DE3750378T2 - Sekretionssignal-Selektionsvektoren für extrazelluläre Proteinsynthese in Bazillen. - Google Patents
Sekretionssignal-Selektionsvektoren für extrazelluläre Proteinsynthese in Bazillen.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erkennung unbekannter sekretorischer Signalsequenzen und die Verwendung dieser sekretorischen Signalsequenzen zur Herstellung mit hoher Ausbeute von extrazellulären Proteinen, vorzugsweise von Enzymen, in rekombinanten DNA-Mikroorganismen der Gattung Bacillus.
- Infolge einiger sehr vorteilhafter Eigenschaften haben die Bacilli eine sehr lange Verwendungsgeschichte in der industriellen Fermentation in großem Maßstabe. Sie sind wachstumsfähig auf eher billigen Nährstoffen, sie erzeugen keine Endotoxine, so daß sie für den Menschen, die Pflanzen und die Tiere ungefährlich sind, und sie sind zur Synthese zahlreicher, für die Industrie interessanter Proteine, wie der Enzyme, in der Form von extrazellulären Produkten fähig, welche in den meisten Fällen ziemlich leicht isoliert werden können.
- Diese Kombination von charakteristischen Eigenschaften, insbesondere die Sekretion von Produkten in das Kulturmedium, macht die Verwendung der Bacilli für kommerzielle Zwecke viel attraktiver als beispielsweise die Verwendung von E. coli. Um den wirtschaftlichen Wert der Bacilli noch mehr zu steigern, sind zahlreiche Versuche zur Entwicklung eines Wirt-Vektorsystems von Bacillus sowohl für die homologe als auch für die heterologe Genexpression gemacht worden. Siehe beispielsweise D. Dubnau in "Experimental Manipulation of Gene Expression", Academic Press (1983) 33-51 und R.H. Doi, Biotechnology and Genetic Engineering 2 (1984) 126-155.
- Unglücklicherweise hat sich allerdings die Ausbeute der Expression und der Sekretion relativ schwach erwiesen. Siehe beispielsweise S. Kovacevic et al., j. Bacteriol. 162 (1985) 521-528, C.W. Saunders et al., j. Bacteriol. 157 (1984) 718-726, R. Ohmura et al., J. Biochem. 95 (1984) 87-93, Sammlung der Auszüge der 3. Internationalen Konferenz über Genetik und Biotechnologie der Bacillen, Stanford, USA (1984), K. Lundström, FEMS Letters 23 (1984) 65-70, I. Palva et al., Gene 22 (1983) 229-235, K. Lundström et al., Virus Res. 2 (1985) 69-83, K. Hardy et al., Nature 293 (1981) 481- 483, K. Mosbach et al., Nature 302 (1983) 543-545, S. Chang et al., NSC Ser. 4 (1982) 254-261, D.M. Williams et al., Gene 16 (1981) 199-206 and J.I. Flock et al., Mol. Gen. Genet. 195 (1984) 246-251.
- Bezüglich einer auf eine wirtschaftlich annehmbare Ausbeute gesteigerten Expression ist bereits von zahlreichen Verbesserungen des Klonierungssystems vom Bacillus berichtet worden. Sie beziehen sich zur Hauptsache auf Verbesserungen der Promotor-Region, um die Wirksamkeit der Transkription zu erhöhen [D.M. Williams et al., J. Bacteriol. 146 (1981) 1162-1165, R.G. Schoner et al., Gene 22 (1983) 47-57, D.S.
- Goldfarb et al., Nature 293 (1981) 309-311, L. Band et al., Gene 26 (1983) 313-315, C.E. Donelly und A.L. Sonnenshein, J. Bacteriol. 157 (1984) 965-967 und europäische Patentanmeldung Nr. 86201951.0], betreffen aber auch Verbesserungen der Shine-Dalgarno-Region, um die Wirksamkeit der Translation zu erhöhen (A. Hui et al., EMBO Journal 3 (1984) 623-629, H. de Boer et al., DNA 2 (1983) 231-235, LI. Band und J. Henner, Biochem. Soc. Symp. 48 (1984) 233-245 und europäische Patentanmeldung Nr. 86101951.0]. Bis jetzt ist jedoch über den Aufbau und die Verwendung von Vektoren, welche die Isolierung, Verbesserungen und Verwendung von sekretorischen Signalsequenzen ermöglichen würden, nicht berichtet worden.
- Das meiste herkömmliche Wissen über die Proteinsekretion in prokaryotischen Zellen beschränkt sich auf E. coli [L.L. Randall und S.J.S. Hardy, Microbiol. Reviews 48 (1984) 290-298 und S.A. Benson et al., Ann. Rev. Biochem. 54 (1985) 101-134]. In E. coli, einem Gram-negativen Organismus, besteht die Sekretion eines Proteins in Wirklichkeit in dem Transport zum Periplasma, eher als zum Kulturmedium, wie es in Bacillus, einem Gram-positiven Organismus, der Fall ist. Die Kenntnis der Proteinsekretion in E. coli ist zur Hauptsache aus dem Studium der Fusionsproteine erhalten worden, welche einen an die beta-Galactosidase gebundenen Proteinabschnitt enthalten, der bekanntlich zum Periplasma verlagert wird.
- Eine sehr ernsthafte Beschränkung in der Verwendung solcher Hybridproteine besteht darin, daß der beta-Galactosidaseteil die Cytoplasmamembrane von E. coli zu passieren nicht fähig zu sein scheint, siehe C.S. Hoffman und A. Wright, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 5107-5111. Obschon diese Schwierigkeit durch die Verwendung einer alkalischen Phosphatase an Stelle der beta-Galactosidase [C. Monoil und J. Beckwith, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 8129-8133] überwunden worden ist, beschreiben die Autoren ihre mit einigen hybriden alkalischen Phosphatasen erhaltenen Ergebnisse als einen Transport aus dem Cytoplasma in das Periplasma, eher als eine Sekretion in das Kulturmedium.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erkennung einer unbekannten sekretorischen Signalsequenz auf einem DNA-Fragment einer Mikroorganismus- Wirtszelle zur Verfügung, welches Verfahren umfaßt: das Einfügen des besagten Fragments in ein Plasmid, das umfaßt: ein Replikationssystem, welches in einer Expressions-Wirtszelle funktionsfähig ist; eine multiple Klonierungsstelle, welche mindestens zwei für das besagte Plasmid einzigartige Restriktionsstellen besitzt; einen offenen Leseraster, welcher für ein Genprodukt codiert, das durch Sekretion nachweisbar ist, und an besagter Klonierungsstelle angrenzend ist; wobei besagte Insertion an einer oder zwei der besagten einzigartigen Stellen vorkommt und mit dem besagten offenen Leseraster in Phase ist; das Transformieren der besagten Expressions-Wirtszelle mit dem die besagte Insertion enthaltenden Plasmid; und das Züchten der besagten transformierten Wirtszelle in einem Nährmedium und das Nachweisen der Sekretion in dem besagten Medium mittels des besagten Genproduktes.
- Überraschenderweise wurde gefunden, daß bestimmte Signalsequenzen viel wirksamer sind als andere Sequenzen, welche eine hohe Ausbeute bei der Sekretion von bekannten extrazellulären Bacillus-Proteinen ergeben. Deshalb bringt die vorliegende Erfindung eine Verbesserung in den Ausbeuten an extrazellulären Proteinen, sowohl an homologen und heterologen Proteinen, welche bisher nicht auf wirksame Weise sekretiert worden waren, -als auch an Proteinen (beispielsweise Enzymen), welche bereits auf wirksame Weise sekretiert worden waren.
- Diese Figur zeigt die Klonierungsstrategie für die Konstruktion von pGPA11, pGPB11 und pGPP11. Die Ursprünge der Plasmidsegmente werden im Schlüssel angegeben. Dargelegt werden nur jene Restriktionsstellen, welche für die Konstruktion und die Eigenschaften der rekombinanten Plasmide relevant sind.
- Diese Figur zeigt die Klonierungsstrategie für die Konstruktion von pHP12. Die Ursprünge der Plasmidsegmente werden im Schlüssel angegeben. Dargestellt werden nur jene Stellen, welche für die Konstruktion und die Eigenschaften des rekombinanten Plasmids relevant sind. Das Plasmid pHP14 wurde auf ähnliche Weise konstruiert, mit der Ausnahme, daß das 1,6 kb AatII- AhaIII-Fragment aus pUC13 übernommen wurde.
- Diese Figur zeigt die DNA-Sequenzen an den Fusionsstellen der Polylinker (MCS) mit den Strukturgenen (A: alpha-Amylase; B: beta-Lactamase; C: penP). Die senkrechten Pfeile in Fig. 3A und 3C geben die ursprünglichen Spaltstellen für die Leader-Peptidase an. Zahlreiche Codone um die Verarbeitungsstellen herum sind numeriert und die entsprechenden Aminosäuren sind kursiv angegeben. Die Derivate der Plasmide pGPA14, pGPB14 und pGPP14 sind hergestellt worden durch Verdauen von pGPA11, pGPB11 bzw. pGPP11 mit PstI und danach Zurückkauen mit der DNA-Polymerase T4 zur Bildung eines stumpfen Endes. In der Fig. 3C, L gibt die Aufarbeitungsstelle zu der großen extrazellulären Form der Penicillinase an; M gibt die membrangebundene Form der Penicillinase an. Die Plasmide pGPA14, pGPB14 und pGPP14 sind am 2. Mai 1986 bei dem Centraal Bureau of Schimmelcultures, Oosterstraat 1, NL- 3742 SK Baarn, gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages in dem Bacillus subtilis-Stamm 805 hinterlegt worden und es sind ihnen die Bezeichnungen CBS 245.86, CBS 246.86 bzw. CBS 247.86 zugeteilt worden.
- Diese Figur zeigt auf schematische Weise die Konstruktion der alpha-Amylase-beta-Lactamase- und der penP-beta-Lactamase-Genfusionen. Zahlreiche Codone um die PSTI-Stellen sind numeriert. Die ----Linie gibt ein aus der pGK13-alpha-Amylase abgeleitetes Fragment an; die -.-.-Linie gibt ein aus pRW101 abgeleitetes Fragment an, die ------Linie gibt ein beta-Lactamase- Gen aus pGPB11 an und die +++++-Linie gibt geladene Aminosäureradikale an. Für Einzelheiten siehe Beispiel V.
- Diese Figur zeigt die penP-penP- und die alpha- Amylase-penP-Genfusionen. In pGPP3 ist die ursprüngliche, für die penP-Signalsequenz codierende Region wiederhergestellt, während in pGPP5 eine Region für eine Hybridsignalsequenz konstruiert ist. Für Einzelheiten, siehe Beispiel V. Das durch - .- .- angegebene Teilstück ist aus pRW101 und das als ---- angegebene Teilstück aus der pGK13-alpha-Amylase abgeleitet.
- Die rekombinanten Bakterien (siehe Tabelle 2) sind in TY und in dem Minimalmedium gezüchtet worden. Die beta-Lactamase-Aktivität ist mittels Nitrocefin wie weiter unten auf Seite 22 beschrieben bestimmt worden. Das Wachstum der Bakterien ist durch die Absorption bei 450 nm überwacht worden. - - , A&sub4;&sub5;&sub0;/TY; - - , A&sub4;&sub5;&sub0;/ Minimalmedium; - - , beta-Lactamase-Aktivität in dem TY-Medium; Δ-Δ-Δ, beta-Lactamase-Aktivität in dem Minimalmedium.
- Es werden Verfahren und Zusammensetzungen zur Erkennung von Signalsequenzen zur Verfügung gestellt, welche an der Sekretion in unizellulären Mikroorganismen, insbesondere in prokaryotischen Organismen, beteiligt sind. Die Verfahren werden zur Identifizierung von Signalsequenzen verwendet, welche in dem Wirtsgenom, auf dem Genom anderer Organismen und auf anderen DNA- Fragmenten (identifiziert oder nicht identifiziert) vorhanden sind, zur Bestimmung solcher Sequenzen und danach zur Ermöglichung des Isolierens der Sequenzen und der Verwendung derselben mit einem anderen als dem Wildtypgen, um eine wirksame Sekretion der interessierenden Polypeptidsequenzen, insbesondere der dem Expressionswirt fremden Sequenzen, zu erreichen. Durch Verwendung des Erfindungsgegenstands kann die Signalsequenz erkannt und mit einer Vielzahl von anderen Genen als mit dem mit der Signalsequenz verbundenen Wildtypgen bestimmt werden. Auf diese Weise entdeckte wirksame Signalsequenzen können dann für die wirksame Sekretion von interessierenden Produkten wie von Proteinen oder Enzymen - sowohl prokaryotisch als auch eukaryotisch - von Säugetieren, von Bioziden, Strukturpolymeren usw. verwendet werden.
- Der Erfindungsgegenstand wird durch eine Bestimmung der Signalsequenzen in Bacillus subtilis und Escherichia coli veranschaulicht. Während sich E. coli als besonders brauchbarer Klonierungswirt erweist und ungeachtet der Quelle der Signalsequenzen der interessierende Wirt für die DNA-Klonierung sein dürfte, kann B. subtilis als Beispiel der Bacillus-Organismen, wie B. thuringiensis, B. stearothermophilus, B. licheniformis, wie auch der anderen prokaryotischen Organismen betrachtet werden.
- Das Verfahren verwendet Vektoren, welche zum Klonieren und zum Screening von Genom-DNA oder cDNA nach der Gegenwart von Signalsequenzen, im allgemeinen von nicht identifizierten Fragmenten dienen. Die Vektoren sind durch eine Vielzahl von funktionellen Sequenzen gekennzeichnet. Die Vektoren haben mindestens einen, im allgemeinen zwei Replikationsursprünge, der eine für den Screening/Expressionswirt, welcher vorzugsweise ein Bacillus-Wirt ist, und der andere für einen Klonierungswirt, welcher vorzugsweise E. coli ist. Der Replikationsursprung des letzteren ist im allgemeinen aus reinen Bequemlichkeitsgründen eingefügt. In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung sind der Klonierungswirt und der Expressionswirt derselbe, vorzugsweise ein Bacillus-Wirt, so daß die Vektoren nur einen Replikationsursprung enthalten können. Für das Screening der Genome wird das Replikationssystem im allgemeinen von einer verhältnismäßig niedrigen Kopienzahl sein, im allgemeinen von mindestens 1 und nicht mehr als 500, noch allgemeiner von nicht mehr als 200 Kopienzahl. Die Kopienzahl in dem Klonierungswirt entspricht primär der Bequemlichkeit, sie ist nicht von Bedeutung in der vorliegenden Erfindung.
- Wahlweise hat der Vektor einen oder mehrere Promotoren, üblicherweise 0 bis 1 Promotor, welcher in dem Screening-Wirt funktionell ist. Das Vorliegen des Promotors ermöglicht die Erkennung von Signalsequenzen, welche von ihrem Wildtyp-Promotor abgetrennt worden sind, und die Erkennung neuer Signalsequenzen, insbesondere solcher, welche für Sequenzen codieren, die als sekretorische Signalsequenzen fungieren können, jedoch normalerweise diese Wirkung nicht besitzen. Auf diese Weise können verhältnismassig kleine Fragmente ausgesucht und die Gegenwart der Signalsequenzen erkannt werden. Darüber hinaus ist die Wirksamkeit der Signalsequenz für eine wirksame Produktion des gewünschten Peptides maßgebend, sie wird von der Wirksamkeit des Promotors unabhängig sein. Allerdings, da man die Ausbeute an Cytoplasma-Peptid im Vergleich zum sekretierten Peptid bestimmen kann, kann dieses Verhältnis zur Bestimmung der Wirksamkeit der Signalsequenz bezüglich der Sekretion verwendet werden.
- Das nächste funktionelle Element im Vektor, welcher bei Abwesenheit des Promotors das erste funktionelle Element sein kann, ist ein Polylinker (MCS). Der MCS ist dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens 2, üblicherweise mindestens 3, im allgemeinen nicht über 10, vorzugsweise nicht über 6, Restriktionsstellen besitzt, von welchen mindestens 2 und vorzugsweise alle für den Vektor einzigartig sind. Das heißt, daß der Vektor nur in dem MCS wird gespalten werden können. Die Klonierungsstellen können stumpfe Enden oder Überhänge von 1 bis 4 Nucleotiden haben, vorzugsweise haben sie Überhänge. Vorzugsweise werden die Überhänge für beides fähig sein, für die Hybridisierung mit den durch andere Restriktionsenzyme als jene Restriktionsenzyme, welche in dem MCS an der Restriktionsstelle spalten, erhaltenen Überhängen und für die Hybridisierung mit den mit demselben Restriktionsenzym erhaltenen Überhängen. Während die Einfügung eines Fragmentes, welches durch Restriktion mittels einer anderen Restriktions- Endonuclease als der für die Spaltung des Vektors verwendeten Restriktions-Endonuclease abgeleitet ist, die Unfähigkeit zum Ausschneiden der Einfügung zur Folge haben wird, kann dies in einigen Fällen erwünscht sein. In einigen Fällen kann dies die Verwendung von kleineren Fragmenten ermöglichen, indem eine Vielzahl von Restriktions-Endonucleasen mit unterschiedlichen Erkennungsstellen verwendet werden oder indem Restriktions- Endonucleasen verwendet werden, welche 4 anstelle von 6 Nucleotide erkennen.
- Im allgemeinen wird der MCS nicht mehr als etwa 100 Nucleotide, im allgemeinen nicht mehr als etwa 60 Nucleotide und im allgemeinen mindestens etwa 6 Nucleotide, allgemeiner noch mindestens etwa 10 Nucleotide haben.
- Vorzugsweise wird der MCS von Stopcodonen in dem Translations-Leseraster für die Strukturgene frei sein. Wenn ein adäquater MCS im Handel erhältlich ist, kann der MCS durch Spaltung an einer Restriktionsstelle in dem MCS und durch Entfernen oder Hinzufügen einer anderen Nucleotidanzahl als 3 oder ein Mehrfaches von 3 verändert werden, was eine Veränderung in dem Leseraster zur Folge hat. Auf diese Weise wird der Leseraster so verändert werden, daß die Termination der Expression an einer Stelle innerhalb des MCS verhindert wird. Vorzugsweise wird der MCS von Codonen verhältnismäßig frei sein, welche mit einer wirksamen Sekrektion des Expressionsproduktes interferieren könnten. Bei dieser Sachlage werden mindestens 50% der durch den MCS codierten Codone für neutrale Aminosäuren, vorzugsweise mindestens etwa 80%, codieren. Vorzugsweise werden mindestens etwa 60% der Codone aliphatisch sein, wobei die Seitenkette polar sein kann, beispielsweise eine Oxi-, Thio- oder Amidofunktion tragen kann, oder nicht polar und lediglich aus Wasserstoff und Kohlenstoff bestehen kann. Darüber hinaus wird der MCS üblicherweise kein Aufarbeitungssignal tragen.
- Bezüglich einer Signalsequenz wird die Signalsequenz normalerweise drei Regionen enthalten. Die erste Region wird normalerweise eine hydrophile Region sein, welche üblicherweise eine, noch üblicher mindestens etwa zwei positiv geladene Aminosäuren, beispielsweise K oder R, einschließt. Auf der geladenen Region wird üblicherweise eine hydrophobe Region folgen, wobei die Mehrzahl der Aminosäuren nicht polare Aminosäuren sein wird. Der hydrophoben Region wird dann eine stärker polare Region mit dem Aufarbeitungssignal folgen, welches zwei oder mehrere Aminosäuren einschließen kann, die durch ein besonderes, an der Aufarbeitungsstelle spaltendes Leader-Peptidenzym erkannt werden. Die Aufarbeitungssignale können soviel wie 8 oder mehr Aminosäuren enthalten und können durch die Aminosäuren beeinflußt sein, welche in dem reifen Peptid der Aufarbeitungsstelle unmittelbar naheliegen.
- Der MCS kann eine Kette von zwei oder mehreren Aminosäuren zwischen dem Genomfragment und dem Expressionsprodukt hergeben. Üblicherweise wird der MCS weniger als 30 Aminosäuren, vorzugsweise weniger als etwa 20 Aminosäuren, hergeben. Selbstverständlich wird die Anzahl der durch den MCS eingefügten Aminosäuren nicht nur von der Größe des MCS, sondern auch von der Stelle abhängig sein, bei welcher das Genomfragment in dem MCS eingefügt ist.
- Das Expressionsprodukt wird dem MCS angrenzend sein. Das Expressionsprodukt kann, muß aber nicht, den C-terminalen Teil einer Signalsequenz oder das mit dem Expressionsprodukt verbundene Aufarbeitungssignal des Wildtyps enthalten. Vorzugsweise werden eine Vielzahl von Expressionsprodukten in verschiedenen Vektoren verwendet, wobei ein Vektor ein ein Aufarbeitungssignal enthaltendes Gen verwenden und der andere Vektor ein Gen ohne Aufarbeitungssignal verwenden kann. Auf diese Weise kann man durch einen Vergleich der erhaltenen Produkte abklären, ob das Fragment ein wirksames Aufarbeitungssignal enthält oder nicht.
- Das verwendete Gen muß einer Anzahl Anforderungen entsprechen. Eine Anforderung besteht darin, daß das Gen leicht erkannt werden kann, entweder durch Auffinden eines Metabolits, des Widerstandes gegenüber einem Biozid, beispielsweise einem Antibiotikum, oder durch andere Mittel, welche eine rasche Prüfung auf die Sekretion des Expressionsproduktes ermöglichen. In den meisten Fällen wird das Expressionsprodukt ein Enzym sein, welches ein leicht erkennbares Metabolit, beispielsweise die Amylase, ob die alpha- oder die beta- Amylase, erzeugt; welches einen Schutz gegenüber einem Antibiotikum, beispielsweise der beta-Lactamase, der Penicillinase oder dem Bakteriocin, schafft. Während ein Screening der überstehenden Flüssigkeit unter Verwendung verschiedener Bestimmungsmethoden, beispielsweise der Immunbestimmungen, des Southern-Blotting usw., möglich ist, um in der überstehenden Flüssigkeit das Expressionsprodukt aufzufinden, sollte das Expressionsprodukt vorzugsweise ein rasches Screening ermöglichen und es wird üblicherweise erst nach dem Auffinden von positiven Klonen erwünscht sein, in der überstehenden Flüssigkeit die Ausbeute an Expressionsprodukt quantitativ zu bestimmen. Zusätzlich wird die Bestimmung der Ausbeute an Cytoplasma-Expressionsprodukt üblicherweise von Interesse sein. Da das Cytoplasmaprodukt in den meisten Fällen unaufgearbeitet sein wird, ist es wünschenswert, daß das Expressionsprodukt sowohl mit als auch ohne den N-terminalen Leader aktiv sei.
- Schließlich kann der Vektor auch einen oder mehrere Markierer enthalten. Unter Markierer ist ein Gen gemeint, welches zur Expression in dem besonderen Wirt fähig ist und eine leichte Selektion jener den Vektor enthaltenden Wirte ermöglicht. Der Markierer kann gegenüber einem Biozid, beispielsweise einem Antibiotikum wie oben beschrieben sowie auch gegenüber anderen Antibiotika wie dem Erythromycin, dem Actinomycin, dem Chloramphenicol, dem Tetracyclin usw., Widerstand gewähren, er kann auxotrophe Wirte zwecks Erzeugung von Prototrophie ergänzen usw. Für jeden der einbezogenen Wirte, sofern die Klonierungs- und Screeningwirte unterschiedliche Markierer verlangen, werden üblicherweise zwei Markierer vorliegen. Auf diese Weise können die Klone rasch geprüft werden, um die den Vektor enthaltenden Klone und die den Vektor nicht enthaltenden Klone voneinander zu unterscheiden.
- Das Genomscreening kann sowohl mit einer genomischen Genbank, das heißt, eine Restriktionsendonuclease oder ein Spaltprodukt aus dem Chromosom und jedwelche in dem Wirt vorhandene extrachromosomale Elemente, als auch mit einer cDNA-Genbank durchgeführt werden, wobei darauf geachtet werden muß, daß die die N-terminale Sequenz codierende Sequenz während der Reverse- Transkription und Replikation erhalten worden ist. Die verwendeten Fragmente werden üblicherweise mindestens etwa 45 bp, nicht mehr als etwa 5 kbp, üblicherweise nicht mehr als etwa 2 kbp und vorzugsweise mindestens etwa 60 bp enthalten. Da die Fragmente beliebig sind, können sie nicht nur den Promotor und die nicht codierende 5-Sequenz, sondern auch die die Signalsequenz und das Aufarbeitungssignal codierende Sequenz und sogar Teile des reifen Expressionsproduktes enthalten. Die Restriktionsfragmente werden mit mindestens einer Restriktionsendonuclease, öfters mit einer Vielzahl von Restriktionsendonucleasen erhalten werden, wobei die Restriktionsendonucleasen dieselben oder unterschiedliche Überhänge oder Fragmente mit stumpfen Enden erzeugen können.
- Eine Anzahl unterschiedlicher Methoden kann zur Steuerung der Fragmentgröße verwendet werden. Beispielsweise kann man eine Restriktionsendonuclease, welche einen komplementären Überhang erzeugt, und eine zweite Restriktionsendonuclease verwenden, welche eine ziemlich herkömmliche Stelle erkennt, jedoch ein Ende erzeugt, welches mit dem Ende der Restriktionsstelle des Vektors nicht komplementär ist. Nachdem die Fragmente dem gespaltenen Vektor hinzugefügt worden sind, kann man die erhaltene lineare DNA zusätzlichen Restriktionsenzymen unterziehen, wobei Erkennungsstellen für diese Restriktionsenzyme in dem Vektor fehlen. Auf diese Weise kann eine Vielfalt von Größen erhalten werden.
- Wenn der Vektor einen Promotor enthält, kann man es sich leisten, kleinere Fragmente zu verwenden, als wenn der Vektor den Promotor nicht enthält. So ist es in vielen Fällen wünschenswert, entweder größere Fragmente zu verwenden oder einen Promotor zu haben, welcher in Bezug auf den MCS aufwärts sitzt und die Transkription der Einfügung im Zusammenhang mit dem Expressionsprodukt ermöglicht.
- Nachdem die Insertion in den Vektor eingefügt und auf jede adäquate Art gehandhabt worden ist, kann der Vektor dann in den Klonierungswirt transformiert werden. Es kann erwünscht sein, auch die Expression in dem Klonierungswirt zu erzeugen. In diesem Fall werden die Promotoren der Genomquelle in dem Klonierungsvektor funktionsfähig sein oder es wird ein Promotor zur Verfügung gestellt, welcher in dem Klonierungswirt die Transkription der Expressionskonstruktion besorgt. Auf diese Weise kann man zusätzlich abklären, ob die Signalsequenz und das Aufarbeitungssignal durch den Klonierungswirt sowie auch durch den Wirt der Genomquelle erkannt werden. So kann man einen Hinweis auf das Vorhandensein einer Signalsequenz erhalten, da ein positives Ergebnis in hohem Masse, wenn auch nicht endgültig, für das Vorhandensein einer funktionellen Signalsequenz in dem Expressionswirt sprechen wird. Manchmal kann das Klonieren und das Screening in dem Expressionswirt erwünscht sein. In einem solchen Fall kann der Vektor mitsamt der Insertion direkt in den Expressionswirt transformiert werden.
- Jede Methode kann zur Einfügung des Vektors in den Klonierungswirt sowie auch in den Expressionswirt verwendet werden. Verschiedene Methoden umfassen die Konjugation, die Transformation, die Transfektion, die Elektroporation, die Fusion usw. Die erhaltenen Transformanten können dann auf einem geeigneten Nährstoffmedium gezüchtet werden, welches die Selektion jener Klonierungswirte beschafft, welche die Vektoren enthalten. Die Vektoren können dann isoliert und durch Transformieren in einen geeigneten Expressionswirt überprüft und in einem für den Wirt geeigneten Nährstoffmedium gezüchtet werden. Eine wirksame Sekretion kann durch Überprüfen der überstehenden Flüssigkeiten auf die Gegenwart des sekretierten Produktes abgeschätzt werden. So können während oder nach dem Wachstum je nach der Eigenart des Expressionsproduktes verschiedene Reagentien zugegeben werden, welche beispielsweise ein erkennbares Signal, zum Beispiel eine Färbungsreaktion, erzeugen oder welche für den Wirt, in Abwesenheit des sekretierten Expressionsprodukt lethal sind usw. Auf diese Weise kann man rasch eine große Anzahl Klone für eine wirksame Sekretion auffinden.
- Jene Klone, welche erfolgsversprechend zu sein scheinen, können dann auf vielfache Weise weiter analysiert werden. Die Insertion kann herausgeschnitten werden, wobei die angrenzenden Restriktionsstellen verwendet werden, und zwar jene für die Einfügung verwendete oder jene in dem MCS vorhandene aber nicht verwendete Stellen, und das erhaltene Fragment isoliert wird. Dieses Fragment kann dann sequenziert werden, so daß das Startcodon und die Signalsequenz aufgrund der Codierungscharakteristiken bestimmt werden können. Das Proteinprodukt kann zur Bestimmung der Stelle sequenziert werden, bei welcher die Aufarbeitung erfolgt ist. Die Nucleinsäuresequenz kann dann als Probe zur Bestimmung des Wildtypgens verwendet werden, welches diese besondere Signalsequenz verwendet. Die Signalsequenz kann isoliert werden oder es kann erwünscht sein, eine DNA-Sequenz zu isolieren, welche die Signalsequenz und das Aufarbeitungssignal zusammen mit ein paar Codonen des Wildtypgens unterhalb des Aufarbeitungssignals codiert. Die zusätzlichen Codone können die Sekretionswirksamkeit steigern. Zusätzlich kann man die Promotorregion und die nicht codierende Sequenz erhalten, welche zur Erhöhung der Transkription und der Translation des Produktes wertvoll sein können.
- Durch Verwendung des vorliegenden Verfahrens sind eine Anzahl von früher unbekannten Signalsequenzen isoliert und als mit anderen Genen als mit dem Wildtypgen aktiv nachgewiesen worden. Diese Signalsequenzen codieren für Aminosäuresequenzen, wie in dem experimentellen Teil dargelegt wird.
- Diese Signalsequenzen können an jedes für die Sekretion interessierende Gen, insbesondere in einem Bacillus-Wirt, gebunden werden. Die Sequenzen können auf eine vielfältige Art abgeändert werden. Die 3' proximale Sequenz kann wenn nötig zur Einfügung einer geeigneten Restriktionsstelle verändert werden. Ein oder mehrere Codone können zur Aufarbeitungsstelle hinzugefügt werden, um eine geeignete Restriktionsstelle zu erzeugen. Üblicherweise wird die Anzahl Codone kleiner als 5, noch allgemeiner kleiner als 6, im allgemeinen mindestens 2 sein, wobei die Codone in Verbindung mit den in der Aufarbeitungsstelle vorhandenen Nucleinsäuren zur Bildung der Erkennungsstelle fungieren können. Wenn eine Restriktionsstelle oberhalb der Aufarbeitungsstelle liegt, kann ein Adaptor hergestellt werden, welcher die notwendigen, die Aufarbeitungsstelle codierenden Codone wiederherstellen soll. Ferner kann der Adaptor in das interessierende Gen verlängert werden, wobei er zu einer geeigneten Restriktionsstelle verlängert wird und die gesamte Konstruktion zu einem geeigneten Leseraster adaptiert.
- Die verschiedenen Fragmente können miteinander gemäß üblichen Mehtoden zwecks Bildung einer Expressionskonstruktion ligiert werden, welche eine wirksame Sekretion und Reifung des Endproduktes zur Folge hat. Das Expressionsprodukt kann in einen geeigneten Vektor eingefügt werden, welcher eine Transkriptions- und Translations-Startregion enthalten kann, oder eine solche Region kann mit der Signalsequenz derart verbunden sein, daß die Expressionskonstruktion die für die Transkription und die Translation notwendige Startregion und Terminationsregion einschließen kann. So kann die Konstruktion in einen Vektor eingefügt werden, welcher die Replikation und die Selektion wie oben beschrieben ermöglicht.
- Ein Bacillus-Wirt kann für die Erzeugung einer großen Vielfalt von Produkten, sowohl prokaryotischen als auch eukaryotischen, verwendet werden. Diese Produkte können eine Vielzahl von Enzymen umfassen, wie das Prochymosin, die alpha- und beta-Amylasen, die Proteasen, die Lipasen, die Esterasen, die Cellulasen, von Proteinen der Säugetiere, worunter Wachstumsfaktoren, Plasminogenaktivatoren, Lymphokine, Blutfaktoren, Interferone, Kolonie-stimulierende Faktoren, Endorphine, Serumalbumine, Hormone und Rezeptoren eingeschlossen sind.
- Mittels der vorliegenden Erfindung können die Produkte auf bequeme Weise aufgearbeitet und in die überstehende Flüssigkeit sekretiert werden, aus der sie isoliert und gereinigt werden können.
- Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung sind besondere Vektoren hergestellt worden. Die spezifischen Ausführungsformen, das heißt, die Konstruktion von pGPA11, pGPB11 und pGPP11 wird in Fig. 1 dargestellt. Diese Vektoren werden unter Verwendung der Plasmide pHP12 und pHP14 (siehe Fig. 2) aufgebaut, welche Hinundher-Vektoren von E. coli - B. subtilis (4,2 kb, Em®) sind und das Em®-Gen aus pGK13, den Replikationsursprung und die lacZ-Region aus pUC9 bzw. pUC13 und ein 1,6 kb-Fragment aus dem kryptischen, die Replikationsfunktionen enthaltenden B. subtilis-Plasmid pTA1 060 enthalten.
- Das Plasmid pGPA11 ist durch Einfügung eines 1,6 kb-PstI-HindIII-Fragments aus pGK13-alpha amy in PstI + HindIII-digeriertes pHP14 aufgebaut worden. Dieses Fragment trägt das alpha-Amylasegen aus B. licheniformis, es fehlt ihm jedoch die für die ersten 26 N-terminalen Aminosäureradikale des nativen Signalpeptids (insgesamt 29 Aminosäuren) codierende Region. Deshalb enthält dieser Vektor weiterhin die ursprüngliche Aufarbeitungsstelle des alpha-Amylasegens.
- Das Plasmid PGPP11 enthält ein 1,2 kb-PstI- HindIII-Fragment aus pRW101, welches das meiste des Penicillinasegens aus B. licheniformis enthält, die für die ersten 13 N-terminalen Aminosäureradikale (die gesamte hydrophile Region) des Signalpeptides codierende Region nicht enthält. Dieses Fragment wurde zu PstI + HindIII digeriertem pHP14 verschmolzen.
- Das Plasmid pGPB11 ist dadurch hergestellt worden, daß in die HindIII-Stelle von pHP14 ein HindIII- Fragment von 1,5 kb eingefügt worden ist, welches das beta-Lactamasegen von E. coli aus pKTH74 trägt, in welchem die gesamte die Signalsequenz codierende Region, einschließlich der ursprünglichen Aufarbeitungsstelle, fehlt.
- In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung sind diese drei rekombinanten Vektoren zum Isolieren der das sekretorische Signal codierenden Regionen verwendet worden, indem eine Schrotschußklonierung der Restriktionsfragmente der chromosomalen DNA von B. subtilis in die multiplen Klonierungsstellen der entsprechenden Vektoren ausgeführt wurde. Wie in Fig. 3 gesehen werden kann, enthält der MCS jedoch in pGPA11, pGPB11 und pGPP11 ein amber (TAG) nonsense-Codon (an der XbaI-Stelle) in dem Leseraster der Strukturgene. Da dies die Anzahl Stellen in dem MCS beschränkt, welche für Schrotschuß-Experimente verwendet werden können, ist in einer anderen Ausführungsform dieses amber-Codon durch Verdauen des Plasmids mit PstI und danach Entfernen der in 3'-herausragenden kohäsiven Enden mittels der DNA-Polymerase T4 eliminiert worden. Die erhaltenen Vektoren sind durch pGPA14, pGPB14 bzw. pGPP14 (siehe Fig. 3) bezeichnet worden.
- In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind Derivate der Plasmide pGA14, pGPB14 und pGPP14 hergestellt worden, in welchen das einen SPO2-Promotor enthaltende EcoRI-Fragment von 278 bp aus pPL608 in die einzige EcoRI-Stelle des MCS kloniert worden war. Es wird verstanden werden, daß jedes aus der DNA des Bacillus-Phagen SP02 abgeleitete Fragment mit Startaktivität für die Transkription verwendet werden kann. Diese Vektoren haben gegenüber den ursprünglichen den Vorteil, daß sie das Auffinden von zusätzlichen, das sekretorische Signal codierenden Fragmenten, nämlich von solchen ohne Promotoren, ermöglichen.
- Die Erfindung ist weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, welche lediglich als Erläuterung und nicht als Beschränkung betrachtet werden müssen.
- Amp®, Ampicillin-Resistenz; Cm®, Chloramphenicol- Resistenz; Em®, Erythromycin-Resistenz; Km®, Kanamycin- Resistenz; MCS, multiple Konierungsstelle; bp, Basenpaare; kb, Kilobasenpaare.
- Die TY-Media haben (per Liter) enthalten: 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 10 g NaCl; pH 7,4. Die in der für B. subtilis (805) geeigneten Zusammensetzung verwendeten Minimalmedia sind durch S. Bron und G. Venema, Mutat. Res. 15 (1972) 1-10 beschrieben worden. Die bei der Protoplast-Transformation von B. subtilis verwendeten Media sind durch S. Chang und S.N. Cohen, Mol. Gen. Genet. 168 (1979) 111-115 beschrieben worden. Die Media sind mit selektiven Antibiotika folgendermaßen ergänzt worden: für B. subtilis: Cm, 5 ug/ml; Em, 1 ug/ml und für E. coli: Amp, 25 ug/ml; Em 100 ug/ml; wenn nichts anderes steht.
- Restriktionsenzyme, DNA-Polymerase I, DNA-Polymerase T4, Bal 31, die Nuclease der Mungobohnen und die DNA-Ligase T4, von Boehringer, Mannheim (BRD), oder von New England Biolabs (Beverly, Mass.) erhalten, sind gemäß den Angaben der Verkäufer verwendet worden.
- In den Beispielen sind die allgemeinen Analysenmethoden folgendermaßen ausgeführt worden.
- Die Gel-Elektrophorese auf Agarose ist bei 10 bis 50 mA auf 10 cm · 6,5 cm · 0,5 cm horizontal dick aufgetragenen Gelen ausgeführt worden, welche 0,8 bis 2,0% Agarose (Bio-Rad), Richmond, Calif.) enthielten. Der Elektrophotese-Puffer hat aus 89 mM Tris-HCl, 89 mM Borsäure und 10 mM EDTA, pH 8,3 bestanden. Zur Färbung der DNA ist Ethidiumbromid, 1 ug/ml, zugegeben worden.
- In diesem Fall hat die Substratlösung 60 mg Stärke Azure (Sigma) enthalten, welche in 10 ml 20 mM Kaliumphosphat von pH 7,5 und 50 mM NaCl suspendiert waren, und sie wurde während einer Minute bei 100ºC erhitzt. Das Gemisch wurde während 5 Minuten bei 5000 UpM zentrifugiert und das Pellet wurde in 10 ml 20 mM K-Phosphat von pH 7,5 und 50 mM NaCl wieder suspendiert. Danach wurden Anteile von 1,5 ml der Stärkesuspension mit geeigneten Mengen der Enzymlösung inkubiert und die Inkubation wurde während 10 bis 60 Minuten bei 37ºC in einem Wasserbad-Schüttelapparat (250 UpM) durchgeführt. Die Reaktionen wurden durch Zentrifugieren während 5 Minuten bei 5000 UpM in einer Eppendorf- Zentrifuge gestoppt und hierauf wurde die Absorption der überstehenden Flüssigkeiten bei 595 nm gemessen. Als alpha-Amylase-Einheit wurde die Enzymmenge definiert, welche die Absorption in einer Stunde bei 37ºC um 1,0 erhöhte.
- Die E. coli-Kolonien wurden auf TY-Platten gezüchtet, welche mit 1% löslicher Stärke ergänzt waren. Die B. subtilis-Kolonien wurden auf Minimalagar-Platten ohne Glukose gezüchtet, welche mit 1% löslicher Stärke ergänzt waren. Nach Gießen des Iodreagens (0,3% I&sub2; + 0,6% KI) auf die Platten erschienen Haloringe um die alpha-Amylase produzierenden Kolonien.
- Die Gel-Elektrophorese mit Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamid (SDS-PAA) wurde auf dick aufgetragenen Gelen nach der Methode von Laemmli (U.K. Laemmli, Nature 227 (1970) 680-685) durchgeführt. Zum Feststellen der alpha-Amylase-Aktivität wurden die 0,25% lösliche Stärke enthaltenden Gele übereinander geschichtet und abgetrennt. Nach der Elektrophorese wurden die Gele in 1,0 M Tris/HCl von pH 6,8 + 0,25% Stärke (vier mal während 30 Minuten) gewaschen, um das SDS zu entfernen und die Renaturierung der Protein zu ermöglichen. Hierauf wurden die Gele während zwei Stunden bei 65ºC (oder über Nacht bei 37ºC) in demselben Puffer inkubiert. Die alpha-Amylase-Aktivität wurde als helle Zonen sichtbar gemacht, nachdem die Stärke in den Gelen durch 0,5% I&sub2; + 1,5% KI blau gefärbt worden war.
- Die beta-Lactamase-Aktivität in den überstehenden Flüssigkeiten der B. subtilis-Kulturen wurde spektrophotometrisch unter Verwendung von Nitrocefin (Becton Dickinson B.V., Amersfoort, die Niederlande) nach der Methode von C.H. O'Callaghan et al., Antimicrob. Ag. Chemother. 1 (1972) 283-288 bestimmt. Zur Herstellung der Substratlösung wurden 5 mg Nitrocefin in 0,5 ml Dimethylsulfoxid aufgelöst und hernach auf 10 ml mit 100 mM K-Phosphat von pH 7,0 verdünnt. Die Gemische für die Bestimmung enthielten 0,3 ml Substratlösung, 2,7 ml K-Phosphatpuffer von pH 7,0 und eine geeignete Menge (25-500 ul) der Enzymlösung und wurden während 5 bis 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Als Einheit der beta-Lactamase wurde die Enzymmenge definiert, welche die Absorption bei 486 nm in 1 Minute bei Raumtemperatur um 0,001 erhöht.
- Die die beta-Lactamase produzierenden E. coli- Kolonien wurden direkt durch Auftragen auf mit Amp (2 bis 20 ug/ml) ergänztes TY-Agar selektiert.
- Die B. subtilis-Kolonien, welche auf diese Weise nicht selektiert werden können, wurden auf TY oder auf mit 0,75% Polyvinylalkohol ergänztes Minimalagar aufgetragen. Die beta-Lactamase produzierenden Kolonien wurden als jene erkannt, welche nach Zugabe des Iodreagens (0,3% 12 + 0,6% KI) während 1 Minute Haloringe entwikkelten, worauf eine Inkubation mit 5% Penicillin G in 50 mM Na-Phosphat von pH 6,4 folgte.
- pKTH74 E. coli-Plasmid von 5,8 kb, Amp®, Tc®, beschrieben von I. Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 79 (1982) 5582-5586.
- pGK13 Streptococcus cemoris-Plasmid, pGK12-Derivat von 4,8 kb, Cm®, Em®, beschrieben von Kok et al. (1984), Laborsammlung, Universität von Groningen, die Niederlande.
- pGK13-alpha-Amylase: pGK13, trägt das alpha-Amylasegen von B. licheniformis, 7,8 kb, Cm®, Em®, alpha- Amylase&spplus;, Laborsammlung, Universität von Groningen, die Niederlande.
- pRW101 bifunktionelles Replicon, trägt das Penicillinasegen von B. licheniformis, 7,0 kb, Km® (B. subt.), Amp® (E. coli), beschrieben von P.S.F. Mezes et al., J. Biol. Chem. 258 (1983), 11211- 11218.
- pUC9 E. coli-Plasmid von 2,7 kb, Amp®, beschrieben von J. Vieria und J. Messing, Gene 19 (1982) 259.
- pUC13 E. coli-Plasmid von 2,7 kb, Amp®, beschrieben von J. Messing, Methods Enzymol. 101 (1983) 20- 78.
- pPL608 B. subtilis-Plasmid von 5,0 kb, Km®, Cm®, beschrieben von D.M. Williams et al., J. Bacteriol. 146 (1981), 1162-1165.
- pTA1060 kryptisches B. subtilis-Plasmid von 7,8 kb, beschrieben von T. Uozumi et al., J. Bacteriol. 142 (1980) 315-318.
- Die chromosomale DNA wurde aus B. subtilis (8G-5) wie durch S. Bron und G. Venema, Mutat. Res. 15 (1972) 1-10 beschrieben extrahiert. Präparative Mengen der Plasmid-DNA wurden nach der durch T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (198 2) S. 90 beschriebenen Arbeitsweise durch alkalische Lyse erhalten. Selektierte Restriktionsfragmente wurden durch Abtrennung auf 0,8% oder 2,0% Agarosegelen, danach Extraktion und Reinigung auf DEAE NA-45-Membranen (Schleicher & Schuell, Dassel, BRD) gemäß den Angaben des Herstellers erhalten. Zur Extraktion der Plasmide aus 2,5 ml Kulturen von E. coli wurde die durch D. Ish-Horowicz und J.F. Burke, Nucl. Acids Res. 9 (1981) 2989-2998 beschriebene analytische "Miniprep"-Arbeitsweise verwendet. Minipreps aus B. subtilis wurden nach derselben Arbeitsweise hergestellt, mit der Abänderung, daß vor der Lyse die Zellen aus 5 ml-Kulturen einmal durch Zentrifugieren mit SO mM Tris-HCl von pH 7,4, 10 mM EDTA und 200 mM NaCl gewaschen wurden. Miniprep-DNA wurde mit 100 ug/ml pankreatischer RNase (BDH, Poole, England) während 30 Minuten bei 37ºC inkubiert.
- Die Vektormoleküle und die spezielle Ziel-DNA wurden in einem Gewichtsverhältnis von ungefähr 1 : 2 und einer Gesamtkonzentration von 100 ug/ml vermischt.
- Zur Bindung der kohäsiven Enden wurden die Gemische während 5 Minuten bei 68ºC erhitzt. Die Pufferverhältnisse wurden auf 20 mM Tris-HCl, pH 7,6 10 mM MgCl&sub2;&sub1; 50 mM NaCl, 10 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM ATP und 50 ug/ml Rinderserumalbumin (BSA) (Boehringer Mannheim, BRD) eingestellt. Hierauf wurden ungefähr 0,2 E (für die kohäsiven Enden) oder 1 E (für die Ligierung der stumpfen Enden) der T&sub4;-Ligase zugegeben. Die Ligierungsgemische wurden über Nacht bei 4ºC (kohäsive Enden) oder über Nacht bei Raumtemperatur (stumpfe Enden) inkubiert. Die ligierten Proben wurden zum Transformieren der kompetenten Zellen von B. subtilis oder E. coli verwendet.
- Die Einfügung der ausgesparten kohäsiven Enden in 3' wurde durch Inkubieren der DNA (100 ug/ml) in 50 mM Tris-HCl von pH 7,2, 10 mM MgSO&sub4;, 0,1 mM DTT, 50 ug/ml BSA mit 1 E des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I und 0,1 mM der vier dNTPs während 15 Min. bei Raumtemperatur oder durch Inkubieren der DNA (100 ug/ml) mit 1 E der DNA-Polymerase T&sub4; während 30 Min. bei 37ºC in einem Puffer aus 33 mM Tris-Acetat von pH 7,9, 66 mM K- Acetat, 10 mM Mg-Acetat, 0,5 mM DTT, 0,1 mg/ml BSA und 0,1 mM der vier dNTPs ausgeführt. Die herausragenden 3'-Enden wurden mit der DNA-Polymerase T&sub4; unter denselben Bedingungen digeriert. Für eine teilweise Digerierung mit Bal 31 wurde die DNA (100 ug/ml) während 10 Minuten bei 30ºC mit 1 E von Bal 31 in 20 mM Tris-HCl von pH 9,1, 60 mM NaCl, 12 mM CaCl&sub2;, 12 mM MgCl&sub2; und 1 mM EDTA inkubiert. Die mit Bal 31 digerierte DNA wurde mit der DNA-Polymerase T&sub4; wie oben beschrieben behandelt und anschließend für die Ligierung verwendet.
- Zur Entfernung der herausragenden kohäsiven Enden in 5' wurde die DNA (100 ug/ml) während 25 Minuten bei 25ºC mit 0,5 E Mungobohnen-Nuclease in dem 51-Puffer inkubiert, welches enthielt: 50 mM Na-Acetat von pH 4,6, 280 mM NaCl, 4,5 mM ZnSO&sub4; und 0,5% Glycerin.
- Anteile von 0,1 ml der kompetenten Zellen von B. subtilis wurden in einem Wasserbad-Schüttelapparat zu 0,5 bis 1 ug Plasmid-DNA während 30 Minuten bei 37ºC ausgesetzt. Um ausreichend Zeit zur Expression der Markierer für Antibiotikaresistenz zu gewähren, wurde 0,1 ml TY-Medium zugegeben und die Suspension wurde während einer Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Transformanten wurden auf TY-Platten selektiert, welche mit selektiven Antibiotika (Em, 1 ug/ml; Km, 5 ug/ml) ergänzt worden waren. Die Protoplasten von B. subtilis wurden transformiert und regeneriert, wie durch S. Chang und S.N. Cohen, Mol. Gen. Genet. 168 (1979) 111- 115 beschrieben wird. Die transformierten Protoplasten wurden auf ein Em (5 ug/ml) enthaltendes DM3-Medium aufgetragen. Die E. coli-Zellen wurden kompetent gemacht und mit ungefähr 1 ug/ml Plasmid-DNA nach der durch T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) S. 250 beschriebenen CaCl&sub2;/Kälteschock-Technik transformiert. Nachdem Zeit zur Expression der Markierer für Antibiotikaresistenz (1 Stunde, 37ºC) gewährt wurde, wurden die Transformanten auf Antibiotika enthaltenden TY-Platten (Em, 200 ug/ml oder Em, 50 ug/ml + Amp, 2 ug/ml) selektiert.
- Die chromosomale DNA von B. subtilis wurde mit Sau3A, AluI, HaeIII oder RsaI digeriert und anschliessend mit BamH1- oder SmaI-digerierten Vektormolekülen (pGPB14 oder pGPA14) in einem Gewichtsverhältnis von 4 : 1 ligiert. Die ligierten Proben wurden zum Transformieren der kompetenten E. coli-Zellen verwendet. Die Transformanten wurden durch Auftragen auf TY-Platten selektiert, welche Em (200 ug/ml) + 1% lösliche Stärke (für pGPA14) enthielten. Die aus den Tranformanten extrahierte Plasmid-DNA wurde danach zum Transformieren der kompetenten B. subtilis-Zellen unter Selektion für Em (1 ug/ml) verwendet. Die Transformanten wurden auf ihre Fähigkeit zur Sekretion der alpha-Amylase oder der beta-Lactamase in das Kulturmedium, wie oben in dem experimentellen Teil beschrieben wurde, geprüft.
- Dieses Beispiel zeigt die Wirkung der Fusion der gestutzten Gene zu einer Anzahl bekannter Signalsequenzen in dem richtigen Leseraster, siehe Fig. 4 und 5.
- Gereinigte BamH1-PstI-Fragmente aus pRW101 und pGK13-alpha-amy wurden mit BamH1 + PstI-digeriertem pGPB11 ligiert. Das BamH1-PstI-Fragment von 300 bp aus pRW101 enthält den Promoter und die codierende Region für die ersten 13 N-terminalen Aminosäuren des penP- Signalpeptids. Das BamH1-Pst1-Fragment von 940 bp aus pGK13-alpha-amy codiert den gesamten Promotor und die gesamte Signalsequenz der alpha-Amylase, mit der Ausnahme der letzten drei Aminosäuren. Da die Amp®-Trans formanten in B. subtilis nicht direkt selektiert werden können (Amp® wurde als die Fähigkeit einer Einzelzelle zur Koloniebildung auf Ampicillin enthaltenden Platten definiert), wurden die Ligierungsgemische zum Transformieren der E. coli BHB2600-Zellen verwendet. Die pGPB15-Konstruktion, in welcher der Promotor und die die Signalsequenz codierende Region des alpha-Amylasegens dem gestutzten beta-Lactamasegen vorangehen, ergab eine beträchtliche Anzahl von Amp®-E. coli-Transformanten. Allerdings ergab die Fusion des Promotors und des hydrophilen Teils der die penP-Signalsequenz codierenden Region zum gestutzten beta-Lactamasegen (pGPB16) keine Amp®-Transformanten in E. coli.
- Diese Ergebnisse zeigen, daß das Auftreten von Amp®-Transformanten in E. coli von der Fusion einer funktionellen Signalsequenz zu dem gestutzten beta- Lactamasegen abhängig ist und daß die Übergabe der beta-Lactamase wiederhergestellt wurde. Überdies, da der Wildtypvorläufer der beta-Lactamase als inaktiv bekannt ist (P.C. Tai et al., Anal. Biochem. 144 (1985) 199-203 und R. Roggenkamp et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 1508-1512), gibt das Auftreten von Amp®-Transformanten (= beta-Lactamase-Aktivität) an, daß das Hybridprotein aufgearbeitet ist. Ferner bestätigen diese Ergebnisse die Annahme, daß die Signalsequenzen in funktioneller Hinsicht austauschbar sind (siehe auch Beispiel IX).
- Auch die Versuche mit pGPP3 (enthält die ursprüngliche penP-Signalsequenz) und pGPP5 (enthält das ursprüngliche hydrophobe Kernstück dieses Signals, verlängert mit 15 zusätzlichen Aminosäuren, siehe Einzelheiten in Fig. 5) haben gezeigt, daß die Hybrid-Signalsequenz in E. coli funktionell ist, siehe Tabelle 1. TABELLE 1 Eigenschaften verschiedener Genfusionen in B. subtilis und E. coli B. subtilis E. coli Plasmide Haloringe auf Platten Resistenzniveau gegenüber Amp "inoculum"-Wirkung
- Es wurden B. subtilis-Zellen, welche verschiedene rekombinante Plasmide enthielten, auf ihre Fähigkeit zur Bildung von Haloringen auf Polyvinylalkohol enthaltenden Platten wie auf Seite 23 beschrieben geprüft. Über Nacht geführte Kulturen von E. coli-Zellen, welche die verschiedenen rekombinanten Plasmide enthielten, wurden auf TY-Platten aufgetragen, welche mit steigenden Ampicillin-Konzentrationen ergänzt waren.
- Die maximale geprüfte Ampicillin-Konzentration betrug 300 ug/ml. Die Anzahl lebensfähige Zellen wurde als deren Prozentsatz auf nicht selektiven Platten ausgedrückt. Daß Plasmid pGPP11 zeigte eine ausgeprägte "inoculum"-Wirkung auf das erhältliche Resistenzniveau. Dies bedeutet, daß eine einzelne Zelle gegenüber niederen Ampicillin-Konzentrationen praktisch wehrlos ist, während das Resistenzniveau bei Verwendung größerer Inocula gewaltig zunimmt.
- Aus den in der Tabelle 1 dargelegten Ergebnissen geht hervor, daß das Plasmid pGPB15 im Gegensatz zur Kontrolle (pGPB11) die E. coli-Zellen gegenüber eher hohen Ampicillin-Konzentrationen resistent macht. In B. subtilis jedoch, weder 8G-5(pGPB15) noch 8G5(pGPB14) zeigten sich zur Bildung von Haloringen auf Polyvinylalkohol-Platten fähig. Das sichtbare Ausbleiben der Sekretion von beta-Lactamase durch B. subtilis geht wahrscheinlich auf das Zerbrechen der sekretierten beta-Lactamase durch extrazelluläre Proteasen (K. Nakamura et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 128 (1985) 601-606 und I. Ulmanen et al., J. Bacteriol. 162 (1985) 172-182). Es ist erwähnenswert, daß im Gegensatz zu E. coli-Zellen, welche das Plasmid pGPP3 enthalten, in welchem die ursprüngliche penP-Signalsequenz wiederhergestellt war, erweisen sich die E. coli-Zellen gegenüber Ampicillin weniger resistent, welche pGPP5 enthalten, in dem die Signalsequenz für das Hybridamylase-penP dem penP vorangeht. Diese Erscheinung, die sich auch durch eine verminderte Penicillinase-Erzeugung in B. subtilis wiederspiegelt, kann höchstwahrscheinlich durch Unterschiede der sekretorischen Wirksamkeit der beiden Signalsequenzen erklärt werden.
- Um die Gefahr des Fehlens von sekretorischen Signalen durch Klonierung der Insertionen in Translations- Leserastern, welche bezüglich der Zielgene unrichtig sind, wurden zur Spaltung der chromosomalen DNA von B. subtilis 805 verschiedene Restriktionsenzyme (Sau3A, AluI, HaeIII, RsaI) verwendet. Nach der Schrotschußklonierung von DNA-Fragmenten von B. subtilis zu den verschiedenen Vektoren, wurden in E. coli Klone selektiert, entweder aufgrund ihrer Fähigkeit zur Bildung von Haloringen auf Stärkeplatten (pSPA-Plasmide) oder aufgrund ihrer Resistenz gegenüber Ampicillin (pGPB- Plasmide). Aus den tausenden von geprüften Kolonien wurden bezüglich der alpha-Amylase positive Klone mit einer Wirksamkeit von 0,1 bis 0,5% erhalten, während Amp®-Klone mit einer etwa 5 mal kleineren Wirksamkeit (0,02 bis 0,1%) erhalten wurden.
- In der Tabelle 2 wird eine Zufallsselektion von 20 potentiellen sekretorisch wirksamen Klonen vorgelegt. Die Restriktionsanalyse hat gezeigt, daß Insertionen von verschiedener Länge kloniert worden sind. Ferner haben die verschiedenen Insertionen die E. coli- Zellen gegenüber unterschiedlichen Ampicill in-Konzentrationen resistent gemacht. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, daß die vorliegende Erfindung das Isolieren von mehreren unterschiedlichen sekretorischen Signalsequenzen ermöglicht. TABELLE 2 Eigenschaften von potentiellen sekretorisch wirksamen in E. coli erhaltenen Klone Plasmid Insertionsgröße
- 1) Die gezeigten pSPB-Klone enthalten keinen SPO2-Promotor.
- 2) Alle pSPB-Klone enthalten Sau3A-Insertionen. Da einige der pSPB-Klone teilweise digerierte Sau3A- Fragmente enthielten, wurden diese Insertionen nochmals mit Sau3A digeriert und nochmals in mit BamH1 digeriertem pGPB14 ligiert. Die neuen Klone werden durch ein ' angegeben. Die Größe der Insertionen wurde durch Restriktionsanalyse bestimmt.
- Das Resistenzniveau gegenüber Ampicillin wurde als die maximale Ampicillin-Konzentration definiert, bei welcher 100% der lebensfähigen Zellen resistent waren. Dies wurde, wie in den Fußnoten zu Tabelle 1 beschrieben, bestimmt.
- Zum Nachweis, daß die selektierten Insertionen für Übergabefunktionen codierende Regionen enthalten, wurde eine Anzahl von zufälligerweise gewählten rekombinanten Plasmiden zu kompetenten B. subtilis-Zellen transformiert und die erhaltenen Transformanten wurden auf die alpha-Amylase-Aktivität in den überstehenden Flüssigkeiten der Kulturen geprüft. Die Bestimmung der alpha-Amylase-Aktivitäten (Tabelle 3, Seite 35) zeigt, daß beträchtliche Mengen der alpha-Amylase-Aktivität in den überstehenden Flüssigkeiten der Kultur von die rekombinanten Plasmide enthaltenden B. subtilis-Zellen gefunden wurden. Diese Ergebnisse bestätigen die Klonierung der die sekretorische Signalsequenz codierenden Regionen.
- B. subtilis 8G-5(pSPA2, pSPA8 bzw. pSPA12) zeigten alpha-Amylase-Aktivitäten, welche wesentlich höher waren als jene durch B. subtilis (pGK13-alpha-Amylase) produzierte, das heißt, als das die native sekretorische Signalsequenz für alpha-Amylase enthaltende Plasmid. Da sämtliche in bezug auf die alpha-Amylase positive Transformanten mit einem dem SPO2-Promotor enthaltenden Vektor selektiert waren, beinhalten die Insertionen nicht notwendigerweise eine Promotor-Aktivität. Die Auslassung des SPO2-Promotors in pSPA8, pSPA9, pSPA12 und pSPA42 zeigte (Tabelle 3), daß einige Insertionen (pSPA8, pSPA9, pSPA12) eine Promotor-Aktivität beinhalten, andere (pSPA42) hingegen nicht.
- Diese Beobachtung zeigt ganz klar, daß sekretorische Funktionen mit höherer Wirksamkeit durch Verwendung von Selektionsvektoren selektiert werden können, welche oberhalb der für die Insertion der Ziel-DNA verwendeten Stelle eine Promotor-Sequenz enthalten.
- Die besagten Plasmide pSPA2, pSPA8 und pSPA12 sind am 2. Mai 1986 in dem Bacillus subtilis-Stamm 8G-5 bei dem Centraalbureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, NL- 3742 SK Baarn, gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt worden, und es sind ihnen die Bezeichnungen CBS 248.86, CBS 249.86 bzw. CBS 250.86 zugeteilt worden. TABELLE 3 alpha-Amylase-Mengen in den überstehenden Flüssigkeiten der Kultur verschiedener B. subtilis-Klone Plasmid Insertionsgröße alpha-Amylase-Aktivität in der überstehenden Flüssigkeit der Kultur B. subtilis pGKl3-alpha-Amylase
- 1) Sämtliche dargelegten pSPA-Klone enthalten den SPO2- Promotor, wenn nichts anderes erwähnt wird.
- 2) pSPA2 enthält eine AluI-Insertion, pSPA8 enthält eine HaeIII-Insertion, und pSPA9, 12, 13, 26, 31 und 42 enthalten eine RsaI- Insertion.
- * Die Plasmide pSPA2, pSPA8 und pSPA12 sind bei CBS unter den Nrn 248.86, 249.86 bzw. 250.86 hinterlegt worden.
- Die B. subtilis-Zellen sind während eines Tages in dem TY-Medium gezüchtet und die alpha-Amylase-Aktivitäten in den überstehenden Flüssigkeiten der Kultur, wie oben auf Seite 21 beschrieben, bestimmt worden.
- Eine vergleichende Untersuchung wurde in bezug auf die beta-Lactamase-Aktivität in den überstehenden Flüssigkeiten der Kultur von B. subtilis-Zellen (Stamm 805) durchgeführt, welche Zellen verschiedene rekombinante Plasmide enthielten, entweder auf Polyvinylalkohol-Platten oder durch die Bestimmung mit Nitrocefin, nachdem die Zellen über Nacht in reichen Medien gezüchtet worden waren. Durch Verwendung dieser Methoden konnte jedoch keine signifikante beta-Lactamase-Aktivität gefunden werden. Diese Ergebnisse stehen in Übereinstimmung mit den im Beispiel V für 8G5(pGPB15) beschriebenen Ergebnissen. Sehr wahrscheinlich wird das Fehlen einer Aktivität durch die Empfindlichkeit der beta-Lactamase gegenüber den Exoproteasen von B. subtilis bedingt (K. Nakamura et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 128 (1985) 601-606, I. Ulmanen et al., J. Bacteriol. 162 (1985) 172-182, I. Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 5582-5586). Dies konnte durch eine vergleichende Untersuchung der beta-Lactamase-Produktion in minimalen bzw. reichen Medien (Fig. 6) gezeigt werden. In dem TY-Medium erhöhte sich die Menge der beta-Lactamase während der logarithmischen und der frühen stationären Wachstumsphasen.
- Allerdings nahm die Menge der beta-Lactamase nach längerem Wachstum ab und ging in den Kulturen über Nacht vollständig verloren. Im Gegensatz dazu blieb die Menge der beta-Lactamase bis 24 Stunden in einem minimalen Medium konstant. Diese Ergebnisse stützen den Gedanken, daß mindestens in dem TY-Medium die beta- Lactamase vermutlich infolge der Proteolyse unbeständig ist.
- Die Menge der beta-Lactamase in der überstehenden Flüssigkeit einiger pSPB-Klone wird in Tabelle 4 wiedergegeben.
- pSPB4' 630
- pSPB8' 800
- pSPB9' 16
- pSPB19' 230
- pSPB20' 585
- pSPB23 9
- pSPB28 17
- pSPB32 78
- Die Menge der beta-Lactamase wurde in dem minimalen Medium, wie zuvor auf Seite 22 beschrieben, bestimmt.
- Dieses Beispiel zeigt, daß die mit pGPA14 detektierten sekretorischen Signalsequenzen in pGPB14 funktionsfähig sind und umgekehrt (siehe Tabelle 5). Die meisten konstruierten pSPB-A-Vektoren, welche das beta-Lactamasegen enthalten, vor welchem aus pSPA-Klonen abgeleitete Insertionen stehen, verliehen Ampicillin-Resistenz in E. coli. Darüber erzeugten dieselben Plasmide beträchtliche Mengen der beta-Lactamase-Aktivität in B. subtilis. Ferner, die pSPA-B-Klone, in welchen dem alpha-Amylasegen ursprünglich in pGPB14 selektierte Insertionen vorstehen, erzeugten und sekretierten die alpha-Amylase (siehe. Tabelle 5).
- Ein Vergleich der Tabellen 5 und 3 zeigt allerdings, daß in B. subtilis die relative Reihenfolge der Niveaus der alpha-Amylase-Aktivität mit den ursprünglichen pSPA-Vektoren (Tabelle 3) und jene der beta-Lactamase mit den ausgetauschten pSPB-A-Vektoren (Tabelle 5) nicht identisch waren. Qualitativ ähnliche Ergebnisse wurden in dem umgekehrten Versuch erhalten (Tabellen 5 und 4). Da in diesem Vergleich keine Unterschiede bei den Transkriptions- und Translations-Niveaus bestanden und dieselben sekretorischen Signale verwendet wurden, legen diese Resultate nahe, daß die Wirksamkeit der Proteinsekretion in B. subtilis sowohl durch die Natur der sekretorischen Signalsequenzen als auch durch die reifen Teilstücke der Proteine beeinflußt waren.
- Ferner waren die Niveaus der beta-Lactamase-Aktivität in den überstehenden Flüssigkeiten der pSPB-A- Vektoren enthaltenden B. subtilis-Zellen (siehe Tabelle 5) im Durchschnitt höher (manchmal sogar 10 bis 30 mal) als jene in den überstehenden Flüssigkeiten der pSPB- Vektoren enthaltenden B. subtilis-Zellen (siehe Tabelle 4). Ferner ergaben die pSPA-Vektoren im allgemeinen etwas höhere Niveaus an alpha-Amylase als die pSPA-B- Vektoren.
- Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, daß sämtliche geprüfte klonierte sekretorische Signalsequenzen zwischen den verschiedenen Vektoren funktionell austauschbar waren und die Ergebnisse legen nahe, daß mit den Zweiproben-Vektoren verschiedene "Klassen" von sekretorischen Signalen aufgelesen worden sind. TABELLE 5 Austauschbarkeit der sekretorischen Signale Plasmid E. coli Bacillus subtilis beta-Lactamase-Aktivität alpha-Amylase-Aktivität
- Das amp®-Niveau der E. coli-Zellen wurde, wie in den Fußnoten zu den Tabellen 1 und 2 beschrieben, bestimmt. Die beta-Lactamase-Aktivität der B. subtilis- Zellen wurde mit Nitrocefin, wie oben auf Seite 22 beschrieben, bestimmt. Die alpha-Amylase-Aktivität der B.
- subtilis-Zellen wurde, wie oben auf Seite 21 beschrieben, bestimmt.
- Die in den vorher gegebenen Beispielen dargelegten Ergebnisse zeigen klar, daß die pGPB14- und pGPA14-Vektoren zum Selektieren der sekretorisch codierenden Regionen verwendet werden können, wobei diese Vektoren sowohl in E. coli als auch in B. subtilis fungieren. Um die Möglichkeit auszuschließen, daß die in B. subtilis gemessenen enzymatischen Aktivitäten das Ergebnis der Zellenlyse eher als jene der Sekrektion waren, wurde der zelluläre Standort der durch pSPA2 und pSPA8 erzeugten alpha-Amylase mit dem Standort eines zytoplasmischen Markiererproteins verglichen, wofür die Isocitrat-dehydrogenase (ICDH) gewählt wurde. Zuerst wurde geprüft, ob ICDH selber in verschiedenen Medien beständig war (siehe Tabelle 6). Nach einer Inkubation von 24 Stunden bei 37ºC in dem Minimalmedium oder in der überstehenden Flüssigkeit einer über Nacht geführten B. subtilis-Kultur in diesem Medium waren noch 80% der ursprünglichen ICDH-Aktivität vorhanden. Durch Inkubation in dem TY-Medium jedoch war die Aktivität nach 3 bis 5 Stunden bei 37ºC vollständig verloren gegangen. TABELLE 6 Beständigkeit der Aktivität der Isocitrat- Dehydrogenase (ICDH) in verschiedenen Medien Zeit TY-Medium überstehende Flüssigkeit (TY-Medium) Minimalmedium (Minimalmedium)
- Volumina von 10 ml einer über Nacht geführten Kultur des B. subtilis-Stamms 805 (oder DB104) in TY oder in dem Minimalmedium wurden während 10 Minuten bei 6000 UpM zentrifugiert. Die Zellen wurden zweimal durch Zentrifugieren gewaschen. Die Pellets wurden wieder in 5 ml eines 200 ug/ml Lysozym enthaltenden, verarmten Mediums suspendiert und während 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. Anteile von 2,5 ml der aufgeschlossenen Zellen wurden danach mit Anteilen von 2,5 ml des TY-Mediums, der überstehenden Flüssigkeit einer TY-Kultur, des Minimalmediums oder der überstehenden Flüssigkeit einer in dem Minimalmedium gezüchteten Kultur vermischt und bei 37ºC inkubiert. Die ICDH-Aktivitäten werden als Funktion der Zeit durch den Prozentsatz der ursprünglichen ICDH-Aktivität ausgedrückt.
- Ähnliche Ergebnisse wurden mit den überstehenden Flüssigkeiten der B. subtilis-Kulturen von 805 und von DB104 erhalten (Protease-defizitärer Stamm, F. Kawamura und R.H. Doi, J. Bacteriol. 160 (1984) 442-444). Diese Ergebnisse zeigen, daß die ICDH als zytoplasmischer Markierer in dem Minimalmedium, jedoch nicht in dem TY- Medium verwendet werden kann.
- Die Tabelle 7 zeigt, daß die alpha-Amylase-Aktivität hauptsächlich in den überstehenden Flüssigkeiten der Kultur gefunden wird, während das meiste, wenn nicht das gesamte der ICDH-Aktivität in den Zellenpellets vorliegt. Diese Ergebnisse stützen bestens die Schlußfolgerung, daß die in den überstehenden Flüssigkeiten gemessenen alpha-Amylase-Aktivitäten das Ergebnis einer Sekretion eher als jenes einer Zellenlyse sind. TABELLE 7 alpha-Amylase- und ICDH-Aktivitäten in den Zellenpellets und den überstehenden Flüssigkeiten der Kulturen von zwei B. subtilis-Klonen Plasmid alpha-Amylase-Aktivität überstehende Flüssigkeit Pellet ICDH-Aktivität
- Die Kulturen wurden über Nacht in dem Minimalmedium ohne Glukose ausgeführt. Anteile von 1 ml wurden während 3 Minuten in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Die Zellen wurden zweimal mit 100 mM K-Phosphat von pH 8,0 gewaschen. Die Pellets wurden in 0,5 ml 100 mM K-Phosphat von pH 8,0 und 200 ug/ml Lysozym suspendiert und während 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die überstehenden Flüssigkeiten der Kultur wurden durch ein 0,45 um Filter filtriert, um Zellen und Teilstücke zu entfernen. Hierauf wurden die alpha-Amylase- und die ICDH-Aktivitäten bestimmt.
- Die Verteilung der alpha-Amylase-Aktivität in den überstehenden Flüssigkeiten der Kulturen und in den Zellenpellets einer Anzahl von pSPA-Klonen wurde auf SDS-Polyacrylamid-Gelen (PAA) untersucht. Als Kontrolle wurde die gereinigte alpha-Amylase aus B. licheniformis verwendet, um die Lage des Molekulargewichtes zu bestimmen. Die Lage des Molekulargewichtes der aus den überstehenden Flüssigkeiten der Kultur von 805(pGK13- amy) und 805(pSPA2, pSPA8, pSPA9) isolierte alpha- Amylase schien mit jener der Kontrolle identisch zu sein, was zeigt, daß in sämtlichen Konstruktionen die Spaltung der sekretorischen Signalfunktion an etwa derselben Aufarbeitungsstelle der alpha-Amylase erfolgt war. Extrakte der Zellenpellets aus 805(pSPA2 und pSPA8) zeigten alpha-Amylase-Banden bei einer höheren Lage der Molekulargewichte als jene, die in den überstehenden Flüssigkeiten gefunden wurde. Der Vorläufer in 805(pSPA2) hat ein höheres Molekulargewicht als jenes, das in 805(pSPA8) exprimiert wird. Es scheint, daß einige der Vorläufer formen der alpha-Amylase von B. licheniformis enzymatisch aktiv sind. Da die Banden für den Vorläufer sowohl immunologisch als auch enzymatisch mit derselben Intensität bezüglich der reifen Produkte detektiert werden konnten, so scheint die spezifische Aktivität der Vorläuferformen jener des reifen Produktes ähnlich zu sein. Da in 805(pSPA2, pSPA8) Vorläuferformen unter Fließgleichgewichtsbedingungen detektiert werden konnten, scheint die Sekretionsgeschwindigkeit und/oder die Aufarbeitungsgeschwindigkeit der alpha-Amylase in diesen Fusionen gegenüber dem Wildtyp verzögert zu sein. Es konnten in den Zellenpellets von8G-5(pSPA9, pSPA12, pSPA13) keine Vorläuferformen in den Gelen detektiert werden.
- Es wurden die Mengen der an die Zellenpellets gebundenen alpha-Amylase-Aktivität bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 8 wiedergegeben. TABELLE 8 Zellengebundene enzymatische Aktivität Plasmid % an zellengebundener alpha-Amylase-Aktivität
- Die B. subtilis-Zellen wurden über Nacht in dem TY-Medium gezüchtet. Die alpha-Amylase-Aktivität in den überstehenden Flüssigkeiten und in den Zellenpellets wurde, wie oben auf Seite 21 beschrieben, bestimmt.
- In den Auszügen der Zellenpellets konnte in den den Wildtyp des alpha-Amylasegens enthaltenden Zellen mit pGK13-amy keine Aktivität festgestellt werden. Mit der Ausnahme von 8G5(pSPA-B19') waren reproduzierbare Mengen der alpha-Amylase-Aktivität an die Zellenpellets gebunden. Wie aus den obigen Ergebnissen hervorgeht, liefern eine Anzahl Plasmide verhältnismäßig große Mengen der zellengebundenen alpha-Amylase. In Gegenwart des SPO2-Promotors waren die Mengen der alpha-Amylase- Aktivität in den überstehenden Flüssigkeiten der die verschiedenen Plasmide enthaltenden B. subtilis-Kulturen erhöht. Trotz dieser Erhöhung war die relative Menge der zellengebundenen alpha-Amylase nicht verändert.
- Es wurden nach der Didesoxy-Methode von Sanger die Insertionen von pSPB4' bis pSPB20', pSPB21 bis SPB38 und pSPA2 bis pSPA42 sequenziert und auf die Gegenwart der sekretorischen Signalsequenzen geprüft. Durch Anpassung der drei Leseraster mit dem bekannten Leseraster der alpha-Amylase oder der beta-Lactamase wurde der richtige Leseraster bestimmt. In der Folge wurde die Länge des Vorläufers (die sekretorische Signalsequenz plus das reife Enzym) mit den mittels eines in vitro Transkriptions-Translationssystems erhaltenen Data verglichen, um die Gültigkeit der Sequenz zu stützen. Die folgende Tabelle gibt eine Anzahl Sequenzen an. TABELLE 9 Insertion von Sequenz
- *Die nach dieser Linie stehenden Aminosäuren sind jene der multiplen Klonierungsstelle des Plasmids.
- ** Die vor dieser Linie stehenden Aminosäuren sind jene des SPO2-Fragments.
- Durch Verwendung der Aufzeichnung des hydrophoben Charakters nach Hopp und Woods, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981) 3824-3828 wurde gezeigt, daß die meisten sekretorischen Signale einen hydrophilen (positiv geladenen) Kopf und einen hydrophoben Kern haben. Mehrere sekretorische Signalsequenzen, beispielsweise pSPA2 und pSPB32, unterscheiden sich von in der Literatur bekannten Signalsequenzen dadurch, daß sie signifikant länger sind. Eine Anzahl solcher Sequenzen verbessern die Sekretion, wie mit pSPA2 gezeigt wurde.
- Wie aus den obigen Ergebnissen hervorgeht, stellt das erfindungsgemäße Verfahren ein bequemes und wirksames System zur Isolierung der Signalsequenzen aus den Wirten und zur Abschätzung ihrer Wirksamkeit auf rasche und bequeme Art zur Verfügung. Die Signalsequenzen können dann mit einer breiten Vielfalt von anderen Genen als den Wildtypgenen verwendet werden, um eine wirksame Produktion eines interessierenden offenen Leserasters zu gewähren. Auf diese Art können eine Vielfalt von Wirten, insbesondere von unizellulären Mikroorganismuswirten, insbesondere noch von prokaryotischen Wirten, geprüft werden, um Sequenzen zu identifizieren, die für die Produktion verschiedener Peptide in unizellulären Mikroorganismen Verwendung finden können.
- Sämtliche in dieser Beschreibung erwähnten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen zeigen das Niveau des Fachwissens jener Fachleute, welche die vorliegende Erfindung betrifft. Sämtliche Veröffentlichungen und Patentanmeldungen sind durch Bezugnahme hierin gleichermaßen eingeschlossen, als ob für jede individuelle Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch und individuell ihr Einschluß durch Bezugnahme angegeben wäre.
- Obschon die vorliegende Erfindung in einigem Detail zwecks Klarheit und Verständnis durch Veranschaulichung und Beispiel beschrieben worden ist, wird es selbstverständlich sein, daß gewisse Abänderungen und Abwandlungen im Bereich der angehängten Ansprüche vorgenommen werden können.
Claims (15)
1. Verfahren zur Erkennung einer unbekannten
sekretorischen Signalsequenz auf einem DNA-Fragment einer
Mikroorganismus-Wirtszelle, welches Verfahren umfaßt:
das Einfügen des besagten Fragments in ein Plasmid,
das umfaßt:
ein Replikationssystem, welches in einer
Expressions-Wirtszelle funktionsfähig ist;
eine multiple Klonierungsstelle, welche mindestens
zwei für das besagte Plasmid einzigartige
Restriktionsstellen besitzt;
einen offenen Leseraster, welcher für ein
Genprodukt codiert, das durch Sekretion nachweisbar ist, und an
besagter Klonierungsstelle angrenzend ist;
wobei besagte Insertion an einer oder zwei der
besagten einzigartigen Stellen vorkommt und mit dem besagten
offenen Leseraster in Phase ist;
das Transformieren der besagten
Expressions-Wirtszelle mit dem die besagte Insertion enthaltenden Plasmid;
und
das Züchten der besagten transformierten
Wirtszelle in einem Nährmedium und das Nachweisen der Sekretion
in dem besagten Medium mittels des besagten Genproduktes.
2. Verfahren nach Anspruch I, in welchem das
besagte Plasmid außerdem ein Replikationssystem umfaßt,
das in einer Klonierungs-Wirtszelle funktionsfähig ist;
wobei das besagte Verfahren außerdem umfaßt:
das Transformieren der besagten Klonierungs-
Wirtszelle mit dem besagte Insertion enthaltenden Plasmid
zwecks Amplifikation des besagten Plasmids; und
das Isolieren des besagten amplifizierten
Plasmids und das Transformieren der besagten
Expressions-Wirtszelle mit besagtem amplifiziertem Plasmid.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, in welchem
besagte Expressions-Wirtszelle ein Bacillus ist.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3,
in welchem besagte Mikroorganismus-Wirtszelle ein Bacillus
ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
in welchem besagtes Enzym die alpha-Amylase oder die beta-
Lactamase ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
in welchem besagtes Plasmid außerdem eine Transkriptions-
Startregion umfaßt, wobei die Richtung der Transkription
von besagter Startregion über besagte multiple
Klonierungsstelle zum besagten offenen Leseraster geht und die
Startregion mindestens in besagter Expressions-Wirtszelle
funktionsfähig ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, in welchem besagte
Transkriptions-Startregion die Transkriptions-Startregion
eines Bacillus SPO&sub2; ist.
8. Verfahren zum Auffinden eines Fragments aus
einer unizellulären Mikroorganismus-Wirtszelle für eine
unbekannte sekretorische Signalsequenz, welches Verfahren
umfaßt:
das Einfügen besagten Fragments in mindestens
ein Plasmid, das umfaßt:
ein Replikationssystem, welches in einer
Expressions-Wirtszelle funktionsfähig ist;
eine multiple Klonierungsstelle, welche
mindestens zwei für das besagte Plasmid einzigartige
Restriktionsstellen besitzt;
einen offenen Leseraster, welcher für ein
Genprodukt codiert, das durch Sekretion nachweisbar ist, und an
besagter Klonierungsstelle angrenzend ist;
wobei besagte Insertion an einer oder zwei der
besagten einzigartigen Stellen vorkommt und mit dem besagten
offenen Leseraster in Phase ist;
in welchem bei Benützung von mehr als einem
Plasmid sich diese-dadurch unterscheiden, daß sie mindestens
unterschiedliche, für verschiedene Enzyme codierende
offene Leseraster besitzen;
das Transformieren der besagten
Expressions-Wirtszelle mit dem die besagte Insertion enthaltenden Plasmid;
und
das Züchten der besagten transformierten
Wirtszelle in einem Nährmedium und das Nachweisen der Sekretion in
dem besagten Medium mittels des besagten Genproduktes.
9. Verfahren nach Anspruch 9, in welchem das
besagte Plasmid außerdem ein Replikationssystem umfaßt,
das in einer Klonierungs-Wirtszelle reaktionsfähig ist:
wobei das besagte Verfahren außerdem umfaßt:
das Transformieren der besagten Klonierungs-
Wirtszelle mit dem besagte Insertion enthaltenden Plasmid
zwecks Amplifikation des besagten Plasmids; und
das Isolieren des besagten amplifizierten
Plasmids und das Transformieren der besagten
Expressions-Wirtszelle mit besagtem amplifiziertem Plasmid.
10. Verfahren nach Anspruch 9, in welchem besagte
Klonierungs-Wirtszelle E. coli ist.
11. Verfahren nach Anspruch 9, in welchem besagte
Mikroorganismus-Wirtszelle ein Bacillus ist.
12. Plasmid, welches aus der aus pGPA14, pGPB14,
pGPP14 bestehenden Gruppe ausgewählt ist und für welche
die Hinterlegungsnummern der Kultur CBS 245.86, 246.86 bzw.
247.86 sind.
13. Plasmid nach Anspruch 12, welches außerdem
ein aus der DNA des Bacillus-Phage SPO2 abgeleitetes
Fragment enthält, welches Aktivität als Transkriptionsstart
besitzt.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11,
welches umfaßt:
die Verwendung der sekretorischen Signalsequenz,
welche die Sekretion besagten Genproduktes hervorruft, zur
Herstellung eines Peptidproduktes durch Transformation eines
Mikroorganismus-Wirtes mit einer Expressions-Kassette,
welche besagte sekretorische Signalsequenz und ein für
besagtes Peptid codierendes Gen enthält, und das Züchten des
besagten Wirtes unter Nährmediumbedingungen, wodurch besagtes
Peptid sekretiert wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, in welchem
besagter Mikroorganismus-Wirt zur Herstellung des besagten
Peptidproduktes ein Bacillus ist.
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