SK505985A3 - Vector comprising gene that encods gm-csf protein of primates, host cell plasmid, process for the production of proteins, gm-csf protein of primates, cdna corresponding with a gene encoding gm-csf protein of primates - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu výroby lymfokínov, predovšetkým bielkoviny, ktorá má schopnosť podporovať rast a diferenciáciu základných krvných buniek primátov; predovšetkým sa jedná o faktor, ktorý podporuje tvorbu kolónií (CSF). Faktor CSF je možné získať pomocou rekombinantnej DNA. DO odboru vynálezu patria taktiež vektory, ktoré obsahujú gén pre expresiu uvedenej bielkoviny, ako i mikroorganizmy a bunečné línie transformované pôsobením uvedených vektorov. Predmetom vynálezu je taktiež spôsob izolácie a čistenie CSF a to ako z prírodných zdrojov tak zo zdrojov získaných rekombinantnou technikou; týmto spôsobom sa získa bielkovina, ktorá má čistotu a účinnosť ovela vyššiu ako bielkovina, ktorá sa pripravovala doteraz.

Doterajší stav techniky

Rôzne typy buniek, ktoré sa nachádzajú v krvi, sa všetky dajú odvodit od základných buniek, ktoré sa môžu ďalej diferencovať. Tieto základné bunky majú dve funkcie:

1) reprodukujú samy seba, takže udržiavajú populáciu základných buniek v tele a

2) vytvárajú ďalšie bunky, ktoré diferencujú do rôznych zrelých typov krvných buniek.

Bunka, ktorá sa diferencuje určitým spôsobom sa nazýva progenitor. Progenitor pre lymfocyty T, lymfocyty B, granulocyty, červené krvinky, doštičky a eozinofilné bunky ako i nezrelé progenitory, ktoré môžu dávať vznik rôznym typom zrelých buniek sa pokusne študovali ako in vi vo tak in vitro, ako je popísané napríklad v publikácii Dexter, T. M., J. Pathology 141, 415 - 433, 1983. In vitro bolo možné preukázať, že proliferácia a/alebo diferenciácia každého typu progenitora závisí na špecifických faktoroch, ktoré je možné odvodit z rôznych zdrojov. Napríklad progenitory pre červené krvinky vyžadujú prítomnosť faktora, ktorý bol nazvaný erytropoietin. Faktory, ktoré sú potrebné pre prežitie, proliferáciu a diferenciáciu myeloidných progenitorov pre tvorbu zrelých neutrofilných granulocytov, monocytov a zrelých makrofágov sa nazývajú faktory, ktoré podporujú tvorbu kolónií (CSF).

Účinnosť týchto faktorov bola velmi dôkladne študovaná u myší. Väčšina orgánov dospelých myší produkuje látku s účinnosťou CSF. Zlúčeniny, ktoré majú určitú účinnosť tohoto typu boli získané z rôznych tkanív a rôznymi spôsobmi, tieto látky sa však od seba značne líšia svojimi biochemickými vlastnosťami. Z tohoto dôvodu zostáva štruktúrna príbuznosť rôznych faktorov zatial neznáma. Okrem toho sa javí, že CSF pôsobí pravdepodobne vo viacerých než v jednom stupni vývoja granulocytov a makrofágov, pričom opäť nie je známe, či je jediný faktor zodpovedný za všetky typy účinnosti, alebo či je potrebné, aby v každom stupni pôsobil iný faktor, ako je podrobnejšie popísané v publikácii Burgess, A. a Metcalf, D., Blood 56, 947 - 957, (1980).

Látka s účinnosťou ludského CSF bola získaná z placenty, niektorých tkanív plodu, z makrofágov a zo stimulovaných T-buniek. Línia T-buniek (Mo), ktorá vytvára jednu alebo väčší počet látok s účinnosťou CSF bola získaná od chorého na leukémiu, pri ktorej boli zmnožené určité varianty buniek T (Leukemická retikuloendotellióza), ako bolo popísané v publikácii Golde a kol., Blood 52, 1068 - 1072, (1978).

Schopnosť CSF stimulovať granulocyty a makrofágy znamená, že farmaceutické prostriedky s touto účinnosťou by bolo možné klinicky použiť v tých situáciách, kedy by bolo potrebné zvýšiť produkciu buniek myeloidného typu. Niektorí chorí s velmi vysokými hladinami normálnych granulocytov mali v¹ skutočnosti nádory, ktoré produkovali príliš velké množstvo CSF. V jednom prípade prišlo po chirurgickom odstránení nádoru k rýchlemu poklesu počtu granulocytov na normálnu hladinu, čo viedlo k názoru, že týmto spôsobom by bolo možné regulovať počet obiehajúcich granulocytov. Tento názor bol vyslovený taktiež v publikácii Hocking, W., Goodman, J. a Golde, D., Blood 61, 600, (1983). Farmaceutické prostriedky s obsahom CSF je možné použiť klinicky pri liečbe potlačenia drene, ktorá je spôsobená po ožiarení nádorov alebo pri chemickej liečbe týchto nádorov. Okrem toho farmaceutické prostriedky s obsahom CSF by mohli byť. užitočné pri liečbe ťažkých infekcií, pretože CSF môže zvýšiť počet granulocytov a/alebo monocytov a/alebo môže tieto elementy aktivovať.

Existujú rôzne typy známej účinnosti CSF, vrátane granulocytárnej účinnosti (G-CSF), účinnosti na makrofágy (M-CSF), účinnosti na granulocyty i makrofágy (GM-CSF) a účinnosti na väčší počet týchto buniek. Vynález sa predovšetkým zaoberá otázkou výroby GM-CSF. Bielkoviny tohoto typu už boli izolované z rôznych živočíšnych zdrojov, vynález sa však predovšetkým týka výroby CSF cicavcov, predovšetkým človeka a opíc.

Biologické a biochemické štúdie látok s účinnosťou CSF boli až doteraz brzdené skutočnosťou, že jednak bolo týchto látok k dispozícii veľmi malé množstvo, predovšetkým pokiaľ ide o CSF ludí a/alebo ďalších primátov, jednak neboli tieto látky čisté. Je zrejmé,že by bolo žiadúce presne identifikovať bielkovinu alebo bielkoviny, ktoré sú nositeľmi účinnosti CSF. Ďalej by bolo žiadúce získať stály zdroj CSF, s výhodou primátov a predovšetkým človeka tak, aby bolo možné lahko získať tieto bielkoviny vo väčšom množstve a s čistotou, ktorá je dostatočná pre zaistenie biologických a biochemických vlastností týchto látok, aby ich potom bolo možné použiť pre ďalšiu liečbu.

V poslednom období bola vyvinutá technika molekulárneho klonovania, ktorá umožňuje klonovať sled nukleotidov, ktorý je kódom pre bielkoviny a tak získať bielkovinu vo väčšom množstve pri vhodnej voľbe hostiteľa a vektora, ako bolo popísané v publikácii Maniatis T., Molecular Cloning - A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Ϋ. 1982. Bielkovinu je možné izolovať a čistiť bežnými spôsobmi. Spôsoby klonovania, ktoré sa až doteraz používali je možné vo všeobecnosti rozdeliť na tri skupiny:

(1) spôsoby, ktoré sú založené na znalosti štruktúry bielkoviny, napríklad na znalosti sledu aminokyselín, (2) spôsoby, založené na identifikácii bielkoviny, k expre4 sii ktorej prišlo pri použití klonovaného génu použitím protilátky, špecifickej pre túto bielkovinu a (3) spôsoby, založené na identifikácii RNA, ktorú je potom možné podrobiť translácii za získania bielkoviny, pre ktorú je kódom uvedený gén.

Všetky	tieto spôsoby	sú	velmi	neľahké
bielkovina,	napríklad CSF	je	k dispozícii
množstve.	To znamená, že	v	prípade,	že je

alternatívny prístup, avšak velmi obťažne získava bez to velmi malom obťažné získať dostatočné množstvo čistenej bielkoviny, je taktiež obťažné stanoviť sled aminokyselín tejto bielkoviny alebo aspoň časť tohto sledu. Identifikácia bielkoviny po expresii väzbou na protilátku sa s výhodou uskutočňuje za použitia monošpecifického polyklonálneho antiséra s vysokým titrom. Toto antisérum sa však rovnako nedá získať bez väčšieho množstva čistej bielkoviny, ktorá sa použije ako antigén. Monoklonálna protilátka poskytuje požadovaná protilátka sa taktiež vhodného antigénu a okrem toho monoklonálna protilátka nemusí reagovať s bielkovinou vo forme, v ktorej u tejto bielkoviny došlo k expresii pri dostupnom systéme hostiteľa a vektora. Okrem toho na transláciu RNA za získania identifikovateľnej bielkoviny je potrebné, aby požadovaná RNA bola prítomná v zdroji RNA v dostatočnom množstve, aby ju bolo možné oddeliť. Relatívny dostatok RNA, ktorá je kódom pre určitú bielkovinu, ide zvyčajne ruka v ruke s malým množstvom RNA, takže sa dá povedať, že v prípade príliš malého množstva bielkoviny je k dispozícii taktiež velmi malé množstvo príslušnej mRNA.

Bunečná línia Mo sa použila ako východiskový materiál pre čistenie ludského CSF a taktiež na identifikáciu zodpovedajúcich typov mRNA. Avšak i pri použití¹ tohoto pomerne dobrého zdroja CSF je nesmierne obťažné izolovať dostatočné množstvo uvedenej bielkoviny pre štrukturálne štúdie.

Podstata vynálezu

Aby bolo možné prekonať problémy, spojené s klonovaním sledu nukleotidov, ktorý je kódom pre bielkovinu, ktorá sa vyskytuje v malom množstve, napríklad pre CSF bola navrhnutá nová metóda.

Pre túto inetótu je potrebná iba skutočnosť, aby produkt génov bolo možné vhodným spôsobom merať. Vhodné metódy pre meranie CSF budú popísané ďalej v príklade 2. Na základe zistenia bol potom navrhnutý i spôsob čistenia, ktorý umožňuje izoláciu a čistenie CSF z prírodného zdroja alebo zo zdroja, získaného rekombinantnou technikou tak, že sa získa produkt s takou čistotou a účinnosťou, s akou ho až doteraz nebolo možné získať.

Spôsobom pódia vynálezu je treba prekonať problémy, predtým spojene so technológie, vynálezu je čistotou za použitia DNA. Spôsob pódia vyžaduje len stanoviť získaním CSF s dostatočnou využívajúcej rekombinantnú nový spôsob klonovania, ktorý citlivo účinnosť CSF. Spôsobom pódia vynálezu sa získava cDNA, ktorá je kódom pre bielkovinu s účinnosťou CSF (CSF/cDNA), ďalej mikroorganizmus alebo bunečná línia, transformovaná rekombinantným vektorom, ktorý obsahuje CSF/cDNA a spôsob pre výrobu bielkoviny s účinnosťou CSF expresií CSF/cDNA kultivovaním uvedeného mikroorganizmu alebo bunečnej línie. Pretože bielkovina s účinnosťou CSF je produkovaná klonom, získaným spôsobom pódia vynálezu, je celkom isté, že sa jedná o bielkovinu s účinnosťou CSF. Predmetom vynálezu je predovšetkým spôsob výroby, izolácie a transformácie vektora s obsahom CSF/cDNA, ktorý spočíva v tom, že sa pripravia RNA z bunky, ktorá produkuje CSF, pripraví sa polyadenylovaná mRNA z uvedenej RNA, pripraví sa cDNA s jednoduchým reťazcom z uvedenj mRNA a cDNA s jednoduchým reťazcom sa pretransformuje na cDNA s dvojitým reťazcom, cDNA s dvojitým reťazcom sa včlení do vektora pre transformáciu a týmto vektorom sa transformujú baktérie za vzniku kolónií, spojí sa vždy 200 až 500 kolónií a z každej skupiny kolónií sa izoluje plazmidová DNA, plazmidová DNA sa prenesie do vhodných hostitelských buniek pre expresiu bielkoviny s účinnosťou CSF, bunky, do ktorých bola prenesená plazmidová DNA sa kultivujú a supernatant sa skúma na účinnosť CSF a pozitívne vzorky sa izolujú a kolónie sa skúmajú tak, aby sa stanovila kolónia, ktorá produkuje CSF.

CSF, získané spôsobom podlá vynálezu, sú rastové a diferenciačné hormóny pre bunky myeloidného . systému. Tieto látky sú určené napríklad pre klinické použitie pri útlme drene, predovšetkým v prípade (symptomatickej) granulocytopénie po chemickej liečbe nádorov alebo po liečbe nádorov ožarovaním.

Prehlad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 znázorňuje sled DNA, ktorý je kódom pre bielkovinu CSF. Úplná DNA je kódom pre ludský CSF. Zmeny, uvedené pre ludský sled sú rozdiely, ktoré odlišujú tento sled od sledu opice gibon. Znázornený je taktiež sled aminokyselín, ktorý vzniká pri použití uvedeného sledu DNA.

Na obr. 2 je schématicky znázornený spôsob výroby plazmidu pTPL z plazmidu pAdD26SVpA(3).

Obr. 3 je schematickým pokračovaním obr. 2 a znázorňuje spôsob výroby plazmidu p91023 z plazmidu pTPL.

Obr. 4 je schematickým pokračovaním obr. 3 a znázorňuje plazmid p91023(B).

Ďalej bude uvedené vysvetlenie niektorých pojmov pre ulahčenie pochopenia spôsobu podlá vynálezu. Pokial by sa rozsah definície odlišoval od bežného rozsahu v odbore, bude to ďalej uvedené.

Amplifikácia alebo pomnoženie znamená pochod, pri ktorom bunka produkuje opakovanie génu s vlastnou chromozonálnou DNA.

CSF je látka s biologickým účinkom, ktorá je ďalej definovaná metódami stanovenia.

Bielkovina CSF je bielkovina z primátov, ktorá má účinnosť CSF. Pre potreby vynálezu je pojem CSF ako bielkovina používaný i pre modifikované bielkoviny CSF, alelové variácie bielkoviny CSF a pre túto bielkovinu i v prípade, že je pred jej reťazec zaradený zvyšok MET.

Smerom dole znamená smerom k 3· - zakončeniu nukleeotidového sledu.

Sled, podporujúci reakciu je nukleotidový sled, ktorý môže spôsobiť potenciáciu transkripcie génu nezávisle na svojej polohe vzhladom k tomuto génu alebo na orientáciu sledu.

Gén je sled dezoxyribonukleotidov, ktorý je kódom pre danú bielkovinu. Pre účely vynálezu gén nemá obsahovať oblasti, ktoré sú pre transláciu zbytočné, napríklad signálne sledy, polyadenilové reťazce, promótory alebo podporné sledy.

Väzba je spôsob, pri ktorom dochádza k tvorbe fosfodiesterovej väzby medzi 5'- zakončením a 3'-zakončením dvoch reťazcov DNA. Väzbu je možné uskutoniť niekolkými známymi spôsobmi za použitia enzýmov vrátane T4 ligázy.

Orientácia je poradie nukleotidov v slede DNA. Prevrátená orientácia sledu DNA je taká orientácia, pri ktorej je poradie 5'- a 3'-zakončenia jedného sledú obrátené vzhíadom ku tomuto poradiu v druhom slede. Toto uloženie je dôležité pre transkripciu ďalšieho sledu DNA v zdroji DNA alebo pre replikáciu vektorov, ktoré obsahujú uvedený sled.

Transkripcia je syntéza RNA z pôvodnej DNA.

Transformácia znamená zmenu genotypu bunky tým, že bunka prijme cudzorodú DNA. V niektorých prípadoch je možné transformá8 ciu preukázať zmenou fenotypu bunky. Transformované bunky sa nazývajú transformanty, bunky pred transformáciou sú pôvodné bunky.

Translácia je syntéza polypeptidov z mRNA.

Účinnosť CSF je možné získať z veľkého počtu bunečných zdrojov vrátane prostredí, v ktorom sa nachádzajú mononukleárne bunky periférnej krvi, z pľúcneho a placentárneho tkaniva, z kostnej drene, z moču chorých, ktorí trpia na chudokrvnosť, z krvného séra a z normálnych a neoplastických línií T-lymfocytov a mononukleárnych fagocytov. Jednou bunečnou líniou, ktorá produkuje CSF je línia Mo. CSF, produkovaný touto bunečnou líniou je známy ako CSF pre granulocyty a makrofágyy (GM-CSF), jedná sa o ľudský CSF. Jeden zdroj CSF opice gibon je línia T-buniek, ktorá je označená ako UCD MLA-144. Táto bunečná línia bola uložená v zbierke ATCC, odkiaľ je ju možné získať pod číslom uloženia.

Aby bolo možné izolovať kloň CSF podľa vynálezu, bolo nutné použiť nový spôsob, ktorý predovšetkým vyžaduje stanovenie účinnosti CSF. Najskôr je potrebné identifikovať bunku, ktorá produkuje CSF, napríklad T-lymfocyty alebo iné bunky, ako bolo uvedené vyššie. Potom sa izoluje mRNA tejto bunky. S výhodou sa používajú T-lymfocyty. V tomto prípade sa mRNA, ktorá je viazaná na membránu a obsahuje m-RNA pre lymfokiny oddelí od voľnej mRNA v bunkách. Týmto oddelením sa obohatí izolovaná mRNA 5 až lOkrát o sled, ktorý je nutný pre výrobu lymfokinov a tým sa znižuje námaha, vynaložená na identifikáciu príslušného klonu. Potom sa pripraví chromatografiou na oligo dT celulóza polyadenylová mRNA.

Z mRNA sa pripraví skupina cDNA za použitia vektora, vhodného na prenesenie do hostiteľa pre expresiu požadovanej bielkoviny s účinnosťou CSF. Potom sa pripraví cDNA použitím štandardných spôsobov z vyššie získanej mRNA. Hybridná RNA/cDNA sa prevedie na cDNA s dvojitým reťazcom a tento materiál je potom možné včleniť do vhodného vektora.

Vhodný systém hostiteľa a vektora pre izoláciu klonu CSF je založený na expresii cDNA vo vhodnom vektore pre transformáciu. Vhodným vektorom pre transformáciu môže byť vektor, získaný prechodným včlenením DNA do buniek cicavcov spôsobom podía publikácie P. Mellon, V. Parker, Y. Gluzman, T. Maniatis, Celí 27, 279 - 288 (1981). Aby bolo možné izolovať požadované tranformanty CSF, nie je nutné, aby všetky bunky populácie stabilne obsahovali exogénne gény, ktoré by bolo možné využiť pre expresiu požadovaného CSF ako produktu. Je možné prechodne včleniť exogénne gény do subpopulácie buniek tak, aby táto subpopulácia produkovala požadovanú bielkovinu aspoň počas niekoíkých dní. Pretože nie je potrebné použiť ďalšie látky pre označenie podía vynálezu, môže dôjsť k tomu, že exogénna DNA sa stratí pri bunečnom raste v priebehu jedného až dvoch týždňov.

prenesení do vhodných buniek cicavcov a dokázať.

Avšak dva až tri dni po je možné produkty zistiť

Systém hostite! a vektor, ktorý je vhodný pre toto použitie je bunečná línia opíc CV-1, transformovaná pôsobením defektívnej molekuly DNA SV40, ako bolo popísané v publikácii Gluzman, Y., Celí. 23, 175 - 182, (1981). Transformované opičie bunky CV-1, ktoré obsahujú defektívnu SV-40 DNA sú označované COS (CV-1, defektívna, SV40), tieto bunky neobsahujú úplnú kópiu genómu SV-40, avšak produkujú vysokú úroveň veíkého antigénu T a dochádza u nich k replikácii SV40 DNA.

Tieto bunky taktiež podporujú replikáciu SV40, ktorej chýbajú na začiatku niektoré časti a bakteriálneho plazmidu, ktorý obsahuje SV40 podía publikácie Myers, R. M. a Tjian, R., PNAS 77, 6491 - 6495 (1980). Tento systém teda predstavuje prostriedok pre amplifikácie prenesenej exogénnej DNA cez SV40 za zvýšenia hladiny mRNA a bielkoviny, k expresii ktorej dochádza v prítomnosti exogénnej DNA. Je však možné použiť i podobné systémy.

Vektory, použité pre experesiu CSF typicky obsahujú ďalšie pomocné časti ako podporné sledy, promótory, introny, polyadenylované miesta, 3'-nekódové oblasti a aktivátory translácie, ako bude ďalej podrobnejšie vysvetlené.

Vektory môžu obsahovať podporné sledy. Podporné sledy sa odlišujú od promótora, avšak majú s ním podobný účinok. Ich funkcia na bunečnej úrovni nie je ešte dobre známa, avšak ich jedinečnou vlastnosťou je schopnosť aktivácie alebo potenciácie transkripcie bez závislosti na ich polohe alebo orientácii. Promótory musia byť uložené smerom hore, zatial čo podporné sledy môžu byť uložené smerom hore od 5'-zakončenia promótora, vo vnútri génu ako intron alebo smerom dolu medzi génom a polyadenylovaným miestom alebo 3'-zakončením polyadenylovaného miesta. Promótory s prevráteným sledom nie sú funkčné, avšak prevrátené podporné sledy sú účinné. Podporné sledy majú vplyv na promótory len v tom prípade, ak sú prítomné na tom istom reťazci DNA. Ich úloha je podrobnejšie vysvetlená v publikácii Khoury a kol., Celí .33, 313 - 314 (1983) .

Výhodné podporné sledy pre použitie v bunkách cicavcov je možné získať zo živočíšnych vírusov, napríklad z opčieho vírusu 40, z vírusu polyómu, z vírusu papilomu dobytka, z retrovírusu alebo adenovírusu. Ideálne je, aby podporný sled bol odvodený od vírusu, pre ktorý je bunka hostitela priepustná, t.j. z vírusu, ktorý bežne infikuje bunky tohoto hostitela. Podporné sledy z vírusov sa dajú lahko získať z vírusov bežne dostupných zo zbierok. Oblasti podporných sledov z niektorých vírusov, napríklad z vírusu Rousovho sarkómu a opičieho vírusu 40 sú dobre známe, ako bolo popísané v publikácii See Luciw a kol., Celí 33 . 705 - 716 (1983). Je rutinným postupom molekulárnej biológie vybrať tieto oblasti podlá známych máp pre pôsobenie reštrikčných enzýmov pre jednotlivé vírusy a v prípade potreby modifikovať tieto oblasti, aby bolo možné včleniť podporný sled do vektora požadovaným spôsobom. Tieto postupy sú popísané napríklad v publikáciách Kaufman a kol., J. Mol. Biol. 159, 601 - 621 (1982) a Mol. Celí Biol. 2, (11), 1304 - 1319 (1982). Je možné tiež postupovať tak, že sa podporný sled syntetizuje z údajov, ktoré sú o slede známe. Podporné sledy z vírusov obsahujú zvyčajne menej ako 150 párov báz a sú dostatočne malé, aby ich bolo možné syntetizovať.

Ďalšou súčasťou vektora by mal byt polyadenylovaný sled. Jedná sa o sled DNA, ktorý je uložený smerom dolu od prenášanej oblasti génu, zvyčajne tesne pod miestom, v ktorom sa zastavuje transkripcia. Pridáva sa zvyčajne adenín ribonukleotid, čím vzniká polyadenín nukleotidové zakončenie na 3'-zakončení mRNA. Polyadenylácia je dôležitá pre stabilizáciu mRNA voči degradácii v bunke, ktorá môže znížiť množstvo mRNA a tým tiež množstvo výslednej bielkoviny.

Eukaryatické polyadenylové zakončenia sú dobre známe. Hexanukleotid 5’-AAUAAA-3· sa nachádza 1 až 30 nukleotidov od miesta, v ktorom sa polyadenylácia už začína. Sledy DNA, ktoré obsahujú polyadenylovaný sled, je možné získať z vírusov podľa publikovaných správ. Polyadenylovaný sled je možné získať napríklad z nižšieho beta-globínu a z opičieho vírusu 40, avšak polyadenylované miesta, izolované z vírusov sú výhodnejšie. Pretože tieto sledy sú známe, je možné ich syntetizovať in vitro a naviazať na vektory bežným spôsobom.

Sled, ktorý oddeľuje polyadenylovaný sled od kodonu, na ktorom sa zastavuje translácia, je s výhodou neprenášaný sled DNA, napríklad eukaryatický gén bez promótora. Pretože promótor nie je prítomný, expresia sledu nenastane. Tento sled by mal byt dostatočne dlhý, rádu až približne 1000 báz od kodonu pre ukončenie translácie k polyadenylovanému sledu. Tento 3'-neprenášaný sled má zvyčajne za následok zvýšenie výťažku výsledného produktu. Vektor môže končiť približne 30 párov báz smerom dolu od polyadenylovaného sledu v ich pôvodnej forme. Jedná sa o sledy, ktoré majú zvyčajne 200 až 600 párov báz smerom dolu od polyadenylovaného sledu.

Prítomnosťou intronov v neprenášanej časti vektora sa môžu rovnako zvýšiť výťažky výsledného produktu. Tieto introny je možné získať i z iných zdrojov než z bunky hostitela alebo z génu. Je napríklad možné použiť hybridný intron, ktorý sa izoluje z adenovírusu alebo z génu pre imunoglobulín, včleneného smerom dolu od miesta pre začiatok transkripcie v adenovíruse, čím je možné zvýšiť výťažok výsledného produktu.

Pri výhodnom uskutočnení spôsobu pre klonovanie CSF a pre konštrukciu vektora pre expresiu je možné použiť aktivačný gén pre transláciu. Aktivátory translácie sú gény, ktoré sú kódom pre bielkovinu alebo pre RNA, ktoré ovplyvňujú transláciu požadovanej mRNA. Najlepším príkladom je gén, ktorý je spojený s adenovírusom (VAVAI), u tohoto génu dochádza k transkripcii a interakcii so sledom v 5'-neprenášanéj oblasti mRNA adenovírusu, ako bolo popísané v publikácii Thimmppaya a kol., Celí 2, 543, (1982) Potrebné sledy pre aktiváciu translácie pôsobením VA RNA ležia v oblasti vedúceho sledu mRNA adenovírusu. Tento sled pochádza z genómu adenovírusu a nachádza sa po transkripcii v blízkosti 5'-zakončenia. VA RNA môže aktivovať transláciu mRNA. Vektory pre klonovanie a expresiu cDNA teda s výhodou obsahujú túto formu génov z génu adenovírusu VA.

Tieto vektory môžu byt syntetizované známym spôsobom. Zložky vektorov, napríklad podporné sledy, promótory a podobne je možné získať z prírodných zdrojov alebo syntetizovať, ako bolo uvedené vyššie. Zásadne v prípade, že tieto zložky je možné nájsť v DNA, ktorú je možné získať vo veľkom množstve, napríklad ako zložku vírusov alebo ak je možné tieto zložky lahko syntetizovať, potom sa dajú tieto zložky ľahko získať za použitia reštrikčných enzýmov a tým získať i veľké množstvo vektorov tak, že sa kultivuje organizmus, ktorý je zdrojom DNA, DNA sa rozštiepi príslušnou endonukleázou, fragmenty sa oddelia, fragment s obsahom hľadaného sledu sa identifikuje a izoluje. Zvyčajne sa vektor pre transfomáciu získa v malom množstve a potom sa naviaže na vhodný vektor pre syntézu, u ktorého dochádza k autonómnej replikácii, napríklad na prokaryotický plazmid alebo na fág. Vo väčšine prípadov je možné použiť plazmid pB322, ako bolo popísané vo vyššie uvedenej publikácii Kaufmana a kol.

Vektory pre syntézu sú použité pre klonovanie vektorov pre transformáciu bežným spôsobom, napríklad prenesením do prokaryotického organizmu, replikáciou vektora pre syntézu za získania vysokého počtu kópií s následnou izoláciou tohoto vektora rozštiepením buniek a izoláciou tohoto vektora z bunečnej drviny.

Vektory s obsahom cDNA, pripravené z buniek, ktoré produkujú látky s účinnosťou CSF sa potom prenesú do E. coli a kultivujú na platniach v Petriho miskách v množstve približne 2000 kolónií v miske. Potom sa kolónie prenesú na nitrocelulózový filter a filter sa prenesie na novú platňu, ktorá sa uchováva ako vzorka. Po vypestovaní kolónií sa tieto kolónie pomnožia a porovnajú sa s pôvodnými kolóniami tak, aby úseky filtrov bolo možné iden13 tifikovať so zodpovedajúcou časťou platne, použitej ako vzorka.

Každý filter sa rozreže na úseky, ktoré obsahujú vopred stanovené počty kolónií, s výhodou približne 200 až 500 kolónií na úsek. Kolónie z každého úseku sa prenesú do živného prostredia, napríklad do L-bujónu, baktérie sa oddelia odstredením a izoluje sa plazmidová DNA. Plazmidová DNA z každého úseku filtračného papiera sa prenesie do vhodného hostiteľa pre dosiahnutie expresie bielkoviny. Výhodným vektorom pre syntézu je mutant plazmidu pBR322 z E. coli, v ktorom boli vynechané sledy, ktoré poškodzujú eukaryotické bunky, ako bolo popísané vo vyššie uvedenej citácii Kaufmana a ďalších. Pri použití tohto mutantu odpadá potreba zničiť zvyšok plazmidu pred prenesením. Po kultivácii buniek po transfekcii sa prostredie skúma na príkladnost látok s účinnosťou CSF. Pozitívny výsledok ukazuje na to, že v skúmanom úseku filtra sa nachádza kolónia, ktorá obsahuje CSF/cDNA.

Aby bolo možné stanoviť, ktorý z klonov úseku filtra obsahuje CSF/cDNA, je potrebné vypestovať každý kloň z úseku filtra. Kultúry sa potom uložia do matrice a pripraví sa zmes každého horizontálneho radu a každého vertikálneho stĺpca matrice. Z týchto zmesí sa pripravia vzorky DNA a vyykoná sa transfekcia do hostiteľských buniek pre dosiahnutie expresie. Supernatanty, získané týmto spôsobom sa znova skúmajú na účinnosť CSF. Vo zvyčajnom prípade má túto účinnosť jedna zmes vertikálneho stĺpca a jedna zmes horizontálneho radu. Spoločný kloň potom obsahuje CSF/cDNA. V prípade, že matrica obsahuje viac ako jeden pozitívny kloň, je pozitívna viac ako jeden stĺpec a viac ako jeden rad. V tomto prípade je potrebné ďalej roztriediť malé množstvo klonov, u ktorých by prítomnosť ČSF/cDNA pripadala do úvahy.

CSF/cDNA sa klonu izoluje pomocou reštrikčných enzýmov a známym spôsobom je možné zistiť sled. Je zrejmé, že popísaný postup je možné použiť pre získanie CSF/cDNA z akéhokoľvek zdroja. Úplný sled je znázornený na obr. 1 súčasne s predpokladaným sledom aminokyselín bielkoviny, ktorý je produktom po translácii.

Sled DNA, ktorý je kódom pre bielkovinu s účinnosťoťu CSF podlá vynálezu, tak, ako je znázornený na obr, 1, môže byt modifikovaný bežným spôsobom, čím je možné získať pozmenený výsledný proteín CSF, ktorý má stále požadovanú účinnosť pri testoch. Je napríklad možné jednu, dve, tri, štyri alebo päť aminokyselín nahradiť inými aminokyselinami. V belgickom patentovom spise č. 898 016 sa popisuje typický spôsob náhrady cysteínu napríklad šerí nom.

CSF/cDNA, získaný spôsobom pódia vynálezu obsahuje úplný gén, ktorému predchádza kodon ATG a CSF/cDNA, ktorý je kódom pre alelové variácie bielkoviny CSF. Jedna alela je znázornená na obr. 1. Ďalšia alela, ktorá bola objavená pri práci na spôsobe pódia vynálezu má tymidínový zvyšok v polohe 365 namiesto cytozínového zvyšku, ktorý je znázornený na obr. 1. Bielkovina CSF, získaná spôsobom podlá vynálezu zahrňuje taktiež l-metionínový derivát (Met-CSF) a alelové variácie bielkoviny CSF. Úplná bielkovina CSF, tak, ako je znázornená sledom na obr. 1, začína sledom Ala-Pro-Ala-Arg..., začiatok ktorého je označený šípkou po nukleotide v polohe 66 na obr. 1. V prípade Met-CSF začína táto látka sledom Met-Ala-Pro-Ala-Arg... . Alelová variácia, znázornená na obr. A obsahuje Thr v polohe 100 (zvyšok začína pri Ala za šípkou) a je možné ju označiť ako CSF (Thr). Iná variácia má zvyšok íle v polohe 100 a je možné ju označiť ako CSF (íle). Čistená bielkovina CSF, získaná spôsobom pódia vynálezu má špecifickú účinnosť najmenej 10⁷ jednotiek/mg bielkoviny a s výhodou najmenej 4 x 10⁷ jednotiek/mg v prípade, že sa pokus na účinnosť tejto látky uskutočňuje s použitím buniek z ludskéj kostnej drene.

Systémy hostitei-vektor pre expresiu CSF môžu byť prokaryotické alebo eukaryotické, avšak vzhiadom ku komplexnosti CSF je výhodnejším systémom pre expresiu systém z cicavca. Expresia sa lahko dosiahne transformáciou prokaryotických buniek alebo eukaryotických buniek vhodným vektorom pre CSF. Sled DNA, získaný vyššie uvedeným spôsobom môže dosiahnuť expresiu priamo v bunkách cicavca za riadenia vhodným promótorom. Je možné použiť heterologné promótory, ktoré sú v odbore dobre známe. Aby bolo možné dosiahnuť expresiu CSF v prokaryotických bunkách alebo v bunkách kvasiniek, je nutné odstrániť vedúci sled (sled pre sekréciu). Poloha kodonu pre N-zakončenie úplného proteínu CSF je znázornená na obr. 1. Akonáhle sa získa požadovaný kloň CSF/cDNA, je možné použiť príslušné známe prostriedky pre dosiahnutie expresie bielkoviny CSF, napríklad včlenenie do príslušného vektora, prenesenie vektora do príslušnej bunky hostiteľa, selekciu a transformáciu buniek a kultiváciu transformovaných buniek pre dosiahnutie expresie CSF. Takto získaná bielkovina CSF môže mat metionínový zvyšok na N-zakončení bielkoviny (jedná sa teda o Met-CSF). Úplne zrelé bielkoviny, produkované prokaryotickými a eukaryotickými bunkami budú mať sled aminokyselín poprípade totožný, avšak eukaryotické bunky môžu produkovať produkt, ktorý bude do určitej miery inak glykozylovaný ako pôvodný prírodný produkt.

Bielkoviny CSF, k expresii ktorej došlo v príslušných prokaryotických alebo eukaryotických bunkách môže byť izolovaná a čistená spôsobmi, ktoré sú v odbore známe. Spôsob podlá vynálezu však taktiež navrhuje čistenie, ktoré umožňuje získať bielkovinu CSF z rekombinantných i prírodných zdrojov vo vysokej čistote a s vysokou účinnosťou.

Čistenie pódia vynálezu

Spôsob pódia vynálezu odstraňuje problémy predtým spojené s izoláciou a navrhuje spôsob čistenia bielkoviny s účinnosťou CSF. Bielkovina CSF, získaná spôsobom podľa vynálezu má špecifickú účinnosť najmenej 1 x 10⁷ jednotiek/mg bielkovín, s výhodou najmenej 2 x 10⁷ jednotiek/mg bielkovín, predovšetkým výhodne —i x 10' jednotiek/mg bielkovín pri stanovení na bunkách z iudskej kostnej drene.

Pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu sa bielkovina CSF čistí nasledujúcim spôsobom:

bielkovina sa vyzráža síranom amónnym, pridávaným do vysýtenia na 80 %, čím sa získa granula bielkoviny CSF, ktorá sa znovu uvedie v suspenzii do roztoku pufru pri pH 6 až 8 a takto získaný roztok sa nanesie na vrchol chromatografického stĺpca, stĺpec sa premýva tlmivým roztokom s obsahom chloridu sodného a odoberajú sa frakcie s účinnosťou CSF. Účinné frakcie sa spoja, nanesú na stĺpec C4 v reverznej fáze a stĺpec sa vylúhuje postupne zvyšova16 ným množstvom acetonitrilu v koncentrácii 0 až 90 % pre získanie účinnej frakcie.

Popis čistenia v súvislosti s vyobrazením

Na obr. 5 je znázornená analýza čistenej bielkoviny CSF (SDS-PAGE).

Bielkovina CSF, ktorá má byť čistená spôsobom podľa vynálezu môže byt akéhokoľvek prírodného pôvodu a môže byt zdrojom pre rekombinantný spôsob získavania za použitia veľkého počtu pôvodných zdrojov, vrátane napríklad bunečnej línie Mo alebo bunečnej línie UCD MLA-144 gibona.

Bielkovina CSF však môže byť produkovaná taktiež za použitia rekombinantnej DNA spôsobom podľa vynálezu.

Spôsobom podľa vynálezu je teda možné čistiť bielkovinu CSF z akéhokoľvek zdroja. Postupuje sa tak, že sa prostredie s výhodou zahustí ultrafiltráciou na koncentráciu bielkoviny najmenej 0,1 mg bielkoviny/ml. Bielkovina sa potom vyzráža pridaním síranu amónneho do nasýtenia 80 %. Výsledná granula sa znova privedie do suspenzie vo vodnom roztoku pufru s pH 6 až 8. Príkladom vhodných tlmivých roztokov môžu byt tris-HCl, HEPES, citrónan sodný a podobne .

Roztok v tlmivom roztoku sa podrobí deleniu chromatografiou na stĺpci. Vhodným materiálom pre použitie pre tento stĺpec je napríklad oktylsepharóza, DEAE-ultragel, AcA44-ultragel, AcA-54 ultragel a podobne. Je možné použiť jeden alebo väčší počet týchto materiálov po sebe, pre získanie väčšej čistoty výslednej látky.

Z každého stĺpca sa odoberajú frakcie a skúmajú sa na účinnosť CSF. Účinné frakcie sa spoja a zriedia kyselinou trifluóroctovou (TFA), kyselinou heptafluórmaslovou (HFBA) a podobne a materiál sa nanesie na stĺpec C4 v reverznej fáze. Zlúčenina s účinnosťou CSF sa potom vymýva za použitia zvyšujúceho sa množstva acetonitrilu od 0 do 90 % v TFA alebo HFBA, s výhodou v kon17 centrácii 0,10 až 0,15 % objemových, v závislosti od použitej kyseliny.

Frakcie s účinnosťou CSF sa analyzujú na SDS polyakrylamidovom géle elektroforézou, použije sa gél s koncentráciou 13,5 %, ako bolo popísané v publikácii Lammli U., Náture 227, 680 (1970). Je možné použiť ešte ďalšie postupy na dosiahnutie homogénnej še j bielkoviny CSF. Čistená bielkoviny CSF po frakcionácii elektroforézou na SDS-polyakrylamidovom géle poskytla heterogénnu bielkovinu CSF s molekulou hmotnosťou v rozmedzí 15 000 až 26 000 jednotiek. Táto zrejmá heterogenita je následkom velkej glykozylácie bielkoviny a je bežnou vlastnosťou glykoproteínu. Pri frakcionácii menej čistej vzorky z buniek Mo rovnakým spôsobom sa analýzou bielkoviny preukázala prítomnosť ďalšej bielkoviny s účinnosťou CSF, ktorej molekulová hmotnosť bola 28 000 až 30 000 jednotiek.

Látky s účinnosťou CSF sa viažu a znova uvolňujú z oktylsepharózy, DEAE ultragelu a stĺpca C4 v reverznej fáze. Približne 60 % účinnosti CSF sa viaže na Con-A sepharózu (40 % prechádza bez zachytenia) a je možné túto látku potom vymyť metylmanozidom.

Analýza molekulovej hmotnosti rekombinantnej CSF gélovou filtráciou v prostredí s nízkym obsahom solí dokazuje, že približne 30 % účinnosti tvorenej zlúčeninou s molekulovou hmotnosťou 19 000 je homogénne, avšak 70 % materiálu sa chová ako dimér, takže sa vymýva v polohe, ktorá zodpovedá molekulovej hmotnosti približne 38 000. V prípade, že sa do stĺpca pridá chlorid sodný v koncentrácii IM, vymýva sa všetka účinnosť v širokom vrchole, ktorý zodpovedá zlúčenine s molekulovou hmotnosťou približne 19 000 jednotiek.

Čistená bielkovina CSF je stála najmenej 16 hodín pri teplote 4 C a pH 7,4 v 4M guanidín hydrochloridu, v 10 mM EDTA, 10 mM 2-merkaptoetanolu a v 30 % (objemové percentá) etanolu. Látka s účinnosťou CSF je stála taktiež v 0,1 % kyseline trifluóroctovej pri pH 2,0 a 0,1% kyseline trifluóroctovej s 25 % objemových acetonitrilu.

Ako už bolo uvedené, bielkovina CSF, získaná spôsobom podlá vynálezu je určená pre použitie v liečbe útlmu drene, napríklad pri (symptomatickej) granulocytopénii, ktorá môže byt spôsobená

Okrem toho je možné vynálezu použit pre sa použije dávka 200 liečbou nádorov chemicky alebo ožiarením, bielkoviny CSF, vyrobené spôsobom podlá liečbu ťažkých infekcií. Pre toto použitie až 1000 mikrogramov denne. Bielkovina CSF sa s výhodou podáva vnútrožilovo spolu s vhodným farmaceutickým nosičom. Príkladom vhodného nosiča môže byt roztok chloridu sodného a ludský sérový albumín v roztoku chloridu sodného.

Okrem toho má bielkovina CSF, vyrobená spôsobom podlá vynálezu ešte ďalšie účinkyy a ďalšie použitie. Bolo napríklad dokázané, že CSF myší aktivuje neutrofily. Dalo by sa očakávať, že CSF primátov, získaný spôsobom podlá vynálezu bude rovnako aktivovať neutrofily. Fyziologické funkcie tejto bielkoviny sú teda mnohotvárne. V kostnej dreni môže táto látka podporovať vývoj a diferenciáciu buniek, ktoré zabezpečujú obranu, na periférii zasa aktivuje nové i neexistujúce bunky. Pri miestnej imunologickej reakcii môže CSF spôsobiť nahromadenie alebo neprítomnosť neutrofilov v zapálenej oblasti. Nevhodná lokalizácia a/alebo aktivácia neeutrofilov môže byt jednou z príčin patofyziológie rôznych porúch imunologického systému, napríklad reumatoidných artritíd.

Vynález bude ďalej vysvetlený v súvislosti s príkladmi, ktoré sú určené len na ozrejmenie, v žiadnom prípade nie sú však obmedzením spôsobu podlá vynálezu a znázorňujú, ako je možné prakticky uskutočňovať spôsob podlá vynálezu.

Pokial nie je uvedené inak, sú všetky teplotné údaje v príkladovej časti prihlášky uvedené v stupňoch Celzia.

Reštrikčné endonukleázy sa používajú za podmienok a spôsobom, ktorý je odporúčaný ich výrobcom. Reakcie, pri ktorej dochádza k väzbe, sú uskutočňované podlá vyššie uvedenej publikácie Maniatisa a kol. na str. 245 - 6, za použitia tlmivého roztoku, ktorý je popísaný na str. 246 uvedenej publikácie a koncentrácia DNA v rozmedzí 1 až 100 μ9/ιη1 pri teplote 23 ’C pre DNA so slepými koncami a 16 ’C pre DNA s koncami, ktoré sa na seba ľahko viažu. Elektroforéza sa uskutočňuje na 0,5 až 1,5 % agarozovom géle s obsahom 90 mM tris-boritanu a 10 mM EDTA. Každá DNA, označená rádioaktívne je značená 32P.

Pod pojmom rapid prep sa rozumie rýchla produkcia DNA bakteriofágu alebo plazmidu v malom merítku tak, ako je popísaná napríklad vo vyššie uvedenej publikácii Maniatisa a kol na str. 365 až 373.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad A

Stupeň 1

Línia buniek Mo

Bunky Mo (ATCC CRL 8066) sa bežne kultivujú na prostredí alfa zo 6 % oxidu uhličitého alebo prostredí pódia Iscova s 10 % oxidu uhličitého a s obsahom 20 % fetálneho teiacieho séra (FCS), 2 mM glutamínu, 100 jednotiek/ml streptomycínu a 100 μ9/ιη1 penicilínu. Bunky je treba preočkovávať každých 4 až 5 dní. Bunky sa spočítajú a potom sa nimi očkujú Falkonove T-175 fiašky s obsahom 100 až 150 ml živného prostredia pri hustote 3 až 4 x 10⁵ buniek/ml. Počet buniek sa zdvojnásobí za prítomnosti 20 % FCS za 4 až 7 dní. Rýchlosť rastu nie je stála a niekedy môžu bunky úplne zastaviť rast, po čom sa náhle rýchle rozrastajú. Bunky Mo je možné kultivovať taktiež v prostredí, ktoré je prosté séra. Prežívanie buniek je oveia lepšie v prípade, že sa bunky pri prenesení z FCS do prostredia, ktoré je prosté séra nepremývajú. Optimálna hustota v prostredí, ktoré je prosté séra (SF) je 5 x 10⁵ buniek/ml. Bunky mierne rastú, alebo si aspoň zachovávajú rovnaký počet buniek po tri dni v prostredí, ktoré je prosté séra, potom je potrebné pridať 20 % FCS počas najmenej 4 dní, Túto schéma rastu (3 dni SF, 4 dni 20 % CSF), je možné opakovať každý týždeň, ak sa vyyžaduje prostredie bez séra a to počas niekoľkých mesiacov bez akéhokoľvek zjavného poškodenia buniek.

Stupeň 2

Zisťovanie účinnosti CSF

A. Stanovenie s použitím kostnej drene

Získa sa čerstvá kostná dreň a odstránia sa kostné úlomky, dreň sa zriedi v pomere 1 : 1 sterilným chloridom sodným s obsahom fosfátového tlmivého roztoku (PBS) pri laboratórnej teplote a potom sa dreň prevrství Picoll-Paque, približne 30 ml BM-PBS a 6 ml Ficollu. Zmes sa ďalej odstreďuje pri 1500 otáčkach za minútu pri laboratórnej teplote. Tuk a vrstva PBS sa izoluje a odloží. Potom sa pipetou odoberie zakalená vrstva, ktorá sa dvakrát premyje PBS a spočítajú sa bunky, ktoré sa ďalej nanesú do prostredia RPMI (GIBCO, RPMI 1640) s 10 % FCS, inaktivovaného tepelne, (HIFCS) na 3 hodiny, pre odstránenie prilnutých buniek.

Živné prostredie, ktoré musí byť čerstvé, sa pripraví nasledujúcim spôsobom:

% FCS

0,3 % agaru, rozpusteného vo vode, ochladí sa na teplotu °C, x Iscoves (objemový pomer 1 : 1 v agare) % P/S konečnej koncentrácie 100 gg/ml streptomycínu a 100 jednotiek/ml penicilínu

10^-4 M α-tioglycerolu v 2 x Iscoves zo zásobného roztoku s koncentráciou 10 M agar sa ochladí na teplotu 40 °C a pridajú sa ďalšie zložky, na vodnom kúpeli sa výsledná zmes ochladí na teplotu 37 až 38 °C a na tejto teplote sa udržiava.

Po 3 hodinách sa bunky, ktoré neprilnuli oddelia pipetou, materiál sa odstredí a bunky sa znova spočítajú. Pridá sa 2 x 10⁵ buniek/ml a prostredie sa udržiava na vodnom kúpeli pri teplote 37 až 38 'C. Potom sa pridá.vzorka, napríklad prostredie z buniek po trasfekcii, v množstve zvyčajne 10 mikrolitrov do prvého radu vyhĺbenia mikrotitračnej dosky v dvojitom prevedení. Potom sa do každého vyhĺbenia pridá 100 mikrolitrov bunečnej sus21 penzie a potom ešte ďalších 50 mikrolitrov bunečnej suspenzie do každého vyhĺbenia prvého radu. Materiál vo vyhĺbeninách sa dôkladne premieša a 50 mikrolitrov roztoku z prvého radu sa prenesie do nasledujúceho radu a potom sa ďalej postupuje po celej doske, čím sa získa postupné riedenie vždy 1:3. Doska sa zabalí do parafínu a temperuje sa.10 až 15 dní v 10 % oxidu uhličitého pri teplote 37 ’C vo vlhkom prostredí, po čom sa spočítajú kolónie .

Spočíta sa celé množstvo kolónií v každom vyhĺbení. V každom pokuse sa použije niekoíko vyhĺbení bez vzorky, čím sa získa základný počet kolónií. Tento počet sa odpočíta od počtu kolónií, ktoré sa nachádzajú v každom vyhĺbení s obsahom vzorky. Jedna jednotka CSF je také množstvo, ktoré vyvolá tvorbu jednej kolónie nad základný počet kolónií 10^ buniek z íudskej kostnej drene v prípade, že sa použije 10⁵ buniek v jednom mililitri a to v prípade, že koncentrácia CSF je pod stupňom nasýtenia. Táto koncentrácia sa stanoví zriedením a porovnaním počtu kolónií pri rozličnom zriedení tak, aby bolo možné určiť koncentráciu práve pred hladinou nasýtenia.

Pri tomto stanovení sa počítajú kolónie, ktoré obsahujú granulocyty, monocyty alebo obidva typy kolónií. Typ buniek v kolóniách sa stanoví odobratím kolónie a farbením buniek.

Stanovenie za použitia buniek KG-1

Bunky KG-1, popísané v publikácii Blood, zv. 56, č. 3 (1980) sa kultivujú v prostredí podía Iscova s 10 % FCS, bunky sa preočkovávajú 2 x týždenne, pri každej pasáži sa použije 2 x 10^ i

buniek/ml. Bunky sa použijú na stanovenie iba s pasážou 30 až 35. Stanovenie je rovnaké ako pri použití buniek kostnej drene s tým rozdielom, že bunky KG-1 sa kultivujú na agarovej zmesi za použitia 4 x 10³ buniek/ml.

Počet kolónií, ktoré rastú v každom vyhĺbení sa stanoví po odčítaní základného počtu kolónií rovnakým spôsobom ako pri použití buniek z kostnej drene. Jedna jednotka/ml pre tieto bunky pri použití CSF je taká koncentrácia CSF, ktorá stimuluje polovicu maximálneho množstva kolónii buniek KG-1 pre rast (nasýtenie). Maximálny počet kolónií je možné dosiahnuť tak, že sa do niekoíkých vyhĺbení pridá CSF až do nasýtenia.

Stupeň 3

Konštrukcia vektora p91023(B)

Vektorom, použitým pre transformáciu, bol vektor pAdD26SVpA(3), ktorý bol popísaný v publikácii Kaufman a kol., Mol. Celí. Biol. 2, (11), 1304 - 1319 (1982). Tento vektor má štruktúru, ktorá je znázornená na obr. 2. Tento plazmid obsahuje gén pre dihydrofolát reduktázy myší (DHFR), ktorý je pod transkripčným riadením hlavného promótora adenovírusu 2 (Ad2). Do adenovírusu sa pridá sled z génu pre imunoglubulín, ktorý je prítomný medzi promótorom Ad2 a sledom DHFR a mení zakončenie 5' a 3'. Miesto pre polyadenyláciu SV40 sa nachádza smerom dolu od sledu, ktorý je kódom pre DHFR. Sled tohoto vektora, ktorý je odvodený od prokaryotických buniek je prevzatý z pSVOd (Mellon P., Parker, V., Gluzman Y. a Maniatis, T., Celí 27, 279 - 288, (1981)) a neobsahuje sledy z pBR322, ktoré spôsobujú inhibíciu replikácie v bunkách cicavcov, ako bolo popísané v publikácii Lusky, M. a Botchan, M. Náture (London) 293, 79 - 81, (1981).

Vyššie uvedený plazmid sa transformuje na plazmid pCVSVL2 spôsobom, znázorneným na obr. 2 a na plazmid pAdD26SVpA(3) (d) tak, že sa vypustí jedno z dvoch miest pre pôsobenie reštrikčnej endonukleázy Pstl v pôvodnom plazmide. Tento spôsob sa uskutoční čiastočným rozštiepením uvedeným enzýmom, čím je možné získať subpopuláciu linerizovaných plazmidov, v ktorých je rozštiené iba jedno miesto pre pôsobenie enzýmu Pstl, potom sa pôsobí Klenowovým fragmentom, ktorý sa naviaže pre recirkuláciu plazmidov, ktorý sa v ďalšom použije pre transformáciu E. coli a híadajú sa kolónie, ktoré majú rozštiepené miesto pre pôsobenie Pstl, ktoré je uložené blízko 3' zakončenia polyyadenylovaného sledu SV40.

Vedúci sled adenavírusu a gény, získané z vírusov (VA-gény) sa včlenia do plazmidu pAdD26SVpA(3) (d) spôsobom, znázorneným na obr. 2. Postupuje sa tak, že sa uvedený vektor rozštiepi enzýmom

PvuII zaz získania otvorenej lineárnej molekuly, ktorá sa otvára v blízkosti zakončenia 3' prvého z troch elementov, ktoré tvoria vedúci sled. Potom sa rozštiepi plazmid pJAW 43, popísaný v publikácii Zain a kol., Celí 16, 851, (1979), pôsobením enzýmu Xhol, naviaže sa Klenowov fragment so 140 pármi báz, ktorý obsahuje druhý element a časť tretieho elementu vedúceho sledu sa izoluje elektroforézou na akrylamidovom géle (6 % v trisborátovom tlmivom roztoku podlá vyššie uvedenej publikácie Maniatisa a kol., (1982) .

Fragment so 140 pármi báz sa potom naviaže na plazmid pAdD26SVpA(3) (d) po štiepení enzýmom PvuII. Produkt tejto väzby sa použije na transformáciu E. coli za vzniku odolnosti tohoto mikroorganizmu proti tetracyklínu, kolónie sa sledujú spôsobom podlá Grundsteina a Hognessa za požitia 32p-označenej vzorky hybridizáciou na fragment so 140 pármi báz. Z kolónií s pozitívnou hybridizáciou sa pripraví DNA, aby bolo možné zistiť, či rekonštruované miesto pre pôsobenie PvuII sa nachádza na zakončení 5' alebo 3' včleneného fragmentu so 140 pármi báz, čím je možné dokázať, či hybridizácia je špecifická pre druhý alebo tretí element vedúceho sledu z adenovitu. Správna orientácia miesta pre pôsobenie uvedeného enzýmu sa nachádza na 5'-zakončení včleneného sledu so 140 pármi báz. Takto vytvorený plazmid sa označuje pTPL a je znázornený na obr. 2.

Fragment Ava II D SV40 s obsahom podporného sledu SV40 sa získa tak, že sa DNA SV40 štiepi enzýmom Ava II, na zakončenie sa naviaže Klenowov fragment po štiepení Pol I, na tieto fragmenty sa naviažu spojovacie sledy za použitia enzýmu Xho 1, potom sa materiál štiepi enzýmom Xho 1 pri štiepení príslušného miesta a t

štyri najdlhšie fragmenty (D) sa izolujú elektroforézou na géle. Takto získané fragmenty sa naviažu na plazmid pTPL po štiepení enzýmom Xho 1, čím sa získa plazmid pCVSVL2-TPL. Orientácia fragmentu SV40 D v tomto plazmide je taká, že promótor SV40 má rovnakú orientáciu ako hlavný promótor adenovitu.

Aby bolo možné zaviesť gény, spojené s vírusom adenovírusu (VA) do plazmidu pCVSVL2-TPL, skonštruujee sa najskôr plazmid pBR322, ktorý obsahuje fragment adenovírusu typ Hind III a fragment B sa izoluje elektroforézou na géle. Takto získaný fragment sa potom člení do rozštiepený enzýmom Hind III. odolnosti proti ampicilínu tak, aby bol zistený kmeň s plazmidu pBR322, ktorý bol predtým Po transformácii E. coli za získania sa rekombinantné kmene vyhľadávajú fragmentom Hind III B a orientácia tohto fragmentu sa stanoví štiepením reštrikčnými enzýmami. Plazmid pBR322 - Ad Hind III B obsahuje fragment adenovírusu typ 2 Hind III B v orientácii, ktorá je znázornená na obr 3.

Ako je zrejmé z obr. 3, gény VA je možné získať z plazmidu pBR322-Ad Hind III B štiepením pomocou enzýmu Hpa I, po pridaní sledov, napomáhajúcich väzbe AcoRl s následným štiepením enzýmom Eco R1 s izoláciou fragmentu o 1,4 kb. Fragment, ktorý má zakončenie po štiepení enzýmom EcoRl sa potom naviaže na miesto v plazmide pTPL, ktoré bolo predtým rozštiepené tým istým enzýmom. Po transformácii E. coli HB101 a po selekcii klonov odolných voči tetracyklínu sa kolónie podrobia skúške na hybridizáciu na filtri, za použitia vzorky DNA špecifickej pre gény VA. Potom sa pripraví DNA z klonov s pozitívnou hybridizáciou a tento materiál sa podrobí charakterizácii pôsobením reštrikčných endonukleáz. Produktom je plazmid, ktorý sa označuje p91023.

Obidve miesta pre štiepenie enzýmom EcoRl v plazmide p91023 sa odstránia, takže sa tento plazmid celkom rozštiepi enzýmom EcoRl, čím vzniknú dva fragmenty DNA, z ktorých jeden obsahuje približne 7 Kb s obsahom génov VA. Zakončenie oboch fragmentov sa vyplní pri použití Klenowovho fragmentu a enzýmu Poli, a potom sa obidva fragmenty, t.j. fragment 1,3 Kb a 7 Kb opäť spoja. Plazmid p91023 (A), ktorý obsahuje gény VA je podobný plazmidu p91023, avšak do miesta pre pôsobenie enzýmu EcoRl sú v obidvoch prípadoch včlenené gény VA, ako je možné preukázať Grundstein - Hognessovou analýzou a pôsobením reštrikčných enzýmov.

Jediné miesto pre pôsobenie enzýmu Pstl v plazmide p91023(A) sa odstráni a nahradí sa miestom pre pôsobenie eenzýmu EcoRl. Potom sa plazmid p91023(A) celkom rozštiepi enzýmom Pstl a potom sa naviaže Klevowov fragment za požitia Poli a na zakončenie sa naviažu pomocné sledy tak, aby namiesto miesta pre pôsobenie Pstl vzniklo miesto pre pôsobenie enzýmu EcoRl v plazmide p91023(A).

Lineárny plazmid p91023(A) s pomocnými sledmi pre vytvorenie miesta pre pôsobenie enzýmu EcoRl sa oddelí a celkom sa rozštiepi enzýmom EcoRl, potom sa takto získané fragmenty znovu naviažu. Izoluje sa plazmid p91023(B), jeho štruktúra sa identifikuje a je možné dokázať, že sa jedná o štruktúru, podobnú plazmidu p91023(A) s výnimkou toho, že tento plazmid obsahuje miesto pre pôsobenie enzýmu EcoRl, namiesto miesta pre pôsobenie enzýmu Pstl

Stupeň 4

Príprava skupiny cDNA

Bunky Mo sa kultivujú 16 až 20 hodín za použitia PHA a PMA na stimuláciu produkcie lymfokinov. Bunky sa potom nanesú na platne v množstve 5 x 10⁵ buniek/ml v prostredí podľa Iscova s 20 % FCS, 0,3 % objemovými PHA a 5 ng/ml TPA: Bunky sa oddelia odstredením. Takto oddelené bunky sa znova zavedú do suspenzie v 20 ml hypotonického tlmivého roztoku na rozrušenie buniek, chladeného ľadom (RSB tlmivý roztok: 0.01 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,01M KC1, 0,0015 M MgCl₂, 1 μg/ml cykloheximidu, 50 jednotiek/ml RNAsin a 5 nM ditiotreitolu). Bunky sa nechajú napučať na ľade 5 minút, potom sa mechanicky rozrušia v sklenenom homogenizátore desiatimi zdvihmi tesne priľnievajúceho piesta. Homogenát sa potom odstredí pri otáčkach 2000 otáčok za minútu (odstredivka Beckman J6) na odstránenie jadier a nerozrušených buniek. Supernatant sa uloží v ľade a jadrá sa znova zavedú do suspenzie v 10 ml RSB a tento materiál sa znova odstredí pri malej rýchlosti. Tento druhý supernatant sa spojí s prvým supernatantom a získaný materiál sa znova odstredí pri malej rýchlosti pre odstránenie zostatkových jadier a nerozrušených buniek. Supernatant sa v tomto prípade zmiešava pridávaním 2 M KC1 až na koncentráciu 0,15 M KC1 a potom sa znova odstredí počas 30 minút pri otáčkach 25 000 otáčok za minútu (rotor Beckman Sw 28), čím sa ako segment získajú bunkové membrány. Sediment bunkových membrán sa opatrne premýva chladným RSB a potom sa znovu uvedie do suspenzie v 12 ml RSB s obsahom 2 M sacharózy a 0,15 M chloridu draselného. Potom sa v skúmavkách do odstredivky (Beckman SW41) pripraví diskontinuálny gradient tak, že sa prevrství 6 ml roztoku membrány v 2 M sacharóze na 2 ml RSB s 2,5 M sacharózy a 0,15 M KC1. Skúmavky sa doplnia 2,5 ml RSB s obsahom 1,3 M sacharózy a 0,15 M KC1. Tieto gradienty sa potom odstredia počas 4 hodín pri 27 000 otáčkach za minútku (Beckman, rotor SW41) pri teplote 4 ’C. Vrstva membrány, ktorá sa nachádza na rozhraní medzi koncentráciou 2,0 M a 1,3 M sacharózy sa opatrne odstráni zo strany pri použití injekčnej striekačky a ihly č. 18. Frakcia membrány z oboch gradientov sa spojí a zriedi jedným objemom destilovanej vody, potom sa pridá do koncentrácie 0,5 % Triton X-100 a do koncentrácie 0,5 % deoxycholár sodný a materiál sa extrahuje rovnakým objemom fenolu. Vodná vrstva sa znovu extrahuje zmesou fenolu a chloroformu v pomere 1:1a napokon rovnakým objemom chloroformu. Potom sa RNA, viazaná na membránu vyzráža pridaním chloridu sodného do koncentrácií 0,25 M a 2,5 objemu chladného etanolu, zmes sa temperuje cez noc pri teplote -20 ’C. Vyzrážaná RNA sa oddelí odstredením počas 10 minút pri 400 otáčkach za minútu (odstredivka Beckman J-6) a materiál sa znova uvedie do suspenzie v 1 ml destilovenej vody. Z množstva 2 x 10^ buniek sa získa približne 1 mg RNA. Potom sa izoluje z celkového množstva RNA príslušné množstvo mRNA chromatografiou na stĺpci s obsahom 0,5 ml oligo dT-celulózy. Potom sa RNA zahreje na 5 minút na teplotu 70 °C, rýchle sa ochladí v íade a ďalej sa 5x riedi pri laboratórnej teplote pufrom pre väzbu, ktorý obsahuje 0,5 M LiCl, 0,01 M Tris-HCl, s pH 7,4, 0,002 M EDTA a 0,1 % SDS. RNA v tomto tlmivom roztoku sa potom nechá prejsť, stĺpcom oligo dT-celulózy v rovnovážnom stave v rovnakom tlmivom roztoku pri laboratórnej teplote. Stĺpec sa premyje s 5 ml tlmivého roztoku pre väzbu a potom s 5 μΐ 0,15 M LiCL, 0,01 M Tris-HCl s pH 7,4, 0,002 EDTA a 0,1 % SDS. Napokon sa mRNA vymýva za použitia 2 ml 0,01 Tris-HCL s pH 7,4, 0,002 EDTA a 0,1 SDS. Potom sa mRNA vyzráža pridaním, chloridu sodného do koncentrácie 0,25 M a 2,5 objem etanolu a zmes sa temperuje cez noc pri teplote -20 ’C. Vyzrážaná mRNA sa oddelí odstreďovaním počas 30 minút pri 30 000 otáčkach za minútu (rotor Beckman SW 55). Supernatant sa opatrne zleje a granula mRNA sa zvova zavedie do suspenzie v 50 ml vody. Táto suspenzia sa upraví na koncentráciu 0,25 M chloridu sodného a extrahuje sa zmesou fenolu a chloroformu v pomere 1:1a potom trikrát chloroformom. mRNA sa vyzráža pridaním 2,5 objemu etanolu. Zmes sa niekoľkokrát zmrazí a nechá roztopiť v kúpeli so suchým ladom a etanolom a potom sa 15 minút odstreďuje v Eppendorfovej odstredivke. Supernatant sa opatrne zleje a granula mRNA sa znova uvedie do suspenzie v 20 μΐ destilovanej vody. Konečný výťažok je približne 30 μg mRNA.

Prvý reťazec cDNA sa pripraví za použitia štandardných metód. Postupuje sa tak, že sa 10 μg mRNA z membrán zriedi so 100 μΐ zmesi pre vznik cDNA, ktorá obsahuje 300 mmol Tris s pH

8.4, 140 mmol KCL, 10 mmol MgCl₂, 10 mmol β-merkaptoetanolu, 500 μΜ dATP, dGTP, dCTP a dTTP, 5 μg oligo-dT (fosforylovanej pri priemernom priemere 12 - 18), ďalej 150 μ<3ί 32 P dCTP (400Ci/mmol) a 20 jednotiek inhibítora ribonukleázy RNAsin. Reakcia sa spustí pridaním 100 jednotiek reverznej transkriptázy pri temperovaní počas 30 minút pri teplote 42 ’C. Potom sa reakcia zastaví pridaním EDTA do koncentrácie 40 mmol a RNA sa rozloží temperovaním počas 20 minút pri teplote 65 ’C v 0,2 M hydroxidu sodného. Báza sa neutralizuje pridaním 20 μΐ 2 M Tris s pH 7,4. Reakčná zmes sa extrahuje zmesou fenolu a chloroformu a potom sa uskutočňuje spätná extrakcia za použitia 50 μΐ 10 mmol Tris s pH

7.5, 1 mmol EDTA (TE) a vodné fázy sa spoja. Potom sa cDNA s jednoduchým reťazcom transformuje na cDNA s dvojitým reťazcom tak, že sa zmes temperuje počas 12 hodín pri teplote 16 ’C spolu so 40 jednotkami Klenowho fragmentu v prítomnosti DNA-polymerázy I v 100 μΐ reakčného prostredia, ktoré obsahuje roztok 50 mmol fosforečnanu draselného s pH 7,4, 2,3 mmol DTT, 2-merkaptoetanol, 10 mmol MgCl₂, vždy 140 μΐ jedného zo štyroch deoxynukleotidfosfátov a 25 μΰί 32P dCTP. Reakcia sa zastaví extrakciou zmesi fenolu a chloroformu a nevčlenené trifosfáty sa odstránia prechodom vodnej fázy cez stĺpec prostriedku Sephadex-G-50 s objemom 1 ml. Vylúčené frakcie sa spoja a vyzrážajú sa etanolom.

Granula cDNA sa premyje studeným etanolom a potom sa znova uvedie do suspenzie v 200 μΐ 2o mmol Tris s pH 8,0, i mmol EDTA, 80 μιηοΐ S-adenozylmetionínu a 300 jednotiek EcoRl metylázy na 60 minút pri teplote 37 ’C. Reakcia sa zastaví extrakciou zmesou fenolu a chloroformu a metylovaná cDNA sa izoluje vyzrážaním s etanolom.

Granula cDNA sa premyje 70 % etanolom a potom sa znova zavedie do suspenzie v 200 μΐ tlmivého roztoku SI (Maniatis a kol.) a materiál sa temperuje s 200 jednotkami Sl-nukleázy pri teplote 30 “C celkove počas 30 minút. Potom sa reakcia zastaví extrakciou zmesou fenolu a chloroformu a cDNA sa izoluje vyzrážaním s etanolom.

Zakončenie cDNA s dvojitým reťazcom sa vyplní temperovaním v 100 μΐ 20 mmol Tris s pH 7,4, 50 mmol chloridu sodného, 10 mmol 2-merkaptoetanolu a 500 μΐ všetkých štyroch deoxynukleotidtrifosfátov s 25 jednotkami Klenowho fragmentu pri laboratórnej teplote počas 30 minút. Reakcia sa zastaví extrakciou zemsou fenolu a chloroformu a cDNA sa izoluje vyzrážaním s etanolom.

Takto získané cDNA sa podrobí väzbe v 50 μΐ tlmivého roztoku s obsahom T4 - ligázy (Maniatis a kol.) v prítomnosti 500 pMol väzbových reťazcov R1 so sledom pCGGAATTCCG (New England Biolabs) za použitia 2000 jednotiek T4-ligázy cez noc pri teplote 16 C. Reakcia sa zastaví temperovaním pri teplote 70 C počas 20 minút, potom sa reakčná zmes zriedi na 300 mikrolitrov, takže konečná koncentrácia solí je 0,1 NaCl, 10 mmol MgCl₂, 50 mmol Tris-HCl s pH 7,4. cDNA sa štiepi 2 minúty pri teplote 37 ’C pôsobením 700 jednotiek enzýmu EcoRI. Reakcia sa zastaví extrakciou zmesou fenolu a chloroformu a cDNA sa izoluje vyzrážaním etanolom. Získaná granula sa znova uvedie do suspenzie v 50 μΐ TE a potom sa nechá prejsť stĺpcom s 5 ml C1-4B. Získané frakcie sa zlejú a vyzrážajú etanolom. Vyzrážaná cDNA sa podrobí elektroforéze na 1 % agarovom gélee v Tris-acetátovom tlmivom roztoku v prítomnosti 1 μΐ/ml etidiumbromidu. Potom sa cDNA s rozmerom 500 až 4000 párov báz izoluje z gélu za použitia štandardného postupu. Vylúčená cDNA sa extrahuje zmesou fenolu a chloroformu, vyzráža sa etanolom a granula (po opláknutí etanolom) sa znovu zavedie do roztoku v 50 μΐ TE. Konečný výťažok bol 10 až 500 ng cDNA.

Ďalej bude popísaná príprava vektora pre expresiu p91023(B). 500 ng vektora, rozštiepeného enzýmom EcoRI a spracovaného pôsobením fosfatázy sa podrobí väzbe s 100 ng cDNA v 100 μΐ reakčného prostredia (štandardné prostredie pre pôsobenie T4-ligázy) cez noc pri teplote 16 ’C. Reakcia sa zastaví extrakciou zmesou fenolu a chloroformu a potom sa naviazaná cDNA oddelí vyzrážaním etanolom— po pridaní 5 μg tRNA ako nosiča.

DNA, vyzrážaná etanolom, sa premyje so 70 % etanolom a potom sa znova zavedie do suspenzie v 100 μΐ TE. Táto DNA sa potom použije v podieloch s objemom 4 μΐ pre transformáciu E. coli MC1061 (4 μΐ pre transformáciu v objeme 100 μΐ). Každá z 25 transformovaných vzoriek sa rozotrie v Petriho miske s priemerom 150 mm s obsahom 1 % agaru, v L-prostredí s 10 μg/ml tetracyklínu (Tet-platňa) a platne sa temperujú cez noc pri teplote 37 °C. Na každej platni sa vyvinie približne 2000 kolónií, výsledkom je teda celkove približne 50 000 kolónií. Každá z týchto kolónií má priemer približne 0,5 mm. Každá z týchto kolónií sa prenesie na na mikrocelulózový kotúč s priemerom 137 mm tak, že sa na povrch agaru opatrne uloží suchý filter, ktorý sa potom opatrne sníme. Všetky kolónie zostanú na filtri, ktorý sa potom uloží kolóniami smerom nahor na čerstvú Tet-platňu. Kolónie sa nechajú rásť. niekoľko hodín a potom sa znova rozdelia tak, že sa presne na pôvodný filter uloží čerstvý zvlhčený filter, filtre sa k sebe pritlačia, potom sa oddelia a každý filter sa uloží na čerstvú Tet-platňu a platne sa temperujú cez noc pri teplote 37 °C. Každá kópia sa starostlivo označí, aby bolo možné uloženie kolónií presne porovnať s ich uložením na pôvodnom filtri.

Stupeň 5

Príprava zmesi plazmidovej DNA

Každá z 25 kópií filtrov sa opatrne rozrežie skalpelom na osminy, pričom sa zaznamená orientácia každej z týchto osmín v porovnaní s pôvodným filtrom. Z každého úseku sa kolónie odoberú do 10 ml L-bujónu. Baktérie sa oddelia odstredením počas 10 minút pri 3000 otáčkach za minútu (odtredivka Beckman J-6) a potom sa znova zavedú do suspenzie v 0,6 ml 25 % sacharózy s 50 M Tris-HCl s pH 8,5 a zmenia sa na protoplasty pridaním 0,2 ml lyzozýmu s koncentráciou 5 mg/ml s následnou inkubáciou v ľade počas 5 až 10 minút. Protoplasty sa potom inkubujú pri laboratórnej teplote počas 10 minút, pridá sa 0,125 ml EDTA s koncentrráciou 0,5 molov a potom sa bunky rozrušia pridaním 0,12 ml 10 % SDS v 50 mmol Tris-DCl s pH 8,0. Rozrušený materiál sa opatrne premieša, inkubuje sa počas 15 minút pri laboratórnej teplote a potom sa DNA bielkovín a chromozómov vyzráža pridaním 0,3 ml 5 M NaCl. Po in30 kubácii v lade počas 15 minút sa materiál odstredí na Eppendorfovej odstredivke počas 30 minút za chladenia. Supernatant sa opatrne odstráni, čím sa získa viskózna granula DNA a bielkoviny, ktorá sa zriedi pridaním 2,5 ml vody. Zmes sa extrahuje s 1 ml fenolu, vrstvy sa oddelia odstredením (10K počas 10 minút, rotor Sorvall SS-34) a vodná vrstva sa oddelí do novej skúmavky. DNA sa vyzráža pridaním 0,5 ml 5M NaCl a 7,5 ml chladného etanolu a zmes sa niekoíkokrát zmrazí v kúpeli etanolu a suchého ladu. Vyzrážaný materiál sa oddelí odstredením (10K, 15 minút, Sorvall SS-34), znovu sa zavedie do suspenzie v 0,3 ml 0,3 M octanu sodného a znovu sa vyzráža (v Eppendorfovej skúmavke) pridaním 1 ml etanolu. Po 10 až 15 minútach v kúpeli so suchým ladom a etanolom sa vyzrážaná DNA oddelí odstredením (5 minút v Eppendorfovej odstredivke) a výsledná granula sa znova zavedie do suspenzie v 100 μΐ sterilného prostredia TE (10 mmol Tris s pH 8, 1 mmol EDTA). Z typickej vzorky sa získa 5 až 10 μg plazmidovej DNA. Každá vzorka obsahuje DNA 200 až 500 kolónií z pôvodného filtra. Z 25 filtrov sa pripraví celkove 200 vzoriek DNA.

Stupeň 6

Izolácia klonov CSF

Každá zo vzoriek DNA zo stupňa 5 sa oddelene prenesie do buniek opíc M6 tak, ako bude popísané ďalej.

Bunky M6 sa bežne kultivujú na modifikovanom Eaglovom prostredí (Dulbecco, DME je možné získať od Gibco) s obsahom 10 % fetálneho teľacieho séra, inaktivovaného teplom (HIFCS), bunky sa dvakrát týždenne preočkovávajú pri riedení 1 : 6. 24 hodín po delení v pomere 1:6 sú bunky M6 pripravené pre transfekciu. 24 hodín pred transfekciou sa 1,2 x 10⁸ buniek M6 naočkuje na platňu (Celí Factory, Nunc) v 1,5 1 prostredia DME + 10 % HIFCS. Tesne pred transfekciou sa platne dvakrát premyjú so 7 ml DME bez séra (SF). DNA sa rozpustí v 0,1 M Tris s pH 7,3 a pridá sa k prostrediu DME, ktoré obsahuje 2 mmol glutamínu, 100 μg/ml streptomycínu, 100 jednotiek/ml penicilínu a 0,20 mg/ml DEAE-dextránu, doplneného na 4 ml Tris-DNA roztokom. 4 ml prostredia s obsahom rozpustenej DNA sa pridajú k platni, s obsahom buniek M6 COS a bunky sa počas 12 hodín temperujú.

Po inkubácii sa bunky jedenkrát alebo dvakrát premyjú so 7 ml SF DME. Potom sa 5 ml DME s 10 % HIFCS, 100 jednotiek/ml penicilínu, 100 μ9/ιη1 streptomyycínu, 2 mmol glutamínu a 0,1 mmol chlorochinu pridá k zmesi a bunky sa temperujú počas 2,5 hodín.

Po inkubácii sa bunky premyjú s SF DME a pridá sa 10 ml DME +10 % HIFCS na platne. Po 30 hodinách sa prostredie odsaje a pridá sa 4 ml DME +10 % HIFCS na platňu. Bunky sa izolujú odstránením prostredia po 24 až 26 hodinách ďalšej inkubácie.

Prostredie z každej vzorky sa skúma na účinnosť CSF za použitia skúšky KG-1. Pre každú vzorku, ktorej účinnosť je pozitívna, je potrebné vyhĺadat kloň na pôvodnom filtre, ktorý je príčinou tejto účinnosti. Napríklad, v prípade pozitívnej transfekcie účinnosti CSF sa odoberú všetky kolónie pôvodného úseku filtra, na ktorom sa zistila táto účinnosť. Jedná sa zvyčajne o približne 320 kolónií, ktoré sa odoberú do 3 ml L-prostredia s 10 μg/ml tetracyklínu. Kultúry sa kultivujú cez noc. 320 kolónií sa uloží do matrice 18 x 18. Z horizontálnych radov a vertikálnych stĺpcov matrice sa pripravia zmesi (36 zmesí, posledný horizontálny rad mal iba 14 klonov). Vzorky DNA sa pripravia z každej zmesi a použijú sa na transfekciu buniek (CDS). Supernatanty z takto získaného materiálu sa skúmajú na účinnosť. Získali sa dve pozitívne vzorky, jedna vo vertikálnom stĺpci, druhá v horizontálnom rade. Kultúra spoločná pre obidve zmesi obsahovala kloň s účinnosťou CSF.

Z kultúry sa izolovalo celkove dvanásť jednotlivých klonov a miniprep DNA sa potom pripravila z kultúr o objeme 10 ml v L-prostredí tak, ako bolo popísané vyššie. Potom boli rozštiepené vzorky 10 μΐ DNA z týchto skúšok enzýmom EcoRl a výsledné fragmenty DNA sa analyzovali elektroforézou na agarovom géle. Deväť z dvanástich klonov malo spoločný včlenený sled s približne 750 pármi báz. DNA zo štyroch z týchto klonov a zo zostávajúcich troch klonov bola prenesená do buniek M6 COS vyššie uvedeným spôsobom. Supernatanty z takto uskutočných tranfekcií sa skúmali skúškou KG-1 rovnako ako skúškou s použitím buniek z kostnej dre32 ne na účinnosť CSF. Štyri klony mali 750 párov báz ako spoločný fragment, včlenený v správnom slede, takže dochádzalo ku expresii bunkami M6 COS vo vysokom stupni, ako bolo možné dokázať účinnosťou CSF v oboch uvedených skúškach na rozdiel od zostávajúcich troch klonov. Znamená to, že kódová oblasť pre CSF musí byť uložená vo včlenenom slede so 750 pármi báz.

Sled DNA, ktorý je kódom pre CSF bol odstránený z vektora pre transformáciu v pozitívnom klone rozštiepením enzýmom EcoRI a jeho sled bol stanovený za použitia štandardnej metódy po podrobení fragmentov klonovaniu vo vektoroch M13, čím sa dokázal sled, znázornený na obr. 1. Plazmid p91023(B) - CSF, o ktorom sa najskôr preukázalo, že riadi expresiu CSF v bunkách COS bol označený ako pCSF-1. Tento plazmid bol potom uložený v zbierke American Type Culture Collection v kmeni E. coli MC1061 pod číslom ATCC 39754 2. júla 1984.

Stupeň 7

Expresia bielkoviny CSF

Opičie bunky M6 COS, transformované vektorom p91023(B) s obsahom CSF/cDNA tak, ako bol tento materiál izolovaný v stupni 6, sa kultivujú spôsobom popísaným v stupni 6, čím nastáva produkcia bielkoviny CSF, ktorá sa potom nachádza v živnom prostredí.

Postupuje sa tak, že sa 1 mg tejto DNA (pCSF-1) rozpustí v ml 0,1 Tris s pH 7,3 a pridá sa k 600 ml DME s obsahom 2 mmol glutamínu, 100 jednotiek/ml streptomycínu, 100 μ/ml penicilínu (P/S) a 0,25 mg/ml DEAE Dextránu s molekulovou hmotnosťou 500 000 (Pharmacia). 600 ml roztoku DNA DEAE dextránu sa pridá k bunkám M6 COS a zmes sa temperuje počas 12 hodín pri teplote 37 °C. Po inkubácii sa bunky premyjú 900 ml SF DME a potom sa temperujú 2,5 hodín v 600 ml DNA s obsahom 0,1 mmol chlorochínu, 10 % HIFCS, mmol glutamínu a P/S: Prostredie s obsahom chlorochínu sa odstráni odsávavním, bunky sa premyjú SF DME a potom sa pridá 1500 ml DME s 10 % HIFCS. Po 30 hodinách sa bunky premyjú SF DME, prostredie sa nahradí s 800 ml čerstvého prostredia SF DME a bunky pre tranfekciu sa temperujú počas 24 hodín pri teplote 37 C.

Prostredie sa odsaje a nahradí sas 800 ml čerstvého prostredia SF DME. Bunky sa potom temperujú v tomto prostredí počas 24 hodín, potom sa prostredie odstráni. Akonáhle je to možné, zahustia sa vzorky prostredia 20 x ultrafiltráciou pod tlakom za použitia komory Amicon s objemom 2,5 1 s membránou YM5, ktorá oddeľuje zlúčeniny do molekulovej hmotnosti 5 000.

Stupeň 8

Čistenie rekombinantného CSF

200 ml koncnetrovaného prostredia zo 41 východiskového materiálu zo stupňa 7 sa na 30 % nasýti síranom amónnym pridaním pevného síranu amónneho a vyzrážaná bielkovina sa oddelí odstredením. Supernatant sa na 80 % nasýti síranom amónnym pridaním ďalšieho pevného síranu amónneho a vyzrážaná bielkovina sa opäť oddelí odstredením. Granula sa znova uvedie do suspenzie v 5 ml 20 mmol citrónanu sodného s pH 6,1 s obsahom 1 M NaCl, Rozpustená bielkovina sa nanesie na stĺpec o rozmeroch 1,6 x 100 cm s náplňou Ultrogel AcA54 v rovnovážnom stave v rovnakom tlmivom roztoku. Účinnosť CSF sa vymýva zo stĺpca pri molekulovej hmotnosti 19 k jednotiek alebo približne po 90 ml počiatočného eluátu. Pozorovalo sa, že v prípade, že sa filtrácia na géle uskutočňuje pri malej iónovej sile, vymýva sa látka s účinnosťou CSF zo stĺpca v dvoch polohách s molekulovou hmotnosťou 19 a 38 k jednotiek, čo pravdepodobne znamená tvorbu dimérov. Účinné spoja a pridáva sa 10 % TFA do koncentrácie 0,15 % materiál nanesie na stĺpec Vydac C4 s rozmermi 0,46 x 25 cm v rovnovážnom stave v 0,1 % TFA. Stĺpec sa vyvíja lineárnym gradientom acetonitrilu od 0 do 90 % v 0,1 % TFA rýchlosťou 1 ml za minútu pri celkovom množstve ^!340 ml. Účinnosť CSF sa vymýva medzi 39 a 43 % acetonitrilu, frakcie 16 až 20. Vzorka frakcie 19 s objemom 20 μΐ bola analyzovaná elektroforézou na SDS polyakrylamidovom géle (13,5 % gél podľa publikácie Lammli, Náture 227, 680 (1970)). Bolo možné pozorovať jediný široký pás pre bielkoviny s molekulovou hmotnosťou 18 až 26 jednotiek. Širšie rozmedzie pre molekulovú hmotnosť CSF je bežnou vlastnosťou glykoproteínov a pravdepodobne odráža veíké, avšak meniace sa množstvo uhľohydrátov. Bielkovina z frakcie 19 bola podrobená Edmanofrakcie sa a potom sa vej degradácii za použitia zariadenia na stanovenie sledu. Z približne 20 μg bielkoviny bolo možné určiť sled prvých šestnástich aminokyselín ako A-P-A-R-S-P-S-P-S-T-Q-P- W-E-H. Vysoký výťažok tohto jediného sledu napovedá, že bielkovina CSF z frakcie 19 bola vyčistená až do homogenity. Biologická skúška ukázala, že frakcia 19 obsahovala 3 x 10⁷ jednotiek na jednotku absorbancie A₂₈₀. Typické bielkoviny vo vodnom roztoku majú extinkčný koeficient 0,8 až 1,2 jednotiek absorbancie Α₂₈θ. Na 1 mg bielkoviny, špecifická účinnosť čisteného CSF je v rozmedzí 1 x 10⁷ až *7 x 10 jednotiek/mg v prípade, že sa použije skúška s bunkami z ludskej kostnej drene.

Príklad B

Klonovanie CSF gibona

Stupeň 1

Príprava mRNA z T-buniek gibona

Vzorka línie T-buniek gibona, označený UCD-MLA 144 sa kultivuje počas niekoíko týždňov v prostredí RPMI 1640 (Gibco) a 20 % fetálneho teľacieho séra (FCS) až do získania počtu 1 x 10⁹ buniek. Tieto bunky sa spracovali tak, že bola indukovaná produkcia vysokej hladiny CSF aktiváciou počas 24 hodín pôsobením 10 ng/ml 12-0-tetradekanolyforbol-13-acetátu (TPA v RPNI 1640) s 1 % FCS. Bunky sa potom izolovali odstredením počas 5 minút pri 1000 otáčkach za minútu, premyli sa chloridom sodným s fosfátovým tlmivým roztokm (PBS) a potom sa opäť izolovali odstredením.

Z týchto buniek sa pripravila mRNA polyzómov, viazaných na membránu (MBP) spôsobom, popísaným v príklade A pre prípravu RNA z buniek Mo.

Stupeň 2

Reakcia s cDNA prvého reťazca μg MBP mRNA zo stupňa 1 sa zriedi v reakčnej zmesi pre prípravu cDNA v množstve 50 μΐ, rovnako ako bolo popísané v stupni 4 príkladu A a reakcia sa začne pridaním reverznej transkriptázy. Zmes sa temperuje počas 30 minút pri teplote 42 °C, potom sa reakcia zastaví pridaním EDTA do koncetrácie 50 mmol a zmes sa zriedi vodou na 100 μΐ. Potom sa zmes extrahuje najskôr zmesou fenolu a chloroformu a potom chloroformom. Hybridy cDNA/RNA sa oddelia od nevčlenených trifosfátov chromatografiou na stĺpci s obsahom 2 ml Sepharose CL-4B. Odobraté frakcie sa zlejú a hybridy sa vyzrážajú etanolom, výťažok je 570 mg.

Stupeň 3

Reakcia s cDNA druhého reťazca

Granula cDNA z prvého reťazca zo stupňa 2 sa znova uvedie do suspenzie v 50 ml vody a uskutočňuje sa syntéza druhého reťazca v štandardnej reakčnej zmesi za použitia polymerázy I E. coli, ligázy E. coli a ribonukleázy H. Reakčná zmes sa temperuje cez noc pri teplote 16 C a potom hodinu pri teplote 37 C. Reakcia sa zastaví pridaním EDTA a zmes sa extrahuje zmesou fenolu a chloroformu. Potom sa cDNA oddelí od nevčlenených trifosfátov chromatografiou na stĺpci prostriedku Sepharoza CL-4B, získané frakcie sa spoja a cDNA sa izoluje vyzrážaním s etanolom.

Stupeň 4

Príprava rekombinantnej cDNA

Granula cDNA zo stupňa 3 sa uvedie znova do suspenzie v 75 μΐ vody. Potom sa pridajú na konce cDNA homopolymérne zakončenia tak^!, že sa pridá 10 μΐ roztoku cDNA k 25 μΐ štandardnej reakčnej zmesi s obsahom terminálnej transferázy a výsledná zmes sa temperuje počas 5 minút pri teplote 30 'C. Reakcia sa zastaví pridaním EDTA do koncentrácie 40 mmol a potom sa zmes inaktivuje teplom počas 10 minút pri teplote 68 ‘C. 10 ng cDNA s takto upraveným zakončením sa spojí s 50 ng plazmidu pBR322 so zakončeniami G (NEN) v 10 μΐ 10 mmol Tris s pH 7,5, 1 mmol EDTA a 100 mmol chloridu sodného. Výsledná reakčná zmes sa temperuje počas 10 minút pri teplote 68 “C a potom ešte 2 hodiny pri teplote 57 ‘C.

Stupeň 5

Transformácia baktérií

Kmeň E. coli MC1061 sa kultivuje v L-bujóne, potom sa schladí v lade, bunky sa oddelia odstredením a pridá sa chlorid vápenatý pre prípravu buniek pre transformáciu. Potom sa 5 μΐ roztoku zo stupňa 4 temperuje s 200 μΐ takto pripravených baktérií. Táto transformácia sa opakuje 15 x za použitia celého množstva cDNA z predchádzajúceho stupňa a materiál sa nanesie na platne o priemere 15 cm s 1 % agarom v L-bujóne s obsahom 10 μΐ/ml tetracyklínu. Na každej platni vyrástlo približne 1000 kolónií.

Stupeň 6

Kultivovanie kolónií

000 kolónií z transformácií sa individuálne vyberú, prenesú na čerstvé platne v množstve 500 kolónií na platňu v mriežke a kolónie sa kultivujú cez noc pri teplote 37 °C. Potom sa kolónie oddelia od platní pritlačením filtra zo suchej mikrocelulózy na povrch platne. Z každého základného filtra sa pripravia dve kópie. Pôvodné filtre sa skladujú pri teplote 4 °C a na kópie sa pôsobí zásadou a potom sa za tepla sušia, aby boli pripravené pre hyybridizáciu.

Stupeň 7

Príprava hybridizačných vzoriek, značených ³²P

Včlenený sled cDNA z pCSF-1 sa izoloval rozštiepéním reštrikčným enzýmom EcoRl s následnou elektroforézou na agarovom géle za použitia Tris acetátového tlmivého roztoku a etidiumbromidu. Pás, obsahujúci fragment cDNA bol z gélu vyrezaný a vyčistený zvyčajným spôsobom.

300 ng fragmentu cDNA sa potom pridalo k 1 μΐ 10 x tlmivého roztoku pre pôsobenie T4 DNA polymerázy (0,33 M Tris acetát s pH 7,9, 0,66 M octan draselný, 0,1 M octan horečnatý a 10 mmol

- 37 ditiotreitolu) s 3 jednotkami T4 DNA polymerázy (New England Biolabs) a zmes sa zriedi vodou na 10 μΐ. Po inkubácii počas 5 až 10 minút pri teplote 37 °C sa zmes mieša s 1 μΐ 10 x T4 tlmivého roztoku s DNA polymerázou, pridá sa ešte 1 μΐ 2 mmol roztoku dCTP, dTTP, dGTP a 10 μΐ ³²P dATP (10 μθί/μ1, 3000 Ci/mmol) a 3 jednotky Tr DNA polymerázy. Potom sa reakčná zmes temperuje počas 20 minút pri teplote 37 ’C, pridá sa 1 μΐ 2 mmol dATP a reakčná zmes sa temperuje ešte ďalších 10 minút pri teplote 37 “C.

Nevčlenené trifosfáty sa oddelia od značenej cDNA chromatografiou na stĺpci Sephadex G100. Potom sa pripraví druhá vzorka zo syntetického oligonukleotidu so sledom

ATC TGG CTG CAC AG ktorý je komplementárny k zakončenej oblasti, ktorá je kódom pre CSF na tej časti, na ktorej sa nachádza aminoskupina. Tento o n oligonukleotid bol označený P dATP na 5'-zakončení za použitia štandardnej reakcie s polynukleotidkinázou.

Stupeň 8

Izolácia klonov CGS cDNA

Pri skúškach sa štandardnú hybridizáciu bolo možné preukázať túto hybridizáciu u 45 klonov za použitia pCSF-1 cDNA, označené T4. Týchto klonov hybridizovalo približne 20 klonov so vzorkou, ktorá obsahovala značený oligonukleotid. Kódová oblasť jedného z týchto klonov bola podrobená analýze sledu, pričom sa zistilo, že došlo ku substitúcii väčšieho počtu báz, niektoré tieto substitúcie viedli k rozdielnym aminokyselinám v bielkovine, k expresii ktorej prišlo. Preukázané rozdiely sú znázornené na obr. 1 nad sledom DNA pre gén ľudského CSF tak, ako bol klonovaný v príklade A.

Príklad C

Klonovanie CSF z mRNA lymfocytov z periférnej krvi

Stupeň 1

Príprava mRNA z lymfocytov z periférnej krvi

Lymfocyty z periférnej krvi s pripravili z vedľajších produktov pri výrobe plazmy (poskytol Červený kríž) frakcionáciou za použitia gradientu Ficoll-Hypaque. Pri kultivovaní v prostredí RPMI-1640 v prítomnosti 5 % fetálneho teľacieho séra, 0,17 % fytohemaglutinínu a 10 ng/ml PMA o hustote 2 x 10⁶ buniek/ml celkove sa získalo 6 x 10⁹ buniek. Bunky sa oddelili odstredením počas 5 minút pri 1000 otáčkach za minútu, potom sôi premyli chloridom sodným z obsahom fosfátového tlmivého roztoku (PBS) a napokon sa bunky oddelili odstredením. Potom sa pripravila cytoplazmatická RNA opatrným rozrušením buniek tak, že bunky sa zaviedli do suspenzie v 50 ml chladného tlmivého oroztoku pre rozrušenie buniek s obsahom Tritonu (tlmivý roztok pozostával zo 140 mmol NaCl,

1,5 mmol MgCl₂, 10 mmol Tris s pH 8,6a0,5 % Triton X-100) s mmol ditiotreitolu (DTT) a 50 jednotkami/ml RNA sin (Biotec). Materiál bol rozdelený na dve rovnaké časti a každá z týchto častí bola navrstvená na 10 ml tlmivého roztoku s obsahom 20 % sacharózy. Bunečné jadrá sa odstránili odstredením pri teplote 4 ’C počas 5 minút pri 400 otáčkach za minútu. Horná vrstva, ktorú tvoril cytopiazmatický extrakt sa opatrne odstránila a pridal sa dodecylsulfát sodný (SDS) do konečnej koncentrácie 1 %. Potom sa roztok 2 x extrahoval tým istým objemom zmesi fenolu a chloroformu v pomere 1 : la RNA sa vyzrážala pridaním 2,5 objemu chladného etanolu. Vyzrážaná RNA sa oddelila odstredením počas 15 minút 4000 otáčkach za minútu a potom sa znova zaviedlo do suspenzie v zmesi 0,01 M Tris s pH 7,5, 1 mmol EDTA, 0,25 M NaCl (tlmivý roztok TE s 0,25 M NaCl) a mateiál sa znova vyzrážal priI daním 2,5 objemu chladného etanolu. Napokon sa RNA oddelila odstredením a znova zaviedla do suspenzie v 5 ml vody. Celkový výťažok bol 7,5 mg.

Z celkového množstva cytoplazmatickej RNA sa izolovala mRNA selekciou na oigo dT celulóze. Potom sa 2,5 mg celkovej RNA zahreje na 5 minút na teplotu 65 °C. Pridá sa chlorid sodný do koncentrácie 0,5 M a RNA sa nechá vychladnúť na laboratórnu teplotu a potom sa nechá prejsť stĺpcom s obsahom 1 ml oligo dT ce39 lulózy v rovnovážnom stave v TE + 0,5 M chloridu sodného (tlmivý roztok pre väzbu). Nenaviazaná RNA sa oddelí dôkladným premytím stĺpca tým istým roztokom. Viazaná RNA sa potom vymýva s 3 ml vody a vyzráža sa pridaním 0,2 ml 4 M chloridu sodného a 2,5 objemom chladeného etanolu. Vyzrážaná RNA sa oddelí odstredením počas 30 minút pri 25 000 otáčkach za minútu. Výsledná usadenina v množstve približne 100 μ9 sa zvova zavedie do suspenzie v 50 μΐ vody.

Stupeň 2

Reakcia s prvým reťazcom cDNA μg PBL mRNA sa zriedi v reakčnej zemsi s obsahom 50 μιη cDNA, ktorá obsahuje 100 mmol Tris s pH 8,4, 140 mmol KC1, mmol MgC^, 10 mmol 2-merkaptoetanolu, 400 μπιοί dATP, dGTP, dCTP a dTTP, 5 μg oligo-dT s priemernou veľkosťou 12 až 18 a 25 μθΐ 32p dcTP (400 μΟΐ/ππηοΙ) a 20 jednotiek inhibítora ribonukleázy RNAsin. Reakcia sa spustila pridaním 60 jednotiek reverznej transkriptázy pri teplote 37 °C a následnou inkubáciou počas 30 minút pri teplote 42 C. Reakcia sa potom zastavila pridaním EDTA do koncentrácie 40 mmol s následnou extrakciou rovnakým objemom fenolu nasýteného vodou. Fenolová fáza sa podrobila spätnej extrakcii 50 μπιιηοΐ tlmivého roztoku TE. Vodné fázy sa spojili a hybridy cDNA/RNA sa izolovali od nevčlenených trifosfátov tak, že spojené vodné fázy prešli stĺpcom s obsahom 5 ml prostriedku Sepharose CL-4B (Sigma) v rovnovážnom stave s TE. Frakcie, ktoré prešli stĺpcom, sa spojili, doplnili na obsah 250 mmol chloridu sodného a nukleové kyseliny sa vyzrážali pridaním 2,5 objemu chladného etanolu. Hybridy sa odstránili počas 30 minút pri

000 otáčkach za minútu. Výsledná usadenina 2,5 μg cDNA sa znova uzaviedla do suspenzie v 50 μΐ vody.

Stupeň 3

Reakcia s druhým reťazcom cDNA

Druhý reťazec cDNA bol syntetizovaný súčasným pôsobením enzýmu DNA polymerázy I, DNA ligázy a RNAázy H z E. coli. 50 μΐ takto získanej reakčnej zmesi obsahovalo 20 mmol Tris s pH 8,0, 4 mmol chloridu horečnatého, 1,2 mmol EDTA, 25 μπιοί NAD, vždy 1000 μπιοί dATP, dGTP, dCTP a dTTP a 50 μθί ³²P dCTP s 3 000 Ci/mmol. Reakcia sa spustí pridaním 3 jednotiek DNA polymerázy I, 0,5 jednotky DNA ligázy a 0,75 jednotiek ribonukleázy H s následnou inkubáciou počas 18 hodín pri teplote 16 °C a potom hodinu pri teplote 37 ’C, po čom sa reakcia zastaví pridaním EDTA do koncentrácie 40 mmol a potom sa extrahuje rovnakým objemom fenolu. Fenolová fáza sa spätne extrahuje 50 μΐ TE, vodné fázy sa spoja a cDNA sa oddelí od nevčlenených trifosfátov chromatografiou na stĺpci prostriedku Sepharose CL-4B tak, ako bolo popísané vyššie v prípade prvého reťazca. V závislosti od včlenenia ³²P sa prvý reťazec cDNA kvantitatívne transformoval do formy s dvojitým reťazcom.

Stupeň 4

Príprava rekombinantnej cDNA

Na zakončení cDNA boli naviazané homopolymérne C-sledy opatrným zahriatím 400 ng cDNA v 50 μΐ reakčnej zmesi, ktorá obsahovala 1 mmol 2-merkaptoetanolu, 1 mmol chloridu kobaltnatého a 9 jednotiek terminálnej deoxynukleotidyltransferázy počas 5 minút pri teplote 30 °C. Potom sa reakcia zastavila pridaním EDTA do koncentrácie 40 mmol s následným zahriatím, počas 10 minút na teplotu 68 ’C. Potom sa 200 ng získanej cDNA naviazalo na 500 ng pAT153 so zakončeniami G (Amersham) v 100 μΐ 10 mmol Tris s pH 7,5, 1 mmol EDTA a 100 mmol chloridu sodného. Väzba sa uskutočňovala počas 2 hodín pri teplote 57 ’C pri 5 minútach predbežnej inkubácie pri teplote 68 ’C.

Stupeň 5

Transformácia baktérií

Produkt, získaný väzbou cDNA sa priamo použil pre transformáciu kmeňa E. coli MC1061. Čerstvá kolónia baktérií sa použila pre naočkovanie 50 ml L-bujónu a bola kultivaná počas niekoľkých hodín tak dlho, až optická hustota pri 550 nm bola

0,25. Bunky sa ochladili v lade a potom sa oddelili odstredením počas 10 minút pri 2000 otáčkach za minútu. Získaná usadenina sa znovu zaviedla do suspenzie v 10 ml chladného 0,1 M chloridu vápenatého a potom sa ponechala v lade počas 10 minút. Bunky sa odstredili počas 5 minút pri 2000 otáčkach za minútu, na čo sa znova zaviedli do suspenzie v 2,5 ml 0,1 M chloridu vápenatého. Potom sa 10 μΐ reakčnej zmesi pre väzbu cDNA temperovalo s 200 μΐ baktérií, na ktoré sa pôsobilo chloridom vápenatým najskôr 30 minút v lade a potom 2 minúty pri teplote 37 ’C, po čom sa pridalo 0,8 ml L-bujónu a bunky sa temperovali ešte 30 minút pri teplote 37 ’C.

Uskutočnilo sa celkove 20 transformačných reakcií pri využití celého množstva viazanej cDNA. Každá z transformačných zmesí na naniesla na platne o priemere 15 cm, ktoré obsahovali L-bujón s obsahom 1 % agaru a 10 μg/ml tetracyklínu. Z 20 uskutočnených transformácií sa pripravilo 20 takto upravených platní a tieto platne sa temperovali cez noc pri teplote 37 C. Na každej platni vyrástlo približne 1 500 kolónií baktérií, čo znamená celkove 30 000 klonov.

Stupeň 6

Produkcia kolónií

Pôvodné kolónie rastúce na každej platni sa preniesli na nitrocelulózové filtre s priemerom 137 mm tak, že suchý filter sa pritlačil na hornú stranu platne s kolóniami a potom sa opäť sňal. Z každého originálneho filtra sa potom pripravili dve totožné kópie bežným spôsobom tak, aby bolo možné presne označiť časti, ktoré si zodpovedajú. Každý pôvodný filterr sa opatrne uložil kolóniami nahor na sterilný filtračný papier (Whatman 3 MM) nachádzajúci sa na sklenenej doske. Potom sa tento filter uložil na vopred navlhčený nitrocelulózový filter, tento filter sa prikryl druhým väčším úsekom filtračného papiera a filtre sa k sebe pritlačili druhou sklenenou doskou. Filtre sa očíslovali a na troch nesymetrických miestach prepichli špendlíkom tak, aby ich bolo možné v budúcnosti opäť presne priložiť. Potom sa kópia oddelila od pôvodného filtra a uložila kolóniami nahor na novú platňu s L-bujónom, agarom a tetracyklínom. Okamžite bol rovnakým spôsobom priložený čistý filter, čím sa získala ďalšie kópia. Potom sa pôvodný filter vrátil na agarovú platňu a všetky platne sa temperovali počas niekoľkých hodín pri teplote 37 C, po tomto čase mali kolónie baktérií priemer približne 1 mm. Pôvodné filtre sa skladovali pri teplote 4 °C na prípravu kópií, slúžiacich pre hybridizáciu vyššie uvedeným spôsobom.

Stupeň 7

Úprava filtrov pre hybridizáciu

Každá kópia pôvodného filtra, získaná v stupni 6 sa uložila kolóniami smerom nahor na filtračnom papieri (Whatman 3 MM, ktorý sa navlhčil 0,5 M hydroxidom sodným a 1,5 M chloridom sodným na 7 minút. Filtre sa potom neutralizovali, navlhčili na 2 minúty 1 M Tris s pH 7,5 s 1,5 M chloridom sodným, po čom sa znova neutralizovali počas 5 až 10 minút a potom sa uložili na filtre, navlhčené tlmivým roztokom SSC na 5 minút (0,015 M citrát sodný, 0,15 M chlorid sodný, pH 7,4), potom sa filtre usušia na vzduchu a ďalej zahrievajú 1 až 2 hodiny vo vákuu pri teplote 80 ’C.

Stupeň 8

Izolácia klonov cDNA CSF

Kópie filtrov sa v dvojitom vyhotovení uviedli do styku s včlenenou cDNA pCSF-1 po rádioaktívnom označení, plazmid sa pripravil spôsobom podľa príkladu B. S cDNA sa hybridizovalo 20 kolónií. 12 z týchto kolónií sa oddelilo a kultivovalo cez noc _t i v L-bujóne pre dalšiu analýzu. Materiál, ktorý sa získal rozštiepením reštrikčným enzýmom Pst 1 z týchto klonov bol prevažne nesúrodý, avšak tri z týchto klonov mali takmer úplnú dĺžku požadovaného sledu. Pre jeden z týchto sledov sa vykonal celkový rozbor celého sledu. Sled, ktorý bol kódom pre CSF v tomto klone— βόί totožný so zodpovedajúcim sledom plazmidu, pCSF-1, čo znamená, že obsahoval T v polohe 365-CSF(IIe).

Príklad D

Čistenie CSF z bunečnej línie Mo

1 prostredia z kultivovania bunečnej línie Mo sa temperuje počas 30 minút pri teplote 55 'C pre inaktiváciu vírusu HTLV-II, spojeného s touto bunkovou líniou. Potom sa prostredie zahustí ultrafiltráciou pod tlakom za použitia zariadenia Pellicon Casette s membránou PTGC (1/6 m²), so schopnosťou oddeliť látku do molekulovej hmotnosti 10 000. Bielkovina sa ďalej koncentruje vyzrážaním síranom amónnym do nasýtenia na 80 %. 800 mg výslednej bielkoviny sa znova uvedie do suspenzie v 100 ml 20 mmol tris(hydroxymetyl)aminometánhydrochloridu (Tris-HCl) s pH 7,4 a materiál sa potom dialyzuje proti tomuto tlmivému roztoku celkom 3 x vždy za použitia 4 1 tlmivého roztoku. Dialyzovaná bielkovina sa nanesie na stĺpec s rozmermi 2,5 x 10 cm s obsahom DEAE (dietylaminoetyl)-ultragélu, v rovnovážnom stave v tomto tlmivom roztoku. Stĺpec sa premýva 800 ml 20 mmol tris-HCl s pH 4 a ďalej s 800 ml 20 mmol tris-HCl s pH 7,4, s obsahom 0,12 M chloridu sodného, čím sa začne vymývať látka s účinnosťou CSF. Odoberie sa rad frakcií po 100 ml, účinné frakcie sa spoja. Jedná sa celkove o tri frakcie, ktoré sa zahustia na 1/6 svojho objemu, t.j. na 5 ml ultrafiltráciou pod tlakom za použitia membrány Amicon YM5, ktorá oddeľuje zlúčeninu do molekulovej hmotnosti 5000). Koncentrovaná vzorka z DEAE-stĺpca sa nanesie na stĺpec s rozmerom 1,6 x 100 cm s obsahom AcA44 ultragelu (akrylamidagarový ultragel s frakcionáciou do 10 až 130 jednotiek molekulovej hmotnosti). Stĺpec je v rovnovážnom stave v 20 mmol kyseliny N-2-hydroxyetylpiperazín-N-2-etánsulfónovej (HEPES), s pH 7,4, s 50 mmol chloridu sodného a 0,01 % polyetylénglykolu (PEG-8000). Látka s účinnosťou CSF, ktorá sa vymýva zo stĺpca mala molekulovú hmotnosť 30 k jednotiek. Účinné frakcie sa spojili a pridala sa k nim kyselina trifluóroctová (TFA) do koncentrácie 0,15 objemových percent pridávaním 10 % roztoku tejto kyseliny, čím sa získala zmes nanesená na stĺpec o rozmeroch 1 x 25 cm s obsahom prostriedku Vydac C4 v reverznej fáze. Stĺpec sa vyvíjal lineárnym gradientom 0 až 90 % acetonitrilu v 0,1 % objemových TFA rýchlosťou 4 ml/min, celkove sa získalo 1000 ml eluátu. Látka s účinnosťou CSF sa vymýva pri koncentrácii acetonitrilu približne 47 % objemových. Účinné frakcie sa spoja a upravia na koncentráciu 0,05 % objemových kyseliny heptafluórmaslovej (HFBA) pridaním 0,15 % HFBA a získaný materiál sa potom nanesie na stĺpec o rozmeroch 0,46 x 25 cm s obsahom prostriedku Vydac C4 v rovnovážnom stave v HFBA o koncentrácii 0,15 % objemových. Stĺpec sa vyvíja lineárnym gradientom 0 až 90 % objemových acetonitrilu v 0,15 % objemových HFBA rýchlosťou 1 ml/min., získa sa celkom 340 ml eluátu. Látka s účinnosťou CSF sa vymýva pri koncentrácii acetonitrilu približne 53 % objemových. Účinné sú frakcie 37 až 44, každá z nich mala objem 1 ml. 0,15 ml frakcie 40 sa zahustilo na 1/4 objemu za použitia zahustovacieho zariadenia SAVANT Speed Vac a potom sa pridalo 40 μΐ 2 x SDS tlmivého roztoku (0,125 M Tris-HCl s pH 6,8, 4 % SDS, 20 %glycerolu a 0,004 % brómfenolovej modrej). Tieto vzorky sa povarili 2 minúty a potom sa naniesli na 13,5 % SDS gél spôsobom podía publikácie Lammli, U. Náture 227. 680 (1970), ako je znázornené na obr. 2. Frakcia mala účinnosť 110 000 jednotiek/ml za použitia buniek kostnej drene. Toto zodpovedá približne 3 x 10 jednotiek na jednu jednotku absorbancie Α₂₈₀· Pretože typické bielkoviny majú extinkčný koeficient v rozmedzí od 0,8 až 1,2 jednotiek ^A280 ^{v m}ili9^ralne, má čistený CSF špecifickú účinost v rozmedzí 1 x 10⁷ až 4 x 10⁷ jednotiek/mg. Vzorka 1 μg čisteného GM-CSF sa podrobila Edmanovej degradácii za použitia zariadenia Appleid Biosystems Gas Phase Microseguenator. Sled medzi zvyškami 3 až 5 bol Ala Arg Ser.

Príklad E

Kotransformáciou a amplifikáciou sledu CSF v bunkách CHO bol včlenený plazmid p91023(B)-CSF do buniek DUKX-B11, ktoré neobsahujú DHFR CHO, ako bolo popísané v publikácii Chasin a Urlaub PNAS 72, 4216 (1980) a to fúziou protoplastu, popísanou v publikácii Sandri-Goldin a kol., Mol. Celí. Bio. 1, 743 - 752, (1981). Rast a udržiavanie buniek CHO bolo popísané v publikácii Kaufman a Sharp, J. Mol. Bio. 150, 601 - 621, (1981). Pri uskutočňovaní fúzie protoplastov bol plazmid p91023(B)-CSF-l včlenený do kmeňa E. coli HB101 a baktérie sa kultivovali v 50 ml prostredia m9 s obsahom solí a 0,5 % aminokyselín kazeínu, 0,4 % glukózy, 0,012 % síranu horečnatého, 5 μg/ml tiamínu a 10 μg/ml tetracyklínu do adsorbancie 0,6 pri 600 nm. Chloramfenikol sa pridal

- 45 do koncentrácie 250 μ9/κι1 a kultúra sa temperovala pri teplote 37 °C na pomnoženie kópií plazmidu. Potom sa bunky odstredili pri 3000 otáčkach/min počas 10 minút pri teplote 4 °C a zaviedli sa do suspenzie v 2,5 ml chladenej 20 % sacharózy v 50 mmol Tris-HCl s pH 8,0. Potom sa pridal lyozým, a to 0,5 ml roztoku s koncentráciou 5 mg/ml v 0,25 M Tris-HCl s pH 8,0 a zmes sa uloží do íadu na 5 minút. Pridá sa 1 ml 0,25 M EDTA s pH 8,0 a zmes sa uloží do íadu na ďalších 5 minút a potom sa pridá 1,0 ml 0,05M tris-HCl s pH 8,0 a zmes sa temperuje počas 15 minút pri teplote 37 ’C, a po tomto čase sa baktérie premenia na protoplasty. Suspenzia sa pomaly zriedi s 20 ml predhriateho prostredia, ktoré obsahuje 10 % sacharózy a 10 mmol chloridu horečnatého, po čom sa zmes nechá stáť počas 15 minút pri teplote 37 ’C. Pridá sa roztok protoplastu (približne 10⁹/ml) k bunkám DUKX-B11 bez DHFR CHO v platniach so šiestimi vyhĺbeninami v množstve približne 1 x 10⁶ buniek/vyhĺbeninu v pomere asi 1 až 2 x 10⁴ protoplastov/bunka a protoplasty sa granulujú spolu s bunkami odstredením počas 8 minút pri 2000 otáčok/minútu za použitia odstredivky IEC model K. Po odstredení sa supernatant odsaje a pridajú sa 2 ml roztoku polyetylénglykolu (50 g PEO-1450, Baker Chem. Co. v 50 ml prostredia) do každého vyhĺbenia vyššie uvedenej platne. Potom sa bunky znova odstredia počas 90 sekúnd pri 2000 otáčkach/minútu, roztok polyetylénglykolu sa odstráni a platne sa opláknu 3 x vždy so 4 ml prostredia/vyhĺbeninu. Potom sa bunky spracujú pôsobením trypsínu, zavedú sa do suspenzie v 10 ml prostredia s obsahom 10% fetálneho teíacieho séra a odstredia sa v skúmavke (kónickej) pri 500 otáčok/minútu v bežnej odstredivke. Granulované bunky z troch vyhĺbenín sa spoja a nanesú na platňu o priemere 10 cm, ku každej platni sa pridá čerstvé prostredie, ktoré obsahuje 100 μg/ml kanamycínu, tymidínu, adenozínu, deoxyadenozínu, peniI cilínu a streptomycínu a 10 % dialyzovaného fetálneho telacieho séra. Kanamycín sa pridáva na zamedzenie rastu akýchkoívek baktérií, ktoré by pretrvávali pri premene na protoplasty.

Po dvoch dňoch sa bunky preniesli v pomere 1 : 15 do prostredia a- s 10 % dialyzovaného fetálneho teíacieho séra, penicilínu a streptomycínu, avšak bez nukleozidov. Potom sa k bunkám pridalo to isté selektívne prostredie bez nukleozidov ešte po 4 až 5 dňoch.

- ·χ6 Kolónie sa objavili po 10 až 12 dňoch kultivácie v selektívnom prostredí. Potom sa uskutočňovali dva pokusy na selekciu pôsobením metotraxu (MTX) a pokus na amplifikácii. V prvej sérii pokusov boli izolované jednotlivo nezávisle klonované transformanty podlá expresie DHFR a každý kloň bol kultivovaný v podmienkach, pri ktorých dochádza k amplifikácii počtu kópií cudzorodej DNA, tj. pri použití stúpajúceho množstva metotrexátu. Pri druhej sérii pokusov bola izolovaná zmes nezávislých transformantov podlá expresie DHFR a táto zmes bola ďalej kultivovaná za podmienok, pri ktorých dochádza k amplifikácií cudzorodej DNA, tj. pri stúpajúcej koncentrácii metotrexátu. Potom boli izolované jednotlivé klony a analyzované na expresii GM-CSF. Klony, ktoré vykazovali najvyššiu úroveň expresie GM-CSF boli ďalej kultivované za podmienok, pri ktorých dochádza k amplifikácií cudzorodej DNA, tj. pri stúpajúcej koncentrácii metotrexátu v živom prostredí.

Pri jednom z pokusov bolo spojených sedem transformantov DHFR⁺ v prostredí a bez nukleosidov. Tieto bunky potom boli kultivované pri stúpajúcej koncentrácii MTX od 0,02 μπιοί cez 0,1 a 0,5 až do 2,0 μπιοί. Pri skúmaní na účinnosť GM-CSF pri použití buniek KG-1 bolo možno dokázať 3 000 až 12 000 jednotiek/ml. Tieto bunky boli potom klonované v 0,5 μπιοί MTX (klony 010, D2 a B6) boli postupne podrobené selekcii na rast v 2,0 μπιοί MTX. Pri zkúškach na účinnosť GM-CSF pri pokuse s bunkami KG-1 produkovali klonované bunkové línie 15 000 až 300 000 jednotiek/ml tejto účinnosti. GM-CSF, produkovaný bunkami pri uskutočnení spôsobu podlá tohoto príkladu má sled aminokyselín, uvedený pre CSF-Thr na obr. 1.

Príklad F

Expresia GM-CSF v E. coli

Expresia GM-CSF bola dosiahnutá v E. coli pri použití vektoru pTALC-195R, jedná sa o materiál, ktorý je znázornený na obr.

6. Sled, ktorý je kódom pre GM-CSF začína syntetickým sledom ATG CCA CCA CCT CCT TCT CCA TCT CCA TCT ACT, ktorý určuje počiatočných jedenásť zvyškov aminokyselín úplného GM-CSF. Zvyšok sledu, ktorý kódom pre GM-CSF v pTALC-185R je totožný so sledom v pCSF-1, nukleoidy 97 - 447, po čom prichádza sled TAR TAR TAG. Potom ihned nasleduje terminačný sled, pozostávajúci z troch častí a z naviazaného sledu p-UC-18. Do génu pre CSF bol včlenený gén pre odolnosť proti tetracyklínu z plazmidu pBR322 s orientáciou opačnou ako je orientácia génu pre CSF 100 bázou smerom dolu od sledu pUC-18. Gén pre odolnosť proti tetracyklínu nesie svoj vlastný promótor. Potom sa v smere opačnom ako je smer hodinových ručičiek nachádza gén pre β-laktamásu a potom sled z pUC-18 (CoLEl) pre začiatok replikácie.

Konečnou štruktúrou plazmidov pred návratom k sledu pre CSF je promótor PL. Tento promótor je v podstate popísaný v publikácií A. Skatzman a M. Rosenberg (v Molecular cloning, a laboratory manual (1982), Cold Spring Marbor Laboratory, str. 149). Expresia CSF je riadená promótorom PL po tepelnej indukcii vo vhodnom kmeni E. coli ako hostiteía.

Kmeňom použitým pre všetky tieto konštrukcie bol kmeň W3110 lacI°L8, popísaný v publikácii R. Brent a M.. Ptashne PNAs 78, 4204 - 4208, (1981) .

Fragment λ DNA ( Λ-nukleotidy 34499 až 38214) bol integrovaný do chromozómu W3110 lacI°L8 v mieste lacZ. Integrácia sa uskutočnila za použitia integračného vektora, zloženého zo sledov pBR322, nesúcich gény pre odolnosť proti chloramfenikolu a apmicilínu a taktiež začiatok pre replikáciu z pBR322, ako bolo popísané v publikácii F. Bolivara Gene 4, 121 - 136, (1978). Fragment /DNA sa včlení do génu lacZ, ktorý je sám v plazmide prítomný ako fragment, ktorý zasahuje od miesta BstEil v LacI k miestu Tthilll smerom dolu od lacZ.

í

Integrácia /DNA do p chromozomálnej kópie lacZ sa dosiahla homológnou rekombináciou a získali sa lac+, na ampicilín citlivé a proti chloramfenikolu odolné kolónie. K ďalšej rekombinácii, ktorá vedie ku odstráneniu všetkých prídavných sledov plazmidov pri ponechaní integrovaného fragmentu _λ DNA došlo na platniach MacConkeyho s obsahom laktózy. Počiatočný genotyp lac+, ampS, camR sa zmenil po druhej rekombinácii na fenotyp lac-, ampS, camS. Výsledný kmeň bol nazvaný GL400 a mal vlastnosti /R pri teplote

- 4α 30 ’C a JIS pri teplote 42 ’C. Tento fenotyp preukazuje existenciu funkčnej chromozomálnej kópie alelami CI⁸^^.

Kmeň GL400 bol prevedený na lon- transdukciou PL z lyzátu kmeňa SG20252 (las Δ. ul69. ara A 139 rpsl lon Δ 100 : TnlO). TnlO sa zistil pri testoch na Tet^s na selektívnych prostrediach, ako bolo popísané v publikácii S. Maloy, W. Nunn, J. Bacteriol. 145, 1110 - 1112, (1981) .

Výsledný hostitelský kmeň bol nazvaný GI413 (lacl°L8, LacZA. ( ÁCI, REX, N), 1ΟΠΔ 100).

pTALC-185R bol transformovaný na GI413. Kultúra tohoto kmeňa, ktorá vyrástla cez noc, bola kultivovaná pri teplote 30 C v 5 ml indukčného prostredia s obsahom 7 μς/ιηΐ tetracyklínu. Indukčné prostredie obsahuje v 1 litri g aminokyselín kazeínu 6 g Na₂HPO₄.7H₂O 3 g KH₂PO₄ 0,5 g NaCl 1 g NH₄C1 % glycerolu mg vitamínu Bj 2 mg CaCl₂.2H₂O 0,2 g MgCl₂.6H₂O ml tohoto prostredia s obsahom 7 μg/ml tetracyklínu sa naočkuje so 125 μΐ vyššie uvedenej kultúry a kultúra sa ďalej kultivuje na vodnom kúpeli pri teplote 30 °C ζει trepania tak dlho, pokým živné prostredie dosiahne optickú hustotu ‘0,5 pri ^Ä550' Potom sa prostredie rýchle prenesie do vodného kúpeía s teplotou 40 ’C a pretrepáva sa počas ďalších dvoch hodín pre dosiahnutie syntézy GM-CSF. Bunky sa oddelia a stanovuje sa obsah CSF v týchto bunkách elektroforézou na SDS polyakrylamidovom géle. Za týchto podmienok sa GM-CSF nahromadí tak, že tvorí približne 5 % bunečných bielkovín.

Príklad G

Expresia GM-CSF v Sacharomyces cerevisiae

A. Konštrukcia vektora

Bol skonštruovaný plazmid, ktorý obsahoval gén pre enzým pri biosyntéze uracilu (URA3) ako selekčný gén na začiatku replikácie 2u. Plazmid bol odvodený od Ylp5, ktorý bol popísaný v publikácii Botstein a kol., Gene 8, str. 17 - 24 (1979), pri pridaní fragmentu, obsahujúceho začiatok replikácie z plazmidu kvasiniek.

B. Izolácia génu pre glyceraldehydfosfát

Dehydrogenáza (GPDH)

Dva gény pre GPDH sa izolovali z kvasníc, ako bolo popísané v publikácii Holland a Holland, Journal of Biological Chemistry 255, 2596 - 2605 (1980). Vzorka oligonukleotidu, syntetizovaná z uverejneného sledu sa použila pre izoláciu génu pre GPDH zo zostavy plazmidov DNA genómu kvasníc za použitia štandardných spôsobov. Plazmid, ktorý obsahuje celý gén GAP491 bol už do zbierky uložený prv pod č. ATCC č. 30777.

C. Príprava promótora glyceraldehydfosfátdehydrogenázy pre expresiu heterologného génu

Bol skonštruovaný plazmid, v ktorom sa udržuje prirodzený odstup od promótora GPDH od začiatku požadovaného heterologného štrukturálneho génu. Tento ciel sa dosiahol tak, že bolo včlenené miesto pre pôsobenie enzýmu KpnI bezprostredne ku kodonu pre metionín na začiatku štrukturálneho génu pre GPDH. Táto oblasť bola potom včlenená do vektora pre expresiu YOpl kvasníc.

D. Izolácia génov pre faktor a

Gén pre faktor a (feromon) bol taktiež izolovaný z kvasníc a bol popísaný v publikácii Kurjan a Herskowitz Celí, 30., 933 - 943 (1982). Vzorka oligonukleotidu, syntetitovaná z tohoto sledu sa použila pre izoláciu génu zo zostavy plazmidov DNA genómu kvasníc známym spôsobom.

Príprava plazmidov pre expresiu CSF

Z vyššie uvedených zložiek a z ludského génu pre CSF sa bežným spôsobom skonštruoval vektor pre expresiu AJ14, znázornený na obr. 1. V tomto vektore bol odstánený prírodný vedúci sled CSF a bol včlenený sled, ktorý je kódom pre úplný CSF v bezprostrednej blízkosti sledu pre faktor a. Spojenie medzi promótorom GPDH, pre-pro sledom pre faktor a a sledom pre úplný CSF je znázornené ďalej a bolo potvrdené tak, že bol analyzovaný sled dideoxynukleotidu.

AAATAAACAAAATG.CGTTTTCCTTCA.....AAA AGA GAG GCG GAA

GCT.GCA CCC GCC CGC TCG ...

Claims (22)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Vektor zahrňujúci gén kódujúci bielkovinu GM-CSF primátov, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 1 za šípkou pre CSF-Thr, CSF-Ile alebo CSF-G alebo alelické alebo iné jeho funkčne ekvivalentné odchýlky, kde jedna alebo väčší počet aminokyselín je pridaných, nahradených alebo odstránených, bez podstatného vplyvu na aktivitu GM-CSF primátov pri stanovení v ludskej kostnej dreni.
2. 2. Vektor podľa nároku 1, kde gén kóduje bielkovinu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 1 za šípkou pre CSFThr alebo CSF-Ile alebo alelické ekvivalentné odchýlky podľa nároku 1.

   alebo iné jeho funkčne
3. 3. Vektor podľa nároku 1 alebo 2, kde funkčne ekvivalentné odchýlky GM-CSF primátov, keď sa vyčistia, majú aktivitu najmenej 1.10⁷ jednotiek na mg bielkoviny pri stanovení v ludskej kostnej dreni.
4. 4. Vektor podľa nárokov 1 alebo 2, kde gén kóduje bielkovinu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 1 za šípkou pre CSF-Thr.
5. 5. Vektor podlá nárokov 1 alebo 2, kde gén kóduje bielkovinu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 1 za šípkou pre CSF-Ile.
6. 6. Vektor podlá nároku 1, kde gén kóduje bielkovinu, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 1 za šípkou pre CSF-G.
7. 7. Vektor podľa nárokov 4, 5 alebo 6, kde aminokyselinová sekvencia bielkoviny, ktorá kóduje gén, dodatočne zahrňuje na svojom N-konci signálnu sekvenciu, ktorá predchádza šípke na obr. 1.
8. 8. Vektor podlá nároku 4, 5 alebo 6, kde aminokyselinová sekvencia bielkoviny, ktorá kóduje gén, dodatočne zahrňuje na svojom N-konci metionínový zvyšok.
9. 9. Vektor podlá nároku 1, kde gén zahrňuje sekvenciu uvedenú na obr. 1 pre CSF-Thr alebo CSF-Ile začínajúcu za šípkou a končiacu na kodóne zodpovedajúcom aminokyseline v polohe 127.
10. 10. Vektor podlá nároku 1, kde gén kóduje DNA plazmidu p91023(B), ktorý je deponovaný pod číslom ATCC 39754.
11. 11. Plazmid p91023(B), ktorý je deponovaný pod číslom ATCC 39754.

    12. Hostiteľská bunka, ktorá je transformovaná vektorom podľa niektorého z nárokov 1 až 11. 13. Hostitelská bunka, ktorá je transformovaná vektorom podľa niektorého z nárokov 2, 3, 4, 5 a 9 až 11. 14. Hostitelská bunka podľa nároku 12 alebo 13, ktorá je

    prokaryotická.
12. 15. Hostitelská bunka podlá nároku 14, ktorou je Escherichia coli.
13. 16. Hostitelská bunka podlá nároku 12 alebo 13, ktorá je eukaryotická.
14. 17. Hostitelská bunka podlá nároku 16, ktorou je bunka kvasinková bunka.
15. 18. Hostiteľská bunka podlá nároku 16, ktorou je bunka cicavca.
16. 19. Hostiteľská bunka podľa nároku 18, ktorou je bunka vaječníka čínskeho škrečka.
17. 20. Spôsob výroby bielkoviny GM-CSF primátov, vyznačujúci sa tým, že sa kultivuje bunka podľa niektorého z nárokov 12 až 19 a izoluje sa bielkovina GM-CSF.
18. 21. Spôsob výroby bielkoviny GM-CSF primátov podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že sa kultivuje bunka podľa nároku 13 alebo niektorého z nárokov 14 až 19, ktoré sú závislé na nároku 13 a izoluje sa bielkovina GM-CSF.
19. 22. Bielkovina GM-CSF primátov, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 1 pre CSF-Ile, začínajúcu za šípkou.
20. 23. cDNA, ktorá zodpovedá génu uvedenému v niektorom z nárokov 1 až 10.
21. 24. cDNA, ktorá zodpovedá génu uvedenému v niektorom z nárokov 2, 3, 4, 5, 9 a 10.
22. 25. cDNA plazmidu p91023(B), ktorý je deponovaný pod číslom ATCC