DE69131112T2

DE69131112T2 - Verbesserung der Ausscheidung von Proteinen

Info

Publication number: DE69131112T2
Application number: DE69131112T
Authority: DE
Inventors: Sierd Nl-9752 Jl Haren Bron; Wilhelmus Johannes Nl-2243 Vb Voorschoten Quax; Hilde E. Nl-9713 Ad Groningen Smith; Jan Maarten Nl-9715 Ak Groningen Van Dijl
Original assignee: DSM NV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1990-02-28
Filing date: 1991-02-28
Publication date: 1999-08-12
Anticipated expiration: 2011-03-01
Also published as: DE69131112D1; FI910975A; ATE178944T1; FI910975A0; WO1991013154A1; EP0444759A1; DK0444759T3; EP0444759B1; PT96913A; FI110007B; JP3124289B2; US5246838A; PT96913B; JPH05500456A; IE910663A1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft die mikrobiologische Herstellung von Proteinen. Insbesondere betrifft die Erfindung Enzyme, die bei der Prozessierung von Proteinen beteiligt sind, sowie Verfahren zur Gewinnung der für diese Enzyme kodierenden Gene. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Züchtung von Organismen, in denen diese Gene überexprimiert sind. Insbesondere betrifft die Erfindung die Prozessierung von exportierten Proteinen. Ganz besonders betrifft die Erfindung das Klonieren und die Expression von Signalpeptidasen.

Hintergrund der Erfindung

Bisher erfolgt die Bildung der Mehrzahl von rekombinanten Proteinen intrazellulär in E. coli. Um das Produkt in einer verwendbaren Form zu erhalten, muß man zunächst die Zellen aufbrechen und anschließend eine aufwendige Reinigung durchführen.
Die Reinigung kann stark vereinfacht werden, indem man eine Wirt/Gen-Kombination verwendet, die zur Sekretion des exprimierten Proteinprodukts führt. E. coli war häufig der Mikroorganismus der Wahl. Da man nicht viele Proteine kennt, die in natürlicher Weise durch gram-negative Bakterien sezerniert werden, besteht eine Tendenz darin, allmählich gram-positive Bakterien, wie Bacilli, bei der Herstellung von Fremdproteinen einzusetzen.
Die Expressionsgrade von zu sezernierenden gebundenen Proteinen, die aus gram-positiven Bakterien stammen, sind sowohl in homologen als auch in nicht-homologen gram-positiven Wirten häufig zufriedenstellend, wobei sie etwa 0,5-1 g/Liter Protein ergeben. Jedoch sind die Ausbeuten in gram-positiven Wirten bei der Expression von Sekretions- oder Exportproteinen gram-negativen bakteriellen oder eukaryontischen Ursprungs erheblich niedriger (Palva, 1989). Verschiedene Erklärungsversuche wurden für diese Erscheinung unternommen. Man hat versucht, die Ausbeuten an Fremdproteinen zu steigern.
Als Hauptgrund für die niedrigen Ausbeuten nimmt man eine extrazelluläre Proteolyse der Expressionsprodukte an. Es wurden daher erhebliche Anstrengungen zur Konstruktion von protease-negativen Wirten unternommen (Kawamura und Doi, 1984; Fahnestock und Fisher 1987; Sloma et al., 1988), wobei aber die Sekretionsschwierigkeiten teilweise bestehen blieben.
Eine weitere Erklärung für die niederen Ausbeuten bei der Expression von Fremdproteinen liegt möglicherweise in einer geschwindigkeitsbegrenzenden Stufe bei der intrazellulären Prozessierung. Die Wirkung einer derartigen geschwindigkeitsbeschränkenden Stufe ist ausgeprägter, wenn das Fremdprotein überexprimiert wird. Im allgemeinen werden entweder homologe oder heterologe Gene in die Wirtszelle an eine hohe Kopienzahl klonierende Träger eingeführt oder in das Genom integriert. Ein starker Promotor wird stromaufwärts vom Gen geklont oder das Gen wird stromabwärts von einem starken Promotor integriert. Die Einführung eines derartigen Konstrukts kann zu einer schweren Belastung des Translations- oder Sekretionsapparats der Zellen führen. Mögliche geschwindigkeitsbegrenzende Stufen sind beispielsweise die Transkription, die Translation, der intrazelluläre Transport, die Translokation und schließlich die tatsächliche Freisetzung in das Kulturmedium. Die Translokation und die tatsächliche Freisetzung in das Medium sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Eine wichtige Rolle beim Membrantransport von Proteinen spielen spezifische Sequenzen im Protein.
Zahlreiche sezernierte und membrangebundene Proteine werden in einer Vorläuferform synthetisiert. Dieser Vorläufer enthält eine N-terminale Addition von 15-30 Aminosäuren, das Signal- oder Leader-Peptid. Es besteht eine große Variabilität bezüglich der Länge und der Sequenz dieser Peptide. Jedoch gibt es einige allgemeine strukturelle Eigenschaften, die erfüllt werden müssen, daß diese Peptide ihre Funktion korrekt erfüllen. Signalpeptide weisen eine basische aminoterminale Region auf, der sich ein zentraler hydrophober Kern anschließt, der die Membran spannen kann. Am C-Terminus befindet sich üblicherweise eine kleine, ungeladene Aminosäure.
Der Großteil der gegenwärtigen Kenntnisse über Signalpeptidasen (SPasen) in prokaryontischen Systemen wurde aus Untersuchungen in E. coli abgeleitet. In diesem Organismus lassen sich mindestens zwei unterschiedliche SPasen unterscheiden. SPase I (im vorliegenden Text ein Synonym für die Leader-Peptidase) ist zur Prozessierung des Großteils der Proteine befähigt. Bemerkenswerte Ausnahmen sind mit Glycerid modifizierte Lipoproteine (Tokunaga et al., 1982), die durch SPase II, die auch als Prolipoprotein-Signalpeptidase bekannt ist, prozessiert werden (Tokunaga et al., 1982; Yamada et al., 1984; Yamagata et al., 1982).
Die Isolierung und Klonierung des E. coli-SPase I (lep)-Gens wird von Date und Wickner (1981) beschrieben. Aliquotanteile von Zellysaten aus individuellen Kolonien einer vollständigen genomischen E. coli-DNA- Bank in ColE1-Plasmiden wurden auf ihre Fähigkeit zur posttranslationalen Umwandlung von M13-Vorbeschichtungsprotein in Beschichtungsprotein untersucht. Dabei konnte ein Stamm nachgewiesen werden, der eine Überproduktion von SPase I zeigte. Das Wachstumsverhalten dieses Stammes (7-47) war mit dem von anderen Stämmen in der Sammlung vergleichbar. Restriktionsfragmente von pLC7-47 wurden in pBR322 rekloniert. Eine 30-fache Steigerung der SPase I-Konzentration wurde nach der Transformation der Plasmide in E. coli in einem der Stämme nachgewiesen. Bei Infektion dieses überproduzierenden E. coli-Stammes mit M13 konnte eine Steigerung der Transformation des Vorbeschichtungsproteins (Vorstufe) zum Beschichtungsprotein (integrales Transmembranprotein) nachgewiesen werden. Eine Wirkung auf periplasmatische oder sezernierte Proteine wurde nicht beschrieben.
Die Sequenz des für SPase I kodierenden Gens (lep) aus E. coli wurde von Wolfe et al. (1983) bestimmt. Diese Autoren stellten auch fest, daß sich dieses Protein weitgehend in der inneren Membran befindet.
Dalbey und Wickner (1985) klonierten und exprimierten das E. colilep-Gen unter der Kontrolle des Arabinose-Promotors und konnten keinerlei Einfluß auf die Proteintranslokation bei der Expression des lep-Gens feststellen. Bei Repression der SPase I-Synthese stellten sie fest, daß eine Spaltung der Signalsequenz wesentlich für die Freisetzung der Proteine aus der Membran war.
Die Wirkung der Überproduktion der in den vorstehenden Literaturstellen beschriebenen SPase I wurde nur am vollständigen M13-Transmembranprotein bestimmt. Die Wirkung auf äußere Membran- oder exportierte Proteine wurde nicht beschrieben. Die Wirkung der Überproduktion von klonierter SPase I auf ein periplasmatisches (TEM-beta-Lactamase) und ein äußeres Membranprotein (PhoE) wurde von Anba et al. (1986) beschrieben. Sie zeigten, daß die Überproduktion zu keinerlei Anstieg der Prozessierungsgeschwindigkeiten für eines der vorerwähnten Proteine führte, woraus sie den Schluß zogen, daß die SPase I nicht die geschwindigkeitsbestimmende Komponente bei den in Frage stehenden Vorläufern und unter den Bedingungen, die angewandt wurden, darstellte.
In sämtlichen vorerwähnten Druckschriften wurde der Einfluß der SPase I-Überproduktion auf homologe Proteine mit ihren natürlichen Si gnalsequenzen untersucht. Ferner wurde bisher die Klonierung und Expression des lep-Gens nur an einer Spezies, d. h. E. coli, beschrieben.
Im Hinblick auf die vorstehend beschriebenen Vorteile in bezug auf die Verwendung der gram-positiven Bakterien bei der Herstellung von rekombinanten Proteinen könnte es sehr wertvoll sein, Signalpeptidase-Gene von anderen Spezies als E. coli, insbesondere aus gram-positiven Bakterien, zu klonieren und zu überexprimieren. Obgleich erwartet werden kann, daß die Homologie zwischen für Signalpeptidase kodierenden Genen aus gram-positiven und gram-negativen Bakterien für eine Kreuzhybridisierung ausreichen könnte, berichteten Lampen et al. (1986), daß sie bei Hybridisierung des E. coli-lep-Gens mit genomischer DNA aus Bacilli und Staphylococcus aureus in Southern-Blotting-Experimenten keine reproduzierbaren Signale erhalten konnten.
Wie vorstehend erwähnt, läßt es sich erwarten, daß der Prozessierungswirkungsgrad zu einer geschwindigkeitsbestimmenden Stufe bei der Sekretion von überproduzierten Proteinen werden kann. Palva (1989) wies darauf hin, daß es von Interesse wäre, zu testen, ob das Klonieren eines Signalpeptidase-Gens oder einer anderen Komponente der Translokationsmaschinerie die Produktionsausbeute weiter steigern kann. Jedoch wurden keine Vorschläge gemacht, wie dies durchzuführen wäre.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beschreibt erstmals eine für eine Signalpeptidase kodierende DNA-Sequenz, die aus einem gram-positiven Bakterium erhalten worden ist. Insbesondere werden die DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz der Signalpeptidase von Bacillus subtilis beschrieben.
Die vorliegende Erfindung zeigt ferner, daß diese Sequenz dazu verwendet werden kann, die für die Signalpeptidase aus anderen gram-positiven Spezies kodierenden Gene durch Hybridisierung zu selektieren.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ferner ein Verfahren zur Isolierung von für Signalpeptidase kodierenden Genen sowohl aus gram-positiven als auch aus gram-negativen Bakterien. Dieses Verfahren umfaßt die Verwendung von speziell entwickelten Signalpeptidase-Sondenvektoren. Derartige Vektoren können zur Identifizierung eines Gens, das für eine homologe oder eine heterologe Signalpeptidase kodiert, verwendet werden, vorzugsweise sowohl in gram-negativen als auch in gram-positiven Bakterien.
Gemäß einem weiteren Aspekt werden Expressionsvektoren für die klonierte Signalpeptidase beschrieben.
Gemäß einem weiteren Aspekt wird das klonierte, für Signalpeptidase kodierende Gen in einem mikrobiellen Wirt überexprimiert. Der Wirt kann zur Signalpeptidase sowohl homolog als auch heterolog sein. Es kann sich sowohl um ein gram-negatives als auch um ein gram-positives Bakterium handeln.
Gemäß einem weiteren Aspekt zeigt die Erfindung, daß eine Coexpression des Signalpeptidase-Gens mit dem Gen für ein periplasmatisches oder sezerniertes Protein zu einem starken Anstieg der Prozessierungsgeschwindigkeit des Expressionsprodukts eines heterologen oder homologen Gens führt.
Gemäß einem weiteren Aspekt zeigt die vorliegende Erfindung, daß einige normalerweise unprozessierte Genprodukte durch einen Anstieg der Menge der Signalpeptidase prozessiert werden können.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ferner ein Verfahren zur Erhöhung der Prozessierungsgeschwindigkeit von einigen unprozessierten oder unter Schwierigkeiten prozessierten Proteinen durch Mutagenese des für Signalpeptidase kodierenden Gens. Es wird sowohl eine willkürliche als auch eine positionsgerichtete Mutagenese beschrieben.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 zeigt die Konstruktion von pGD40. Relevante Restriktionsstellen sind angegeben. pGD40 wurde durch Ersatz des 44 bp PstI-BamHI-Fragments aus pBS61-pL durch ein 1,1 kb-PstI-BamHI-Fragment aus pBR322 konstruiert. Tc' und bla' stellen eine 5'-Deletion des Tetracyclin-Resistenzgens bzw. eine 3'-Deletion des β-Lactamase-Gens dar. Das Tetracyclin-Resistenzgen ist in pGD40 wieder hergestellt.
Fig. 2 zeigt das Wachstum von transformiertem E. coli-N4156::pGD28 bei 28ºC. Die Lebensfähigkeit von 50 Transformanten jeder Klasse, die bei 28ºC erhalten wurden, wurde durch Übertragung auf frische Platten und Inkubation bei 28ºC getestet. Der prozentuale Anteil von Zahnstochermaßnahmen an frischen Platten, die sich zu Kolonien entwickelten, wurde als eine Funktion der Inkubationszeit ermittelt. (o): pGD40; ( ): pGDL05 oder pGDL06.
Fig. 3A ist eine schematische Darstellung des E. coli-lep-Operons. Relevante Restriktionsstellen sind angegeben (March und Inouye 1985; March et al.; 1985, Wolfe et al., 1983).
Fig. 3B zeigt die Restriktionskarten der 1,3 kb-E. coli- und S. thyphimurium-PstI-Fragmente, die für SPaseI kodieren.
Fig. 4: Southern-Hybridisierung eines [³²P]-markierten 931 bp-BglII- EcoRI-Fragments des E. coli-lep-Operons mit PstI-gespaltener chromosoma- ler DNA von S. thyphimurium (Bahn 1). Die Bahnen 2 und 3 zeigen die Hybridisierung der gleichen Sonde mit PstI-gespaltenem pUC9, das die ausgewählten 1,3- bzw. 1,0 kb-S. thyphimurium-DNA-Fragmente trägt.
Fig. 5 zeigt die in vitro-Transkriptions/Translationsprodukte, die dirigiert werden durch pUC9 (Bahn 1), pUC9, das das 1,3 kb-PstI-Fragment von S. thyphimurium trägt (Bahn 2), und pTD142 (Bahn 3). P und M geben die Positionen der Pre-β-lactamase bzw. des reifen Enzyms wieder.
Fig. 6 zeigt die Prozessierung von E. coli-TEM-β-Lactamase. Die Herstellung von Kulturen, die "pulse-chase"-Markierung und die Analyse der 15 sec nach dem "Chase" entnommenen Proben erfolgten gemäß den Angaben im experimentellen Teil. Die angegebenen Prozessierungsprodukte stammen von pGD40 (Bahn 1), pGDL06 (Bahn 2), pGDL05 (Bahn 3), pGDLl2 (Bahn 4), pGDL11 (Bahn 5) und pGDA2 (Bahn 6) P und M geben die Positionen der Pre-β-lactamase bzw. des reifen Enzyms wieder. P' und M' geben die Positionen des Vorläufers der geschnittenen β-Lactamase bzw. ihres reifen Produkts wieder.
Fig. 7 zeigt die Kinetik der Prozessierung von pre(A2)- und pre(A2d)-α-Amylase in B. subtilis (Bs) und E. coli (Eco) gemäß Bestimmung durch "pulse-chase"-Markierung. B. subtilis 8G5- (für α-Amylasen), B. subtilis DB114- (für β-Lactamasen) und E. coli C600-Kulturen, die die verschiedenen Plasmide enthielten, wurden bei 37ºC in 57-Medium bzw. M9- Medium bis zur logarithmischen Phase gezüchtet. Man setzte die Zellen etwa 30-45 min bei 37ºC einem Methioninmangel aus. Die Proteine wurden durch Inkubation der Kulturen mit [³&sup5;S]-Methionin für 30 Sekunden bei der gleichen Temperatur oder bei 25ºC im Fall von pre(A2)-α-Amylase und pre(A2)-β-Lactamase in B. subtilis markiert. Unmittelbar nach dem Impuls wurde ein weiterer Einbau von Radioaktivität durch Zugabe von überschüssigem nicht-radioaktivem Methionin (Chase) verhindert. Anschließend wurden Proben nach verschiedenen Zeiträumen entnommen. Die relativen Mengen des Vorläufers und des reifen Proteins in jeder Probe wurden durch densitometrisches Abtasten von Autoradiogrammen nach Immunopräzipitation und Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid (PAA)-Gelelektrophorese bestimmt.
Fig. 8 zeigt die Kinetik der Prozessierung von pre(A2)- und pre(A2d)-β-Lactamase in B. subtilis 8G5 oder DB114 (Bs) und E. coli C600 (Ec). Die Proben wurden durch "pulse-chase"-Markierung gemäß den vorstehenden Angaben (Fig. 7) analysiert.
Fig. 9 zeigt die Kinetik der Prozessierung von pre(A13)- und pre(A13i)-α-Amylase in B. subtilis 8G5 oder DB114 (Bs) und E. coli C600 (Ec). Die Proben wurden durch "pulse-chase"-Markierung gemäß den vorstehenden Angaben (Fig. 7) analysiert.
Fig. 10 zeigt die Kinetik der Prozessierung von pre(A13)- und pre(A13i)-β-Lactamase in B. subtilis 8G5 oder DB114 (Bs) und E. coli C600 (Ec). Die Proben wurden durch "pulse-chase"-Markierung gemäß den vorstehenden Angaben (Fig. 7) analysiert.
Fig. 11 zeigt ein Western-Blot von SPase I. E. coli C600 wurde nach Transformation mit pBS61ΔpL oder pGDL2 in M9-Minimalmedium gezüchtet. Exponentiell wachsende Zellen wurden in Puffer mit einem Gehalt an 0,1 M Kaliumphosphat (pH-Wert = 7,2) und 0,2 mg Lysozym/ml lysiert. Ähnliche Mengen (0,02 mg Gesamtprotein) wurden der SDS-PAA-Gelelektrophorese unterworfen. SPase I wurde mit spezifischen Antiseren nachgewiesen: Bahn 1, E. coli C600 (pBS61ΔpL); Bahn 2, E. coli C600 (pGDL2); Bahn 3, Referenz- SPase I.
Fig. 12 zeigt die Prozessierung von Wildtyp-TEM-β-Lactamase durch E. coli C600 (pGB25, pBS61ΔpL) (A) und E. coli C600 (pGB25, pGDL2) (B). Die "pulse-chase"-Markierung wurde bei 25ºC durchgeführt. Die anschließende Immunopräzipitation, die SDS-PAA-Gelelektrophorese und die Fluorographie wurden gemäß den Angaben unter Methoden durchgeführt. Zellen wurden 30 sec markiert. Proben wurden nach dem "Chase" (t = 0) zu den angegebenen Zeitpunkten entnommen. Die Kinetik der Prozessierung wurde als prozentualer Anteil des gesamten β-Lactamase-Proteins (Vorläufer + reifes Protein), das zum Zeitpunkt der Probennahme noch in der Vorläuferform vorhanden ist, aufgetragen. (C): ( ) E. coli C600 (pGB25, pBS61ΔpL); (o) E. coli C600 (pGB25, pGDL2). p, Vorläufer; m, reifes Protein.
Fig. 13 zeigt die Prozessierung von pre(A2)-β-Lactamase durch E. coli C600 (pSPB-A2, pBS61ΔpL) (A) und E. coli C600 (pSPB-A2, pGDL2) (B). Die Analyse erfolgte gemäß den Angaben zu Fig. 12. Zellen wurden 50 sec markiert. (C): ( ) E. coli C600 (pSPB-A2, pBS61ΔpL); (o) E. coli C600 (pSPB-A2, pGDL2).
Fig. 14 zeigt die Prozessierung von pre(A42)-β-Lactamase durch E. coli C600 (pSPB-A42, pBS61ΔpL) (A) und E. coli C600 (pSPB-A42, pGDL2) (B). Die Analyse erfolgte gemäß den Angaben zu Fig. 10. Jedoch wurde die Markierung bei 37ºC durchgeführt. (C): ( ) E. coli.C600 (pSPB-A42, pBS61ΔpL); (o) E. coli C600 (pSPB-A42, pGDL2).
Fig. 15 zeigt die Prozessierung von pre(A2d)-β-Lactamase durch E. coli C600 (pSPB-A2d, pBS61ΔpL) (A) und E. coli C600 (pSPB-A2d, pGDL2) (B). Die Analyse erfolgte gemäß den Angaben zu Fig. 11. (C): ( ) E. coli C600 (pSPB-A2d, pBS61ΔpL); (o) E. coli C600 (pSPB-A2d, pGDL2).
Fig. 16 zeigt die Prozessierung von pre(A13i)-β-Lactamase durch E. coli C600 (pSPB-A13i, pBS61ΔpL) (A) und E. coli C600 (pSPB-A13i, pGDL2) (B). Die Analyse erfolgte gemäß den Angaben zu Fig. 12. (C): ( ) E. coli C600 (pSPB-A13i, pBS61ΔpL); (o) E. coli C600 (pSPB-Al3i, pGDL2).
Fig. 17 zeigt eine Ausrichtung der Aminosäuresequenzen von B. subtilis- und E. coli-SPase.
Fig. 18 zeigt eine photographische Aufnahme eines Southern-Hybridisierungs-Blottings, wobei ein internes Fragment des Leader-Peptidase-Gens von B. subtilis als eine Sonde verwendet wird. Die folgenden chromosomalen DNAs wurden nach Verdauung mit A: PStI und B: EcoRI verwendet:
Bahn 1 Bacillus subtilis, Bahn 2 Bacillus licheniformis, Bahn 3 Bacillus amyloliquefaciens, Bahn 4 Bacillus alcalophilus.
Fig. 19 zeigt eine schematische Darstellung von pGDL40, pGDL41 und pGDL42. Nur die für die Konstruktion und die Eigenschaften der Plasmide relevanten Restriktionsstellen sind angegeben. Beim Plasmid pGDL41 handelt es sich um ein Derivat von pGDL40 mit einem Gehalt an einem selektierbaren Marker (Kmr) für B. subtilis. pGDL41 und pGDL42 wurden konstruiert, indem man das 0,3 kb-EcoRI-Fragment mit einem Gehalt an dem SP02- Promotor von pGDL40 bzw. pSBA13i durch ein 1,4 kb-EcoRI-Fragment von pKM1 (Kiel et al., 1987) mit einem Gehalt an einem Streptococcus faecalis Kmr- Gen ersetzte.
Fig. 20 zeigt eine "pulse-chase"-Analyse der Prozessierung von pre(A13i)-β-Lactamase. Die Prozessierung der pre(A13i)-β-Lactamase durch B. subtilis DB104 (pGDL41) (A, C und E) und durch B. subtilis DB104 (pGDL42) (B, D und E) wurde durch "pulse-chase"-Markierung bei 37ºC und durch anschließende Immunopräzipitation, SDS-PAA-Gelelektrophorese und Fluorographie analysiert. A und B: Zellen aus vier separaten Kulturen von B. subtilis DB104 (pGDL41) (Bahnen 1-4) bzw. B. subtilis DB104 (pGDL42) (Bahnen 5-8) wurden 1 min markiert. Proben wurden sofort nach dem "Chase" (t = 0) entnommen. C und D: Zellen von B. subtilis DB104 (pGDL41) (C) und B. subtilis DB104 (pGDL42) (D) wurden 1 min markiert. Proben wurden zu den angegebenen Zeitpunkten entnommen. Die Kinetik der Prozessierung wurde als prozentualer Anteil des gesamten (A13i)-β-Lactamase-Proteins (Vorläufer + reifes Protein), das im Vorläufer zum Zeitpunkt der Probennahme noch vorhanden ist, aufgetragen. E: (o) B. subtilis DB104 (pGDL41): ( ) B. subtilis DB104 (pGDL42). p, Vorläufer; m, reifes Protein.
Fig. 21 zeigt eine Ausrichtung der Aminosäuresequenzen von B. subtilis-, E. coli- und Salmonella typhimurium-SPase I, dem SEC11-Protein von Saccharornyces cerevisiae und dem Hunde-21K-Protein. Die erhaltenen Asp- und Ser-Reste sind gekennzeichnet (*).

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Den meisten Proteinen, die von Mikroorganismen sezerniert werden, geht eine hydrophobe Sequenz voraus, die die Integration des Proteins in die Zellmembran erleichtert. In Eukaryonten werden ähnliche Sequenzen zum Transport von Proteinen über die Membran des endoplasmatischen Retikulums gefunden. Diese Sequenzen werden als Signalpeptide bezeichnet. Die Integration dieser Signalpeptide in die Membran ist eine Voraussetzung für den Export dieser Proteine. Aufgrund ihrer hydrophoben Natur stehen die Signalpeptide in der Membran als eine Art von Anker. Das Protein wird gewissermaßen durch die Membran "gezogen", ist aber aufgrund des Signalpeptids in der Membran verankert. Um das Protein in das Medium (oder Periplasma) freizusetzen, ist ein proteolytisches Enzym erforderlich, um das Protein unmittelbar nach dem Signalpeptid zu spalten. Bei diesen proteolytischen Enzymen handelt es sich um die Signalpeptidasen. Signalpeptidasen sind Gegenstand der Erfindung.
Für eine Signalpeptidase kodierende DNA kann im Prinzip aus sämtlichen Mikroorganismen isoliert werden, die zur Sekretion von Proteinen über den vorstehend beschriebenen Mechanismus unter Beteiligung eines Signalpeptids befähigt sind. Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren lassen sich sowohl mit gram-positiven als auch gram-negativen Bakterien als DNA-Donatoren anwenden. Vorzugsweise werden gram-positive Mikroorganismen verwendet. Insbesondere werden Bacilli verwendet.
Es können verschiedene Wege für die Isolierung eines Gens, das für eine Signalpeptidase kodiert, herangezogen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die DNA eines Wirtsorganismus auf solche Weise rekombiniert, daß das chromosomale Signalpeptidase-Gen unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gebracht wird. Es können verschiedene regulierbare Promotoren verwendet werden. Beispielsweise kann es sich um einen durch einen Zucker induzierbaren oder um einen temperaturempfindli chen Promotor handeln. In einer der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird der lambda-Phagen-PL-Promotor verwendet.
Der Promotor der Wahl wird an einen Vektor geklont, der eine oder mehrere Sequenzen enthält, die mit Sequenzen, die das chromosomale Signalpeptidase-Gen umgeben, homolog sind, so daß dieser Vektor integriert werden kann. Die Integration wird beispielsweise durch homologe Rekombination so durchgeführt, daß letztlich der induzierbare Promotor in funktioneller Weise mit dem Signalpeptidase-Gen verknüpft wird. Im reprimierten Zustand ist der Stamm nicht zum Wachstum befähigt, wobei jedoch das Wachstum wieder hergestellt wird, wenn ein funktionelles Leader-Peptidase-Gen eingeführt wird. Die Einführung des lep-Gens kann mit einem Leader-Peptidase-Sondenvektor durchgeführt werden. Als ein derartiger Vektor wurde pGD40 speziell konstruiert.
Nach dem Klonieren von willkürlichen DNA-Fragmenten eines Donator- Mikroorganismus in einen Signalpeptidase-Sondenvektor und nach der anschließenden Transformation des mutierten Wirtsmikroorganismus wird festgestellt, daß bei einigen Klonen die Protein-Prozessierungsaktivität wieder hergestellt und die Wachstumshemmung unterdrückt worden ist. Diese Klone enthalten ein aktives Leader-Peptidase-Gen, das das mutierte Wirtsorganismusgen komplementiert (Van Dijl et al., 1988 und 1990).
Das beschriebene Verfahren zur Selektion eines Signalpeptidase-Gens kann in jeder Kombination von Wirt und Gen verwendet werden, vorausgesetzt, daß das klonierte Signalpeptidase-Gen im eingesetzten Wirtsorganismus aktiv ist. Die Erfindung wird durch E. coli als Wirt und S. typhimurium als eine DNA-Donatorspezies beispielhaft dargestellt. Weitere bevorzugte Donatoren, die hier ebenfalls als Beispiele aufgeführt werden, sind Bacilli.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Reportergen hinter einer DNA-Sequenz kloniert, die für ein Signalpeptid kodiert, das den Exportwirkungsgrad des durch das Reportergen kodierten Proteins stark verringert. Dieses Konstrukt wird in einen Expressionsvektor inseriert. Der Vektor wird in eine Wirtszelle gebracht. Der Vektor kann selbst-replizierend oder integrierend sein. Beim Reportergen kann es sich um ein beliebiges Gen handeln, für das ein Test verfügbar ist oder entwickelt werden kann. Ein geeigneter Test steht für α-Amylase zur Verfügung. Erfindungsgemäß ist auch ein Halo-Test für β-Lactamase entwickelt worden. Als Signalpeptide werden A2, A13 und A42 (beschrieben in EP-244042) und deren Derivate A2d, A13i und A42d verwendet. Diese Signalsequenzen wurden ursprünglich willkürlich aus dem Bacillus subtilis-Chromosom auf der Grundlage ihrer günstigen Exporteigenschaften ausgewählt. Die Derivate enthalten entweder eine Deletion (d) oder eine Insertion (i), die in starkem Maße ihre Prozessierungseigenschaften in E. coli und/oder in B. subtilis beeinflussen. Die Verwendung dieser und ähnlicher Konstrukte ermöglicht nicht nur den Nachweis von klonierten Signalpeptidasen, sondern erlaubt auch eine ausführliche Untersuchung der Einflüsse der Überexpression von klonierten lep-Genen in unterschiedlichen Wirtspezies.
Anschließend wird eine Genombank hergestellt. Wirtszellen werden mit Expressionsvektoren, die jeweils ein Fragment der Genom-DNA enthalten, transformiert. Das Reportergen kann an einem unterschiedlichen oder am gleichen Vektor kloniert werden. Ein Klon, der bei einem Plattentest eine Halo-Bildung zeigt, enthält ein aktives lep-Gen, da die SPase, die gebildet wird, die Prozessierungswirkung des Reporterproteins wieder herstellt. Ansonsten käme es nicht zur Halo-Bildung. Voraussetzung ist, daß der Exportmangel des Reporterproteins auf dem SPase I-Niveau liegt. Für einen Fachmann ist es ersichtlich, daß die beschriebenen oder ähnliche Vektoren auch zur Bildung anderer DNA-Elemente, die für einen limitierenden Faktor für eine Protein-Prozessierungsaktivität kodieren, verwendet werden können (und auch gleichzeitig verwendet werden). Diesbezüglich kann man beispielsweise an Proteine denken, die funktionell gleichwertig mit E. coli-secA, secB, secY, secD, secF und secE sind (Bieker und Silhavy, 1990).
Dieses Verfahren wird erfindungsgemäß zur Bildung des Signalpeptidase-Gens eines gram-positiven Bakteriums verwendet. Ein hier gegebenes Beispiel ist die Klonierung des Signalpeptidase-Gens aus B. subtilis.
Ein weiterer Weg zur Bildung eines Signalpeptidase-Gens ist ebenfalls möglich. Eine Signalpeptidase (Protein) läßt sich isolieren und Nterminal sequenzieren. Aus dieser Sequenz kann die degenerierte Basensequenz abgeleitet werden. Eine Sonde läßt sich gegen diese Sequenz synthetisieren und zum Nachweis eines Klons in einer DNA-Bank, die das Genom des entsprechenden Mikroorganismus enthält, verwenden. Die Sequenz läßt sich bestimmen. Die DNA läßt sich in einem Expressionsvektor klonieren.
Ferner ist es möglich, ein lep-Gen unter Verwendung eines bekannten lep-Gens als Sonde zu bilden. Beispielsweise wurden Sonden, die vom B. subtilis-lepBS-Gen abgeleitet wurden, zum Nachweis der für das lep-Gen aus anderen gram-positiven Bakterien kodierenden DNA verwendet.
Die Klonierung der Signalpeptidase-DNA läßt sich unter Verwendung eines Expressionsvektors der Wahl (Plasmid, Cosmid, Bacteriophage, Virus) durchführen. Bei positiven Klonen handelt es sich um Klone mit wieder hergestelltem Wachstum. Es ist möglich, aus diesen Klonen das Gen zu isolieren und zu charakterisieren. Das Gen läßt sich isolieren und in einem geeigneten Wirt reklonieren. Zu geeigneten Wirten gehören sämtliche Wirte, in denen die klonierten SPasen funktionell sind. Dieser Wirt kann mit dem lep-Gen homolog oder heterolog sein. Beispiele für geeignete Wirte, die sich zur Durchführung der vorliegenden Erfindung eignen, sind Salmonella, E. coli und Bacilli. Es ist offensichtlich, daß im Prinzip jeder Wirt, der mit dem klonierten lep-Gen verträglich ist, verwendet werden kann.
Der das klonierte Gen enthaltende Vektor kann in die Zelle gebracht werden, beispielsweise durch Transformation. Es ist möglich, einen selbst-replizierenden Vektor zu verwenden. Ferner ist es möglich, den Vektor in das Genom zu integrieren.
Das klonierte Signalpeptidase-Gen kann überexprimiert werden, was zu einem Anstieg der Prozessierungsgeschwindigkeit von solchen Proteinen mit einem Gehalt an dem Signalpeptid führt, deren Prozessierungsgeschwindigkeit auf dem Niveau der Signalpeptidase begrenzt ist. Diese Proteine können konstitutiv im Wirt exprimiert werden. Ferner ist es möglich, heterologe Proteine im Wirtsorganismus zu klonieren. Diese heterologen Proteine lassen sich in das Genom oder in ein geeignetes Klonierungsvehikel inserieren. Beschränkungen der Prozessierungsgeschwindigkeit lassen sich beispielsweise feststellen, wenn
a) die Menge der Signalpeptidase limitierend wird; dies kann erfolgen, wenn homologe oder heterologe Proteine überexprimiert werden, insbesondere wenn es um eine Produktion auf hohem Niveau geht;
b) die Aminosäuresequenz um die Signalpeptid-Spleißstelle nicht optimal ist; dies hängt von der Kombination Protein-Signalpeptid und Signalpeptidase (Wirtsorganismus) ab.
In derartigen Fällen kann die Überexpression des coexprimierten SPase-Gens gelegentlich diese Geschwindigkeitsbeschränkung überwinden. Vorzugsweise handelt es sich bei den Wirtsorganismen um gram-positive Bakterien, wenngleich auch gram-negative Bakterien nicht ausgeschlossen sind.
Ein weiteres Problem, das teilweise durch die Überexpression von SPase vermieden werden kann, ist die Unverträglichkeit der SPase-Prozes sierungsstelle des heterologen oder teilweise heterologen Expressionsprodukts mit der Wirts-SPase. Eine Überexpression der SPase des Wirtsorganismus kann dazu herangezogen werden, die Prozessierungsgeschwindigkeit des Fremdproteins zu steigern. Alternativ kann eine Überexpression einer heterologen SPase herangezogen werden. Im erwähnten Fall kann es auch wertvoll sein, das SPase-Gen in dem Organismus, aus dem das heterologe Gen stammt, zu coexprimieren. Es ist ersichtlich, daß eine Überexpression eines beliebigen DNA-Fragments, das für einen die Protein-Translokation limitierenden Faktor kodiert, zu einer Verbesserung der Sekretion von Proteinen beitragen kann.
Die Verträglichkeit der Prozessierungsstelle mit den klonierten Signalpeptidasen kann durch positionsgerichtete Mutagenese oder willkürliche in vitro-Mutagenese am klonierten Peptidase-Gen weiter gesteigert werden. Bei Vergleich der Sequenzen von Signalpeptidasen, die aus verschiedenen Mikroorganismen erhalten wurden, tauchen konservierte Regionen auf. Konservierte Aminosäuren sind im allgemeinen an der durch das Enzym katalysierten Reaktion beteiligt. Daher sind Unterschiede in diesen Aminosäuren des aktiven Zentrums oder darum herum (räumlich gesehen) an der Spezifität des Enzyms beteiligt. Zwischen E. coli, B. subtilis und S. typhimurium festgestellte Unterschiede lassen auf einige mögliche positionsgerichtete Mutationen schließen. Ein Selektionstest auf der Basis der A2-α-Amylase-, der A2-β-Lactamase-, der A13-α-Amylase- oder der A13-β- Lactamase-Vorläuferspaltung (Smith et al., 1988) läßt sich zur Selektion der mutanten lep-Gene verwenden, die die in Frage stehende Prozessierungsstelle spalten können.
In einer bevorzugten Anwendung der vorliegenden Erfindung wird die Signalpeptidase in einem Wirt geklont und überexprimiert, der ein Gen enthält, das für ein Protein der Wahl kodiert und das überexprimiert wird. Wenn die Prozessierung des Proteins der Wahl begrenzt ist, unterliegt die Signalpeptidase einer Mutagenese durch willkürliche Mutagenese, beispielsweise unter Anwendung einer "Spike"-Oligomutagenese (Hermes et al., 1989), wobei der Stamm mit einer erhöhten Prozessierungsgeschwindigkeit ausgewählt wird. Somit gelangt man zu einer optimalen Kombination von Expressionskonstrukt und Signalpeptidase.
Die erfindungsgemäßen Enzyme sind spezifisch zur Entfernung der Signalpeptide von Polypeptiden. Obgleich die Erfindung durch die Beispiele anhand von Signalpeptidase I aus E. coli, S. thyphimurium und Bacillus erläutert wird, ist es ersichtlich, daß auch andere Mikroorganismen als Quelle für die Isolierung oder als ein Wirt für die Überexpression des Signalpeptidase-Gens herangezogen werden können.
Obgleich die vorliegende Beschreibung sämtliche Informationen zur Ausführung der Erfindung enthält, wurde das lepBS-Gen in pGDL40 beim CBS, Baarn, Niederlande, am 19. Februar 1991 unter der Hinterlegungsnummer CBS 116.91 in E. coli WK 6 hinterlegt.

Experimenteller Teil

Medien und Platten

TY-Medium enthielt (pro Liter) Bacto-Tryptone (1%), Bacto-Hefeextrakt (0,5%) und NaCl (1%). M9-Medium (Miller, 1972) für E. coli enthielt Glucose (0,4%), CaCl&sub2; (15 ug/ml), MgSO&sub4;·7H&sub2;O (250 ug/ml), Casaminsäuren (0,02%), Thiamin (1 ug/ml) und Thymidin (2 ug/ml). M9-Medium-2 ist ein von Methionin und Cystein freies Medium, das sich vom M9-Medium-1 darin unterschied, daß MgSO&sub4;·7H&sub2;O durch MgCl&sub2; (250 ug/ml) ersetzt war und die Casaminsäuren durch eine Lösung sämtlicher Aminosäuren (250 ug/ml) mit Ausnahme von Methionin und Cystein ersetzt waren. Gegebenenfalls wurden Erythromycin (100 ug/ml) und Kanamycin (20 ug/ml) zugesetzt. 57-Medium wurde beim "pulse-chase"-Markieren von B. subtilis DB114 (pGDL41, pGDL42) grundsätzlich gemäß Vasantha und Freese (1980) mit der Modifikation verwendet, daß 3-(N-(Morpholino)-propansulfonsäure durch 20 mM Kaliumphosphat (57-Medium-1) ersetzt wurde. 57-Medium-3 war eine methioninfreie Variante von 57-Medium-1. Beide Medien wurden mit Kanamycin (10 ug/ml) ergänzt.

DNA-Techniken

Verfahren zur DNA-Reinigung, Restriktion, Ligation, Agarose-Gelelektrophorese und Transformation von kompetenten E. coli-Zellen wurden gemäß den Angaben von Maniatis et al. (1982 oder 1989, 2. Auflg.) oder von Ausubel et al. (1987) durchgeführt. Enzyme wurden von der Fa. Boehringer Mannheim, Deutschland, bezogen.

"Pulse-chase"-Markierung

E. coli: Die "pulse-chase"-Markierung von Proteinen zur Untersuchung der Kinetik der Prozessierung in E. coli wurde im wesentlichen gemäß den Angaben von Minsky et al. (1986) durchgeführt. Im exponentiellen Wachstumsstadium befindliche Zellen in M9-Medium-1, das mit 0,2 mM Isopropylβ-D-thiogalactopyranosid (IPTG) ergänzt war, wurden mit M9-Medium-2 gewaschen und 45 Minuten in diesem methionin- und cysteinfreien Medium inkubiert, das ebenfalls mit IPTG ergänzt war. Die Markierung mit [³&sup5;S]- Methionin (50 uCi/ul, 1330 Ci/mMol, Radiochemical Centre, Amersham, UK), "Chase" mit überschüssigem (2,5 mg/ml) nicht-radioaktivem Methionin und Cystein und die Probennahme, gefolgt von einer sofortigen Fällung mit Trichloressigsäure (TCA, 0ºC), wurden gemäß früheren Angaben (Van Dijl et a1., 1988) durchgeführt.
B. subtilis: Im exponentiellen Stadium wachsende Zellen in 57-Medium-1 wurden 1 mal mit methioninfreiem 57-Medium-3 gewaschen und 45 Minuten bei 37ºC in diesem Medium inkubiert. Die Markierung mit [³&sup5;S]- Methionin (40 uCi/ml, 1330 Ci/mMol, Radiochemical Centre, Amersham, UK), für die angegebenen Zeitspannen, "Chase" mit überschüssigem (2,5 mg/ml) nicht-radioaktivem Methionin und die Probennahme, an die sich die sofortige Fällung von Proteinen mit Trichloressigsäure (TCA, 0ºC) anschloß, wurden gemäß früheren Angaben (Van Dijl et al., 1988) durchgeführt. Die Niederschläge wurden in 100 ul 10 mM Tris-hydrochlorid (pH-Wert 8,0), 25 mM MgCl&sub2;, 200 mM NaCl und 5 mg/ml Lysozym (Boehringer Mannheim, Deutschland) durchgeführt. Nach 10 min bei 37ºC wurde die Lysis durch Zugabe von 10 u1 10% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 10-minütiges Erwärmen auf 70ºC beendet.

Sphäroplastenbildung

Zur Untersuchung der Lokalisation von Vorläufern und reifen Enzymen wurden "pulse-chase"-Markierungsexperimente gemäß den vorstehenden Angaben durchgeführt. Jedoch wurden die Proben nicht sofort mit TCA gefällt, sondern 30 Minuten mit Sphäroplastenpuffer (100 mM Tris·HCl (pH-Wert 8,0), 0,5 M Saccharose, 10 mM EDTA, 0,1 mg/ml Lysozym, 0ºC) inkubiert. Sphäroplasten und periplasmatische Bestandteile wurden sodann vor Fällung mit TCA durch Zentrifugation getrennt.

Immunopräzipitation, PAA-Gelelektrophorese und Fluorographie

Die Immunopräzipitation wurde gemäß den Angaben von Edens.et al. (1982) mit spezifischen Antiseren durchgeführt. Die Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid (PAA)-Gelelektrophorese wurde gemäß dem Verfahren von Laemmli (1970) durchgeführt. [¹&sup4;C]-methylierte Referenz-Molekulargewichtsmarker wurden von der Fa. Amersham (Radiochemical Centre, Amersham, UK) bezogen. Die Fluorographie wurde gemäß den Angaben von Skinner und Griswold (1983) durchgeführt. Die relativen Mengen an Radioaktivität ("pulse-chase") oder die alkalische Phosphatase-Färbung (Western-Blotting) wurden durch Densitometer-Scanning mit einem LKB-Ultroscan XL-verstärkten Laser-Densitometer (LKB, Schweden) bestimmt.

Western-Blot-Analyse

Die Expression von SPase I wurde immunologisch durch Western-Blotting charakterisiert (Towbin et al., 1979). Nach SDS-PAGE wurden die Proteine auf Nitrocellulose-Membranen (BA 85, Schleicher und Schuell, Dassel, Deutschland) durch Elektroblotting übertragen. Die SPase I-Bildung wurde sodann durch Inkubation der Membranen mit spezifischen Antikörpern und anschließende Feststellung von gebundenen Antikörpern mit alkalischer Phosphatase (AP)-Antikaninchen-IgG-Konjugaten (ProtoblotR, Western Blot AP-System, Promega Biotec) überwacht. SPase I, die als Marker verwendet wurde, wurde aus einem Stamm mit Überproduktion gemäß den Angaben von Wolfe et al. (1982) gereinigt.

In vitro-Transkription, -Translation und -Prozessierung

[³&sup5;S]-markierte Vorläufer von exportierten Proteinen wurden in vitro synthetisiert. Ihre Prozessierung durch gereinigte SPase I bei 37ºC wurde gemäß den Angaben von de Vrije et al. (1987) untersucht. Bei co- und posttranslationalen Prozessierungstests wurde SPase I zum Translationsgemisch 5 min bzw. 25 min nach Translationsbeginn zugegeben. Die Inkubation mit SPase I wurde 30 min fortgesetzt.

Test auf β-Lactamase-Aktivität und Prozessierung auf Platten

Die β-Lactamase-Aktivität wurde im wesentlichen gemäß den Angaben von Chevallier und Aigle (1979) getestet. Der Test beruht auf der Fähigkeit von Penicillinasen zur Katalyse der Hydrolyse von Penicillin unter Bildung von Penicilloinsäure, die wiederum zur Reduktion eines blaugefärbten Stärke-Iod-Komplexes befähigt ist, wobei sich eine Entfärbung ergibt. Transformierte E. coli-MC1061-Zellen wurden auf TY-Medium mit einem Gehalt an Agar (2%), Stärke (0,2%, Janssen Chimica, Beerse, Belgien), 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 6,5) und Ampicillin (40 ug/ml) ausgestrichen. Nach Inkubation über Nacht bei 37ºC wurden 6,5 ml tiefblaues weiches (TY)-Agartestmedium mit einem Gehalt an Agar (1,3%), Stärke (0,13%), Iodreagenz (0,23% I&sub2; + 1% KI), Ampicillin (1 mg/ml) und 40 mM Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 6,5) auf die Platten mit Transformanten gegossen. Nach Erstarren der Überschichtung wurden die Platten etwa 15 min bei 30ºC inkubiert. Es bildeten sich weiße Höfe (Halos) um Kolonien, die β-Lactamase gebildet und das reife Protein in das Periplasma freigesetzt hatten.

Beispiel I

Konstruktion des Signalpeptidase-Sondenvektors pGD40

In E. coli N4156::pGD28 wird das lep-Gen aus dem reprimierbaren Phagen-lambda-PL-Promotor transkribiert (von Dijl et al., 1988). Im reprimierten Zustand ist der Stamm zum Wachstum unfähig, jedoch ist zu erwarten, daß das Wachstum wieder hergestellt wird, wenn ein funktionelles lep-Gen, das für SPase I Aktivität kodiert, eingeführt wird. Zu diesem Zweck wurde das Plasmid pGD40, das zwei antibiotische Resistenzmarker (Kmr und Tcr) und das Phagen-lambda-cI857-Gen, das für den temperaturempfindlichen Repressor kodiert, trägt, konstruiert (Fig. 1). Die Anwesenheit dieses Repressors macht die Transkription von lep in E. coli N4156::pGD28 kontrollierbar. Aufgrund der für seine Konstruktion gewählten Strategie kodiert pGD40 auch für eine C-terminal geschnittene, enzymatisch inaktive β-Lactamase. Rekombinanten dieses Plasmids lassen sich durch Klonieren in die einzige BamHI-Stelle und Selektion auf tetracyclinempfindliche Transformanten auswählen. Ferner wäre je nach Orientierung der klonierten Fragmente eine Transkription von fremden Genen, selbst wenn diesen ihre eigenen Promotoren fehlen sollten, unter der Kontrolle des Promotors des Tetracyclin-Resistenzgens (pTcr) möglich.

Beispiel II

Komplementierungstest mit dem homologen E. coli-lep-Gen, das in pGD40 geklont ist

Ein von pTD142 abgeleitetes BamHI-BglII-Fragment von 2,3 kb, das das promotorfreie E. coli-lep-Gen enthält (Date und Wickner, 1981; Wolfe et al., 1983) wurde in die BamHI-Stelle von pGD40 kloniert. Dies führte zu pDL05, das das lep-Gen unter der transkriptionalen Kontrolle von pTcr trägt, und zu pGDL06, das das lep-Gen in der entgegengesetzten Orientierung trägt. Die Lebensfähigkeit von E. coli N4156::pGD28 nach Transformation mit pGD40, pGDL05 und pGDL06 wurde bei 28 und 42ºC getestet, d. h. unter reprimierten bzw. unter dereprimierten Bedingungen. Bei 42ºC, wenn das chromosomal angeordnete lep-Gen exprimiert wird, zeigten Transformanten, die pGD40, pGDL05 oder pGDL06 trugen, Wildtyp-Wachstumseigenschaften. Im Gegensatz dazu hatten bei 28ºC, wo das chromosomale lep-Gen reprimiert wird, Transformanten, die pGD40 trugen, ihre Kolonienbildungskapazität bei Übertragung auf frische Platten mit Zahnstochern verloren, während Transformanten, die entweder pGDL05 oder pGDL06 trugen, Kolonien bildeten (Fig. 2). Trotz der falschen Orientierung des lep-Gens in pGDL06 in bezug auf pTcr, bildeten die Transformanten, die dieses Plasmid ent hielten, SPase I in ausreichendem Maße, um den Zelltod zu verhindern, obgleich das Wachstum bei 28ºC klar behindert war.

Beispiel III

Molekulare Klonierung von S. thyphimurium-DNA-Fragmenten, die homolog mit dem E. coli-lep-Operon waren und Identifizierung des S. thyphimurium-lep-Gens

Chromosomale S. thyphimurium-DNA, die mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut war, wurde durch Southern-Blotting unter Verwendung eines von pTD142 abgeleiteten BglII-EcoRI-Fragments von 931 bp, das das 3'-Ende des lepA-Gens (249 bp) und das 5'-Ende des lep-Gens (664 bp) trug (March und Inouye, 1985; Wolfe et al., 1983), als Hybridisierungssonde analysiert (Fig. 3A). Zwei hybridisierende S. thyphimurium-PstI-DNA-Fragmente von 1,0 kb (schwaches Signal) bzw. 1,3 kb (starkes Signal) konnten identifiziert werden (Fig. 4, Bahn 1). Zur Klonierung dieser Fragmente wurde größenfraktionierte (0,9-1,4 kb), mit PstI-gespaltene chromosomale DNA, die aus Agarosegelen extrahiert worden war, in PstI-gespaltenes pUC9 ligiert. E. coli-JM83 wurde mit dem Ligationsgemisch transformiert. Weiße, ampicillinresistente Transformanten, die das 1,0 kb- oder 1,3 kb- Fragment trugen, wurden durch Kolonienhybridisierung unter Verwendung des 931 bp-BglII-EcoRI-E. coli-lepA-lep-Fragments als Sonde selektiert (Fig. 4, Bahn 2 und 3). Beide Fragmente wurden in die PstI-Stelle von pUC7 subkloniert und aus diesem Plasmid durch BamHI ausgeschnitten. Diese Fragmente wurden anschließend in zwei Orientierungen in die einzige BamHI- Stelle des Tcr-Gens in pGD40 inseriert. Dies führte zu pGDL11 und pGDL12 (die das 1,3 kb-Fragment in beiden Orientierungen trugen) und zu pGDL13 und pGDL14 (die das 1,0 kb-Fragment in beiden Orientierungen trugen). pGDL11, pGDL12, pGDL13 und pGDL14 wurden zur Transformation von E. coli N4136::pGD28 verwendet. Das Wachstum und die Lebensfähigkeitseigenschaften bei 28ºC der Transformanten wurden geprüft. Transformantenkolonien von N4156::pGD28 (pGDL13 oder pGDL14) waren deutlich kleiner als die von N4156::pGD28 (pGDL11 oder pGDL12), was auf einen Unterschied in der Wachstumsgeschwindigkeit je nach der Natur des in pGD40 inserierten Fragments hinweist. Die Zahnstocher-Übertragung auf frische Platten ergab, daß beide Transformanten, die pGDL13 oder pGDL14 enthielten, sowie Transformanten, die pGD40 enthielten, ihre Kolonienbildungsfähigkeit bei 28ºC verloren hatte n. Im Gegensatz dazu, zeigten Transformanten, die pGDL11 oder pGDL12 enthielten, ebenso wie Transformanten, die pGDL05 oder pGDL06 enthielten, keine beeinträchtigte Lebensfähigkeit. Ferner war die Lebens fähigkeit von sämtlichen Transformanten bei 42ºC unbeeinträchtigt (Daten nicht abgebildet). Diese Daten legen es stark nahe, daß das 1,3 kb-S. thyphimurium-PstI-Fragment ein lep-Gen kodierte, das die gehemmte E. coli-SPase I-Synthese komplementierte. E. coli N4156::pGD28 (pGDL11) zeigte eine höhere Wachstumsgeschwindigkeit bei 28ºC als N4156::pGD28 (pGDL12), während sich ihre Wachstumsgeschwindigkeiten bei 42ºC nicht unterschieden. Diese Beobachtung legt es nahe, daß die Expression der S. thyphimurium-SPase I in pGDLll durch pTcr kontrolliert wird. Eine Restriktionsenzym-Analyse des 1,3 kb-S. thyphimurium-PstI-Fragments ergab, daß sich die Restriktionskarte des S. thyphimurium-Fragments erheblich von der Karte des entsprechenden 1,3 kb-PstI-Fragments, das das E. coli lep-Gen trug, unterschied (Fig. 3B).

Beispiel IV

Sequenzierung und weitere Identifizierung des S. thyphimurium-lep- Gens

Zur Bestimmung der Nucleotidsequenz des S. thyphimurium-lep-Gens wurde das 1,3 kb-PstI-Fragment sequenziert (vergl. die Sequenzliste SEQ. ID NO 1). SEQ. ID NO 1 zeigt die Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des S. thyphimurium-lep-Gens (Basen 125 bis 1099) und flankierende Regionen. Die Nucleotidnumerierung beginnt mit der PstI- Stelle. Die Aminosäuren, die in der E. coli-SPase I-Aminosäuresequenz unterschiedlich sind oder fehlen (---), sind angegeben. Die Shine- Dalgarno-Sequenz des lep-Gens ist unterstrichen (Positionen 113-119). Stoppcodons sind angegeben (End). Die Pfeile stromabwärts vom lep-Gen markieren die terminatorartige invertierte Wiederholung. Die -35- und - 10-Regionen stromabwärts von dieser invertierten Wiederholung geben den mutmaßlichen rnc-Promotor wieder (March et al., 1985).
Ein Vergleich der S. thyphimurium-Nucleotidsequenz mit der Sequenz des entsprechenden 1,3 kb-E. coli-PstI-Fragments (March et al., 1985; March und Inouye, 1985; Wolfe et al., 1983) ergab eine hochgradige Ähnlichkeit der Gesamtsequenz (83% Übereinstimmungen/Länge). Wie das E. coli-Fragment enthielt das S. thyphimurium-Fragment zwei offene Leseraster (SEQ. ID NO: 1), von denen einer (Basen 1-108) eine Sequenzähnlichkeit mit dem 3'-Ende des E. coli-lepA-Gens (108 bp mit 95,4% Übereinstimmungen/Länge) und der andere (Basen 125-1099) mit dem E. coli-lep-Gen (975 bp mit 83,5% Übereinstimmungen/Länge) aufwies. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des carboxylendständigen Endes des S. thyphimurium-lepA- Proteins war offensichtlich identisch mit der des E. coli-lepA-Proteins, während die abgeleitete Aminosäuresequenz der S. thyphimurium-SPase I im Vergleich zu der Sequenz von E. coli-SPase I 23 Übereinstimmungsfehler und 1 zusätzliche Aminosäure zeigte (92,5 = 6% Übereinstimmungen/Länge) aufwies. Das berechnete Molekulargewicht der S. thyphimurium-SPase I (bestehend aus 324 Aminosäuren) beträgt 35 782.
Eine in vitro-Translation von pUC9, das das 1,3 kb-PstI-Fragment trug, zeigte, daß es für ein Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 36 000 Dalton kodierte, das bei SDS-PAGE gemeinsam mit der E. coli-SPase I wanderte (Fig. 5). Dies steht in guter Übereinstimmung mit dem berechneten Molekulargewicht von 35 782 für das S. thyphimurium-lep- Gen und von 35 994 für das E. coli-lep-Gen.

Beispiel V

Prozessierung von TEM-β-Lactamase in E. coli N4156::pGD28

Die in vivo-Prozessierung von β-Lactamase, die durch pGD28 kodiert wird, wurde durch Impulsmarkierungsversuche geprüft. Zu diesem Zweck wurde E. coli N4156::pGD28 mit pGD40, pGDL05, pGDL06, pGDL11, pGDL12 bzw. pGDA2 transformiert. Bei pGDA2 besteht ein Mangel an dem geschnittenen β- Lactamase-Gen, das bei den anderen Plasmiden vorhanden ist. Transformanten (Apr, Kmr) wurden bei 42ºC selektiert. M9-Medium-1, das Ampicillin und Kanamycin enthielt, wurden mit Einzelkolonien inokuliert und 21 Stunden bei 28ºC inkubiert. Diese Periode entspricht etwa 7 Generationszeiten, die erforderlich sind, um die SPase I in den Zellen so weit zu verdünnen, daß sie limitierend wird (Van Dijl et al., 1988). Nach dieser Wachstumsdauer bei 28ºC wurde das "pulse-chase"-Experiment durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 und Tabelle 1 aufgeführt. In Proben (entnommen 15 sec nach dem "Chase") von N4156::pGD28 (pGDA2 oder pGD40) unter Bedingungen von reprimierter E. coli-SPase I-Synthese konnte nur der Vorläufer von β-Lactamase (MG 31 500) nachgewiesen werden, was auf eine starke Verringerung der Prozessierungsgeschwindigkeit hinweist. Wenn das E. coli-lep-Gen in pGD40 (pGDL05 oder pGDL06) kloniert wurde, erfolgte eine Prozessierung zum reifen Produkt (MG 29 000). Jedoch hing das Ausmaß der Prozessierung von der Orientierung des lep-Gens in bezug auf pTcr ab. Im Stamm N4156::pGD28 (pGDL06) war die Prozessierung des β-Lactamase-Vorläufers im Vergleich zum Stamm N4156::pGD28 (pGDL05) erheblich verzögert. Die Tatsache, daß die SPase I-Aktivität im Stamm N4156::pGD28 (pGDL06) nicht abwesend war, stimmt mit der Beobachtung überein, daß das Wachstum dieses Stammes leicht behindert war. Eine wirksame Prozessierung von Pre-β-lactamase wurde auch im Stamm N4156::pGD28 beobachtet, der pGD40 trug, in das das von S. thyphimurium abgeleitete lep-Fragment von 1,3 kb inseriert war. Auch in diesem Fall hing das Ausmaß der Prozessierung von der Orientierung des lep-Fragments ab. Die Beobachtung, daß im Stamm N4156::pGD28 (pGDL11) das Ausmaß der Prozessierung von Pre-β-lactamase (bestimmt durch Densitometer-Scanning) ähnlich wie beim Stamm N4156::pGD28 (pGDL05) war, zeigt, daß die S. thyphimurium- und E. coli- SPasen gleichermaßen bei der Prozessierung des β-Lactamase-Vorläufers in E. coli wirksam sind (Tabelle 1). Ferner ist es bemerkenswert, daß das Ausmaß der Prozessierung der geschnittenen Pre-β-lactamase (MG 24 000) zum reifen Produkt (MG 21 000) durch das Ausmaß der Expression von SPase I auf ähnliche Weise wie bei Wildtyp-Pre-β-lactamase bestimmt wurde. Jedoch war, wie in Tabelle 1 gezeigt ist, die Fraktion von unprozessierter geschnittener β-Lactamase erheblich größer als von Wildtyp-β-Lactamase, was darauf hinweist, daß die Prozessierung von geschnittenem Preenzym weniger wirksam war.
Tabelle 1*)
*)Anteil von unprozessierter Wildtyp-(P) und geschnittener (P') Lactamase. Dieser Anteil wurde aus dem Verhältnis der Radioaktivität, die in die Vorläuferbande eingebaut war, zu der Radioaktivität, die in die Vorläuferbande + reife Bande eingebaut war, berechnet (x100%)

Beispiel VI

Konstruktion von mutanten Signalsequenz-Kodierungsregionen

Um zu testen, ob die Überexpression des lep-Gens zu einer erhöhten Prozessierungsgeschwindigkeit von sezernierten Proteinen führt, wurden spezifische Kombinationen von Signalsequenzen und Genen herangezogen.
EP-A-244042 beschreibt willkürlich ausgewählte Signalsequenzen, die aus B. subtilis erhalten wurden. Es wurden die Sequenzen A2, A13, A42 und die speziell modifizierten Sequenzen A2d und A13i herangezogen.
Das Signalpeptid A2 enthielt einen "pro-ähnlichen" langen offenen Leseraster zwischen dem hydrophoben Kern und dem Fusionspunkt mit dem Zielprotein. Um zu untersuchen, ob diese sehr hydrophile "pro-ähnliche" Region eine Rolle beim Proteinexport spielt, deletierten wir die Polypeptidregion von 37 Aminosäuren beginnend mit ala (Position 28) bis leu (Position 64) aus A2 durch oligonucleotidgerichtete positionsspezifische Mutagenese. SEQ. ID NO 2 zeigt die Nucleotid/Aminosäure-Sequenzen von Signal-A2d.
Im Gegensatz zu A2 war das Signalpeptid A13 sehr kurz. Der hydrophobe Kern umfaßte nur 9 Aminosäuren. Da die Signalpeptide aus gram-positiven Organismen üblicherweise länger sind als die aus gram-negativen Organismen (von Heijne, G. und Abrahmsen, L., 1989), ist es denkbar, daß der hydrophobe Kern von A13 zu kurz ist, um in wirksamer Weise in B. subtilis zu funktionieren. Daher versuchten wir die Signalpeptid-Funktion von A13 durch Insertion von 10 zusätzlichen hydrophoben Aminosäuren (Position 8 bis 17, SEQ. ID NO 3) in den hydrophoben Kern durch oligonucleotidgerichtete, positionsspezifische Mutagenese zu verbessern.

Kinetik der Prozessierung

Um den Einfluß der Mutationen auf den Wirkungsgrad der Prozessierung während des Exports aufzuklären, wurden "pulse-chase"-Proteinmarkierungsexperimente durchgeführt. Die mit Pre(A2d)-α-amylase und Pre(A2d)-β-lactamase erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 7 bzw. Fig. 8 dargestellt. Zum Vergleich wurde die Kinetik der Prozessierung von Pre(A2)-α-amylase und Pre(A2)-β-lactamase, die auf die vorstehende Weise bestimmt wurde, aufgenommen. In B. subtilis sowie in E. coli waren die Prozessierungsgeschwindigkeiten von Pre(A2d)-α-amylase stark verringert, verglichen mit den Geschwindigkeiten von Pre(A2)-α-amylase (Fig. 7). Etwa 50% (B. subtilis) bis 75% (E. coli) des Proteins lagen 5 min nach dem "Chase" noch in der Vorläuferform vor (Fig. 7). Qualitativ ähnliche Ergebnisse wurden mit dem der β-Lactamase vorhergehenden Signalpeptid A2d erhalten: die Deletion in A2 verlangsamte in starkem Maße die Kinetik der Prozessierung in beiden Organismen (Fig. 8). In E. coli konnte keine Prozessierung der Pre(A2d)- β-lactamase festgestellt werden, selbst 60 min nach dem "Chase" (Ergebnisse nicht abgebildet). Geringe Mengen an reifer (A2d)-β-lactamase konnten jedoch durch "Chasing" über Nacht nachgewiesen werden (Fig. 8). Diese Daten zeigen, daß die "pro-artige" Region zwischen dem hydrophoben Kern und dem Fusionspunkt mit den Zielproteinen für die wirksame Prozessierung sowohl von Pre(A2)-α-amylase als auch von Pre(A2)-β-lactamase wichtig war. Dieses Ergebnis läßt sich sehr leicht durch die Anwesenheit einer potentiellen Prozessierungsstelle bei ala30, die durch die Deletion in A2d entfernt war, erklären.
Im Vergleich zur ursprünglichen Exportfunktion von A13 verringerte A13i, das einen erweiterten hydrophoben Kern enthielt, den Wirkungsgrad der Prozessierung in B. subtilis noch weiter (Fig. 9 und Fig. 10). Etwa 78% (Pre[A13i]-α-amylase) bis 82% (Pre[A13i]-β-lactamase) des Proteins lagen 5 min nach dem "Chase" noch in der Vorläuferform vor. Die Insertion in A13i hatte eine noch drastischere Wirkung auf den Wirkungsgrad der Prozessierung von Pre(A13i)-α-amylase und β-Lactamase in E. coli (Fig. 9 und Fig. 10). Keine reife (A13i)-α-Amylase konnte 5 min nach dem "Chase" beobachtet werden (Fig. 9). Im Gegensatz dazu wurde mit dem ursprünglichen Signal A13 ausschließlich reife (A13)-α-Amylase 5 min nach dem "Chase" gefunden (Fig. 9). Ferner konnte keine reife (A13i)-β-Lactamase selbst nach "Chase" über Nacht nachgewiesen werden (Daten nicht dargestellt). Insgesamt zeigen diese Daten, daß die Erweiterung des hydrophoben Kerns der Exportfunktion A13 eine negative Auswirkung auf den Prozessierungswirkungsgrad hatte.

Lokalisierung von B-Lactamase in E. coli

Trotz der niederen Prozessierungswirkungsgrade von Pre(A2d)-β-lactamase und Pre(A13i)-β-lactamase machten diese Proteine E. coli gegen hohe Konzentrationen an Ampicillin resistent (Tabelle 2). Tabelle 2 α-Amylase- und β-Lactamase-Aktivitäten in B. subtilis-Kulturüberständen und Ampicillin-Resistenz in E. coli
Tabelle 2: B. subtilis DB104-Kulturen mit einem Gehalt an den Plasmiden pSPA oder pSPB-A wurden über Nacht in TY- bzw. Minimalmedium gezüchtet. Die α-Amylase- und β-Lactamase-Aktivitäten in den Kulturüberständen wurden gemäß den Angaben in Materialien und Methoden bestimmt. Die Beständigkeit gegen Ampicillin wurde als die maximale Konzentration des Antibiotikums definiert, bei der 100% der E. coli-Zellen Kolonien bilden konnten. Plasmide mit der Kennzeichnung pSPA.. enthalten α-Amylase mit dem angegebenen Signalpeptid. Plasmide mit der Bezeichnung pSPB.. enthalten β-Lactamase mit dem angegebenen Signalpeptid.
Das hohe Maß an Ampicillinresistenz läßt darauf schließen, daß mindestens ein Teil der β-Lactamase einer Translokation durch die cytoplasmatische Membran unterworfen worden war. Um dies zu testen, analysierten wir die zelluläre Position von β-Lactamase in E. coli-Zellen mit einem Gehalt an pSPB-A2d und pSPB-A13i. Tabelle 3 zeigt, daß ähnlich wie beim "pulse-chase"-Versuch, fast keine freie β-Lactamase im Periplasma von E. coli-Zellen mit einem Gehalt an pSPB-A13i nachgewiesen werden konnte. Jedoch zeigt Tabelle 3 (letzte Spalte), daß die hohen Konzentrationen von β-Lactamase-Aktivität an unlysierten Sphäroplasten von Zellen mit einem Gehalt an pSPB-A13i gefunden wurden. Dies zeigt, daß das aktive Protein einer Translokation durch die cytoplasmatische Membran unterworfen worden sein muß.
Ferner zeigen die Fraktionierungsdaten, daß trotz der Tatsache, daß der Wirkungsgrad der Prozessierung von Pre(A2d)-β-lactamase in E. coli sehr nieder war (Fig. 8), relativ hohe Konzentrationen an freier β-Lactamase im Periplasma von über Nacht gebildeten Kulturen nachgewiesen werden konnten (Tabelle 3). Diese Daten stützen die Beobachtung, daß in einem "pulse-chase"-Experiment nach "Chasing" über Nacht ein gewisser Anteil an reifer (A2d)-β-lactamase nachgewiesen werden konnte (Daten nicht dargestellt). Offensichtlich erfolgte eine Prozessierung von Pre(A2d)-β-lactamase, jedoch mit sehr langsamer Geschwindigkeit. Tabelle 3 Relative 9-Lactamase-Aktivitäten in verschiedenen E. coli-Zellfraktionen
Tabelle 3: Über Nacht gebildete Kulturen von E. coli, die die verschiedenen Plasmide trugen, wurden in TY-Medium gezüchtet. Die Zellen wurden fraktioniert. Die Werte in den Spalten "Periplasma" und "Cytoplasma + Membranen" geben die prozentualen Werte der gesamten β-Lactamase-Aktivität in den Zellysaten wieder. Die β-Lactamase-Aktivitäten wurden gemäß den Angaben in Materialien und Methoden gemessen. Die mit unlysierten Sphäroplasten verbundenen enzymatischen Aktivitäten wurden in Sphäroplastenpuffer gemessen und sind ebenfalls als prozentuale Anteile der gesamten β-Lactamase-Aktivität angegeben. Als eine Kontrolle für die Lysis wurde die Absorption bei 700 nm für die Sphäroplastensuspension vor und nach dem Test gemessen.

Beispiel VII

Einfluß der SPase I-Überproduktion auf die Prozessierungskinetik

Das E. coli-lep-Gen wurde in das Plasmid pBS61ΔpL inseriert und unter die Kontrolle des reprimierbaren tac-Promotors, abgeleitet von pKK223.3 (De Boer et al., 1983), gestellt. Dies ergab das Plasmid pGDL2. In E. coli C600 führte die Expression des pGDL2-kodierten lep-Gens zu einer etwa 27-fachen Überproduktion von SPase I gemäß Bestimmung durch Western-Blots (Fig. 11). Um etwaige Effekte der SPase I-Überproduktion in E. coli C600 zu überwachen, wurde die Prozessierungskinetik von vier verschiedenen chimären β-Lactamasen durch "pulse-chase"-Markierung gemessen. Die Translokation dieser chimären β-Lactamasen wurde durch Signalpeptide erleichtert, die willkürlich aus dem Chromosom von Bacillus subtilis (A2 und A42; Smith et al., 1987) ausgewählt worden waren und die in einigen Fällen durch positionsgerichtete Mutagenese verändert worden waren (A2d und A13i, Beispiel VI). Außerdem wurde der Einfluß der Prozessierungskinetik auf Wildtyp-TEM-β-Lactamase als Kontrolle gemessen. Um dies durchzuführen, wurden Stämme von E. coli C600, die diese β-Lactamase bildeten, mit pGDL2 (Überproduktion von SPase I) oder mit pBSGlApL (Wildtyp-Bildung von SPase I) transformiert. Die Ergebnisse der "pulse-chase"-Markierungsexperimente sind in Fig. 12-16 aufgeführt. Lediglich die Prozessierungsgeschwindigkeit von Wildtyp-β-Lactamase, die im Vergleich zu den Prozessierungsgeschwindigkeiten der übrigen β-Lactamasen sehr rasch ist, blieb vollkommen unbeeinflußt durch die SPase I-Überproduktion (Fig. 12). Pre(A2)-β-lactamase wurde unter den Bedingungen der SPase I-Überproduktion nur geringfügig rascher prozessiert (Fig. 13). Die Zeitspanne, die zur Prozessierung von 50% des Vorläufers erforderlich war (t&sub5;&sub0;) war um etwa 20 sec verringert (t&sub5;&sub0; unter Wildtyp-Bedingungen = 2,5 Minuten, t&sub5;&sub0; unter Bedingungen der SPase I-Überproduktion = 2, 2 Minuten). In sämtlichen übrigen Beispielen war die Prozessierungskinetik klarer durch die SPase I-Überproduktion beeinflußt: Pre(A42)-β-lactamase zeigte eine klar erhöhte Prozessierungsgeschwindigkeit (Fig. 14), wobei der t&sub5;&sub0;-Wert dieses Vorläufers durch SPase I-Überproduktion um 11 Minuten verringert war (t&sub5;&sub0; unter Wildtyp-Bedingungen = 26 Minuten, t&sub5;&sub0; unter Bedingungen der SPase I-Überproduktion = 15 Minuten). Jedoch konnte die extremste Wirkung bei Pre(A2d)-β-lactamase gemessen werden. Dieser Vorläufer, der in E. coli C600 unter Wildtyp-Bedingungen nur sehr langsam prozessiert wird (vergl. Beispiel VI), zeigte eine drastisch erhöhte Prozessierungsgeschwindigkeit unter Bedingungen der SPase I-Überproduktion (Fig. 15). Der t&sub5;&sub0;-Wert von Pre(A2d)-β-lactamase konnte unter Wildtyp-Bedingungen aufgrund der langsamen Prozessierungsgeschwindigkeit nicht gemessen werden (Smith et al., Daten nicht aufgeführt). Durch SPase I-Überproduktion wurde die Prozessierungsgeschwindigkeit so stark erhöht, daß etwa 65% des Vorläufers bereits innerhalb einer 1-minütigen Markierung prozessiert waren (t&sub5;&sub0;-Wert unter Bedingungen der SPase I-Überproduktion < 1 Minute). Die Möglichkeit, daß eine Mutation in der Signalsequenz von Pre(A2d)-βlactamase die gemessene Wirkung hervorrufen könnte, konnte ausgeschlossen werden. Eine Transformation von E. coli C600 mit pSPB-A2d, das aus dem Stamm mit SPase I-Überproduktion extrahiert worden war, und die anschließende "pulse-chase"-Analyse ergab erneut eine langsame Prozessierungskinetik (Daten nicht aufgeführt). Die Prozessierung von Pre(A13i)-β-lactamase wurde ebenfalls durch SPase I-Überproduktion beeinflußt. Im Gegensatz zu den übrigen drei chimären β-Lactamasen war eine Prozessierung dieses Vorläufers unter Wildtyp-Bedingungen überhaupt nicht nachweisbar (vergl. Beispiel VI). Jedoch war unter Bedingungen der SPase I-Überproduktion eine geringe Menge an reifem Enzym nachweisbar (Fig. 16). Das reife Enzym trat direkt nach dem "Chase" auf. Seine relative Menge (6. bis 7% der gesamten synthetisierten (A13i)-β-lactamase) blieb während der Dauer der Probennahme "Chase") fast unverändert. Dies zeigt, daß zwar nur eine untergeordnete Fraktion der Pre(A13i)-β-lactamase prozessiert wurde, die Prozessierungsgeschwindigkeit sehr hoch war.

Einfluß der SPase I-Überproduktion auf die Lokalisierung von Vorläufern und reifen Enzymen

Die proteolytische Prozessierung der- Vorläufer von translozierten Proteinen durch SPasen in E. coli wird als eine Voraussetzung für die Freisetzung des reifen Enzyms in das Periplasma angesehen (Dalbey und Wickner, 1985). Es war daher von Interesse, die Lokalisierung der in diesen Untersuchungen verwendeten, langsam prozessierten Exportproteine (Pre[A2d]-β-lactamase und Pre[A13i]-β-lactamase), die gegenüber einer SPase I-Überproduktion empfindlich sind, zu untersuchen. Die Lokalisierung von Vorläufern und reifen Produkten wurden durch "pulse-chase"-Mar kierung von Proteinen, anschließende Sphäroplastenbildung und darauf folgende Abtrennung von Sphäroplasten und periplasmatischen Bestandteilen durch Zentrifugation bestimmt.
Die Prozessierung von Wildtyp-β-lactamase (die Proben wurden 90 sec nach dem "Chase" entnommen) konnte durch Kühlung auf Eis nicht sofort gestoppt werden, wie sich durch die Tatsache ergab, daß kein Vorläufer festgestellt werden konnte. Die reife β-Lactamase erlag einer Fraktionierung mit den periplasmatischen Bestandteilen, was nicht durch eine SPase I-Überproduktion beeinflußt wurde (Daten nicht aufgeführt).
Die Lokalisierung von Pre(A2)-β-lactamase und ihres reifen Produkts wurde in Proben bestimmt, die 2 Minuten nach dem "Chase" entnommen wurden. Obgleich wie bei Wildtyp-Pre-β-lactamase die Prozessierung nicht sofort gestoppt werden konnte, war eine signifikante Menge an Pre(A2)-βlactamase nachweisbar, vermutlich als Folge der Tatsache, daß Pre(A2)-βlactamase langsamer als die Wildtyp-Pre-β-lactamase prozessiert wird. Die Pre(A2)-β-lactamase war offensichtlich ausschließlich mit der Sphäroplastenfraktion assoziiert, während der Großteil des reifen Produkts (94%) in der periplasmatischen Fraktion vorlag. Diese Ergebnisse wurden durch SPase I-Überproduktion nicht verändert (Daten nicht aufgeführt).
Das Ausmaß der SPase I-Produktion beeinflußte klar die Lokalisierung von (A2d)-β-Lactamase in Proben, die 5 min nach dem "Chase" (37ºC) entnommen wurden. Obgleich wie bei Pre(A2)-β-lactamase die Pre(A2d)-β-lactamase ausschließlich mit den Sphäroplasten assoziiert war, was auf die erhöhte Geschwindigkeit der Pre(A2d)-β-lactamase-Prozessierung unter Bedingungen der SPase I-Überproduktion zurückzuführen war, konnte eine stark gesteigerte Menge an reifem Enzym in der periplasmatischen Fraktion nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Überproduktion von SPase I nicht nur zu einem drastischen Anstieg der Geschwindigkeit der Pre(A2d)-β-lactamase-Prozessierung führte, sondern auch zu einem gleichzeitigen Anstieg der Geschwindigkeit der Freisetzung des reifen Enzyms in das Periplasma. Diese Ergebnisse stehen in voller Übereinstimmung mit den Vorstellungen von Dalbey und Wickner (1985), wonach die proteolytische Prozessierung des Vorläufers für die Freisetzung des reifen Proteins in das Periplasma erforderlich ist.
Eine Fraktionierung von Zellen mit einem Gehalt an (A13i)-β-lactamase ergab ein unterschiedliches Muster. Unter sämtlichen getesteten Bedingungen blieb Pre(A13i)-β-lactamase mit den Sphäroplasten assoziiert. Jedoch war unerwarteterweise eine überwiegende Fraktion des reifen En zyms, das nur unter Bedingungen der SPase I-Überproduktion nachweisbar war, ebenfalls mit der Sphäroplastenfraktion assoziiert. Nur etwa 20% des reifen Enzyms, die weniger als 2% der Gesamtmenge der synthetisierten (A13i)-β-lactamase darstellten, war in der periplasmatischen Fraktion nachweisbar. Es bleibt unsicher, ob diese geringe periplasmatische Fraktion auf eine echte Freisetzung in das Periplasma als eine Folge der SPase I-Prozessierung oder auf eine Lysis einer geringen Fraktion der Sphäroplasten zurückzuführen war.

Beispiel VIII

Test auf Prozessierung von β-Lactamase-Vorläufern auf Platten

Die Exporteigenschaften von verschiedenen Hybridproteinen, die aus reifer E. coli-TEM-β-lactamase, die mit willkürlich aus dem B. subtilis- Chromosom ausgewählten Signalpeptiden fusioniert war, bestanden, wurden beschrieben (Smith et al., 1987; Smith et al., 1988). Eines dieser Signalpeptide mit der Bezeichnung A13 dirigierte in wirksamer Weise den Export von β-Lactamase in das Wachstumsmedium bei B. subtilis (Sezernierung) und in das Periplasma bei E. coli (Smith et al., 1988; von Dijl et al., 1990). Die Erweiterung der hydrophoben h-Region des Signalpeptids A13 mit 10 hydrophoben Aminosäuren, wodurch sich das Signalpeptid A13i ergab, verringerte in starkem Maße dessen Wirkung bei der Direktion des Exports von β-Lactamase in beiden Organismen. In E. coli wurde die unprozessierte Pre(A13i)-β-lactamase durch die cytoplasmatische Membran, an der es gebunden blieb, transloziert. Wurde das unprozessierte Protein dem Periplasma ausgesetzt, so entstand eine hochgradige Ampicillin-Resistenz. Eine untergeordnete Fraktion der Pre(A13i)-β-lactamase wurde unter Bedingungen der SPase I-Überproduktion in E. coli prozessiert (von Dijl et al., 1990). Daher konnte der beobachtete Exportdefekt von Pre(A13i)-βlactamase in E. coli auf den Mangel einer produktiven Wechselwirkung mit SPase I zugeschrieben werden. Im Gegensatz dazu wurde reife (A13i)-β-lactamase in B. subtilis sezerniert, was darauf hinweist, daß die SPase I dieses Organismus zur Erkennung und Prozessierung des Vorläufers befähigt war (Smith et al., 1990). Um die Komponente der B. subtilis-Exportmaschinerie zu identifizieren, die für die Prozessierung der Pre(A13i)-β-lactamase verantwortlich war, wurde ein Plattentest (Halo-Bildung) für den Nachweis von β-Lactamase-Aktivität in E. coli-Kolonien herangezogen. Die Halo-Bildung um Kolonien kann nur erfolgreich sein, wenn mindestens eine gewisse Menge an reifer TEM-β-lactamase aus dem Periplasma in das Wachstumsmedium austreten kann. Eine Zone der Verfärbung (Halo) aufgrund von β-Lactamase-Aktivität konnte um Kolonien, die die rasch prozessierte (A13)-β-Lactamase erzeugten, nachgewiesen werden, was darauf hinweist, daß diese Hybrid-β-Lactamase ähnlich wie Wildtyp-β-Lactamase (Georgiou et al., 1988) ebenfalls aus dem Periplasma von E. coli austreten konnte. Im Gegensatz dazu konnte kein Halo um Kolonien, die die unprozessierte Pre(A13i)-β-lactamase bildeten, nachgewiesen werden, was darauf hinweist, daß dieser Vorläufer nicht aus den Zellen in das umgebende Agarmedium austreten konnte. Somit stand die Halo-Bildung offensichtlich in Korrelation mit der Prozessierung und Freisetzung der reifen β-Lactamase in das Periplasma.

Selektion von halobildenden Transformanten mit einem Gehalt an in pSBA13i schrotschußklonierter B. subtilis-DNA

Das Potential des vorstehend beschriebenen Halo-Tests in E. coli für die Klonierung des Faktors, der für die Prozessierung von Pre(A13i)-βlactamase in B. subtilis erforderlich ist, wurde anschließend getestet. Es wird erwartet, daß die Klonierung und Expression des für diesen Faktor kodierenden Gens in E. coli zu Kolonien führt, die zur Prozessierung von Pre(A13i)-β-lactamase befähigt sind, vorausgesetzt, daß das Produkt funktionell ist. Unter Verwendung des Halo-Tests sollte es möglich sein, diese Kolonien zu identifizieren. Zu diesem Zweck wurde chromosomale B. subtilis-DNA partiell mit Sau3A verdaut. Diese DNA wurde zur Klonierung in BclI-gespaltenes pSBA13i (wie pSPB-A13i, jedoch wurden die pTA1060- Replikationsfunktionen durch die von pWV01 ersetzt), das mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war, verwendet. Nach (Elektro)-Transformation wurden 26 000 ampicillinresistente Transformanten auf ihre Fähigkeit zur Bildung von Halos getestet. Die Gesamtkollektion von rekombinanten pSBA13i-Plasmiden enthielt klonierte DNA-Fragmente mit einer Gesamtgröße, die etwa dem 13-fachen des B. subtilis-Genoms entsprachen. Es konnten 13 halobildende Transformanten festgestellt werden.
Eine Restriktionsanalyse ergab, daß die Plasmide in diesen Transformanten zwei Typen von inserierten Fragmenten enthielten, wovon eines (Fragment A) in 12 Klonen in überlappenden Sau3A-Fragmenten vorhanden war. Das kleinste dieser Fragmente (2,4 kb) enthielt ein internes 2,1 kb- HindIII-Fragment. Die Größe des anderen Fragments (B) betrug offensichtlich etwa 700 bp. pSBA13i, das das Fragment B enthielt, erhielt die Bezeichnung pGDL40. Transformanten, die entweder das Fragment A oder das Fragment B enthielten, führten nur zur Bildung von Halos, wenn die Überschichtung Ampicillin enthielt, was darauf hinweist, daß die Halo-Bildung auf die β-Lactamase-Aktivität zurückzuführen war (Daten nicht aufgeführt). Ferner war die Halo-Bildung nicht auf Mutationen in der Signalsequenz von A13i zurückzuführen. Dies wurde durch Isolierung des DNA-Fragments, das für A13i kodiert, aus den Transformanten und durch Ligation in das geschnittene β-Lactamase-Gen des Signalsequenz-Selektionsvektors pGPB14 gezeigt. Keine der erhaltenen Transformanten zeigte eine β-Lactamase-Halo-Bildung (Daten nicht aufgeführt).

Prozessierung von Pre(A13i)-β-lactamase

Um zu prüfen, ob die Halo-Bildung auf die Prozessierung von Pre(A13i)-β-lactamase zurückzuführen war, wurden "pulse-chase"-Markierungsversuche durchgeführt. Nur wenn das Fragment B in pSBA13i vorhanden war, wurde eine Prozessierung von Pre(A13i)-β-lactamase beobachtet. Die zelluläre Lokalisierung der reifen (A13i)-β-Lactamase wurde durch "pulsechase"-Markierung von Proteinen unter anschließender Sphäroplastenbildung und anschließender Abtrennung von Sphäroplasten und periplasmatischen Bestandteilen bestimmt. Wie erwartet, wurde das reife Enzym mit den periplasmatischen Bestandteilen fraktioniert. Diese Daten zeigen, daß das Fragment B für den Faktor, der für die Prozessierung von Pre(A13i)-β-lactamase in B. subtilis verantwortlich war, kodierte.
Im Gegensatz dazu war keine Prozessierung von Pre(A13i)-β-lactamase nachweisbar, wenn pSBA13i das Fragment A trug (Daten nicht aufgeführt).

Beispiel IX

DNA-Sequenzanalyse des Bacillus subtilis-lep-Gens

Um zu bestimmen, ob das Fragment B das B. subtilis-lep-Gen, das für SPase I kodiert, enthielt, wurde das in pGDL40 geklonte, vollständige Fragment sequenziert. Die Ergebnisse zeigten, daß dieses Fragment aus zwei Sau3A-Fragmenten von 97 bp bzw. 696 bp bestand (Sequenzliste, SEQ. ID NO 4). Die Sequenzanalyse ergab das Vorliegen eines offenen Leserasters (ORF, Basen 239-793), der für ein Protein (bestehend aus 184 Aminosäuren) mit einem berechneten Molekulargewicht von 21 032 kodieren kann. Dem ORF ging eine potentielle Shine-Dalgarno-Sequenz (GGAGG) mit einem dG-Wert von -14,4 kcal (Tinoco et al., 1973) voraus, wobei ein Abstand von 10 Basen in Bezug zum mutmaßlichen Startcodon (TTG) bestand. Um diesen ORF zu identifizieren wurde seine abgeleitete Aminosäuresequenz mit den Aminosäuresequenzen in der Datenbank verglichen. Signifikante Ähnlichkeiten wurden nur mit SPase I von E, coli (Fig. 17) und S. thyphimurium festgestellt. Daher ziehen wir den Schluß, daß das sequenzierte DNA-Fragment, das für die in vivo-Prozessierung von Pre(A13i)-β-lactamase in E. coli verantwortlich ist, das für die SPase I von B. subtilis kodierende Gen enthält.
Die Ähnlichkeiten zwischen den Enzymen waren hauptsächlich in drei unterschiedlichen Regionen lokalisiert. Die erste Ähnlichkeitsregion (Aminosäuren 6-57 der B. subtilis-SPase I/Aminosäuren 53-103 der E. coli- SPase I; 28,3% Identität) überlappt sich mit zwei Domänen von E. coli- SPase I mit der Bezeichnung H2 und H3, von denen eine (H2) als internes, ungespaltenes Signalpeptid fungiert (Dalbey et al., 1987; Zhu und Dalbey, 1989). Die übrigen beiden Ähnlichkeitsregionen (Aminosäuren 59-93 der B. subtilis SPase I/Aminosäuren 118-155 der E. coli-SPase I; 47,4% Identität; und Aminösäuren 136-155 der B. subtilis SPase I/Aminosäuren 263-282 der E. coii-SPase I; 70% Identität) entsprechen den Aminosäuresequenzen in E. coli-SPase I, die der äußeren Oberfläche der cytoplasmatischen Membran ausgesetzt sind (Moore und Miura, 1987; Wolfe et al., 1983). Analog zum lep-Gen, das für die SPase I von E. coli kodiert, wird das für B. subtilis-SPase I kodierende Gen als lepBS bezeichnet.
Der Vergleich zwischen den E. coli- und B. subtilis-SPase I-Proteinen ergab ferner einen interessanten Unterschied. Während die E. coli- SPase I zwei membranüberspannende Regionen enthält, war die erste dieser Regionen (Aminosäuren 1-22) mit der Bezeichnung H1 (Dalbey et al., 1987) in der B. subtilis-SPase I offensichtlich nicht vorhanden. Dies ist möglicherweise auf eine spezifische Deletion zurückzuführen, die während der Klonierung des Fragments B in pSBA13i erfolgte. Obgleich wir diese Möglichkeit als unwahrscheinlich betrachteten, da eine enzymatische Aktivität in E. colii festgestellt wurde, wurde diese Möglichkeit weiter untersucht. Chromosomale B. subtilis-DNA wurde mit Sau3A verdaut und durch Southern-Blotting unter Verwendung des 696 bp-Sau3A-Fragments mit einem Gehalt an dem lepBS-Gen als Hybridisierungssonde analysiert. Das Sau3A- Hybridisierungsfragment der chromosomalen B. subtilis-DNA wies die gleiche Größe wie das klonierte Fragment auf, das als Sonde verwendet wurde (Daten nicht aufgeführt). Dies weist darauf hin, daß es sehr unwahrscheinlich ist, daß eine peletion von etwa 66 bp (für H1 kodierend) aufgetreten war. Daher ziehen wir den Schluß, daß die Region H1 tatsächlich in B. subtilis-SPase I abwesend ist.
Eine in vitro-Transkription und -Translation von pGDL40 ergab, daß das Fragment B für ein Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 21 000 Dalton kodierte. Dies steht in guter Übereinstimmung mit dem be rechneten MG-Wert von 21 032 für die durch lepBS kodierte B. subtilis- SPase I.

Beispiel X

Hybridisierungsexperimente unter Verwendung des Bacillus subtilislepBS-Gens als Sonde

Das klonierte B, subtilis-Leader-Peptidase-Gen (lep BS) wurde als Sonde zum Nachweis von homologen Genen in mehreren weiteren Bacillus-Spezies sowie in einer Anzahl von anderen Mikroorganismen verwendet. Chromosomale DNA wurde aus den folgenden Spezies unter Anwendung standardmäßiger Verfahren isoliert: B. subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens und B. alcalophilus. Die DNAs wurden getrennt mit den folgenden Restriktionsendonucleasen verdaut: EcoRI, HindIII und PstI. Ferner wurden sie einer Größenfraktionierung an 0,8%-Agarosegelen unterzogen. Anschließend wurden die DNA-Fragmente übertragen und an Genescreen-Filtern immobilisiert. Ein 0,3 kb-DNA-Fragment, das für den N-terminalen Teil der Bacillus-Leader-Peptidase kodierte, wurde unter Anwendung des Polymerase-Kettenreaktionsverfahrens erhalten. Die folgenden Oligonucleotide
a) 5'-GGGCAAAAGCAATTGTG-3' und
b) 5'-CGTCCTGTTTCGCTCTC-3
wurden als Primer und pGDL40 als Matrize verwendet.
Das erhaltene Fragment wurde durch Nick-Translation mit ³²P markiert und mit den immobilisierten chromosomalen DNA-Verdauungsprodukten in 3 · SSC 16 Stunden bei 65ºC hybridisiert. Ein anschließendes Waschen der Blots wurde in 3 · SSC, 0,1% SDS bei 25ºC durchgeführt. Die Blots wurden getrocknet und 24 Stunden auf einen Röntgenfilm aufgelegt.
Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Fig. 18 dargestellt. Diskrete Hybridisierungsfragmente wurden für B, subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens und B. alcalophilus beobachtet.

Beispiel XI

Überexpression des Bacillus subtilis lepBS-Gens in Bacillus

In E. csu konnte der Prozessierungswirkungsgrad der Pre(A13i)-βlactamase durch Überproduktion von SPase I verbessert werden, was zeigt, daß die Verfügbarkeit von SPase I unter standardmäßigen Bedingungen limitierend war. Da die Pre(A13i)-β-lactamase in B. subtilis nur sehr langsam prozessiert wurde (Beispiel VI und Beispiel VII) wurde angenommen, daß auch in diesem Organismus die Verfügbarkeit von SPase I möglicherweise unter standardmäßigen Bedingungen limitierend ist. Um dieser Frage nach zugehen, wurde das lepBS-Gen in B. subtilis DB104 (Kawamura und Doi, 1984) am Plasmid pGDL41 eingeführt (Fig. 19). Bei diesem Plasmid handelt es sich um ein Derivat von pGDL40 mit einem Gehalt an einem selektierbaren Marker (Kmr) für B.. subtilis. pGDL41 und pGDL42 wurden konstruiert, indem man das 0,3 kb-EcoRI-Fragment mit einem Gehalt an dem SPO2-Promotor von pGDL40 bzw. pSBAl3i durch ein 1,4 kb-EcoRI-Fragment von pKM1 (Kiel et al., 1987) mit einem Gehalt an einem Streptococcus faecalis-Kmr-Gen ersetzte.
Die Wirkung dieser gesteigerten lepBS-Gendosis in B. subtilis DB104 (pGDL41) auf die Prozessierungskinetik von Pre(A13i)-β-lactamase wurde durch "pulse-chase"-Markierungsversuche untersucht. Als Kontrolle (standardmäßige Bedingungen) wurden "pulse-chase"-Markierungsexperimente mit B. subtilis DB104, das mit dem Plasmid pGDL42 transformiert war (Fig. 19) und dem das lepBS-Gen fehlte, durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, daß die Prozessierungskinetik von Pre(A13i)-β-lactamase klar durch eine SPase I-Überproduktion beeinflußt wurde.
Unter standardmäßigen Bedingungen (B. subtilis DB104 [pGDL42]) wurde Pre(A13i)-β-lactamase nur langsam prozessiert: bei t = 0 konnte keine reife (A13i)-β-Lactamase festgestellt werden (Fig. 20 B, D und E). Die Zeitspanne, die zur Erzielung von gleichen Mengen der Vorläufer- und reifen Formen von (A13i)-β-Lactamase erforderlich waren (t&sub5;&sub0;), betrug etwa 10 min (Fig. 20 D und E). Die anfängliche Geschwindigkeit der Pre(A13i)- β-lactamase-Prozessierung war unter Bedingungen der SPase I-Überproduktion stark erhöht (B. subtilis DB104 [pGDL41]; Fig. 20 A, C und E): etwa 20% (± 5% in verschiedenen Experimenten; Fig. 20 A und C) der gesamten vorhandenen (A13i)-β-Lactamase waren bereits nach 1-minütiger Markierung reif, wobei der t&sub5;&sub0;-Wert etwa 6 min betrug (Fig. 20 C und E). Diese Daten zeigen, daß in B. subtilis ähnlich wie in E. coli unter standardmäßigen Bedingungen die Verfügbarkeit von SPase I für die Prozessierung von Pre(A13i)-β-lactamase geschwindigkeitsbeschränkend ist.

Beispiel 12

Mutagenese der B. subtilis-SPase

Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen der B. subtilis-, E. coli- und Salmonella thyphimurium-SPase I mit der Datenbank ergab eine kurze Ähnlichkeitsregion mit dem SEC11-Protein von Saccharomyces cerevisiae (Böhni et al., 1988) und dem Hundeprotein 21K (Greenberg et al., 1989) (Fig. 21). Die beiden letztgenannten Proteine stellen Komponenten der Signalpeptidase-Komplexe von S. cerevisiae bzw. des Hundes dar. Diese Region ist offensichtlich in sämtlichen bisher beschriebenen fünf SPasen konserviert. In der SPase I von E. coli befindet sich die konservierte Region in einer Domäne des Enzyms, die für die katalytische Aktivität als wesentlich angesehen wird. Es ist daher wahrscheinlich, daß die konservierten Aminosäuren Bestandteil des katalytischen Zentrums von SPasen sind. Insbesondere sind die konservierten Serin- und Asparaginsäurereste (in Fig. 21 mit * markiert) stark von Interesse, da diese Aminosäurereste zusammen mit einem Histidinrest die katalytische Triade von Serinproteasen bilden. Dies führt zu der Frage, ob SPasen mit dieser Gruppe von Proteinasen verwandt sind. Es ist daher denkbar, daß die Unterschiede innerhalb der konservierten Region dieser fünf Proteine für ihre unterschiedlichen Spezifitäten verantwortlich sind (Von Heijne und Abrahmsen, 1989). Die drei konservierten Regionen sind in der lepBS-Sequenz in SEQ. ID NO 4 ebenfalls unterstrichen.
Zur Aufklärung der Funktion der konservierten Region bezüglich der Aktivität und Spezifität von SPasen lassen sich verschiedene Mutationen in die entsprechende Region der B. subtilis-SPase I einführen. Diese Mutationen können entweder den partiellen oder den vollständigen Austausch der (nicht)-konservierten Aminosäuren umfassen. Alternativ können Mutationen willkürlich eingeführt werden, wobei man "Spike"-Oligonucleotide von etwa 100 Basen verwendet. Vor Beginn der tatsächlichen Mutagenese werden zwei besondere Restriktionsstellen in pGDL40 eingeführt. Eine Smal-Stelle wird unmittelbar vor der Shine-Dalgarno-Sequenz des lepBS- Gens (Position 215, SEQ. ID NO 4) eingeführt. Eine SalI-Stelle wird in der Region des lepBS-Gens, die für die in den verschiedenen SPasen konservierten Aminosäurereste kodiert (Position 353, SEQ. ID NO 4) eingeführt. Unter Verwendung dieser zwei Restriktionsstellen lassen sich mit Hilfe von PCR-Techniken geschaffene Mutationen in das lepBS-Gen einführen. Mutante SPasen mit veränderter Spezifität oder Aktivität können mit Hilfe des Halo-Tests auf Pre(A13i)-β-lactamase-Prozessierungsaktivität nachgewiesen werden. Mutationen, die die Inaktivierung des Enzyms verursachen, lassen sich mit Hilfe von E. coli N415G::pGD28 (pBS61dp), in dem die Expression von SPase I reprimiert werden kann (von Dijl et al., 1987), identifizieren. Die Repression des chromosomal lokalisierten lep- Gens dieses Stammes führt zu einer mangelnden Überlebensfähigkeit. Diese Wachstumshemmung kann nur unterdrückt werden, wenn der Stamm mit Plasmiden ttansformiert wird, die mutierte lep-Gene, die für aktive SPasen kodieren, enthalten.
Ein ähnlicher Ansatz, wie er vorstehend beschrieben wurde, kann auch für die Mutagenese von E. coli-SPase I herangezogen werden.
Sowohl die Mutagenese von B. subtilis- und E. coli-SPasen führt zu neuen SPasen mit unterschiedlichen Spezifitäten und veränderten Aktivitäten. Das Potential dieser neu geschaffenen SPasen zur Verbesserung des Exports von heterologen Proteinen in E. coli, B. subtilis und anderen Bacilli kann geprüft werden.

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SEQUENZPROTOKOLL

ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
ART: Nucleotid mit korrespondierendem Protein
LÄNGE: 1294 Nucleotide
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: genomisch
ORGANISMUS: Salmonella typhimurium

ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:

SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
ART: Nucleotid mit korrespondierendem Protein
LÄNGE: 93 Nucleotide
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: genomisch + Deletion
ORGANISMUS: Bacillus subtilis

ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:

SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
ART: Nucleotid mit korrespondierendem Protein
LÄNGE: 96 Nucleotide
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
MOLEKOLTYP: genomisch + Insert
ORGANISMUS: Bacillus subtilis

ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:

SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
ART: Nucleotid mit korrespondierendem Protein
LÄNGE: 797 Nucleotide
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
MOLEKÜLTYP: genomisch
ORGANISMUS: Bacillus subtilis
GATCTAAAGA TTTTGCATAT GAGAACTCTC TTTCTTCTGA 40
GTCCATCGCT TCTGAATTAT GCGATTCATT TCTTTCAATA 80
TTTTCAGGCC TAGTTATGAT CGACAAGAAA AAATAGGCAT 120
GATGTGGGTA GAAGATGAAG ATTAACAGTT TGTAAAATCA160
CTTCAATGGT CCTAATGGGA TTTTTTTTCG ATTCGTGATA 200

Claims

1. Eine für eine Signalpeptidase I kodierende DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß

a) die DNA-Sequenz aus einem gram-positiven Bakterium erhältlich ist und

b) die Signalpeptidase I eine Aminosäuresequenz umfaßt, die zu 70% oder mehr Identität mit den Aminosäurenpositionen 136 bis 155 von SEQ ID NO: 4 zeigt.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei es sich beim gram-positiven Bakterium um ein Bakterium handelt, das aus der Gruppe Bacilli, Lactobacilli und Lactococci ausgewählt ist.

3. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei das Bakterium aus der Gruppe Bacillus subtilis, bacillus licheniforrriis, bacillus amyloliquefaciens und Bacillus alcalophilus ausgewählt ist.

4. Eine für ein Enzym mit proteolytischer Aktivität kodierende DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß

a) die DNA-Sequenz aus einem gram-positiven Bakterium erhältlich ist und

b) die DNA-Sequenz unter stringenten Bedingungen (6 · SSC, 60ºC, über Nacht) mit einer Sonde, die die Nucleotidpositionen 282 bis 605 von SEQ ID NO: 4 umfaßt, hybridisiert.

5. DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei eine Mutation in eine konservierte Region der DNA-Sequenz eingeführt ist, wobei es sich bei dieser Region um eine der unterstrichenen Regionen von SEQ ID NO: 4 handelt.

6. verfahren zur Auswahl eines für eine heterologe Signalpeptidase kodierenden Gens, umfassend folgende Stufen:

a) Klonieren von verdauten chromosomalen DNA-Fragmenten in einem Expressionsvehikel,

b) Transformieren eines geeigneten Wirtes, dessen endogenes Signalpeptidase-Gen unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors steht, mit dem in a) erhaltenen Expressionsvehikel,

c) Auswählen von Zellen, die unter Bedingungen, die den regulierbaren Promotor gemäß b) reprimieren, normal wachsen und

d) Isolieren des heterologen Signalpeptidase-Gens aus den in c) ausgewählten Zellen.

7. Verfahren zum Selektieren eines für eine heterologe Signalpeptidase kodierenden Gens, umfassend folgende Stufen:

b) Transformieren einer Wirtszelle, die ein Reporterprotein mit einem geringeren Prozessierungswirkungsgrad enthält, mit dem in a) erhaltenen Expressionsvehikel,

c) Selektieren der transformierten Zellen unter Anwendung eines zum Nachweis der Überproduktion des Reporterproteins in Gegenwart einer heterologen Signalpeptidase geeigneten Tests und

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die chromosomalen DNA- Fragmente aus einem gram-positiven Bakterium erhalten werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei es sich bei dem Mikroorganismus um ein Bakterium handelt, das aus der Gruppe Bacilli, Lactobacilli und Lactococci ausgewählt ist.

10. Verwendung einer DNA-Sequenz gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Erzielung einer erhöhten Geschwindigkeit der Prozessierung eines heterologen oder homologen Proteins mit einem Gehalt an einem Signalpeptid.

11. Rekombinanter Wirt, enthaltend:

a) eine klonierte DNA-Sequenz gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 5 und

b) eine klonierte DNA, die für ein in Frage stehendes Protein kodiert.

12. Rekombinanter Wirt nach Anspruch 11, in dem die klonierte DNA- Sequenz überexprimiert wird.

13. Rekombinanter Wirt nach einem der Ansprüche 11 oder 12, wobei es sich bei dem Wirt um ein gram-positives Bakterium handelt.

14. Rekombinanter Wirt nach Anspruch 13, wobei es sich bei dem Wirt um einen Bacillus handelt.

15. Verwendung eines rekombinanten Wirtes nach einem der Ansprüche 11 bis 14 zur Erzeugung eines Proteins.

16. Mutante Signalpeptidase, die durch eine DNA-Sequenz gemäß der Definition in Anspruch 5 kodiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß die mutante Signalpeptidase eine erhöhte Geschwindigkeit der Prozessierung eines heterologen oder homologen Proteins, das ein Signalpeptid enthält, hervorruft.