűnik, hogy a sejtek néha megállnak a növekedésben, majd átmennek robbanásszerű növekedésbe. A Mo sejtek növekedhetnek szérummentes tápközegben. A túlélés sokkal jobb, ha a sejteket nem mossuk, amikor átvisszük FCS-ből szérummentes tápközegbe. Az optimális sűrűség a szérummentes tápközegben (SF) 5xl5⁵ sejt/ml. A sejtek három napig gyengén nőnek (vagy legalábbis fenntartják az állandó számot) szérummentes tápközegben, majd ezeket a sejteket 20%-os FCS-sel tápláljuk legalább 4 napig. Ez a növesztési program (3 nap SF, 4 nap 20% FCS) több hónapon át hetenként ismételhető, ha SF tápközeg szükséges, anélkül, hogy a sejtek láthatóan károsodnának.

2. lépés

A CSF aktivitás mérése

A) Csontvelő-mérés

Friss csontvelőt szerzünk be. Rostokká foszlatjuk, 20, 22, majd 25 kaliberű tűkön áthúzva. Szobahőmérsékleten 1:1 arányban hígítjuk steril, foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldatban (PBS), és Ficoll-Paque-ra rétegezzük (mintegy 30 ml csontvelő-PBS 6 ml Ficollra). 1500 fordulat/perccel centrifugáljuk 40 percen át szobahőmérsékleten. A zsír- és PBS réteget eltávolítjuk és eldobjuk. A kis sűrűségű réteget kipipettázzuk. Kétszer mossuk PBS-sel, és megszámoljuk a sejteket. A sejteket RPMI tápközegre (ez a GIBCO-nál szerezhető be RPMI 1640 néven) szélesztjük 3 órára, hogy eltávolítsuk a hozzátapadt sejteket.

A lemez-képző tápközeg összetétele (frissen készítendő):

20% FCS

0,3% H₂O-ban oldott agar, 40 °C hőmérsékletre lehűtve,

2xlscove tápközeg (1:1 térf./térf. arányban agarral keverve),

1% végső koncentráció mintánként 100 egység/ml sztreptomicinből és 100 μg/ml penicillinből,

10^-4 mól/liter alfa-tioglicerin 2xlscove tápközegben 10“² mól/literes törzsoldatból.

Az agart körülbelül 40 °C hőmérsékletre lehűtjük, összekeverjük a többi alkotórésszel. Vízfürdőben 3738 ’C hőmérsékletre hűtjük és ezen a hőmérsékleten tartjuk.

óra múlva a nem tapadt sejteket lepipettázzuk, majd centrifugáljuk és megszámoljuk. Hozzáadunk 2xl0⁵/sejt/ml sűrűség eléréséhez lemez-képző tápközeget, és 37-38 °C hőmérsékletű szabályozható vízfürdőn tartjuk. A mintákat (párhuzamost is végezve) mikrotitráló lemez üregeinek első sorába adjuk (a minta például az átfertőzött sejtekből származó tápközeg, általában 10 μΐ minta). 100 μΐ sejtszuszpenziót adunk minden egyes üreghez. Az első sorban lévő üregekbe további 50 μΐ sejtszuszpenziót adunk. Alaposan összekeverjük, és átviszünk 50 μΐ oldatot az első sorból a következő sorba stb., és folytatjuk az 1:3 arányú hígítást a lemezen végig. A lemezt parafilmmel beburkoljuk. 10-14 napig 10% CO₂-ben, 37 °C hőmérsékleten, teljesen párásított atmoszférában inkubáljuk, és megjelöljük a telepeket.

A telepek jelölésekor a telepek teljes számát megszámoljuk az egyes üregeken. Minden mérésnél néhány üregben úgy alakítunk ki lemezt, hogy ez nem tartalmaz mintát (vak), így kapjuk meg a háttér-telepszámot. A vak üregekben nőtt telepek átlagos számát kivonjuk a mintákat tartalmazó egyes üregekben talált telepek számából. A CSF egység az a mennyiség, amely egy telep képződését stimulálja a háttér-szinten túlmenően, 10⁵ humán csontvelősejtre számolva (10⁵ sejt/ml koncentrációban szélesztve), amikor a CSF koncentráció nem éri el a telítettséget. A telítés alatti koncentrációt hígítással határozzuk meg, és a különböző hígításoknál lévő telepszámokat összehasonlítjuk, hogy megtaláljuk azt a koncentrációt, amely éppen a telítési szint alatt van.

Ennél a mérésnél a granulocitákat, monocitákat vagy mindkét típusú sejtet tartalmazó telepeket számoljuk meg. A sejtek típusát a telepekben a telepek felszedésével és az egyedi sejtek megfestésével határozzuk meg,

B) KG-1 sejt meghatározás

KG-1 sejteket [Blood, 56, (3) (1980)] növesztünk Iscove-tápközegben, amely 10% FCDS-t is tartalmaz, hetenként kétszer átoltva és minden átoltást 2X10⁵ sejt/ml-rel inokulálva. A sejteket csak a 30-35 átoltás (passzálás) között használjuk fel. A meghatározási módszer ugyanaz, mint amelyet fentebb a csontvelősejteknél leírtunk, azzal az eltéréssel, hogy az agar keverékben 4xl0³ sejt/ml-t helyezünk lemezre.

Az egyes üregekben növekvő telepek számát meghatározzuk, és a háttér-számot ugyanúgy kivonjuk, mint ahogyan ezt fentebb leírtuk a csontvelő-mérésnél. 1 KG1 CSF egység/ml a CSF-nek az a koncentrációja, amely a KG-1 telepek maximális száma (telítettség) felét növekedésre stimulálja. A maximális számot számos üregben mért CSF telítettségi szint beszámításával kapjuk meg.

3. lépés

A p9J023(B) vektor megalkotása

Kaufman és munkatársai leírták [Mól. Cell. Bioi. 2(11), 1304-1319 (1982)] a pAdD26SVpA(3) transzformációs vektort. Ez a 2. ábrán bemutatott szerkezettel bír. Röviden ismertetve, ez a plazmid tartalmaz egy egér dihidrofolát-reduktáz (DHFR) cDNS gént, amely az adenovírus 2 (Ad2) nagyobb késői promotorának átírási szabályozása alatt áll. Az adenovírus DNS egy 5’ összeillesztő helyet és egy az immunglobulin génből származó 3’ összeillesztő helyet tartalmaz az Ad2 nagyobb késői promotor és a DHFR kódoló szekvencia között. Az SV40 korai poliadenilező hely a DHFR kódoló szekvenciától „lefelé” van jelen. A pAdD26SVpA(3)prokarióta-eredetű része a pSVOd-ből ered [Mellon, P., Parker, V., Gluzman, Y. és Maniatis, T.: Cell, 27, 279-288 (1981)], és nem tartalmazza a pBR322 szekvenciákat, amelyekről ismertek, hogy gátolják a replikációt az emlős sejtek9

HU 208 711 Β ben [Lusky, M., és Botchan, M.. Natúré (London), 293,79-81 (1981],

A pAdD26SVpA(3)-at átalakítjuk pCVSVL2 plazmiddá, amint ezt a 2. ábrán ábrázoljuk. A pAdD26SVpA(3)-at pAdD26SVpA(3)(d)-vé alakítjuk úgy, hogy a pAdD26SVpA(3)-ban lévő két PstI hely egyikét töröljük. Ezt úgy végezzük, hogy Pstlgyel részlegesen emésztjük, gyengébb enzimaktivitást használunk, így linearizált plazmidok szubpopulációját nyerjük, amelyben csupán egy PstI hely van hasítva, [Current Protocols in Molecular Biology 7,

3.1.6 (szerk.: Ausubel, Brooklyn, New York)], majd Klenow-fragmenssel kezeljük, a plazmidot újra kör alakúvá ligáljuk, E. coli-ba transzformáljuk, és az SV40 poliadenilezési szekvencia 3’ végénél elhelyezkedő PstI hely deléciójára nézve átvizsgáljuk.

Az adenovírus háromrészes vezetőt és a vírus géneket (VA gének) beiktatjuk a pAdD26SVpA(3)(d)-be, amint ezt a 2. ábrán bemutatjuk. Először a pAdD26SVpA(3)(d)-t PvuII-vel hasítva lineáris molekulát alakítunk ki, amely a háromrészes vezetőt tartalmazó három elem első elemének 3’ részén belül van kinyitva. Ezután pJAW 43-at [Zain és munkatársai: Cell, 76, 851 (1979)] emésztünk Xhol-gyel, Klenow-fragmenssel kezeljük, PvuII-vel emésztjük, és a második vezetőt és a harmadik vezető egy részét tartalmazó 140 bázispáros fragmenst elektroforézissel akrilamid gélen izoláljuk [6%, Trisz-borát pufferban; lásd Maniatis fentebb idézett munkáját (1982)]. A 140 bp-s fragmenst azután a PvuII-vel emésztett pAdD26SVpA(3)(d)-hez ligáljuk. A ligálási termékkel E. colit tetraciklin-rezisztenssé transzformálunk, és a telepeket a Grunstein-Hogness eljárással vizsgáljuk át, a 140 bázispáros fragmenshez hibridizálódó, ³²P-vel jelzett vizsgáló mintát alkalmazva. A pozitívan hibridizáló telepekből a DNS-t kinyerjük, és megvizsgáljuk, hogy a helyreállított PvuII hely a beiktatott második és harmadik adenovírus késői vezetőre fajlagos, 140 bázispáros DNS 5’ vagy 3’ oldalán van-e. Helyes orientációban a PvuII hely a 140 bázispáros beiktatott rész 5’ oldalán van. Ezt a plazmidot a 2. ábrán pTPL-nek nevezzük.

Az SV40 fokozó szekvenciát tartalmazó SV40 Avall D fragmensét úgy nyerjük, hogy az SV40 DNS-t [Gluzman, Y., Cell, 23, 179-182 (1981)], Ava

II-vel emésztjük, a végeket Poll Klenow-fragmensével tompává tesszük, a fragmensekhez Xhol kapcsolókat (linkereket) ligálunk, Xhol-gyel emésztünk az Xhol helyek kinyitása céljából, és a negyedik legnagyobb (D) fragmenst gélelektroforézissel izoláljuk. Ezt a fragmenst azután Xhol-gyel hasított pTPL-hez ligáljuk, így kapjuk a pCVSVL2-TPL plazmidot. Az SV40 D fragmens orientációja a pCVSVL2-TPL-ben olyan, hogy az SV40 késői promotor azonos orientációban van, mint az adenovírus nagyobb késői promotor.

Hogy bevezessük az adenovírus vírus-kapcsolt (VA) géneket a pCVSVL2-TPL-be, először olyan pBR322 plazmidot alkotunk meg, amely tartalmazza a

2. adenovírus típus HindlII B fragmensét. A 2. típusú adenovírus DNS-t HindlII-mal emésztjük és a B fragmenst gélelektroforézis útján izoláljuk. Ezt a fragmenst azután beiktatjuk pBR322-be, amelyet előzőleg HindlII-mal emésztettünk. E. coli ampicillin-rezisztenssé transzformálása után a rekombinánsokat HindlII B fragmens beiktatására átvizsgáljuk, és a beiktatási orientációt restrikciós enzimes emésztéssel meghatározzuk. A pBR322-Ad HindlII B a 2. adenovírus típus HindlII B fragmensét a 3. ábrán bemutatott orientációban tartalmazza.

Amint a 3. ábrán bemutatjuk, a VA géneket megkaphatjuk a pBR322-Ad Hind III B plazmidból olyan módon, hogy Hpal-gyel emésztjük, EcoRI linkereket adunk hozzá és EcoRI-gyel emésztjük, és az 1,4 kb-s fragmenseket kinyerjük. Az EcoRI ragadós végekkel bíró fragmenst azután előzőleg EcoRI-gyel emésztett pTPL EcoRI helyére ligáljuk. Az E. coli HB101 transzformálása és a tetraciklin-rezisztencia alapján végzett szelekció után a telepeket a VA génekre fajlagos DNS vizsgáló mintához való szűrő-hibridizálás alapján átvizsgáljuk. A pozitívan hibridizálódó kiónokból a DNS-t kipreparáljuk és restrikciós endonukleázos emésztéssel jellemezzük. A plazmid terméket p91023nak nevezzük.

A két EcoRI helyet a p91023-ban eltávolítjuk. A p91023-at teljesen elhasítjuk EcoRI-gyel, két DNS fragmenst hozunk létre, az egyik mintegy 7 kb-s fragmens, és a másik a VA géneket tartalmazó mintegy 1,3 kb-s fragmens. Mindkét fragmens végeit betöltjük a Poll Klenow-fragmense segítségével, majd mindkét fragmenst, azaz az 1,3 kb-s és 7 kb-s fragmenseket újra egybe ligáljuk. Ap91023(A) plazmidot, amely tartalmazza a VA géneket és hasonlít a p91023-hoz, de a két EcoRI hely hiányzik belőle, Grunstein-Hogness átvizsgálással azonosítjuk a VA gén fragmenssel, valamint hagyományos restrikciós hely analízissel.

Ezután a p91023(A)-ban az egyedi PstlI helyet eltávolítuk és EcoRI hellyel helyettesítjük. A p91023(A)-t Pstl-gyel teljes mértékben elhasítjuk, majd Poll Klenow-fragmensével kezeljük, tompa végeket alakítva ki. EcoRI linkereket ligálunk a p91023(A) tompa PstI helyére. A lineáris p91023(A)-t, amely tompa végűvé tett PstI helyhez kapcsolt EcoRI linkereket tartalmaz, elválasztjuk a nem ligáit linkerektől, és teljességig emésztjük EcoRI-gyel, majd visszaligáljuk. A p9lO23(B) plazmidot kinyerjük, és megállapítjuk, hogy a P91023(A)-hoz hasonló szerkezettel rendelkezik, de tartalmaz EcoRI helyet ott, ahol korábban PstI hely volt.

4. lépés cDNS könyvtár elkészítése

MO sejteket 16-20 órán át fitohemagglutinnel (PMA) és forbol-mirisztát-acetáttal (PMA) indukálunk, hogy fokozzuk limfokin-termelésüket. A sejteket lemezre visszük 5xl0⁵ sejt/ml koncentrációban Iscove tápközegben, amely 20% FCS-t, 0,3% (térf./térf.) PHA-t és 5 ng/ml TPA-t is tartalmaz.

HU 208 711 Β

A sejteket centrifugálással összegyűjtjük. Az üledékben lévő sejteket újra szuszpendáljuk 20 ml jéghideg lizáló pufferben (RSB puffer. 0,01 mól/liter TriszHCl, pH 7,4, 0,01 mól/liter KC1, 0,0015 mól/liter MgCl₂, 1 gg/ml cikloheximid, 50 egység/ml RNA-zin és 5 mmól/liter ditiotreitol). A sejteket jégen tartjuk 5 percig, majd szorosan illeszkedő Dounce-üveg homogenizáló 10 menetével mechanikusan szétzúzzuk. A homogenizátumot kis sebességnél centrifugáljuk (2000 fordulat/perc Beckman J6 centrifugában), hogy eltávolítsuk a sejtmagokat és a nem lizált sejteket. A felülúszót jégen tartjuk, a sejtmagokból álló üledéket pedig újra szuszpendáljuk 10 ml RSB-ben, és újra centrifugáljuk kis sebességnél. Ezt a második felülúszót egyesítjük az elsővel, és az egyesített felülúszókat kis sebességgel centrifugáljuk, hogy eltávolítsuk a sejtmagokat és a nem lizált sejteket tartalmazó maradék szenynyezéseket. Az ebből a centrifugálásból származó felülúszó KCl-koncentrációját 0,15 mól/literre állítjuk be 2 mól/literes KC1 hozzáadásával, majd nagy sebességnél centrifugáljuk (25 000 fordulat/perc, Beckman SW 28 rotor, 30 perc), hogy a membránokat üledékbe vigyük. A membrán-üledéket gondosan mossuk hideg RSB-vel, amely 2 mól/liter szacharózt és 1,15 mól/liter KCl-t is tartalmaz. Két szakaszos gradienst készítünk Beckman SW41 centrifuga-csövekben, 2 mól/liter szacharóz oldatban lévő 6 ml membrán-oldatot rétegezve 2 ml RSB fölé, amely 2,5 mól/liter szacharózt és 0,15 mól/liter KCl-t is tartalmaz. A csöveket tetejükig töltjük 2,5 ml RSB fölérétegezésével, amely 1,3 mól/liter szacharózt és 0,15 mól/liter KCl-t is tartalmaz. Ezeket a gradienseket 4 órán át forgatjuk 27000 fordulat/percnél (Beckman, SW41 rotor), 4 °C hőmérsékleten. A 2,0 mól/liter és 1,3 mól/liter szacharóz közötti határfelületnél található membránréteget oldalról gondosan eltávolítjuk, 18-as tűt és fecskendőt alkalmazva. A két gradiensből származó membrán frakciókat egyesítjük és 1 térfogat desztillált vízzel hígítjuk, majd koncentrációját Triton Χ-100-ra nézve 0,5%-ra és nátrium-dezoxikolátra nézve 0,5%-ra állítjuk be, majd azonos térfogatú fenollal extraháljuk. A vizes réteget újra extraháljuk fenol-kloroform 1:1 elegyével, végül azonos térfogatú kloroformmal. Végül a membránnal kötött RNS-t NaCI (0,25 mól/liter koncentrációig) és

2,5 térfogat hideg etanol hozzáadásával, majd egy éjszakán át -20 °C hőmérsékleten végzett inkubálással kicsapjuk. A kicsapott RNS-t centrifugálásal összegyűjtjük (4000 fordulat/perc, 10 perc Beckman J-6 centrifugában) és újra szuszpendáljuk 1 ml desztillált vízben. 2xl0⁹ sejtből mintegy 1 mg RNS-t nyerünk. A hírvivő RNS-t (mRNS) a teljes RNS-től 0,5 ml oligodT-cellulóz oszlopon kromatográfiásan izoláljuk. Ezt röviden ismertetve a következő éppen végezzük: az RNS-t 70 °C hőmérsékleten 5 percen át melegítjük, jégen gyorsan lehűtjük, majd ötszörösére hígítjuk kötő pufferral (0,5 mól liter Trisz-HCl, pH 7,4, 0,002 mól/liter EDTA, és 01% SDS). A kötő-pufferban lévő RNS-t átengedjük a kötő-pufferral kiegyensúlyozott oligodT-cellulóz oszlopon, szobahőmérsékleten. Az oszlopot 5 ml kötő-pufferral, majd 5 ml 0,15 mól/liter LiCl-t, 0,01 mól/liter Trisz-HCl-t (pH 7,4), 0,002 mól/liter EDTA-t és 0,1% SDS-t tartalmazó oldattal mossuk. Az mRNS-t NaCI (0,25 mól/liter koncentrációig) és 2,5 térfogat hideg etanol hozzáadásával, és egy éjszakán át -25 °C hőmérsékleten inkubálva kicsapjuk. A kicsapott mRNS-t centrifugálással összegyűjtjük (30 000 fordulat/perc 30 percen át Beckman SW55 rotorban). A csöveket gondosan kiürítjük és az mRNS üledéket újraszuszpendáljuk 50 ml H₂O-ban. Az újra szuszpendált mRNS NaCl-koncentrációját 0,25 mól/liter-re állítjuk be, majd extraháljuk egyszer fenol-kloroform 1:1 arányú eleggyel, majd háromszor kloroformmal. Az mRNS-t 2,5 térfogat etanol hozzáadásával kicsapjuk. A keveréket lefagyasztjuk és felengedtetjük több ízben szárazjég-etanolos fürdőben, majd 15 percig centrifugáljuk Eppendorf-centrifugában. A csövet gondosan kiürítjük, és az mRNS üledéket újra szuszpendáljuk 20 μΐ desztillált H₂O-ban. A végső kitermelés mintegy 30 gg mRNS.

A cDNS első szálát hagyományos módszerekkel készítjük - röviden ismertetve - úgy, hogy 10 gg membrán mRNS-t hígítunk 100 gl cDNS szintézis reakciókeverékkel, amely 300 mmól/liter Trisz-t (pH

8,4), 140 mmól/liter KCl-t, 10 mmól/liter dATP-t, dGTP-t, dCTP-t és dTTP-t, 5 gg oligodT-t (foszforilezett formában és 12-18 bp átlagméret) mint prímért, 150 gCi ³²P-dCTP-t (400 Ci/mmól) és 20 egység ribonukleáz RNA-zint tartalmaz. A reakciót 10 egység reverz transzkriptázzal indítjuk be, és 30 percen át inkubáljuk 42 °C hőmérsékleten. A reakciót EDTA 40 mmól/liter koncentrációig történő hozzáadásával állítjuk le, és az RNS-t 20 percen át 65 °C hőmérsékleten 0,2 mól/liter NaOH-ban végzett inkubálással lebontjuk. A bázist 20 gl 2 mól/literes Trisz (pH 7,4) hozzáadásával semlegesítjük. A reakciókeveréket azután fenol/kloroformmal extraháljuk, az extraktumot visszaextraháljuk 50 gl 10 mmól/liter Trisz-t (pH 7,5) és 1 mmól/liter EDTA-t tartalmazó oldattal (TE), és a vizes fázisokat egyesítjük. Az első cDNS szálat kétszálú cDNS-sé alakítjuk olyan módon, hogy 12 órán át 16 °C hőmérsékleten inkubáljuk 40 egység DNS polimeráz I Klenow-fragmenssel 100 gl reakciókeverékben, amely 50 mmól/liter kálium-foszfátot (pH 7,4), 2,3 mmól/liter DTT-t, 2-merkapto-etanolt, 10 mmól/liter MgCl₂-t, 150-150 gmól-t a négy dezoxinukleotid-trífoszfátból, és 25 gCi ³²P-dCTP-t tartalmaz. A reakciót fenol/kloroformmal végzett extrakcióval állítjuk le, és a be nem épült trifoszfátokat eltávolítjuk olyan módon, hogy a vizes fázist átengedjük egy 1 ml-es Sephadex G-50 oszlopon. A kizárt frakciókat összegyűjtjük és etanollal kicsapjuk.

A cDNS üledéket hideg etanollal mossuk, majd újra szuszpendáljuk 200 gl, 20 mmól/literes Trisz-t (pH 8,0), 1 mmól/liter EDTA-t, 80 gmól/liter S-adenozilmetionint és 300 egység EcoRI metilázt tartalmazó oldatban és 60 percen át 37 °C hőmérsékleten tartjuk. A reakciót fenol/kloroformmal végzett extrakcióval állítjuk le, és a metilezett cDNS-t etanolos kicsapással gyűjtjük össze.

A cDNS üledéket 70%-os etanollal átöblítjük, majd

HU 208 711 Β újra szuszpendáljuk 200 pl SL pufferban (lásd: Maniatis és munkatársai) és inkubáljuk 200 egység SÍ-nukleázzal 30 ’C hőmérsékleten 30 percen át. A reakciót fenol/kloroformmal végzett extrakcióval állítjuk le, és a cDNS-t etanolos kicsapással gyűjtjük össze.

A kétszálú cDNS-t tompavégűvé alakítjuk 100 μΐ reakciókeverékben, 30 percen át szobahőmérsékleten végzett inkubálással, a reakciókeverék összetétele: 200 mmól/liter Trisz (pH 7,4), 50 mmól/liter NaCl, 10 mmól/liter 2-merkapto-etanol, és 500-500 pmól/liter mind a négy dezoxi-nukleotid-trifoszfátból. A reakciót fenol/kloroformmal végzett extrakcióval leállítjuk, és a cDNS-t etanolos kicsapással összegyűjtjük.

A cDNS-t ezután 50 μΐ T4 ligáz pufferban (Maniatis és munkatársai) ligáljuk 500 pmól RÍ linkénél, amely a New England Biolabs terméke (szekvenciája: pCGGAATTCCG), 2000 egység T4 ligázt alkalmazva egy éjszakán át 16 °C hőmérsékleten. A reakciót 70 ’C hőmérsékleten 20 percen át végzett inkubálással leállítjuk, majd 300pl-re hígítjuk úgy, hogy a végső sókoncentráció NaCl-re 0,1 mól/liter, MgCl₂-re 10 mmól/liter és TriszHCl-re (pH 7,4) 50 mmól/liter legyen. A cDNS-t azután 2 percen át 37 ’C hőmérsékleten emésztjük 700 egység EcoRI-gyel. A reakciót fenol/kloroformmal végzett extrahálással állítjuk le, és a cDNS-t etanolos kicsapással gyűjtjük össze. A kicsapott cDNS-t elektroforézisnek vetjük alá egy 1%-os agaróz gélen keresztül Trisz-acetát pufferben, 1 pg/ml etídium-bromid jelenlétében. Az 500-4000 bázispár mérettartományban lévő cDNS-t izoláljuk a gélből, standard üvegporos eljárást alkalmazva. Az eluált cDNS-t fenol-kloroformmal extraháljuk, etanollal kicsapjuk és az üledéket (miután etanollal átöblítettük) újra szuszpendáljuk 50 μΐ TE-ben. A végső kitermelés 100-500 ng cDNS.

A p91023(B) kifejező vektor elkészítését fentebb leírtuk. Az EcoRI-gyel emésztett és foszfatázzal kezelt vektort (500 ng) 100 ng cDNS-sel ligáljuk 100 μΐ reakciókeverékben (standard T4 ligázos reakció) egy éjszakán át 16 ’C hőmérsékleten. A reakciót fenol/kloroform keverékkel végzett reakcióval állítjuk le, majd a ligáit cDNS-t etanolos kicsapással összegyűjtjük, miután 5 pg tRNS-t mint hordozót hozzáadtunk.

Az etanollal kicsapott DNS-t 70%-os etanollal átöblítjük, majd újra szuszpendáljuk 100 pl TE-ben. Ezt a DNS-t alkalmazzuk 4 pl-es alikvotokban, hogy E. coli MC10⁶l-et (ATCC 39754) transzformáljunk (4 pl 100 pl transzformációs elegyhez). A 25 transzfonmátum mindegyikét 150 mm-es Petri-csészére szélesztjük, amely 1% agart, L-tápközeget és 10 pml tetraciklint tartalmaz (Tét lemez), és egy éjszakán át 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. Mintegy 2000 telep nő mindegyik lemezen, így összesen mintegy 50 000 telep a végeredmény. Miután a telepek elérték a mintegy 0,5 mm átmérőt, a telepeket nitrocellulóz lemezekre (137 mm) visszük át, egy száraz szűrőt helyezve el óvatosan a lemez felületére, majd finoman leválasztva a szűrőt. A lemezen lévő összes telep átjut a szűrőre, amelyet azután (a telep-oldallal felfelé) friss Tét lemezre helyezünk. Miután a telepeket hagytuk nőni néhány órán át, replika lemezeket készítünk minden egyes szűrőről olyan módon, hogy frissen nedvesített szűrőt helyezünk pontosan az eredeti szűrő fölé, a kettőt összenyomjuk egymással, majd elválasztjuk ezeket egymástól, majd az egyes szűrőket friss Tét lemezekre visszük vissza, végül a lemezeket 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán át. Mindegyik replika-lemezt gondosan bejelöljük úgy, hogy az hozzáigazítható legyen az eredeti szűrőhöz.

5. lépés

Plazmid DNS gyűjtemények készítése

A 25 replika szűrőt szikével gondosan 8 részre osztjuk, és megjelöljük a nyolc orientációt az eredeti alapminta-szűrőhöz viszonyítva. A telepeket az egyes szekciókról 10 ml-es L-tápközegbe kaparjuk, A baktériumokat centrifugálással összegyűjtjük (3000 fordulat/perc, 10 perc, Beckman J-6 centrifuga), újra szuszpendáljuk 0,6 ml oldatban, amely 25% szacharózt és 50 mól/liter Trisz-HCl-t (pH 8,0) tartalmaz, és protoplaszttá alakítjuk 0,12 ml 5 mg/ml-es lizozim oldat hozzáadásával, és jégen 5-10 percen át végzett inkubálással. A protoplasztokat ezután szobahőmérsékleten inkubáljuk 10 percen át 0,125 ml 0,5 mól/literes EDTA hozzáadását követően, majd lizáljuk 0,12 ml 10% SDS oldat hozzáadásával, amely 50 mmól/liter Trisz-HCl-t (pH 8,0) tartalmaz. A lizátumot enyhén keverjük, szobahőmérsékleten 15 percen át inkubáljuk, majd a fehérjét és a kromoszomális DNS-t 0,3 ml 5 mól/literes NaCl hozzáadásával kicsapjuk. Jégen, 15 percen át végzett inkubálás után a lizátumot Eppendorf-centrifugában 30 percen át hidegben centrifugáljuk. A felülúszót gondosan eltávolítjuk és a viszkózus DNS/fehérje üledéket 2,5 ml H₂O hozzáadásával hígítjuk. A keveréket 1 ml fenollal extraháljuk, a rétegeket centrifugálással elkülönítjük (10K 10 percen át Sorvall SS-34 rotorban) és a vizes réteget egy friss csőbe átvisszük. A DNS-t 0,5 ml 5 mól/literes NaCl és 7,5 ml hideg etanol hozzáadásával kicsapjuk, és a keveréket többször lefagyasztjuk szárazjég-etanolos fürdőben. A csapadékot centrifugálással összegyűjtjük (10K, 15 perc, Sorvall SS34-ben), újra szuszpendáljuk 0,3 ml 0,3 mól/literes nátrium-acetátban, és újra kicsapjuk (Eppendorf-csőben) 1 ml etanol hozzáadásával. 10—15 perc múlva szárazjég-etanolos fürdőben, a kicsapódott DNS-t centrifugálást, összegyűjtjük (5 perc Eppendorf-csőben), és a végső üledéket újra szuszpendáljuk 100 pl steril TE-oldatban (10 mmól/liter Trisz, pH = 8,1 mmól/liter EDTA). Egy tipikus előállítási eljárásban 5-10 pg plazmid DNS-t nyerünk. Minden készítmény 200-500, az eredeti szűrőn lévő telepből származó DNS-t tartalmaz. Összesen 200 DNS mintát készítünk a 25 szűrőből.

6. lépés

A CSF kiónok izolálása

Az 5. lépésből származó DNS minták mindegyikét külön-külön átfertőzzük M6 COS majomsejtekbe (ATCC CRL 1650,1651) az alábbiak szerint.

Az M6 sejteket szokásos módon növesztjük Dulbecco-féle módosított Eagle-tápközegen (DME, amely a Gibco-nál kapható), amely 10% hővel inaktivált borjúembrió-szérumot (HIFCS) tartalmaz, és hetente két12

HU 208 711 Β szer 1:6 arányban szétosztjuk. 24 órával az 1:6 arányú szétosztás után az M6 sejtek készek az átfertőzésre. 24 órával az átfertőzés előtt, 1,2χ10⁸ M6 sejtet (1:6 arányban szétosztva) inokulálunk 1,5 liter DME + 10% HIFCS-be. Közvetlenül az átfertőzés előtt a lemezeket leszívjuk, és kétszer mossuk 7 ml szérum-mentes (SF) DME-vel. A DNS-t 0,1 mmól/liter Trisz-ben (pH = 7,3) feloldjuk, és DME tápközeghez adjuk, amely 2 mmól/liter glutamint, 100 pg/ml szreptomicint, 100 egység/ml penicillint és 0,25 mg/ml DEAE dextránt tartalmaz, összesen 4 ml oldatot képezve a Trisz-DNS oldattal együtt. Az oldott DNS-t tartalmazó 4 ml tápközeget az M6 COS sejteket tartalmazó lemezre visszük, és 12 órán át inkubáljuk.

Az inkubálás után a sejteket egyszer vagy kétszer leöblítjük 7 ml DME-vel. Ezután 5 ml DME-t, amely 10% HIFCS-t, 100 egység/ml penicillint, 100 pg/ml sztreptomicint, 2 mmól/liter glutamint és 0,1 mmól/liter klorokvint is tartalmaz, adunk hozzá, és a sejteket

2,5 órán át inkubáljuk.

2,5 óra múlva egyszer leöblítjük SF DME-vel, és hozzáadunk lemezenként 10 ml DME + 10% HIFCS-t. 30 óra múlva a tápközeget leszívjuk, és lemezenként 4 ml DME + 10% HIFCS-t adunk hozzá. 24-26 órás további inkubálás után a kialakult tápközeg eltávolításával nyerjük ki a terméket.

Az egyes átfertőzésekből származó kialakult tápközeget megmérjük CSF aktivitásra, a KG-1 vizsgálatot alkalmazva. Minden CSF aktivitásra pozitív mintánál a CSF aktivitásért felelős kiónt az eredeti alapminta-szűrőn meg kell határozni. így például egy CSF aktivitásra pozitív átfertőzési mintánál az eredeti alapminta-szűrő, ahonnan az átfertőző DNS minta származott, megfelelő szekciójának összes telepeit felszedjük. Ezekből a telepekből 320 telepet viszünk át 3 ml L-tápközeg + 10 pg/ml tetraciklinre. A telepeket egy éjszakán át növesztjük. A 320 telepet egy 18x18-as mátrixra helyezzük. Gyűjteményeket készítünk a mátrix mindegyik vízszintes sorából és függőleges oszlopából (összesen 36 gyűjtemény) (megjegyezzük, hogy az utolsó függőleges sorban csak 14 klón van). Minden egyes tenyészet-gyűjteményből kipreparáljuk a DNS-mintákat, majd ezeket COS sejtek fertőzésére használjuk fel. A fel ül úszókat ezekből az átfertözött tenyészetekből átvizsgáljuk, a KG-1 telep-vizsgálatot alkalmazva. Két pozitív mintát nyerünk az átfertőzött mintáknak ebből a készletéből: egyet egy függőleges oszlopban, egyet egy vízszintes sorban. Az a tenyészet, amely ezekben a gyűjteményekben közös, tartalmazza a CSF kiónt.

Ebből a tenyészetből tizenkét egyedi kiónt izolálunk és 10 ml L-tápközegben lévő tenyészetből DNS minipreparátumot készítünk, amint azt fentebb leírtuk. Ezekből a preparátumokból 10 pl DNS mintát EcoRI-gyel emésztünk, és az így létrejött DNS fragmenseket agaróz gélen elektroforézissel elemezzük. A 12 klón közül kilencnek van egy közös, mintegy 750 bázispáros beiktatott része. Ezekből a kiónokból négyet, és e további három kiónt COS sejtekbe vezetjük be, amint ezt fentebb leírtuk. Ezekből az átfertőzött tenyészetekből származó felülúszókat átvizsgáljuk, a CSF-hez szolgáló KG-1 vizsgálati módszert, valamint csontvelő vizsgálati módszert alkalmazva. Az a négy klón, amelyek mindegyike tartalmazza a 750 bázispáros fragmenst, mind az M6 COS sejtek által végzett magasszintű CSF aktivitás kifejeződésére irányul, amint ezt mindkét vizsgálati módszerrel kimutattuk, míg a másik három klón ezt nem mutatja. így a CSF-et kódoló területnek a 750 bázispáros beiktatott területen belül kell lennie.

A CSF-et kódoló DNS. szekvenciát eltávolítjuk a transzformációs vektorból a pozitív kiónban olyan módon, hogy EcoRI-gyel emésztjük, és szekvenciáját standard didezoxi-szekvencia-elemző módszerekkel határozzuk meg, miután a fragmenseket Ml3 vektorokba szub-klónoztuk, így az 1. ábrán bemutatott CSFTHr szekvenciát nyerjük. A p91023(B)-CSF plazmidot, amelyről először mutattuk ki, hogy CSF kifejeződésre irányul, pCSF-l-nek nevezzük. Ezt a plazmidot letétbe helyeztük az American Type Culture Collectionnél E. coli MC10⁶l törzsben, ATCC 39754 letéti számon, 1984. július 2-án.

7. lépés

A CSF fehérje kifejezése

A 6. lépésben izolált CSF/cDNS-t tartalmazó p91023(B) I vektorral transzformált M6 COS majomsejtek növesztésével, amint ezt a 6. lépésben leírtuk, a tenyésztő tápközegben CSF fehérjét termelünk.

Ezt pontosabban úgy végezzük, hogy 1 mg DNS-t (pCSF-1) feloldunk 0,1 mól/liter Trisz-ben (pH 7,3) és hozzáadjuk 600 ml DME-hez, amely 2 mmól/liter glutamint, 100 egység/ml sztreptomicint, 100 pg/ml penicillint (P/S) és 0,25 mg/ml DEAE dextránt (molekulatömeg: 500000, a Pharmacia terméke) tartalmaz. A 600 ml DNS-DEAE dextrán oldatot hozzáadjuk a M6 COS sejtekhez a Cell Factory berendezésben, és 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 12 órán át. Az inkubálás után a sejteket egyszer átöblítjük 900 ml SF DME-vel, majd 2,5 órán át inkubáljuk 600 ml DME-vel, amely 0,1 mmól/liter klorokvint, 10% HIFCS-t, 2 mmól/liter glutamint és P/S-t tartalmaz. A klorokvint tartalmazó tápközeg leszívása után a sejteket leöblítjük SF DME-vel, és 1500 ml DME-t adunk hozzá, amely 10% HIFCS-t tartalmaz. 30 óra múlva a sejteket SF DME-vel mossuk, a tápközeget 800 ml SF DME-vel helyettesítjük, és az átfertőzött sejtekkel 24 órán át 37 °C hőmérsékleten kondicionáljuk a tápközeget. A kondicionált tápközeget leszívjuk, és helyettesítjük újabb 800 ml SF DME-vel. A sejtekkel ezt a tápközeget is kondicionáljuk 24 órán át, majd a kondicionált tápközeget összegyűjtjük. A kondicionált tápközeget a sejtek kinyerése után azonnal huszad részére koncentráljuk nyomás alatti ultraszűréssel, Amicon 2,5 literes kamrát alkalmazva YMS membránnal (5000 molekulatömeg elválasztási határ).

8. lépés

A rekombináns CSF tisztítása

200 ml koncentrált kondicionált tápközeghez (a 7. lépés 4 liter kiindulási anyagából) szilárd ammónium-szulfátot adunk 30% telítettségig, és a kicsapott fehérjét centrifugálással eltávolítjuk. A felülúszóhoz további szilárd

HU 208 711 Β ammónium-szulfátot adunk 80%-os telítettségig, és a kicsapódó fehérjét centrifugálással összegyűjtjük. Az üledéket újra szuszpendáljuk 5 ml 20 mmól/literes nátriumcitrátban (pH 6,1), amely 1 mól/liter NaCl-t is tartalmaz. A feloldott fehérjét 1,6x100 cm-es Ultrogel AcA54 oszlopra visszük, amelyet ugyanezzel a pufferral egyensúlyoztunk ki. A CSF aktivitás az oszlopról 19 kilodalton látszólagos molekulatömegnél, vagy mintegy 90 ml-nél eluálódik. Megfigyelhetjük, hogyha a gélszűrést kis ionerősségnél hajtjuk végre, a CSF aktivitás az oszlopról két helyzetnél eluálódik: 19 kilodalton, illetve 38 kilodalton látszólagos molekulatömegnél, ami arra utal, hogy a GM-CSF könnyen képez dimereket. Az aktív frakciókat egyesítjük, és TFA koncentrációját 0,15%-ra állítjuk be (10%-os TFA hozzáadásával), és Vydac C₄ oszlopra (0,46x25 cm) visszük, amelyet 0,1% TFA-val egyensúlyoztunk ki. Az oszlopot 0,1% TFA-ban 0-90% acetonitril lineáris gradienssel (1 ml/perc, összesen 340 ml) fejlesztjük ki. A CSF aktivitás a 39 és 43% acetonitril frakciók között (16-20. frakciók) eluálódik. A 19. frakció 20 μΐ-es mintáját elemezzük SDS poliakrilamid gélelektroforézissel [13,5% gél, amint ezt Laemmli leírta: Natúré, 227, 580 (1970)]. Egyetlen széles, 18-26 kilodalton látszólagos molekulatömegű fehérje csík figyelhető meg. A CSF-hez tartozó meglehetősen széles mérettartomány a glükoproteinek közös vonása, és úgy véljük, a változó mértékű glikozilezést tükrözi. A 19. frakcióból származó fehérjét Edman-lebontásnak vetjük alá, az Applied Biosystems gázfázisú mikro-szekvenciaelemzőt (szekvenátor) alkalmazva. Az alkalmazott mintegy 20 pg fehérjéből az első 6 aminosav szekvenciáját megkapjuk (A-P-AR-S-P-S-P-S-T-Q-P-W-E-H). Ennek az egyedi fehérjeszekvenciának a nagy kitermelése arra utal, hogy a CSF fehérjét a 19. frakcióban a homogenitásig tisztítottuk. A biológiai meghatározás azt jelzi, hogy a 19. frakció 3xl0⁷ egység/A₂go abszorbancia egység aktivitással bír. Mivel a tipikus fehérjék vizes oldatban 0,8-1,2 A₂₈₀ abszorbancia egység/mg fehérje extinkciós együttható tartományt mutatnak, a tisztított CSF fehérje fajlagos aktivitása lxlO⁷ és 4xl0⁷ egység/mg között van, amikor a humán csontvelősejt meghatározást alkalmazva mérünk.

B) példa

Gibbon CSF klónozása

1. lépés mRNS készítése gibbon T-sejtekból Az UCD-MLA 144-nek nevezett gibbon T-sejtvonal (ATCC HB 9370) egy mintáját tenyésztjük több héten át RPMI 1640-ben (a Gibco terméke), amely 20% borjúembrió szérumot (FCS) is tartalmaz, amíg az lxlO⁹ teljes sejtmennyiséget el nem érjük. A sejteket magasszintű CSF termeléshez indukáljuk 24 órán át végzett aktiválással 10 nanogram/ml 12-O-tetradekanoil-forbol-13-acetát (TPA) jelenlétében RPMI 1640ben, amely 1% FCS-t is tartalmaz. A sejteket centrifugálással (1000 fordulat/perc, 5 perc) kinyerjük, egyszer mossuk foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldattal (PBS), végül centrifugálással összegyűjtjük.

A membránhoz kötött poliszóma (MBP) mRNS-t ezekből a sejtekből kinyerjük, azonos eljárást alkalmazva, mint amelyet az A példában leírtunk az Mo sejt RNS készítésénél.

2. lépés

Egyszálas cDNS reakció

Az 1. lépésben nyert 6 pg MBP mRNS-t 50 pl cDNS szintézis reakciókeverékkel hígítjuk [lásd A) példa 4. lépés], és a reakciót reverz transzkriptáz hozzáadásával indítjuk be. 30 percig 42 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után a reakciót EDTA hozzáadásával leállítjuk. Annyi EDTA-t adagolunk, hogy koncentrációja 50 mmól/1 legyen, és az elegyet H₂O-val hígítjuk 100 pl-re. A keveréket fenol/kloroformmal, majd kloroformmal extraháljuk. A cDNS/RNS hibrideket a be nem épült trifoszfátoktól kromatográfiával különítjük el 2 ml Sepharose CL-4B oszlopon. A kizárt frakciókat egyesítjük, és a hibrideket etanolos kícsapással összegyűjtjük. A végső kitermelés 570 ng.

3. lépés

Második szál cDNS reakció

Az első szál cDNS üledéket (2. lépés) újra szuszpendáljuk 50 pl H₂O-ban, és második szál szintézist hajtunk végre standard reakciókeverékben E. coli polimeráz Igyel, E.coli ligázzal és RNA-z H-val. A reakciókeveréket egy éjszakán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten. A reakciót EDTA hozzáadásával állítjuk le, és fenol/kloroformmal extraháljuk. A cDNS-t a be nem épült trifoszfátoktól Sepharose CL-4B oszlopon végzett kromatográfiával elkülönítjük, a kizárt frakciókat egyesítjük, és a cDNS-t etanolos kicsapással összegyűjtjük.

4. lépés

Rekombináns cDNS készítése

A cDNS üledéket (3. lépés) újra szuszpendáljuk 75 pl H₂O-ban. Homopolimer C „farkakat” adunk a cDNS végeihez olyan módon, hogy 10 pl cDNS oldatot adunk 25 pl standard reakciókeverékhez (50 pl reakcióelegy: 100 mmól/1 Na-kakodilát pH = 7,1,1 mmól/1 CoCl₂,0,1 mmól/1 DTT, 4 pmól DNS mint 3’-vég, 20 pmól/1 dNTP-k, 50 pg/ml BSA, 10 egység terminális transzferáz), és inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten 5 percen át. A reakciót 40 mmól/liter végkoncentrációig EDTA hozzáadásával és 68 °C hőmérsékleten 10 percen át végzett hőinaktiválással állítjuk le. 10 ng ilyen „farok”-kal ellátott cDNS-t forrasztunk össze 50 ng G-farokkal ellátott pBR322-vel (amely a NEN-től vásárolható) 10 pl 10 mmól/liter Triszt (pH 7,5), 1 mmól/liter EDTA-t és 100 mmól/liter NaCl-t tartalmazó oldatban. Az összeforrasztó reakciókeveréket 10 percen át 68 °C hőmérsékleten, majd 2 órán át 57 °C hőmérsékleten inkubáljuk.

5. lépés

Bakteriális transzformálás

E. coli MC 1O⁶1 törzset növesztünk L-tápközegben, jégen hűtjük, centrifugálással kinyerjük, és CaCl₂-vel kezeljük, hogy felkészítsük a sejteket a transzformáláshoz. Ezután 5 pl-t a cDNS összeforrasztó reakciókeverékből 200 pl CaCl₂-vel kezelt baktériummal inkubá14

HU 208 711 Β lünk. 15 ilyen transzformálást hajtunk végre, felhasználva az összes összeforrasztott cDNS-t, és szélesztjük 15 cm-es, 1% agart tartalmazó L-tápközeges lemezeken, amelyek még 10 pg/ml tetraciklint is tartalmaznak. Mintegy 1000 telep nő mindegyik lemezen.

6. lépés

Replika lemez képzése

A transzformálásból származó mintegy 10000 telepet egyenként felszedünk fogpiszkálóval, és átvisszük friss lemezekre (500/lemez, rácshálóban), egy éjszakán át 37 ’C hőmérsékleten növesztjük. A telepeket ezután minden egyes lemezről leemeljük olyan módon, hogy száraz nitrocellulóz lemezeket nyomunk szorosan a lemez felületére. Minden alaplemez-szűrőről két replika-lemezt készítünk. Az alaplemezszűrőket 4 ’C hőmérsékleten tároljuk, és a replika-lemezeket bázissal kezelve és sütve előkészítjük a hibridizáláshoz.

7. lépés ³²P-jeIzeit hibridizáló vizsgáló minták előállítása

ApCSF-l-ből származó cDNS beiktatott részt izoláljuk olyan módon, hogy EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, és elektroforézisnek vetjük alá agaróz gélben Trisz-acetáttal és etidium-bromiddal. A cDNSfragmenst tartalmazó sávot kivágjuk a gélből és üvegporos technikával (DNAS 76, 615 (1979) helyen ismertetett módszer B. Paison által módosítva] tisztítjuk.

300 ng cDNS ffagmenst adunk azután 1 μΐ 10xT4 DNS polimeráz pufferhoz (0,33 mól/liter Trisz-acetát, pH 7,9,0,66 mól/liter kálium-acetát, 0,1 mól/liter magnézium-acetát és 10 mmól/liter ditiotreitol), és 3 egység T4 DNS polimerázhoz (New England Biolabs), és vízzel 10 μΐ-re hígítjuk. 5-10 percen át 37 ’C hőmérsékleten végzett inkubálás után ezt a keveréket egyesítjük 1 μΐ 10xT4 DNS polimeráz pufferral, 1 μΐ 2-2 mmól/liter dCTP-t, dTTP-t, dGTP-t tartalmazó oldattal, 10 μΐ ³²PdATP-vel (10 pCi/pl, 3000 Ci/mmól), és 3 egység T4 DNS polimerázzal. A reakciókeveréket 20 percig inkubáljuk 37 ’C hőmérsékleten. Ezután 1 μΐ 2 mmól/literes dATP-t adunk hozzá, és a reakciókeveréket további 10 percen át inkubáljuk 37 ’C hőmérsékleten.

A be nem épült trifoszfátokat a jelzet cDNS-től Sephadex G100 oszlopon végzett kromatográfiával elválasztjuk. Egy második vizsgáló mintát készítünk egy szintetikus oligonukleotidból, amely a következő szekvenciával rendelkezik:

ATC TGG CTG CAC AG és amely a CSF-et kódoló terület amino-terminálisával komplementer. Ezt az oligonukleotidot ³²P-dATP-vel jelezzük 5’ végénél, standard polinukleotid kináz reakciót alkalmazva.

8. lépés

CSF cDNS klánok izolálása

Egy standard hibridizáló átvizsgálási folyamatban mintegy 45 klón hibridizálódik T4-gyel jelzett pCSF-1 cDNS-hez. Ezek közül mintegy 2 hibridizálódik a jelzett oligonukleotid vizsgáló mintához is. Ezek egyikének kódoló területét szekvenciaelemzésnek vetjük alá.

A szekvenciaadatok egy sor bázishelyettesítést tárnak fel, amelyikből néhány aminosavkülönbségeket eredményez a kifejezett fehérjében. Ezeket a különbségeket az 1. ábrán ábrázoljuk az A) példában klónozott humán CSF génhez tartozó DNS szekvencia fölött.

C) példa

CSFP klónozása perifériás vér limfocita mRNS-ből

1. lépés mRNS előállítása perifériás vér limfocitákból

Perifériás vér limfocitákat készítünk négy plazmaferézis melléktermékből (a Vöröskereszttől vásárolható), Ficoll Hypaque gradiensen végzett frakcionálással. A kisebb sűrűségű frakciót RPMI 1640-ben szuszpendáljuk, amely 5% borjúembrió szérumot, 0,17% fitohemaglutinint, és 10 ng/ml forbolmirisztát-acetátot (PMA) tartalmaz 2xl0⁶ sejt/ml sejtstűrűséggel (A sejt összmennyisége 6xl0^{8 9} sejt). A sejteket centrifugálással kinyerjük (1000 fordulat/perc, 5 perc), foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldattal (PBS) egyszer mossuk, és végül centrifugálással összegyűjtjük. Citoplazmás RNS-t készítünk enyhe lizálási eljárással, amelyben a sejteket újra szuszpendáljuk 50 μΐ hideg Triton lizáló pufferban (140 mmól/liter NaCl, 1,5 mmól/liter MgCl₂, 10 mmól/liter Trisz, pH 8,6, 0,5% Triton X-100), 10 mmól/liter ditiotreitollal (DTT) és 50 egység/ml RNAzinnel (amely a Biotechtól szerezhető be). Ezt a lizátumot 2 egyenlő részre osztjuk és mindegyik részt 10 ml-es lizáló puffer-páma fölérétegezzük, amely tartalmaz még 20% szacharózt. A sejtmagokat hideg centrifugálással eltávolítjuk (4 °C, 400 fordulat/perc, 5 perc). A felső réteget (citoplazmás kivonat) gondosan eltávolítjuk és nátrium-dodecil-szulfátot (SDS) adunk hozzá 1% végső koncentrációig. Az oldatot kétszer azonos térfogatú fenol-kloroformmal (1:1 keverék) extraháljuk, és az RNS-t 2,5 térfogat hideg etanol hozzáadásával kicsapjuk. A kicsapott RNS-t centrifugálással öszszegyűjtjük (15 perc 4000 fordulat/perc), és újra szuszpendáljuk 0,01 mól/liter Trisz-t (pH 7,5), 1 mmól/liter EDTA-t, 0,25 mól/liter NaCI-t tartalmazó oldatban (TE puffer + 0,25 mól/liter NaCl), és újra kicsapjuk 2,5 térfogat hideg etanol hozzáadásával. Végül az RNS-t centrifugálással összegyűjtjük, és újra szuszpendáljuk 5 ml H₂O-ban. A végső kitermelés 7,5 mg.

Hírvivő (messanger) RNS-t izolálunk a teljes citoplazmás RNS-ből, oligo dT cellulózon végzett elválasztással. 25 mg teljes RNS-t 65 ’C hőmérsékleten melegítünk 5 percen át. NaCl-t adunk hozzá 0,5 mól/liter koncentrációig, és az RNS-t hagyjuk szobahőmérsékletre lehűlni. Ezt az RNS-t egy 1 ml-es oligo-dT-cellulóz oszlopon engedjük át, amelyet TE + 0,5 mól/liter NaCl-dal egyensúlyoztunk ki (kötő puffer). A nem kötött RNS-t az oszlop kötő pufferral végzett erőteljes mosásával távolítjuk el. A kötött hírvivő RNS-t 3 ml H₂O-val eluáljuk, és 0,2 ml 4 mől/literes NaCl és 2,5 térfogat hideg etanol hozzáadásával kicsapjuk. A kicsapott mRNS-t centrifugálással összegyűjtjük (30 perc 25 000 fordulat/percnél). A végső üledéket (mintegy 100 pg) újra szuszpendáljuk 50 μΐ H₂O-bán.

HU 208 711 Β

2. lépés

Első szál cDNS reakció gg PBL mRNS-t hígítunk 50 μΐ cDNS szintézis keverékkel, amely 100 mmól/liter Trisz-t (pH 8,4), 140 mmól/liter KCl-t, 10 mmól/liter MgCl₂-t, 10 mmól/liter 2merkaptoetanolt, 400-400 gg/liter dATP-t, dGTP-t, dCTP-t és dTTP-t, 5 gg oligodT-t, mint prímért (átlagos méret 12-18), 25 gCi ³²P-dCTP-t (400 gCi/mmól) és 20 egység ribonukleáz inhibitor RNA-zint tartalmaz. A reakciót 60 egység reverz transzkriptáz hozzáadásával indítjuk be, a reakcióelegyet 30 percen át inkubáljuk 42 °C hőmérsékleten. A reakciót állítjuk le (330 mmól/liter EDTA koncentrációra beállítva), és azonos térfogatú, H₂O-val telített fenollal extraháljuk. A fenolos fázist visszaextraháljuk 50 gl TE pufferral. A vizes fázisokat egyesítjük. A cDNS/RNS hibrideket elkülönítjük a be nem épült trifoszfátoktól olyan módon, hogy az egyesített vizes fázist átengedjük 5 ml-es, TE-vel kiegyensúlyozott Sepharose CL4B oszlopon (amely a Sigmától vásárolható). Azokat a frakciókat, amelyek kizáródnak az oszlopról, egyesítjük, 250 mmól/liter NaCl koncentrációra állítjuk be, és a nukleinsavakat 2,5 térfogat hideg etanol hozzáadásával kicsapjuk. A hibrideket 10 percen át 40 000 fordulat/perccel végzet centrifugálással összegyűjtjük. A végső üledéket (2,5 gg cNDS) újra szuszpendáljuk 50 gl H₂O-ban.

3. lépés

Második szál cDNS reakció

Második cDNS szálat szintetizálunk E. coli polimeráz I, E. coli DNS ligáz és E. coli RNA-z H enzimek kombinált akciójával. A reakciókeverék (50 gl) 20 mmól/liter Trisz-t (pH = 8,0), 4 mmól/liter MgCl₂-t, 1,2 mmól/liter EDTA-t, 25 gmól/liter NAD-t, 100100 gmól/liter dATP-t, dGTP-t, dCTP-t és dTTP-t, és 50 gCi ³²P-dCTP-t (3000 Ci/mmól) tartalmaz. A reakciót 3 egység DNS polimeráz 1,0,5 egység DNS ligáz és 0,75 egység RNA-z H hozzáadásával hajtjuk végre olyan módon, hogy 16 °C hőmérsékleten inkubálunk 18 órán át, majd 37 °C hőmérsékleten 1 órán át, ezután a reakciót 40 mmól/liter EDTA koncentráció beállításával leállítjuk, és a reakciókeveréket azonos térfogat fenollal extraháljuk. A fenolos fázist visszaextraháljuk 50 gl TE-vel, a vizes fázisokat egyesítjük, és a cDNS-t a be nem épült trifoszfátoktól Sepharose CD-4B oszlopon végzett kromatográfiával elkülönítjük, amint ezt fentebb az első szálnál leírtuk. A ³²P beépülésére alapozva az első cDNS szál teljes mértékben átalakul kettős szálú forrásává.

4. lépés

Rekombináns cDNS készítése

Homopolimer C „farkakat” kapcsolunk a cDNS végeire olyan módon, hogy 400 ng cDNS-t 50 gl reakciókeverékben, amely 1 mmól/liter 2-merkaptoetanolt, 1 mmól/liter CoCl₂-t, 9 egység terminális-dezoxinukleotidil-transzferázt és 20 gmól/liter dCTP-t tartalmaz, 30 °C hőmérsékleten 5 percen át enyhén melegítünk. A reakciót 40 mmól/liter EDTA segítségével és 68 °C hőmérsékleten 10 percen át végzett melegítéssel állítjuk le. 200 ng ilyen farokkal ellátott cDNS-t összeforrasztunk 500 ng G-farokkal ellátott pAT153-mal (amelyet az Amershamtől szerezhetünk be), 100 gl keverékben, amely 100 mmól/liter Trisz-t (pH 7,5), 1 mmól/liter EDTA-t, és 100 mmól/liter NaCl-t tartalmaz. Az összeforrasztási reakció 57 °C hőmérsékleten 2 órán át hajtjuk végre, 5 perces, 68 °C hőmérsékleten végzett előinkubálás után.

5. lépés

Bakteriális transzformálás

A cDNS összeforrasztási reakcióterméket közvetlenül felhasználjuk E. coli MC10⁶! törzs transzformálására. Baktériumsejtek egy friss telepével inokulálunk 50 ml L-tápközeget, és több órán át növesztjük, amíg az optikai sűrűség 550 nm-nél 0,25 lesz. A sejteket jégen lehűtjük, és centrifugálással kinyerjük (2000 fordulat/perc, 10 perc). Az üledéket újra szuszpendáljuk 10 ml hideg, 0,1 mól/literes CaCl₂-ben, és jégen hagyjuk állni 10 percen át. A sejteket centrifugálással összegyűjtjük (2000 fordulat/perc, 5 perc), és újra szuszpendáljuk 2,5 ml 0,1 mól/literes CaCl₂-ben. 10 gl cDNS összeforrasztási reakcióterméket baktérium-tenyészettel inkubálunk 30 percen át jégen, majd 2 percen át 37 °C hőmérsékleten, ezt követően 0,8 ml tápközeget adunk hozzá, és végül 30 percen át inkubálunk 37 °C hőmérsékleten.

ilyen transzformálást hajtunk végre, az összes összeforrasztott cDNS-t felhasználva. Mindegyik transzformációs keveréket 1% agart tartalmazó L-tápközeges lemezekre (15 cm átmérő) szélesztjük, a lemezek 10 gg/ml tetraciklint is tartalmaznak. Ebből a 20 transzformánsból összesen 20 ilyen lemezt szélesztünk, és inkubálunk egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten. Átlagosan 1500 baktériumtetelep nő ki mindegyik lemezen, összesen tehát 30000 klón.

6. lépés

Replika lemez készítése

Az egyes lemezeken növekvő eredeti telepeket átvisszük 137 mm-es nitrocellulóz szűrőkre olyan módon, hogy egy száraz szűrőt nyomunk a telepek tetejére és felemeljük ezeket a lemezről. Két azonos replika-lemezt készítünk mindegyik eredeti szűrőről standard replika lemezkészítési módszerrel, amely szerint mindegyik eredeti szűrőt óvatosan ráhelyezzük telep oldallal felfelé egy steril szűrőpapír-négyzetre (Whatman 3 MM), amely egy négyszögletes üvegdarabon nyugszik. Egy új, előnedvesített nitrocellulóz szűrőt óvatosan ráhelyezünk az alapminta-szűrő tetejére, lefedjük a második szűrőpapír négyzetével, és a komplett „szendvics”-et ezután szorosan összenyomjuk egy második üvegdarabbal. A „szendvics”-csé alakított szűrőket megszámozzuk és három tűszúrással aszimmetrikusan átszúrjuk úgy, hogy a jövőben ismét pontosan össze lehessen illeszteni. A replikát azután eltávolítjuk az alapmintáról, és teleppel fölfelé elhelyezzük egy új, tetraciklint tartalmazó L-tápközeg agarlemezre. Egy második replikát is készítünk azonnal azonos módon. Az egyes alap-mintákat lemezre helyezzük vissza, és az Összes lemezt 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk több órán át, amíg a baktérium-telepek elérik a mintegy 1 mm átmérőt. Az eredeti alapmintákat 4 °C hőmérsékleten tároljuk, és replikákat készítünk hibridizáláshoz, amint ezt alább leírjuk.

HU 208 711 Β

7. lépés

Szűrők készítése hibridizáláshoz

Mindegyik replika-szűrőt (6. lépés) telep-oldalukkal fölfelé szűrőpapírra (Whatman 3 MM) helyezzük, a szűrőpapírokat előzőleg 7 percig áztatjuk 0,5 mól/liter NaOH-t és 1,5 mól/liter NaCl-t tartalmazó oldatban. A szűrőket ezután átvisszük semlegesítő szűrőpapírokra 2 percre, amelyek 1 mól/liter Trisz-t (pH 7,5),

1,5 mól/liter NaCl-t tartalmazó oldatba voltak áztatva, majd második semlegesítő szűrőpapírokra 5-10 percre. Végül a szűrőket SSC pufferben (0,015 mól/liter nátrium-citrát, 0,15 mól/liter NaCl, pH 7,4) áztatott szűrőpapírokra helyezzük öt percre, levegőn szárítjuk, és vákuumban sütjük 80 °C hőmérsékleten 1-2 órán át.

8. lépés

CSF cDNS kiónok izolálása A párhuzamos szűrőket átvizsgáljuk radioaktívan jelzett pCSF-1 cDNS beiktatott résszel, amelyet a fenti B) példában leírtak szerint készítettünk el. Mintegy 20 telep hibridizálódik a cDNS-sel. Ezekből tizenkettőt az alapminta szűrőről felszedünk és növesztjük egy éjszakán át L-tápközegen további elemzéshez. A DNS minták (gyors készítmény) restrikciós enzimes emésztései (PstI) ezekből a kiónokból azt jelzik, hogy 3 csaknem teljes hosszúságú. Ezekből az egyiket restrikciós enzimes emésztésnek vetjük alá. E klón CSF kódoló területének a szekvenciája megfelel a pCSF-1 megfelelő szekvenciájának [azaz T-vel rendelkezik a 365. helyzetnél-CSF (Ile)].

D) példa

A CSF tisztítása Mo sejtvonalból Mo szérummentes, kondicionált tápközeget (40 liter) inkubálunk 55 °C hőmérsékleten 30 percen át, hogy inaktiváljuk a sejtvonallal asszociált HTLV-II vírust. Ezt a tápközeget nyomás alatti ultraszűréssel koncentráljuk, Pellicon Casette berendezést alkalmazva PTGC membránnal (0,138 m²), amely 10000 molekulatömeg kizárással rendelkezik. A fehérjét tovább koncentráljuk ammónium-szulfátos kicsapással (80% telítés). A végső fehérjeüledéket (800 mg) újra szuszpendáljuk 100 ml 20 mmól/literes trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-hidrokloridban (Trisz-HCl, pH 7,4), és azonos pufferral szemben dializáljuk (háromszor, alkalmanként 4 literes cserével). A dializált fehérjét 2,5x10 cm-es DEAE (dietil-amino-etil)-ultrogél oszlopra visszük, amelyet azonos pufferral egyensúlyoztunk ki. Az oszlopot 800 ml 20 mmól/literes Trisz-HCl-el (pH 7,4) mossuk, majd a CSF aktivitást 800 ml 20 mmól/literes Trisz-HCl-lel (pH 7,4), amely 0,12 mól/liter NaCl-t is tartalmaz, dializáljuk. 10 ml-es frakciókat gyűjtünk, és mérjük CSF aktivitásra. Az aktív frakciókat (3 darab) egyesítjük, és hatodrészére koncentráljuk (6 ml-re) nyomás alatti ultraszűréssel (Amicon YMS membrán, 5000 molekulatömeg kizárás). A DEAE oszlopról származó koncentrált mintát 1,6x100 cm-es Aca 44 ultrogél oszlopra (akrilamid-agaróz ultrogél, amely 10-130 kilodalton frakcionálással rendelkezik) visszük, amelyet előzőleg 20 mmól/liter Ν-2-hidroxi-etil-piperazin-N-2-etánszulfonsavat (HEPES) (pH

7,4), 50 mmól/liter NaCl-t, és 0,01% polietilénglikolt (PEG-8000) tartalmazó oldattal egyensúlyoztunk ki. A CSF aktivitást az oszlopról mintegy 30 kilodalton látszólagos molekulatömeggel eluáljuk. Az aktív frakciókat egyesítjük, és koncentrációját trifluorecetsavra (TFA) nézve 10%-os TFA hozzáadásával 0,15 térf.%-ra állítjuk be, és Vydac C₄ fordított fázisú oszlopra (1x25 cm) visszük. Az oszlopot 0,1 térf.%-os TFA-ban 0-90% acetonitril lineáris gradienssel fejlesztjük ki, 4 ml/perc átfolyási sebességgel (összesen 1000 ml). A CSF aktivitást kb. 47 térfogat% acetonitrilnél eluáljuk. Az összegyűjtött aktív frakciók koncentrációját heptafluor-vajsavra (HFBA) nézve fél térfogat 0,15 térfogat%-os HFBA hozzáadásával 0,05 térfogat%-ra állítjuk be, és a keveréket 0,15 térfogat%-os HFBA-val kiegyensúlyozott Vydac C₄ oszlopra (0,46x25 cm) visszük. Az oszlopot 0,15 térfogat%-os HFBA-ban 0-90 térfogat% acetonitril lineáris gradiensével fejlesztjük ki 1 ml/perc átfolyási sebességgel (összesen 340 ml). A CSF aktivitást kb. 53 térfogat% acetonitrilnél eluáljuk. A 37-44 frakciókat (1-1 ml) találjuk aktívnak. A 40. frakcióból 0,15 ml-t negyedrészére koncentrálunk (SAVANT Speed Vác Concentrator berendezést alkalmazva), és 40 μΐ 2xSDS gél minta puffért adunk hozzá (0,125 mól/liter Trisz-HCl, pH 6,8, 4% SDS, 20% glicerin és 0,004% brómfenolkék). Ezeket a mintákat 2 percig forraljuk és 13,5%-os SDS-gélre visszük [Laemmli, U.: Natúré, 227, 680 (1970), lásd 2. ábra]. A 40. számú frakció 110000 csontvelő-CSF egység/ml aktivitással rendelkezik. Ez mintegy 3,0xl0⁷ egység/A₂8o abszorbancia egységnek felel meg. Mivel a tipikus fehérjék 0,8 és 1,2 közti A₂₈₀ egység/mg tartományban lévő extinkciós együtthatókkal rendelkeznek, a tisztított CSF fajlagos aktivitása az lxl0⁷-4xl0⁷ egység/mg tartományban van a csontvelő meghatározás szerint. Tisztított GM-CSF 1 pg-os mintáját Edman-lebontásnak vetjük alá, Applied Biosystems Gas Phase Microsequenator berendezést alkalmazva. A 3-5 gyökök szekvenciája Alá-Arg-Ser.

E) példa

CSF szekvencia ko-transzformációja és amplifikálása CHO sejtekben p91023(B)-CSF plazmidot vezetünk be CHO DHFRhiányos sejtekbe (DUKX-B11) [Chasín és Urlaub: PNAS 77, 4216 (1980)] protoplaszt-fúzióvál, ahogyan azt Sandri-Goldin és munkatársai leírták: Mól. Cell. Bioi. 7,743-752 (1981). A CHO sejtek növesztését és fenntartását már leírták (Kaufman és Sharp: J. Mól. Bioi. 750, 601-621 (1981)]. A protoplaszt-fúzióhoz p91023(B)CSF-l-et vezetünk be E. coli HB 101-be, és a baktériumokat 50 ml M9 sókeverékben növesztjük, amely 0,5% kazaminosavat, 0,4% glükózt, 0,012% MgSO₄-et, 5 pg/ml tiamint és 10 pg/ml tetraciklint tartalmaz, a növesztést 600 nm-nél mért 0,6 abszorbancia értékig végezzük. 250 pg/ml koncentrációig kloramfenikolt adunk a tenyészethez, és a tenyészetet 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk további 16 órán át abból a célból, hogy a plazmid kópiaszámot amplifikáljuk. A sejteket 3000 g-nél 10 percen át centrifugáljuk 4 ’C hőmérsékleten, és 2,5 ml hűtött 20%-os szacharózban, amely 50 mmól/liter Trisz-HCl-t

HU 208 711 Β is tartalmaz, szuszpendáljuk. Lizozimot adunk hozzá (0,5 ml 5 mg/ml-es oldatot 0,25 mól/literes Trisz-HClben, pH 8,0), és a keveréket jégen tartjuk 5 percen át. EDTA-t adunk hozzá (1 ml 0,25 mól/literes EDTA oldatot, pH 8,0), további 5 percen át jégen tartjuk, majd 1,0 ml 0,05 mól/literes Trisz-HCl-t (pH 8,0) adunk hozzá lassan. A szuszpenziót 15 percen át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten, amíg a baktérium átalakul protoplaszttá. A szuszpenziót azután lassan hígítjuk 20 ml előmelegített tápközeggel, amely 10% szacharózt és 10 mmól/liter MgCl₂-t tartalmaz, és 37 °C hőmérsékleten tartjuk 15 percen át. A protopalsztok oldatát (mintegy 10⁹/ml) a CHO, DHFR-hiányos DUKX-B11 sejtekhez adjuk egy 6 üreges lemezen (mintegy lxlO⁶ sejt/üreg) mintegy 12xl0⁴ protoplaszt/sejt arányban és a protoplasztokat a sejtekre ülepítjük 2000 fordulat/perccel 8 percen át végzett centrifugálással, egy IEC Model K centrifuga lengő mikrotitráló lemez rotorjában. Centrifugálás után a felülúszót leszívással eltávolítjuk. 2 ml mennyiségű polietilén-glikololdatot [50 g PEO-1450 (Baker Chem. Co.) 50 ml tápközegben] adunk a 6 üreges lemez mindegyik üregébe. A sejteket ismét centrifugáljuk 2000 fordulat/percnél 90 másodpercen át, a polietilén-glikol oldatot eltávolítjuk, és a lemezeket háromszor öblítjük üregenként 4 ml tápközeggel. A sejteket azután tripszinnel kezeljük, 10 ml, 100% borjúembrió-szérumot tartalmazó tápközegben szuszpendáljuk, és kúpos csőben centrifugáljuk 500 fordulat/percnél klinikai centrifugában. A 3 üregből leülepített sejteket egyesítjük és 10 cm-es szövettenyésztő lemezekre visszük át. 100 pg/ml kanamicint, timidint, adenozint, dezoxi-adenozint, penicillint és sztreptomicint tartalmazó friss tápközeget és 10% dializált borjú-embriószérumot adunk mindegyik lemezhez. A kanamicin azért szerepel itt, hogy megelőzze bármilyen baktérium kinövését, amely elkerülte a protoplaszttá való átalakulást.

Két nappal később a sejtekből altenyészeteket készítünk 1:15 arányban alfa-tápközegen (forg. JRH Bioscience), amely 10% dializált borjúembrió-szérumalbumint is tartalmaz, valamint penicillint és sztreptomicint, de nem tartalmazza a nukleotidokat. A sejteket azután ismét ugyanabba a szelektív tápközegbe tápláljuk (amely nukleozidokat nem tartalmaz) 4-5 nap múlva.

Az altenyészet készítése után szelektív tápközegben a telepek 10-12 nap múlva tűnnek fel. Két, metotrexátot (MTX) alkalmazó szelekciós és amplifikációs sémát követünk. Az első sémában egyedi független klónozott transzformánsokat izolálunk DHFR kifejeződés alapján, és ezt követően mindegyik kiónt olyan körülmények között szaporítjuk, hogy amplifikáljuk az idegen DNS kópiaszámát, azaz növesztünk metotrexát növekvő koncentrációi mellett. A második séma szerint több független transzformánst izolálunk DHFR kifejeződés alapján és együtt szaporítjuk olyan körülmények között, hogy amplifikáljuk az idegen DNS kópiaszámát, azaz növesztünk metotrexát növekvő koncentrációi mellett. Ezután a tömegben szelektált populációból egyedi kiónokat izolálunk és elemezzük GM-CSF kifejeződésre. Azok a kiónok, amelyek a legmagasabb szinten mutatnak GM-CSF kifejeződést, újra nőnek olyan körülmények között, amelyek az idegen DNS további amplifikálását idézik elő (azaz növesztés a metotrexát növekvő koncentrációi mellett a tápközegben).

Az egyik kísérletben hét DHFR⁺ transzformánst egyesítünk alfa-tápközegben, amely nem tartalmaz nukleozidokat. Ezeket a sejteket egymás után növesztjük lépésről-lépésre növekvő MTX koncentrációk mellett, 0,02 pmól/litemél kezdve, majd 0,1, 0,5 és 2,0 pmól/liter MTX-nél. Amikor GM-CSF aktivitásra mérünk KG-1 sejt mérésben, ezek a sejtek 300012000 egység/ml-t termelnek. A kiválasztott populációt 0,5 pmól/liter MTX-nél és 2,0 pmól/liter MTX-nél klónozzuk. Ezt követően a 0,5 pmól/liter MTX-ben nyert kiónokat (010, D2 és B6) 2,0 pmól/liter MTXben növesztéshez kiválasztjuk. Amikor GM-CSF aktivitásra mérjük KG-1 sejtmérésben, a klónozott sejtvonalak 15000-300000 egység/ml GM-CSF aktivitást termelnek. A jelen példa szerint termelt GM-CSF olyan aminosav-szekvenciával rendelkezik, amelyet, mint CSF-Thr-t az 1. ábrán adunk meg.

F) példa

GM-CSF kifejeződése E. coli-ban

A GM-CSF-et E. coli-ban pTALC-185R vektorból fejezzük ki, amelyet a 6. és 8. ábrán mutatunk be.

A 8. ábra a pTALC-l85R plazmid DNS-szekvenciáját mutatja be. Ez a plazmid megfelelő körülmények között, alkalmas E. coli gazdaszervezetben, például GI400 törzsben nagy mennyiségű GM-CSF termelését biztosítja. A plazmidot olyan standard DNS-manipulációs technikákkal készítettük, amelyeket Maniatis a Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982) irodalmi helyen ismertet.

A pTALC-185R vektor alapvető tulajdonságai a következők:

1-2060 nukleotidok: a pUC18 plazmidból [Norrander és munkatársai, Gene, 26, 101-106 (1983)] származó DNS-szekvencia, amely tartalmazza a βlaktamáz-gén szekvenciát is, amely az E. coli gazdaszervezet számára az ampicillin-rezisztenciát biztosítja, tartalmaz továbbá egy col El-eredetű replikációs origót is.

2061-2726 nukleotidok: a lambda-bakteriofág baloldali nagy promoterét (pL) és a lambda-bakteriofág cll génjének erős riboszóma-kötőhelyét tartalmazó DNS-szekvencia. Ezek a szekvenciák a pASl plazmidból származnak, amelynek a konstrukcióját Sambrook, Fritsch és Maniatis a Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982) irodalmi helyen ismertetik.

2727-2765 nukleotidok: az érett humán GM-CSF első 13 aminosavát kódoló DNS-szekvencia. A természetes GM-CSF DNS-szekvenciáját megváltoztattuk, hogy a GM-CSF gén kezdeténél megnöveljük az A+Ttartalmat. Ez a módosítás sokkal hatékonyabb transzláció-iniciálást eredményez az E. coliban.

2766-310¹ nukleotidok: az érett humán GM-CSF többi részét (14-127. aminosav) kódoló DNS. Ez a

HU 208 711 Β

DNS-szekvencia a pCSF-l-ből származó természetes GM-CSF szekvencia.

3/0⁸-3162 nukleotidok: egy hármas terminációs szekvenciát (-TAA-TAA-TAG-) és ez után egy polilinkert, azaz egy restrikciós endonukleáz multivágóhelyet tartalmazó rövid DNS-szekvenciát tartalmazó DNSszakasz.

3163-3257 nukleotidok: a pUC18 plazmidból származó DNS-szakasz.

3258-4688 nukleotidok: a pBR322 [Bolivár és munkatársai, Gene, 2, 95-113] származó DNS-szekvencia, amely egy, az E. coli gazdaszervezetnek tetraciklin-rezisztenciát adó gént tartalmaz.

4688-4998 nukleotidok: a pUC18 plazmidból származó DNS szakasz.

A GM-CSF-et kódoló szekvencia az ATG-CCACCA-CCT-CCT-TCT-CCA-TCT-CCA-TCT-ACT szintetikus szekvenciával kezdődik, amely az érett GM-CSF indító 11 aminosav-gyökét határozza meg. A GM-CSF-et kódoló szekvencia többi része a pTALC185R-ben azonos a pCSF-1 szekvenciáján belül a 97447 nukleotidokkal, amelyeket a TAA-TAA-TAG szekvencia követ. Azonnal a hármas terminátort (befejező szakaszt) követően a pUC18 polilinker található itt. A pBR322-ből a tetraciklin-rezisztencia gént beiktattuk, a CSF génnel ellentétes orientációban, 100 bázissal „lefelé” a pUC18 polilinkertől. A tetraciklin rezisztencia gén hordozza saját promotorát. Az óramutató járásával ellenkező irányban folytatva a következő gén itt a β-laktamázé, ezt követi a pUC18 (CoLEl) replikációs origó.

A plazmid tartalmaz még egy PL promotort. Ez a promotor esszenciális, amint ezt A. Skatzman és M. Sorenberg leírták [„Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 419. oldala (1982)]. A CSF kifejeződést a PL promotor hajtja a hőindukció után egy megfelelő E. coli gazdasejtben.

Az összes törzs-konstrukcióhoz alkalmazott szülőtörzs a W3110 lacI^QL8 [Brent, R. és Ptashne, M.: PNAS 78, 4202-4208 (1981)].

Az expressziós vektor (pTALC-185R) pL kontrollfunkciókkal való ellátásához a lambda-DNS-nek a lambda-repressziós protein (cl) génjét hordozó fragmensét integráljuk a W3110 lacI^QL8 kromoszómájába a lacZ lókusznál, így alakítjuk ki az új GI400 törzset. Az integrálást úgy végezzük, hogy egy integráló vektort - a pCIN-5-öt (9. ábra) - konstruálunk, amely a pBR325-ból [Bolivár, Gene, 4, 121 (1978)] származik. A pBR325 kloramfenikol- és ampicillin-rezisztencia gént, valamint a colEl replikációs origót tartalmazza. A pCIN-5 ezen gének mellett az E. coli lac DNS-nek a lacl-ben levő BstEII helytől a lacZ-től lefelé levő TthlllI helyig terjedő részét is tartalmazza. A természetes lacZ szekvenciában található Clal helyet a pCIN-5 lacZ génjében szintetikus BamHI DNS-linkerek felhasználásával BamHI helyre cseréljük ki. A pCIN-5-be két helyen szintetikus Xbal linkereket is iktatunk be, éspedig a β-laktamáz és a kloramfenikol rezisztencia gén között fekvő AatlI helynél és a lacZtől lefelé levő Thtl 1II helynél. Ez a két Xbal hely tehát a plazmidban a replikációs origót és az ampicillin-rezisztencia gént szegélyezi. A pCIN-5 lacZ génjében levő BamHI helynél beiktatunk egy 3,7 kb hosszúságú lambda-DNS fragmenst, amely a cl⁸⁵⁷ lambda represszor protein alléi, a lambda rex-protein és a lambda N-protein génjét hordozza (34499—»38 214 lambdanukleotidok). A lambda-DNS-nek a lacZ kromoszomális másolatába történő integrálását a következő módon végezzük. A pCIN-5-öt Xbal-gyel hasítjuk, és a kisebbik fragmenst, amely a replikációs origót és az ampicillin rezisztencia gént tartalmazza, preparatív agaróz gél elektroforézissel elválasztjuk a nagyobbik fragmenstől. A nagyobbik fragmenst, amely a kloramfenikol rezisztencia gént, a lacl gén egy részét és a teljes lacZ gént (a lambda DNS fragmenssel megszakítva) tartalmazza, T4 DNS-ligázzal cirkularizáljuk, és ezzel transzformáljuk a W3110 lacI^QL8 törzset. A transzformációs elegyet 15 pg/ml kloramfenikolt tartalmazó laktóz-MacConcey agar lemezeken választjuk el. A vörös (lac⁺) kloramfenikol-rezisztens kolóniákat, amelyek azokat a sejteket reprezentálják, ahol a cirkularizált pCIN-5 nagy fragmense homológ rekombinációval a kromoszomális lacZ lókusznál integrálódott a kromoszómába, felszedjük. Ezen kolóniák egy részét ampicillin lemezen ellenőrizzük, és egy ampicillin-érzékeny izolátumot kiválasztunk. Ez az izolátum (egy kointegráns) a lacZ DNS két kromoszomális másolatát tartalmazza, egy natív másolatot és egy olyat, amely a lambda DNS inszertet hordozza (a kloramfenikol rezisztencia génjét tartalmazó plazmid DNS szekvenciák a két lacZ gén között fekszenek). Ez a konfiguráció inherens módon instabil, és spontán módon egy második rekombináció következik be, ami mind az extra plazmid szekvenciák, mind a lacZ gén természetes másolatának a kromoszómából való eltávolítását eredményezi. Azokat a kolóniákat, amelyekben a lambda DNS-t hordozó lacZ gén másolata megmarad, laktóz-MacConcey lemezeken történő szélesztéssel találhatók meg. Ezekben a kolóniákban a kointegráns fenotípusa a kezdeti lac⁺,amp^s,cam^R fenotípusról a második rekombináció után lac,amp^s,cam^s fenotípusra változik. A kapott törzset nevezzük GI400-nak. Az ebben a törzsben képződő lambda-proteinek hatékonyan kapcsolják ki a pL promotert 30 °C-on, míg 42 °C-on hatékony átírást tesznek lehetővé a pL promoterról, mivel a cl⁸⁵⁷ represszor protein magas hőmérsékleten instabil. Egy olyan törzsnek, mint például a G1400-nak a szokásos lambda lizogén törzzsel szemben az az előnye, hogy a GI400 nem hordoz fág-eredetű lízist a replikációs funkcióiban. A cl, rex és N gének stabilan integrálódva találhatók a kromoszóma egy olyan területében, amely nem szükséges a gazdaszervezet normál növekedéséhez.

A GL400-at lon-á tesszük egy az SG20252 törzsön (ZacAul69, araD139 rpsl ΙοηΔΙΟΟ: :Tnl0) kinőtt lizátum Pl transzdukciójával (a transzdukciót az Experiments in Molecular Genetics, Jeffery H. Miller, 201. old. (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,

N. Y., 1972) helyen ismertetett módon végezzük], A TnlO-et Tet^s-re való átvizsgálással alakítjuk ki szelek19

HU 208 711 Β tív tápközegen [Maid, S., Nunn, W.: J. Bacteril. 145, 1110-1112(1981)].

A végső gazdasejtet GI413-nak nevezzük [lacI^QL8,LacZA (Xcl⁸⁵⁷, REX, N), ΙοηΔΙΟΟ].

A pTALC-185R-t GI413-ba transzformáljuk. Ennek a törzsnek egy éjszakán át nőtt tenyészetét 30 °C hőmérsékleten növesztjük 5 ml indukciós tápközegben, amely 1 literben a következőket tartalmazza.

g kazamino-sav g Na₂ HPO₄x7 H₂0

3gKH₂PO₄,

0,5 g NaCl, lgNH₄Cl,

1% glicerin 2 mg Bl-vitamin, mg CaCl₂x2 H₂O,

0,2 g MgCl₂x6 H₂O.

A tápközeget (25 ml), amely 7 pg/ml tetraciklint is tartalmaz, 125 pl egy éjszakán át nőtt tenyészettel inokuláljuk, és 30 °C hőmérsékleten rázatjuk vízfürdőben,amíg a tenyészet eléri a 0,5 A_55O sűrűséget. Ezután gyorsan átvisszük 40 °C hőmérsékletű vízfürdőbe, és további két órán át rázatjuk, hogy lehetővé tegyük a GM-CSF szintézisét. A sejteket kinyerjük és CSF tartalmukat ellenőrizzük SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel. Ilyen körülmények között a GM-CSF a sejtfehérje mintegy 5%-a mennyiségében gyűlik össze.

G) példa

GM-CSF kifejeződése Saccharomyces cerevisiae-ban

A) Vektor megalkotása

Olyan palzmidot - a YOpl-et - alkotunk meg, amely tartalmazza az uracil bioszintézis útban lévő egyik enzimet (Í/RA3) kódoló gént, mint szelekciós gént és a 2 p replikációs origót. Ez a plazmid a YIp5-ből [Botstein és munkatársai: Gene, 8, 17-24 (1979)] származik olyan fragmens hozzáadásával, amely tartalmazza a replikációs origót az élesztő 2 mikronos plazmidjából.

A YOpl vektort (10. ábra) a YIp5-ből a következőképpen készítjük: YIp5-öt (ATCC pRB12 37061) EcoRl-gyel emésztünk, az 5 ’-túlny úló véget dNTP-jelenlétében Poll segítségével feltöltjük. 2 pélesztőplazmidot HaelII-mal és Hpal-gyel emésztünk [J. L. Hartley és J. E. Donaldson (1980); 2 p élesztőplazmid nukleotidszekvenciája: Natúré 286, 860], a replikációs origót tartalmazó 1,4 kb fragmenst izoláljuk, ezt a tompavégű fragmenst DNS-ligáz segítségével a tompavégű YIp5 vektorral ligáljuk. A ligálási eleggyel E. coli törzset transzformálunk, és az ampicillin rezisztens kolóniákat kiválogatjuk.

B) A glicerinaldehid-foszfát-dihidrogénázt (GPDH) kódoló gén izolálása

GPDH-t kódoló két gént izoláltak élesztőből (Holland and Holland Journal of Biological Chemsitry, 255, 2596-2605 (1980)]. A publikált szekvencia alapján szintetizált oligonukleotid vizsgáló mintát alkalmazzuk GPDH gén izolálásához standard módszerekkel élesztő genom DNS plazmid „könyvtár”-ból. A teljes GAP491 gént tartalmazó plazmidot korábban deponáltuk (ATCC 39777).

C) Glicerin-aldehid-foszfát-dihidrogenáz promotor előállítása heterológ gén-kifejeződéshez Olyan plazmidot alkotunk meg, amely biztosítja a

GPDH promotor természetes távolságát a kívánt heterológ struktúrgén kiindulási helyétől. Ezt úgy hajtjuk végre, hogy KpnI helyet vezetünk be közvetlenül a GPDH struktúrgént beindító metionin kodonjának szomszédságába. A promotor „kazettá”-t azután beiktatjuk az YOpl élesztő kifejező vektorba.

D) Az Ct.-vektort kódoló gén izolálása

Egy feromont kapcsoló α-vektort kódoló gént izoláltak élesztőből [Kurjan és Herskowitz, Cell, 30,933— 943 (1982)]. Ebből a pre-pro szekréciós szekvenciát izoláljuk, és a GPDH promoter Met kezdetéhez, azzal leolvasási keretben klónozzuk úgy, hogy a plazmidot KpnI-gyel emésztjük, és a túlnyúló 3’-véget Klenowfragmenssel eltávolítjuk. A GPDH promoter és az afaktor pre-pro szekvenciájának kapcsolódásánál a szekvencia:

5’ GPDH promoter 3’ 5’ α-faktor pre-pro-szekvencia

3ΆΑΑ TAA ACA ATG. CTG TTT CCT TCA...

A primeren készített érett GM-CSF kbdolb szekvenciát tompavég-HindlII szekvencia formájában izoláljuk (1. 11. ábra), és egy alkalmas vektorba (pl. AF802-be) klónozzuk, így egy Xhol helyet hozunk létre az érett GM-CSF szekvencia 5’-végénél. Ezt a konstrukciót AG619-nek nevezzük. Az érett GM-CSF 5’-végénél levő kapcsolódás szekvenciáját a 12. ábra mutatja. Az AG619 készítésének vázlatát a 13. ábra mutatja.

Az érett GM-CSF kódoló szekvenciát az AG619bol egy élesztő expressziós vektorba, például Z306-ba visszük át, amely a fenti módon készül, és amely a GPDH 1 kb hosszúságú promoter szekvenciáját közvetlenül az α-faktor pre-pro szekvenciájától felfelé tartalmazza (1. 15 ábra). Az Xhol hely túlnyúló 5’-végét Mung-bab-nukleázzal úgy távolítjuk el, hogy az a-faktor pre-pro-szekvenciájának 5’ túlnyúló végét feltöltjük, az érett GM-CSF kódoló szekvenciáját az a-faktor szekréciós szekvenciájával leolvasó keretbe helyezzük, közvetlenül a ΚΕΧ Π és aminopeptidáz proteáz helyektől lefelé. Ennek a plazmidnak a kifejeződése élesztőkben az érett GM-CSF szekrécióját és feldolgozását eredményezi. (A GM-CSF kapcsolódásának szekvenciáját a 14. ábra szemlélteti.)

E) CSF kifejező plazmid előállítása

A fentebb leírt elemekből és a humán CSF génből egy kifejező vektort (AJ14, 7. ábra) alkotunk meg standard módszerekkel. Ebben a vektorban a CSF természetes vezető szekvenciáját eltávolítjuk, és az érett CSF-et kódoló szekvenciát az α-faktor pre-pro szekvencia szomszédságába beiktatjuk. A GPDH promotor, α-faktor pre-pro szekvencia és az érett CSF szekvencia közti találkozásokat pontosítjuk (lásd alább) és szekvenciájukat didezoxinukleotid szekvencia-elemzéssel igazoljuk:

HU 208 711 Β

AAATAAACAAA47’G.GTTTTCCTTCA.,..AAA AGA GAG GCG GAAGCT.GCA CCCGCCCGCTCG...

F) GM-CSF kifejeződése

Az AJ14 plazmidot Saccharomyces cerevisiae w5 törzsbe transzformáljuk. A sejteket CSF termelése érdekében tenyésztjük.

Claims (9)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 10

   1. Eljárás az 1. ábrán bemutátott szekvenciában a nyílnál kezdődő GM-CSF-Thr aminosav-szekvenciával rendelkező humán GM-CSF proteint, ennek alléi vagy más funkcionális, egy, két, három, négy vagy öt 15 aminosav-beiktatást, -helyettesítést vagy -törlést tartalmazó, de a csontvelővizsgálatban humán GM-CSF-aktivitást kifejtő változatait kódoló GM-CSF-cDNS-et tartalmazó vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy humán GM-CSF-et termelő sejtből RNS-t nyerünk 20 ki, erről mRNS-en keresztül egyszálú cDNS-t készítünk, majd ezt kettősszálúvá tesszük, ezt alkalmas vektorba iktatjuk, és ezzel baktériumot transzformálunk, a transzformált baktérium tenyészetéből a vektort izoláljuk és valamely a GM-CSF proteint kifejezni képes 25 gazdaszervezetbe juttatjuk, a vektort tartalmazó gazdaszervezetet tenyésztjük, a GM-CSF protein kifejező kolóniákat kiválasztjuk, és a vektort izoláljuk. (Elsőbbsége: 1984. 07. 06.)
2. 2. Eljárás az 1. ábrán bemutatott szekvenciában a 30 nyílnál kezdődő GM-CSF-Thr aminosav-szekvenciával rendelkező humán GM-CSF protein, ennek alléi vagy más funkcionális, egy, két, három, négy vagy Öt aminosav-beiktatást, -helyettesítést vagy -törlést tartalmazó, de a csontvelővizsgálatban humán GM-CSF-ak- 35 tivitást kifejtő változatainak az előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, a tárgyi kör szerinti proteint kódoló gént kifejező vektorral transzformált eukarióta vagy prokarióta sejtet tenyésztünk, és a kifejezett GMCSF proteint izoláljuk. (Elsőbbsége: 1984.07. 06.) 40
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdaszervezetként E. coli, COS vagy élesztősejteket tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1984.07.06.)
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdaszervezetként Escherichia coli MCI061 45 (ATCC 39754) törzset (Elsőbbsége: 1984.07.06.)
5. 5. Eljárás az 1. ábrán bemutatott szekvenciában a nyílnál kezdődő GM-CSF-Thr aminosav-szekvenciával rendelkező humán GM-CSF protein, ennek alléi vagy más funkcionális, egy, két, három, négy vagy öt 50 aminosav-beiktatást, -helyettesítést vagy -törlést tartalmazó, de a csontvelővizsgálatban humán GM-CSF-aktivitást kifejtő változatai vizes közegben szuszpendált proteinek elegyéből történő tisztítására, és legalább lxlO⁷ egység/mg aktivitású formában történő előállí- 55 tására, azzal jellemezve, hogy a proteineket a közeg telítési értékének legfeljebb 80%-áig adagolt ammónium-szulfáttal kicsapjuk, a kapott GM-CSF proteint tartalmazó pelletet egy pufferolt oldatban újra szuszpendáljuk, a GM-CSF proteint tartalmazó pufferolt 60 oldatot oktil-szefarózzal, dietil-amino-etil-ultrogéllel és/vagy akrilamid-ultrogéllel töltött kromatográfiás oszlopra visszük, a GM-CSF aktivitást nátrium-kloridot tartalmazó pufferolt oldattal eluáljuk, a GM-CSFaktivitást mutató frakciókat összegyűjtjük, egy reverz fázisú oszlopra visszük, a GM-CSF aktivitást acetonitril-gradienssel eluáljuk, és a GM-CSF aktivitást tartalmazó frakciókat összegyűjtjük. (Elsőbbsége: 1984. 07. 06.)
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ammónium-szulfátos kicsapással kapott, GMCSF proteint tartalmazó pelletet 6-8 pH-értékű oldatban szuszpendáljuk, és a reverz fázisú oszlopról a GMCSF-aktivitást 0-90% acetonitril-gradienssel eluáljuk. (Elsőbbsége: 1984. 09. 19.)
7. 7. Eljárás az 1. ábrán bemutatott szekvenciában a nyíl után kezdődő GM-CSF-Ile vagy GM-CSF-G aminosav-szekvenciával rendelkező főemlős GM-CSF proteint, ennek alléi vagy más funkcionális, egy, két, három, négy vagy öt aminosav-beiktatást, -helyettesítést vagy -törlést tartalmazó, de a csontvelővizsgálatban főemlős GM-CSF-aktivitást kifejtő változatait kódoló GM-CSF-cDNS-t tartalmazó vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy GM-CSF-et termelő sejtből RNS-t nyerünk ki, erről mRNS-en keresztül egyszálú cDNS-t készítünk, majd ezt kettősszálúvá tesszük, ezt alkalmas vektorba iktatjuk, és ezzel baktériumot transzformálunk, a transzformált baktérium tenyészetéből a vektort izoláljuk és valamely a GM-CSF proteint kifejezni képes gazdaszervezetbe juttatjuk, a vektort tartalmazó gazdaszervezetet tenyésztjük, a GM-CSF proteint kifejező kolóniákat kiválasztjuk, és a vektort izoláljuk. (Elsőbbsége: 1984.09.19.)
8. 8. Eljárás az 1. ábrán bemutatott szekvenciában a nyíl után kezdődő GM-CSF-Ile vagy CSF-G aminosav-szekvenciával rendelkező főemlős GM-CSF protein, ennek alléi vagy más funkcionális, egy, két, három, négy vagy öt aminosav-beiktatást, -helyettesítést vagy -törlést tartalmazó, de a csontvelő-vizsgálatban főemlős GM-CSF-aktivitást kifejtő változatainak az előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely a tárgyi kör szerinti proteint kódoló gént kifejező vektorral transzformált eukarióta vagy prokarióta sejtet tenyésztünk, és a kifejezett GM-CSF proteint izoláljuk. (Elsőbbsége: 1984.09.19.)
9. 9. Eljárás az 1. ábrán bemutatott szekvenciában a nyíl után kezdődő GM-CSF-Ile vagy GM-CSF-G aminosav-szekvenciával rendelkező főemlős GM-CSF protein, ennek alléi vagy más funkcionális, egy, két, három, négy vagy öt aminosav-beiktatást, -helyettesítést vagy -törlést tartalmazó, de a csontvelő-vizsgálatban főemlős GM-CSF-aktivitást kifejtő változatai vizes közegben szuszpendált proteinek elegyéből történő tisztítására, és legalább lxlO⁷ egység/mg aktivitású formában történő előállítására azzal jellemezve, hogy a proteineket a közeg telítési értékének legfeljebb 80%áig adagolt ammónium-szulfáttal kicsapjuk, a kapott,

   HU 208 711 Β

   GM-CSF proteint tartalmazó pelletet egy 6-8 pH-értékűre pufferolt oldatban újra szuszpendáljuk, a GMCSF proteint tartalmazó pufferolt oldatot oktil-szefarózzal, dietil-amino-etil-ultrogéllel vagy akrilamid-ultrogéllel töltött kromatográfiás oszlopra visszük, a GM-CSF-aktivitást nátrium-kloridot tartalmazó pufferolt oldattal eluáljuk, a GM-CSF-aktivitást mutató frakciókat összegyűjtjük és egy reverz fázisú oszlopra visszük, majd a GM-CSF-aktivitást 0-90% acetonitrilgradienssel eluáljuk, és a GM-CSF-aktivitást tartalma5 zó frakciókat összegyűjtjük. (Elsőbbsége: 1984. 09. 19.)