CN1134726A - 一种包含修饰酶的酶制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种包含修饰酶的酶制剂，所述修饰酶选自由淀粉酶、脂肪酶、氧化还原酶、果胶酶或半纤维素酶组成的组。由于经化学修饰或氨基酸取代获得的碱性pI和/或增加的表面活性，所述修饰酶具有改进的性能，因而它在例如去垢剂、烘烤食品用面粉、动物饲料中，和纤维素织物的制造中，以及木质纤维素纤维的处理上是有用的。

Description

一种包含修饰酶的酶制剂
发明领域
本发明涉及一种包含修饰酶的酶制剂；一种含有所述酶制剂的去垢添加剂和去垢组合物；以及所述酶制剂在例如纸浆和纸工业、纺织工业、汁液工业、啤酒酿造、动物饲料和烘烤原料中的用途。
发明背景
酶已长时间地用于各种工业用途中。例如近年来酶在去垢剂(衣物洗涤剂和盘碟洗涤剂两者)中的使用日益广泛。而且，酶更重要的用途是在造纸工业中的纸浆处理上、在烘烤工业中的改善面粉性质上、在果子酒和果汁工业中的降解β-葡聚糖上、在纺织工业中的纤维素织物(例如粘胶纤维)的生物抛光(即为了获得柔软光滑的织物，在其制造期间用半纤维素酶处理纤维素织物)上和在动物饲料中的改进植物蛋白漂的可消化性上。
然而，在例如去垢剂系统中，很不容易获得最理想的酶性能，这是因为去垢剂配方和洗涤条件(例如高的pH值，高的离子强度，以及包含某些表面活性剂和洗涤助剂)可以对酶的稳定性和活性具有决定性的影响。
因为洗涤条件经常是碱性的，所以如果某些酶在使用期间pI移向pH值附近，则至少可以期望这些酶表现出改进的性能。
对其它工业(例如以上提到的一种或多种工业)中酶促方法的使用可以作类似的考虑。
例如，在处理造纸的纸浆时，木质纤维素纤维可以进行酶促水解。用于纤维改性的水解酶可以是水解松脂沉积物中甘油三酸脂的脂肪酶、破坏结构蛋白(例如伸展蛋白)的蛋白酶、以及降解构成纤维壁的碳水化合物的半纤维素酶和果胶酶。
由于静电排斥作用，酶(例如糖酶)的作用是受到限制的，这一点被完全证实。迄今还没有提出克服这一限制性静电排斥作用的经济的或技术上可行的方法。在Wo93/11296和Wo93/07332中描述了怎样能够通过酶促除去纤维基质中带阴电荷的葡糖醛酸或者通过交换纤维中酸基上的抗衡离子来降低所述的排斥作用。然而，因大量的木质纤维素纤维必须用昂贵的特别酶或金属盐处理，所以这些方法花费很高。用金属盐处理还可能导致产生木质纤维素纤维处理设备的内部水处理中的问题。
此外，迄今为止人的相信酶分子的大小是有关酶作用在木质纤维素纤维上的效果的另一个决定性参数。要求纤维的平均孔径与单个酶分子的平均直径有相同的大小(Viikari，L.，KanteIinen，A.，Ratto，M.& Sundquist，J.(1991)，Enzymes in Biomass Conversion，Chpt.2：Enzymes in Pulp andPaper Processing，P.14，(Leatham，G.F.& Himmel，M.E.，eds.))。
因而，怎样提高木质纤维素纤维酶促水解的效果仍然是一个没有解决的问题。
发明描述
已令人惊奇地发现，当脂肪酶、淀粉酶、氧化还原酶、果胶酶和/或半纤维素酶以腌蔽带阴电荷侧基的方式衍生时，这种衍生作用可以导致酶活性和/或底物可利用度的意想不到的提高，尽管这种衍生作用增加了酶分子的大小。
因此，所述的静电排斥作用可以通过修饰酶分子而不是修饰底物来降低。以总的数量计算，底物的量一般至少是用于酶促过程(如处理木质纤维素纤维)中的酶产品量的100倍以上。由此，修饰酶比修饰木材纤维素纤维经济得多。
本发明涉及到一种包含修饰酶的酶制剂，所述修饰酶选自由淀粉酶、脂肪酶、氧化还原酶、果胶酶和半纤维素酶组成的组，由于经化学修饰或氨基酸取代获得的碱性pI和/或增加的表面活性，所术修饰酶具有改进的酶性能。
很明显，本发明的酶制剂可以仅含有选自由淀粉酶、脂肪酶、氧化还原酶、果胶酶和半纤维素酶组成的组的一种或多种修饰酶或者含有其与其它酶的组合体，所述的其它酶是未经以获得碱性pI和/或增加的表面活性为目的的化学修饰或氨基酸取代的酶。
在本文中，术语“改进的性能”意指修饰酶在与母体酶相同的标准试验条件下表现出与母体酶相比的提高的效果。就意欲包含在去垢组合物中的酶而言，是在标准洗涤条件下试验所述的修饰酶，并且将其性能(例如有关除去污渍和脏物的性能)与未修饰的母体酶的性能比较。修饰酶的洗涤性能不仅可以在衣物洗涤条件下评价，也可以在盘碟洗涤条件下评价。就意欲用于造纸的纸浆处理中的酶而言，修饰酶在未漂白的或氧漂白的牛皮纸浆上的性能从下述量评价，该量是减去了在对照处理中(省去了内木聚糖酶加入步骤)溶解的木质素的量的在用所说的内木聚糖酶处理下从纸浆中溶解的木质素的量。溶解的木质素的量以在280mm下的吸收来测定(Lin，S.Y.“Methods in Lignin Chemistry”，Chpt.s.1.4.2.，Springer-Verlag，1992)，参见以下实施例6。衡量用例如内木聚糖酶(一种半纤维素酶)处理牛皮纸浆效果的补充性的第二个参数是纸浆中残余木质素的含量。纸浆中残余木质素含量的最好的量度标准是按照TAPPI方法T236的卡伯(kappa)值。
等电点(pI)定义为在酶分子为中性，即静电电荷的总量(净的静电电荷)等于0时的pH值。当然在这一总和中必须考虑到各个静电电荷的阳性或阴性性质。所术的pI可以经含酶溶液的等电聚焦或滴定方便地由实验确定。
术语“碱性pI”意指在标准条件下由等电聚焦测得的修饰酶的等电点高于7.5。按照本发明，修饰酶的pI一般优选的为至少8.0，更优选的为至少8.5，最优选的为至少9.0。按照本发明，修饰酶的pI高出母体酶的pI优选的为至少一个pI单位，更优选的为至少两个pI单位，最优选的为至少三个pI单位。
合适的母体脂肪酶可以是微生物脂肪酶。就此而论，母体脂肪酶可以选自酵母(例如假丝酵母属)脂肪酶、细菌(例如何单胞菌属或芽胞杆菌属)脂肪酶或真菌(例如腐质霉属或Rhizomucor)脂肪酶。更具体地说，合适的脂肪酶可以是Rhizomucor miehei脂肪酶(例如按EP238023中的描述制备的)、Thermomyces Lanuginosa脂肪酯(例如按印305216中的描述制备的，可从Novo Nordisk以商品名LipolaseTM获得)、Humicolainsolens脂肪酶、司徒茨氏假单胞菌脂肪酶、葱头假单胞菌脂肪酶、Candida antarctica脂肪酶A或B，或者得自rGPL、absidiablakesleena、伞枝犁头酶、茄病镰孢、尖孢镰孢、园弧青霉、皮落青霉、扩展青霉、胶粘红酵母、Thiarosporella phaseolina、小孢根霉、Sporobolomyces shibatanus、出芽短柄霉、异常汉逊氏酵母、Geotricum penicillatum、弯曲短芽孢杆菌、Brochothrixthermosohata、Coprinus cinerius、Trichoderma harzanium、Trichoderma reesei、日本根霉或Pseudo monas plantari的酯肪酶。合适的脂肪酶的其它例子可以是以上提到的任一脂肪酶的变体(例如，在WO92/05249或WO93/11254中所描述的)。
在本发明的一个优选的实施方案中，剩余脂肪酶活度最好是在约15％以上。
合适的淀粉酶的例子包括芽孢杆菌属淀粉酶，例如嗜热脂肪芽孢开菌淀粉酶、解淀粉芽孢杆菌淀粉酶、枯草芽孢杆菌淀粉酶或地衣形孢杆菌淀粉酶(例如，可从Novo Nordisk以商品名Termamyl获得的)，或者曲霉属淀粉酶，例如黑曲霉或米曲霉淀粉酶。合适的淀粉酶的其它例子可以是以上提到的任一淀粉酶的变体，例如，在US5,093,257.EP252 666、WO91/00353、FR2,676,456，EP285 123、EP525 610.PCT/DK93/00230中所描述的。
“半纤维素”一词用来包括聚糖酶(除了纤维素和淀粉降解酶以外)、甘露聚糖酶、半乳甘露聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、我聚葡糖醛酸酶或多聚半乳糖醛酸酶。
合适的木聚糖酶的例子包括Humicola insolens(参见例如WO92/17573)、短小芽孢杆菌(参见例如WO92/03540)、BacillussLearathermophilus(参见例如WO91/18976、WO91/10724)、芽孢杆菌AC13(参见例如WO94/01532)、Thermotoga属(参见例如WO93/19171)、Rhodothermus属(参见例如WO93/08275)、Dictyoglomus(参见例如WO92/18612)、Tricoderma longibrachiatum和钦氏菌(参见例如EP0353 342A)橙色热子囊菌(参见例如美国专利4,966,850)、Trichodermaharziahum和Trichoderma reseei(参见例如美国专利4,725,544)、出芽短柄霉(参见例如EP0373107 A2)、Thermomyceslanuginosus(参见例如EP0456 033 A2)、环状芽孢杆菌(WO91/18978)、米曲霉(参见例如SU4610007)、褐色热单胞(参见例如EP0473545 A2)、链霉菌属(参见例如美国专利5,116,746)、变青链霉菌(参见例如WO93/03155)、绿孢链霉菌(参见例如EP496 671A1)、地衣形芽孢杆菌(参见例如JP9213868)和Trichoderma Longibrachiatum〔参见W.J.J.Van denTweel etal.(Eds.)，“Stability of Enzymes”，Proceedings of anInternational Symposium heeld in Maastricht，The Netherlands，22-25 November 1992，Fisk，R.S.and Simpson，pp.323-328〕。合适的木聚糖酶的其它例子可以是以上提到的任一木聚糖酶的变体。
“氧化还原酶”一词用来包括氧化酶、漆酶和过氧化物酶。
氧化还原酶的例子包括辣根过氧化物酶、大豆过氧化物酶或来源于鬼伞属(例如Coprinus cinereus)或来源于芽孢杆菌属(例如短小芽孢杆菌)的过氧化物酶。其它例子包括木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶(例如，来源于Phanerochaete Chrysosporiumr的)。其它例子包括来源于栓菌属(例如Trametes versicolor或Trametes villosa)的漆酶和来源于Polyporus pinsetus或Pyricularia oryzae的漆酶。
“果胶酶”一词用来指多聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)、果胶酯酶(EC3.2.1.11)，果胶裂合酶(EC4.2.2.10)和半纤维素酶(例如内-1，3-β-水糖苷酶(EC3.2.1.32)、木聚糖1，4-β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)和α-L-阿拉伯呋喃糖苷糖苷酶(EC3.2.1.55)。果胶酶合适的生物体源可以是黑曲霉。
需要清楚的是本说明书和权利要求书中提到的任何一种酶都可以是由给定的微生物产生的，或者也可以是单(重组)酶，即基本上不含有其它酶或者酶活性还常出现在由给定的微生物产生的酶产物中的组分，所述的单酶是经克隆编码单酶的DNA序列、接着用该DNA序列转化细胞并在宿主中表达产生的一种重组酶。所述宿主最好是异源宿主，但在某些情况下所述宿主也可以是同源宿主。
“纤维素织物”一词用来包括来源于包含木聚糖的纤维素纤维(例如来源于木浆)的织物。纤维素织物的例子是粘胶纤维(螺萦)；Tencel；粘胶纤维与其它织物的所有掺合物(例如粘胶纤维/聚酯掺合物、粘胶纤维/棉掺合物、粘胶纤维/毛掺合物)；亚麻(亚麻布)和苎麻以及其它以含水聚糖的纤维素纤维为基质的织物，包括纤维素织物与其它织物(例如棉、毛和聚酯)的所有渗合物，例如粘胶纤维/聚酯掺合物、粘胶纤维/棉掺合物、粘胶纤维/毛掺合物、粘胶纤维/棉/聚酯掺合物、亚麻/棉掺合物等。
在本发明的酶制剂的一个优选的实施方案中，将酶进行化学修饰，把一个胺配体偶联到酶中的谷氨酸或天冬氨酸残基的羟基上，经这一化学修饰，羧酸基团被中性化，从而增加了酶的pI。所述的胺配体优选地是胺化了的糖、胺化了的醇或胺化了的多元醇。合适的胺化了的糖的例子是氨基葡糖、其通式为C6H13O5N的异构体、或通式为〔C6H11O4N〕n的低聚体和多聚体，例如氨基葡糖的多聚体(如脱乙酰壳多糖)。低聚体和多聚体可以是支链的或者直链的。
如果胺化了的醇用于偶联到羧基上，则该醇一般应包含至少3个碳原子。合适的胺化了的醇的例子是氨基丙醇或氨基丁醇。更优选的胺配体是胺化了的多元醇。多元醇一般应包含至少3个碳原子，例如可以包含6个碳原子。合适的胺化了的多元醇的例子是葡糖胺、其通式为C6H15O5N的异构体、或其通式为〔C6H13O4N〕n(其中n＞1)的低聚体和多聚体。
其它合适的胺配体是胺取代的链烷烃和其衍生物。胺取代的链烷烃和其衍生物优选的例子是氨基酸(例如赖氨酸、聚赖氨酸)、氨基酸的酯、精胺、亚精胺、腐胺等。
所述胺配体(例如胺化了的糖、链烷烃、醇或多元醇和其聚合物)每一个单体单位至少应具有一个氨基，但不应认为每一个单体单位限于仅一个氨基。
按照优选的方法，所述的胺与谷胺酸或天冬胺酸残基的羧基的偶联以能够结合羧基和氨基的交联剂为媒介。偶联反应可以用S.S.Wong，Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking，CRC Press，Boca Raton，Florida，USA，1991(具体地为第2章，IV，C；第4章，IV；第5章II)或Wong and Wong EnzymeMierob.Technol.14，November 1992，pp.866-873中描述的标准方法恰当地进行。偶联反应的一个特别优选的交联剂是碳化二亚胺，例如1-2基-3-(3-二甲氨丙基)碳化二亚胺(EDC)。
可以按照制造商的描述(例如，Pierce Instructions 0475 c，2298x；22981x；EDC)，采用以下两个方案之一作为用EDC使蛋白质与配体偶联的方法，所述的方案是“使用EDC使半抗原/小配体和载体蛋白质偶联”的方案和“在溶液中使用EDC和N-羟基琥珀酰亚胺或磺基-N-羟基琥珀酰亚胺的蛋白质有效的两步偶联方案”。
例如，可将酶在偶联缓冲液(例如包含200mM氯化钠的pH为5.0的50mMMES)中溶解，或经透析转移，或者经大小排阻色谱脱盐。也可将配体(例如氨基葡糖)溶解在偶联缓冲液中。偶联反应可以从使酶与配体混合达到酶和配体两者的终浓度均为3mg/ml，接着按每毫克酶5mg EDC的量与EDC混合开始。然后将偶联反应在室温并连续搅拌下进行2小时。除去剩余试剂使反应终止，除去剩余试剂的方法是大小排阻色谱脱盐或者是在5℃对例如0.2M乙酸铵(pH6.9)充分透析。然后可将形成的衍生物在5℃下贮存。
当然，配体修饰或掺入的程度可以通过调节起始酶、配体和/或碳化二亚胺的浓度来控制。偶联缓冲液的pH值或温度的变化也可以使特定酶的偶联反应尽可能的完善。
底物、底物类似物和可逆抑制剂对天然活性位点的保护作用可用于修饰反应的控制。
在本发明的酶制剂的另一个优选的实施方案中，所述的酶可以是由一个或多个氨基酸取代修饰的。因此，本发明还涉及到一种包含修饰酶的酶制剂，所述的修饰酶选自由淀粉酶、脂肪酶、氧化还原酶、果胶酶或半纤维素酶组成的组，其中至少一个带阴电荷的或中性的氨基酸残基被带阳电荷的氨基酸残基取代，或者在被取代的氨基酸残基是带阴电荷的氨基酸残基时，该残基被中性氨基酸残基取代。所说的取代的目的是提供相对于母体酶来说具有增加的阳性净电荷的修饰酶，因为较高的阳性净电荷产生更加碱性的pH。
当母体酶是脂肪酶时，修饰酶可用WO92/05249中所描述的一般性方法(以及如下所述)来制备。在按照本发明的修饰脂肪酶的描述中，为简化叙述使用了采用习用的氨基酸残基单字母码的以下专门表示法：
原始氨基酸：位置：取代氨基酸
例如，按照这一专门表示法，精氨酸取代165位的天冬氨酸表示为D165R。
在修饰T.Lanuginosus脂肪酶的一个实施方案中，可以通过取代位于所述酶表面上的一个或多个氨基酸残基(特别是在5、43、45、50、69、70、72、94、 102、105、165、167、199、200或244位上的一个或多个氨基酸残基与在56、87、96、210或254位上的一个或多个氨基酸残基一道)来改变该酶的静电电荷。更具体地说，一种或多个氨基酸残基可以按如下方式取代：D5RE43QE45QT50KL69RD70RT72KN94KD102KS105KD165RD167R/KT199KN200RT244K与以下取代相结合：E56K/RE87K/R；N/QD96K/RE210K/RD254K/R在一个优选的实施方案中，这种结合是/T72K/T244K/D102K/S105K/E87K/D96K/N94K/D165R/D167K/E43Q/E45Q/T50K/L69R/D70R/.
在修饰地衣形芽孢杆菌淀粉酶的一个实施方案中，可以通过取代位于所述酶表面上的(特别是在53、113、114、271、419、421或458位的一个或多个位置上的)一个或多个氨基酸残基来改变该酶的静电电荷。更具体地说，一个或多个氨基酸残基可以按如下方式取代：D53R/KE113R/KD114R/KE271R/KV419R/KN421R/KE447R/KE458R/KH471R/K
在修饰T.lanuginosus木聚糖酶的一个实施方案中，可以通过取代位于所述酶表面上的(特别是在7、11、30、95、110、127、155、156、177、181或183位的一个或多个位置上的)一个或多个氨基酸残基来改变该酶的静电电荷。更具体地说，一个或多个氨基酸残基可以按如下方式取代：E7R/KE7T/SE7Q/ND11Q/ND11R/KE30R/KN95R/KD110R/K/SD127K/RN155R/KA156R/KQ177R/KE181S/TD183N/QD183R/K
在本发明的酶制剂的另外一个优选实施方案中，所述酶可以经由至少一个其它氨基酸残基取代至少一个氨基酸残基来修饰，以形成一个指定糖基化位点的氨基酸序列，所述糖基化位点可以被能够使酶糖基化的微生物(例如真菌或酵母)识别。引入糖基化位点的目的是提供与母体酶比较具有增加的阳性静电荷或增加的亲水性的修饰酶。
经氨基酸取代制备修饰酶
引起基因突变的几种方法是本领域公知的。在有关克隆编码酶的DNA序列的简要的讨论之后，将讨论在编码酶的序列的特定位点产生突变的方法。
克隆编码酶的DNA序列
可以用本领域熟知的各种方法从产生母体酶的任何细胞或微生物分离编码所述酶的DNA序列。首先应使用来源于产生所研究的酶的生物体的染色体DNA或信使DNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。然后，如果所述酶的氨基酸序列是已知的，则可以合成同源的标记寡核苷酸探针，并用于鉴别来源于从所述生物体制备的基因组文库的编码酶的克隆。另一方面，包含同源于已知酶的序列的标记寡核苷酸探针可以用作用杂交和不太严格的洗涤条件鉴别编码酶的克隆的探针。
还有另一种鉴别编码酶的克隆的方法，该方法涉及将基因组DNA片段插入到表达载体(例如质粒)，用所形成的基因组DNA文库转化不产生所述酶的细菌，然后将转化细菌在含有酶度物的琼脂上制成平板，从而识别出表达所述酶的克隆。
另一种替换的办法是，可用已建立的标准方法(例如S.L.Beaucage and M.H.Caruthers，Tetrahedron Letters 22，1981，pp.1859-1869描述的phosphoamidite方法，或者Mattes et al.，The EMBO J.3，1984pp.801-805描述的方法)合成制备编码酶的DNA序列。按照phosphoamidite方法，首先是合成(例如在自动DNA合成仪中合成)寡核苷酸，接着是纯化、退火、连接和在合适的载体中克隆。
最后，所述DNA序列可以是经按标准技术连接合成的、基因组的或eDNA源的(合适的)片段(相应于全长DNA序列的各部分的片段)制备的混合基因组的和合成的、混合合成的和cDNA的、或者混合基因组的和cDNA源的。所述DNA序列也可以通过使用特定的引物(例如，US4,683,202或R.K.Saiki et al.，Science 293,1988，pp.487-491中描述的)经聚合酶链反应(PCR)来制备。定点诱变
一旦分离到编码酶的DNA序列，并且识别出需要突变的位点，就可以使用合成寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸包含侧翼于所需突变位点的核苷酸序列；突变核苷酸序列在寡核苷酸合成期间被插入。在一种特定的方法中，在携带酶基因的载体中产生一个桥连酶编码序列的DNA单链缺口。然后使带有所需突变的合成核苷酸退火到单链DNA的同源部分上。用DNA聚合酶工(克列诺片段)补齐留下的缺口，并用T4连接酶连接构建体。在Morinage et al.，1984，Biotechnology 2：646-639中描述了这一方法的一个特定的例子。1988年7月26日分布的Estell等的美国专利4,760025公开了经进行弹夹的微小改变引入核苷酸编码的多重突变的方法。然而，用Morinaga方法甚至可以随法时引入更大变化的突变，因为可以引入各种长度的众多的寡核苷酸。
将突变引入编码酶的DNA序列中的另一种方法描述于Nelson and Long，Analytical Biochemistry 180，1989，pp.147-151。该方法包括三步生成含有所需突变的PCR片段，所说的突变通过用化学合成的DNA链作为PCR反应中的引物之一而引入。由产生于PCR的片段，携带突变的DNA片段可通过用限制性核酸内切酶切割得到分离并重新插入到表达质粒中。表达修饰酶
按照本发明，可以用表达载体以酶的形式表达由以上所述的方法或本领域公知的任何其它方法产生的突变的编码酶的DNA序列，所述表达载体典型地包括包含启动子、操纵基因、核糖体结合位点、翻译起始信号和可有可无的阻遇基因或各种激活基因的控制序列。
携带有编码本发明的修饰酶的DNA序列的重组表达载体可以是能方便地进行重组DNA操作的任何载体。常常根据要引入载体的宿主细胞选择载体。因此，所述载体可以是一种自主复制载体，即一种以染色体外的实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如质粒、噬菌体或染色体外因子、微型染色体或人工染色体。此外，所述载体也可以是这样一种载体，当引入宿主细胞中时，它整合到宿主细胞基因组中，并与已整合进该载体的染色体一起复制。
在所述载体中，DNA序列应经操作连接到合适的启动子序列上。所述启动子可以是任何在所选择的宿主细胞中表现出转录活性并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的蛋白择质的基因衍生的DNA序列。指导编码本发明的酶变体的DNA序列转录(特别是在细菌宿主中)的合适启动子的例子是大肠杆菌乳糖操纵子的启动子、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因danA的启动子、地衣形芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。对在真菌宿主中的转录而言，有效启动子的例子是从编码下述酶的基因得到的那些，所述的酶是米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、Rhizomucormiehei脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶。
本发明的表达载体也可以包含一个合适的转录终止子，且在真核生物中，聚腺甘酸化序列可操作地连接到编码本发明的酶变体的DNA序列上。终止和聚腺苷酸化序列可以恰当地从与新述启动子相同的来源得到。
所述载体可以进一步包含能够使载体在所述宿主细胞中复制的DNA序列。这类序列的例子是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702复制起点。
所述载体也可以包含一种可选择的标志，例如，其产物修补宿主细胞缺损的基因(例如枯草芽孢杆菌或地衣形芽孢杆菌的dal基因)或者赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。而且，所述载体可以包括曲霉属选择标记(例如amdS、argB、niaD和sC)，一种引起潮霉素抗性的标记，或者选择可以由共转化完成，例如，如WO9/17243中所描述的。
用于分别连接本发明的编码酶变体的DNA构建体、启动子、终止子和其它因子，以及将它们插入到包括复制必需信息的合适载体中的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrooket al.，Moleeular Cloning；A Laboratory Manual，CSH，NY，1989)。
在重组产生本发明的酶变体中，包含以上限定的DNA构建体或者表达载体的本发明的细胞用作宿主细胞是有利的。所述细胞可以用编码修饰酶的DNA构建体转化，方便地将DNA构建体整合进宿主染色体中。通常认为这种整合是有利的，因为DNA序列很可能稳定保持在细胞中。可以按照常规方法(例如同源或异源重组)将DNA构建体整合到宿主染色体中。另外，所述细胞也可以用以下所述的与不同类型的宿主细胞有关的表达载体转化。
宿主细胞可以是高等生物体(例如哺乳动物或昆虫)的细胞，但最好是微生物细胞，例如细菌或真菌(包括酵母)细胞。
合适的细菌的例子是划兰氏阳性菌(例如，枯草孢杆菌、地衣形芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪孢杆菌、Bacillus alkalophilus、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、Bacillus lautus、巨大芽孢杆菌、Bachllus thuringiensis.或者变青链霉菌或鼠灰链霉菌)或划兰氏阴性菌(例如大肠杆菌)。细菌的转化可以由例如用本领域已知方式，进行原生质体转化或使用感受态细胞来实现。
酵母生物体可以顺利地从酵母属或裂殖酵母属的种中选择，例如啤酒酵母。有利的丝状真菌可以是属于曲霉属的种，例如米曲霉或黑曲霉。真菌细胞可以用本领域已知方式经涉及原生质体形成和原生质体的转化，接着使细胞壁再生的方法来转化。在EP238 023中描述了一种转化黑曲霉属宿主细胞的适宜的方法。
可以通过在有助于产生修饰酶的条件下培养以上所述的宿主细胞，并从细胞和/或培养基中回收修饰酶来产生所述的修饰酶。
用于培养细胞的培养基可以是任何适于生长所培养的宿主细胞和获得本发明的修饰酶的表达的常规培养基。合适的培养基可以从市场上购得，也可以按照已出版的配方(例如美国典型培养物保藏中心目录中的配方)制备。
从宿主细胞分泌的修饰酶可以用公知的方法从培养基中便利地回收，所述方法包括经离心或过滤从培养基中分离细胞、采用盐(例如硫酸铵)沉淀培养基中的蛋白质组分、接着进行层析(例如离子交换层析、亲和层析等)步骤。去垢添加剂和组合物
由于其改进的洗涤和或盘碟洗涤性能，本发明的修饰淀粉酶或脂肪酶特别适合包含到去垢组合物(例如需要在pH7-13的范围内，特别是在pH8-11的范围内发挥作用的去垢组合物)中。
按照本发明，修饰淀粉酶或脂肪酶可作为去垢组合物的一个组分加入。就这一点来说，所述酶可以以去垢添加剂的形式包含在去垢组合物中。去垢组合物以及去垢添加剂可以另外包含通常用于去垢剂中的一种或多种其它酶，例如，蛋白酶、氧化酶、过氧化物酶和纤维素酶。
在一个特定的方面，本发明提供了一种去垢添加剂。修饰淀粉酶或脂肪酶和可有可无的一种或多种其它酶可以通过加入包含一种或多种酶的分开的各添加剂或者通过加入包含所有这些酶的组合添加剂包含到去垢组合物中去。本发明的去垢添加剂(即分开的或组合的添加剂)可以配制成例如颗粒、液体、浆状物等。优选的去垢添加剂配方是颗粒(特别是非粉化的颗粒)、液体(特别是稳定化了的液体)、浆状物或保护酶。
可以按照例如US4,106,991和US4,661,452中所述的方法制法备非粉化的颗粒，可按本领域公知的方法包覆或不包覆。可以在制成颗粒前后混进去垢酶。
可以按照已建立的方法，例如通过加入多羟基化合物(例如丙二醇、糖或糖醇)、乳酸或硼酸使液体酶制剂稳定化。其它酶稳定剂是本领域公知的。可以按照EP238 216中所述的方法制备保护酶。
另一方面，本发明涉及到包含本发明的修饰淀粉酶或脂肪酶的去垢组合物。
本发明的去垢组合物可以是任何便利的形式，例如粉末、颗粒或液体。液体去垢剂可以是含水的(典型地含有高达90％的水和-20％的有机溶剂)或不含水的(例如，如欧洲专利120,659中所述的)。
去垢组合物包含一种表面活性剂，该表面活性剂可以是阴离子的、非离子的、阳离子的、两性的或者这些类型的混合物。所述去垢剂通常含有0-50％的阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐、α-烯烃苯磺酸盐、烷基硫酸盐、脂肪醇乙氧基硫酸盐或肥皂。它也可以含有0-40％的非离子表面活性剂，例如壬基酚乙氧基化物或脂肪醇乙氧基化物。此外，它可以包含N-(多羟基烷基)脂肪酸酰胺表面活性剂(例如，如WO92/06154中描述的)。
所述去垢剂可以包含1-40％的去垢助剂，例如，沸石、二或三磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、NTA、EDTA或DTPA、链烯基琥珀酸肝、或硅酸盐，它也可以不含助剂(即，基本上无去垢助剂)。
本发明的去垢组合物可用常规的酶稳定剂来稳定，所述的段定剂例如多羟基化合物(如丙二醇、糖或糖醇)、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(如芳香硼酸酯)。所述组合物可以按例如WO92/19709和WO92/19708中的描述配制。其它酶段定剂是本领域公知的。
本发明的去垢组合物可以包含漂白剂(例如，过硼酸盐、过碳酸盐)和/或活化剂，四乙酰乙二胺或壬酰氧苯磺酸盐，并且可以按例如WO92/07057中的描述配制。
本发明的去垢组合物也可以包含其它习用的去垢组分，例如抗絮凝聚合物、织物调理剂、泡沫促进剂、抑泡剂、防腐剂、污垢悬浮剂、螯合剂、抗污垢再沉淀剂、染料、杀菌剂、荧光增白剂和香料以及以上提到的酶。
在本发明范围内的包含修饰淀粉酶或脂肪酶的本发明的去垢组合物的具体形式包括：
a)一种配制成去垢粉末的去垢组合物，含有磷酸盐助剂、阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、硅酸盐、用来在使用时将pH值调至所需pH值的碱、和中性无机盐。
b)一种配制成去垢粉末的去垢组合物，含有沸石助剂、阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、丙烯酸或相当的聚合物、硅酸盐、用于在使用时将pH值调至所需pH值的碱、和中性无机盐。
c)一种配制成含水去垢液体的去垢组合物，包含阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、有机酸、碱，具有在使用时可调节至7和11之间的pH值。
d)一种配制成不含水的去垢液体的去垢组合物，包含基本上由线性烷氧基化伯醇组成的液体非离子表面活性剂、磷酸盐助剂、碱、具有在使用时可调节至约7和11之间的pH值。
e)一种配制成颗粒形式的具有至少为600g/l的堆积密度的去垢粉末的紧密去垢组合物，含有阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，磷酸盐助剂、硅酸钠，少量含有或/基本上不含有中性无机盐。
f)一种配制成颗粒形式的具有至少为600g/l的堆积密度的去垢粉末的紧密去垢组合物，含有阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂、沸石助剂、硅酸钠，少量含有或基本上不含有中性无机盐。
g)一种配制成去垢粉末的去垢组合物，含有阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、丙烯酸聚合物、脂肪酸皂、碳酸钠、硫酸钠、粘土粒子和硅酸钠。
h)一种包含5-65％(重量)的表面活性剂、0-50％(重量)的助剂和0-30％(重量)的电解质的液态紧密去垢剂。
i)一种紧密粒状去垢剂，包含线性烷基苯磺酸盐、脂烷基(tallow alkyl)硫酸盐、C4-5烷基硫酸盐、7倍乙氧基化的C4-5醇、11倍乙氧基化的脂醇、分散剂、聚硅氧烷流体(Siliconefluid)、柠檬酸三钠、柠檬酸、沸石、马来酸丙烯酸共聚物、DETMPA、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉分解酶、硅酸钠、硫酸钠、PVP、过硼酸盐和促进剂。
j)一种粒状去垢剂，包含线性C1-2烷基苯磺酸钠、硫酸钠、沸石A、次氮基三乙酸钠、纤维素酶、PVP、TAED、硼酸、过硼酸和促进剂。
k)一种液态去垢剂，包含C12-14链烯基琥珀酸、柠檬酸一水合物、C12-15烷基硫酸钠、(2倍乙氧基化的C12-15醇的、7倍乙氧基化的C12-15醇的、5倍乙氧基化的C12-15醇的)硫酸钠、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)、油酸、乙醇、丙二醇、蛋白酶、纤维素酶、PVP、抑泡剂、NaOH、过硼酸盐和促进剂。
此外，合适的去垢组合物(其中包含本发明的修饰淀粉酶或脂肪酶可能是有利的)的例子包括EP373 850、EP378 261、WO92/19709、EP381 397、EP486 073、WO92/19707、EP407225和WO92/13054中所述的去垢组合物。
盘碟洗涤组合物
除了包含本发明的修饰淀粉酶或脂肪酶外盘碟洗涤组合物还包含表面活性剂，所述表面活性剂可以是阴离子的、非离子的、阳离子的、两性的或者这些类型的混合物。该去垢剂含有0-90％的非离子表面活性剂，例如，低泡沫到无泡沫的乙氧基化丙氧基化直链醇。
所述去垢组合物可以含有无机和/或有机类型的去垢助剂盐。所述洗涤助剂可进一步分为含磷类和不含磷类。所述去垢组合物通常含有1-90％的去垢助剂。
含磷的无机碱性去垢助剂(存在时)的例子包括水溶性盐，特别是碱金属焦磷酸盐、正磷酸盐、多磷酸盐和磷酸盐。不含磷的无机助剂(存在时)的例子包括水溶性的碱金属碳酸盐、硼酸盐和硅酸盐以及各种类型的非水溶性晶态或非晶态的硅铝酸盐(其中沸石是最常见的代表)。
合适有机助剂的例子包括碱金属、铵和取代铵的柠檬酸盐、琥珀酸盐、丙二酸盐、脂肪酸磺酸盐、羧甲基琥珀酸盐、聚乙酸铵、羧酸盐、聚羧酸盐、氨基聚羟酸盐、聚乙酰基羧酸盐和多羧基磺酸盐。
其它合适的有机助剂包括已知具有助剂性质的较高分子量的聚合物和共聚物，例如适宜的聚丙烯酸、聚马来酸和聚丙烯酸/聚马来酸共聚物和它们的盐。
盘碟洗涤组合物可以包含氯/溴型或氧型漂白剂。无机氯/溴型漂白剂的例子是锂、钠或钙的次氯酸盐和次溴酸盐以及氯化磷酸三钠。有机氯/溴型漂白剂的例子是杂环N-溴和N-氯酰亚胺，例如三氯异氰尿酸、三溴异氰尿酸、二溴异氰尿酸和二氯异氰尿酸，和其带有水-加溶阳离子(例如钾和钠)的盐。海因类化合物也是合适的。
氧漂白剂是优选的，例如以无机过酸盐，最好是具有一种漂白前体或是一种过氧酸化合物的形式存在。合适的过氧漂白化合物的典型例子是碱金属过硼酸盐(四水合物和一水合物两者)、碱金属过碳酸盐、过硅酸盐和过磷酸盐。优选的活化剂物质是TAED和甘油三乙酸酯。
本发明的盘碟洗涤剂可以用匀用的酶稳定剂稳定，所述的稳定剂例如多羟基化合物(如丙二醇、糖或糖醇)、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如芳香硼酸酯)。
本发明的盘碟洗涤剂组合物也可以含有其它习用的去垢成分，例如，抗絮凝物质、填充物质、抑泡剂、防腐剂、污垢悬浮剂、螯合剂、抗污垢再沉淀剂、脱水剂、染料、杂菌剂、荧光增白剂、增稠剂和香料。
其它用途
依据酶的特异性，预期本发明的酶可以用于一种或可能为多种以上提到的用途，即，在烘烤工业中，果酒和果汁工业中、动物饲料中和造纸纸浆的处理中。在一个特定的实施方案中，本发明的酶制剂可以包含选自由修饰淀粉酶、脂肪酶和半纤维素酶组成的组的一种或多种酶与一种或多种其它酶的组合体。
在纸浆和纸上的用途
在造纸纸浆工业中，按照本发明的酶制剂可以有利地用于例如如下一些方面：
-去树皮，即在去树皮前在机械滚筒中用水解酶(例如果胶溶酶和/或半纤维素酶)预处理可以降解富含果胶的形成层，引起有益的能量节省。
-脱纤维(提炼或打浆)，即在提炼或打浆前用水解酶(例如果胶溶酶和/或半纤维素酶)处理含有纤维素纤维的物质，由于酶对纤维表面的水解作用，这种处理导致能量消耗的降低。与使用未经修饰的酶相比，使用按照本发明的酶制剂导致节省更多的能量，因为修饰酶具有更强的透过纤维壁的能力。
-纤维修饰，即，纤维性质的改进，这种改进需要通过纤维壁的部分水解，这需要更深渗透的酶(例如为了使粗糙的纤维更柔和)。纤维的深度处理迄今还不能用于高产量的纸浆(例如机械纸浆或循环纸浆的混合物)。这种限制是由于纤维壁结构阻止酶分子通过(由于纤维壁孔基质的物理限制)这一性质。令人惊奇地是，本发明酶制剂的修饰(即衍生的)酶更能穿透纤维壁。这一发现表明，微纤丝表面上的带阴电荷的酸基因通过静电排斥限制酶分子透过，对高产量的纸浆也是这样。
-排水：造纸纸浆的排水能力可以通过用水解酶(例如，半纤维素酶、脂肪酶和/或果胶酶)处理来改善。使用按照本发明的酶制剂可能会更有效，例如它导致在更大程度上松开强烈水合的纤细组分中的微纤丝束，该微纤丝来通过堵塞纤维间和纸机械金属丝网中的空间限制排水速率。
-纤维相互结合。水解酶用于制造纸浆以改善纤维相互结合。酶清除掉纤维表面上的非纤维素杂质和细粒。从而产生更大面积的裸露的纤维素和半纤维素，它提高了纤维与纤维之间的氢键合能力。这一过程也称作除去。用包含按照本发明的酶制剂的半纤维素酶生产的纸和纸板具有提高的强度或降低的克重、较光滑的表面和改善的可印刷性。这些改进是由于修饰/衍生酶的改善的穿透性。
-酶促脱墨。使用水解酶(例如脂肪酶、果胶酶和半纤维素酶)部分水解浆状再循环纸以促进墨粒子的除去和凝结是已知的。使用按照本发明的酶制剂可以使墨粒子从结构表面更有效的松动，这是由于酶分子更好地渗透到纤维壁的纤丝基质中，由此软化表面，从而有效地松动墨粒子。
-牛皮纸浆的漂白，参见以下实施例6。为了降低纸浆中残余木质素的含量，工业上用内木聚糖酶(一种半纤维素酶)进行氧漂白的牛皮纸浆的处理，这样降低了后续漂白过程中对化学品的要求。为了最大限度地降低对无机酸的加入的需求并避免出现腐蚀的问题，需要用内木聚糖酶处理在高的pH值下进行。然而，部分由于静电排斥，当pH值增加到7以上时，大多数市售的内木聚糖酶产品的性能降低。
木质纤维素纸浆的处理可以按例如WO93/08275、WO91/02839和WO92/04608中的描述进行。
在纺织品上的用途
在另一个实施方案中，本发明涉及在生物抛光过程中使用按照本发明的酶制剂。生物抛光是对人造丝线表面的一种特殊处理，它在不损失织物可湿性的情况下改善织物的手感和外观质量。生物抛光最重要的效果可以以减少的织物表面微毛和织物表面起球、增加的平滑表面/光泽、改善的织物手感、增加的耐久柔软性和改进的吸水性为特征。生物抛光通常发生在针织和编织织物制造的湿法加工中。湿法加工包括如脱浆、精练、漂白、洗涤、印染和修整这些步骤。在这些步骤的每一步骤中，织物或多或少地受到机械作用。一般来说，在纺织品被针织或编织后，织物进入脱浆阶段，接着是精练阶段等。脱浆是从纺织品除去浆糊的步骤。在织机上织造前，经向的人造丝线常常用浆糊淀粉或淀粉衍生物涂覆，以增加其抗能强度。在织造后，涂覆的浆糊必须在进一步加工该织物前除去，以保证均质的和抗洗涤的结果。优选的脱浆方法是经淀粉酶的作用酶促水解浆糊。已知为了获得生物抛光的效果，需要酶促作用和机械作用联合。也已知如果酶促处理与习用的用软化剂处理结合，可以获得“超级柔软性”。预期酶促脱浆中使用包含淀粉酶的本发明的酶制剂是有利的，并且将包含木聚糖酶的本发明的酶制剂用于纤维素织物(特别是粘胶纤维或Tencel或它们与以上提到的其它织物的掺合物)的生物抛光中是有利的。可以用例如WO93/20278中所述的方法获得生物抛光。
烘烤
在另一个实施方案中，本发明涉及到按照本发明的酶制剂(尤其是一种化学修饰木聚糖酶、淀粉酶、脂肪酶、漆酶和/或氧化酶制剂)在烘烤食品用面粉中改善生面团的发育、弹性和/或稳定性，和/或烤烤产品的片屑结构和/或防腐性能上的用途。尽管酶制剂可以用于制备从任何类型的面粉或粗粉(例如，基于黑麦、大麦、燕麦或玉米的)制得的烘烤产品，但本发明的酶制剂在制备由小麦制得的或包含大量小麦的生面团或烘烤产品上特别有用。用本发明的酶制剂生产的烘烤产品包括面包、面卷、baquettes等。为了烘烤目的，本发明的酶制剂可以在仅有或主要有例如木聚糖酶、脂肪酶、淀粉酶、氧化酶或漆酶酶促活性下使用，或者以与其它酶例如脂肪酶、淀粉酶、氧化酶(如葡萄糖氧化酶、过氧化物酶)、漆酶和／或蛋白酶的组合体使用。所述的脂肪酶、淀粉酶、氧化酶和漆酶选择性地按本文描述的方法修饰。
啤酒酿造
在另一个实施方案中，本发明涉及按照本发明的酶制剂在啤酒酿造工业中(具体说来是在改进包含例如大麦和/或高梁麦芽的麦芽汁的可过滤性上)的用途。木聚糖酶和/或淀粉酶制剂可以用与通常用于酿造的戊聚糖酶相同的方法(例如，如Vi
Figure A9419408000321
tor et al.，1993，J.Inst.BFew.，May-June，99，pp.243-248和EP 227159描述的方法)使用。此外，木聚糖酶制剂还用于处理酒糟，即，从啤酒麦芽汁产生的含有大麦或发芽的大麦或其它谷物的残渣，以提高残渣作为例如动物饲料的利用度。
汁液等
在另一个实施方案中，本发明涉及按照本发明的酶制剂在汁液工业中的用途。
预期本发明的酶制剂(即，木聚糖酶制剂)在水果或蔬菜汁的制备中(提高产量)，和在酶促水解各种植物细胞壁来源的物质或废物中是有用的，所述的物质或废物例如从纸生产得到的，或农业残渣，如，麦秆、玉米棒子、整玉米幼苗、花生壳、草、蔬菜皮、豆荚、废谷物、糖甜菜浆等。可以降解植物材料以改进不同类别的加工过程，方便从谷物纯化或提取除木聚糖外的其它组分(类似纯化β-葡聚糖或β-葡聚糖低聚物)、提高饲料价值、降低水结合能力、改善废水厂中的降解性，改善将例如青草和玉米转化成贮青饲料等。
最后，本发明的木聚糖酶制剂可以用于改变植物细胞壁来源物质的粘性。例如，木聚糖酶可以用于降低含木聚糖饲料的粘性，以便在小麦分离过程中加速处理含粘性木聚糖的物质，也用于在酿造过程中降低粘度。
动物饲料
在另一个实施方案中本发明涉及按照本发明的酶制剂在动物饲料中(或在动物摄食前处理动物饲料上)的用途。最好以提高植物蛋白漂(例如谷物和豆科植物)可消化度有效的量将所述酶制剂加入到饲料中。由此，例如本发明的木聚糖酶制剂可以用于修饰动物饲料，并且可以在体外(经修饰饲料组分)或体内发挥其作用。所述木聚糖酶制剂特别适于加入到阿拉伯糖基木聚糖和葡糖醛酸基木聚糖(glucuronoxylans)含量高的动物饲料组合物，例如，含有谷物(如大麦、小麦、黑麦或燕麦或玉米)的饲料中。部分由于肠内粘性降低，当木聚糖酶加入到饲料中时，可以明显改善植物细胞壁物质的体内分解(Bedford et al.，Proceedings of the 1st Symposium on Enagmes in AnimalNutrition，1993，pp.73-77)，从而获得动物对植物营养物更好的利用。由此，动物的生长速率和/或饲料转化率(即摄取饲料的重量相对重量的增加)得到提高。
以下实施例进一步说明本发明，但它们不用来以任何方式限制所要求的本发明的范围。
实施例1Humicola Lanuginosa脂肪酶在米曲霉中的表达
欧洲专利申请305,216中描述了Humicola Lanuginosa脂肪酶的克隆及该酶在米曲霉中的表达和表征。所用的表达质粒命名为p960。
除了仅在脂肪酶编码区的3’有微小修饰外，本申请中使用的表达质粒与p960相同。按以下方法进行所述修饰：用NruI和BanHI限制酶消化p960。克隆这两个位点之间的质粒pBR322的BamHI/NheI片段(其中NheI片段用克列诺聚合酶补齐)，从而产生质粒pAO1(图3)，该质粒含有单一BamHI和NheI位点。克隆这些单一位点之间的p960的BamHI/XbaI片段，给出pAHL(图4)。脂肪酶基因的体外定点突变
Nelson & Long，Analytical Biochemistry 180，147-151(1989)中描述了所使用的引起脂肪酶基因突变的方法。该方法有关三步产生PCR(聚合酶链反应)片段，所述片段包含了在PCR反应中用化学合成的DNA链作为一个引物产生的所需突变。从该PCR产生的片段经用限制酶切割可以分离到携带该突变的片段，将其再插入到表达质粒中。以下详细说明这一方法。图5和6进一步概括了这一方法。表达Humicola lanuginosa脂肪酶D165R/D167K变体的质粒的构建质粒pAHL的线性化
用限制酶SphI在50μl下列反应混合物中使环状质粒pAHL线性化：50mM Nacl、10mM Tris-Hel(PH7、9)、10mMMgcl2、1mM二硫苏糖醇、1μg质粒和2单位SphI。在37℃下进行消化反应2小时。用苯酚(用Tris-Hcl(pH7.5)饱和)抽提反应混合物，并加入2倍体积冰冷的96％乙醇沉淀。在离心和干燥离心沉淀后，用50μlH2O溶解线性化的DNA，并且在琼脂糖凝胶上估测其浓度。三步PCR突变
如图6所示，三步突变涉及使用四种引物：
突变引物(＝A)：5’-CCATATGAAAACACTTTGATTCTATACCCATTTCC-3’
PCR辅助引物1(＝B)：5’-GGTCATCCAGTCACTGAGACCCTCTACCTATTAAACGGC-3’30 PCR辅助引物2(＝C)：5’-CCATGGCTTTCACGGTGTCT-3’
PCR操作引物(＝D)：5’-GGTCATCCAGTCACTGAGAC-3’
辅助引物1和辅助引物2与编码区外的序列互补，并因此可以在构建突变序列中与任何突变引物组合。
所有三步都在包含下列组分的缓冲液中进行：10mM Tris-Hel(pH8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.001％明胶、0.2mM dATP。0.2mM dCTP。0.2mMdGTP、0.2mM TTP、2.5单位尾位端聚合酶。
在第1步中，将100pmol引物A、100pmol引物B和1 fmol线性化的质粒加入到总量为100μ的反应混合物中，进行由95℃下2分钟、37℃下2分钟和72℃下3分钟构成的15次循环。
在琼脂糖凝胶上估测PCR产物的浓度。然后进行第2步反应。将0.6pmol第1步的产物和1fmol线性化的质粒溶解到总量为100μl的前述缓冲液中，进行由95℃下5分钟、37℃下2分钟和72℃下10分钟构成的1次循环。
向第2步的反应混合物中加入100pmol引物C和100pmol引物D(各1μl)，进行由95℃下2分钟、37℃下2分钟和72℃下3分钟钟构成的20次循环。这一操作包括了突变过程中的第3步。突变的限制片段的分离：
从琼脂糖凝胶分离第3步的产物，并再溶解到20μl水中。然而用限制酶BamHI和BstXI在总量为50μl的具有下列组成的溶液中消化：
100mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH7.9)、10mMMgCl2、1mM DTT、10单位BamHI和10单位BstXI。在37℃下温育2小时，从琼脂糖凝胶分离7336p BamHI/BstXI片段。表达载体pAHL的连接：
在以上指出的条件下用BamHI和BstXI切割表达质粒pAHL，从琼脂糖凝胶分离所得的大片段。将以上分离到的突变片段连接到这一载体上，用连接混合物转化大肠杆菌。通过用限制酶切割从转化体制备的质粒证实所述片段的存在和取向。在ABJ DNA测序仪(373A型)上用Dye DeoxyTM末端循环测序试剂盒(应用生物系统)对双链质粒进行序列分析。该质粒命名为pAHLD165R/D167K，除了取代的密码子外，它与pAHL相同。
实施例2用于构建其它腐质霉属脂肪酶变体的引物
用5实施例1所述相同的方法引入下列突变。以下列出用于修饰的引物
突变            引物A序列E87K/D96K/D102K     5’-
                GCCGGAGCAAATCTTATTTATTTCTTTCAACTTG
                A   A   G   T   T   A   A   G-
                ATTCCCGATCCAGTTTTTTATGGAACGAGA-3’E210K               5’-GCTGTAACCGAACTTGCGCGGCGGGAG-3’T199K/N200R         5’-AGGGACAATATCCCTCTTGTGGGTAATGCG-3’
实施例3表达腐质酶属脂肪酶变体的质粒的构建
使用合适的引物经进行连续突变构建下列质拉：
pAHLD165R/D167K/D102K/D96K/E87K，
pAHLD165R/D167K/D102K/D96K/E87K/T199K/N200R
pAHLD165R/D167K/D102K/D96K/E87K/T199K/N200R/E210K
实施例4曲霉属脂肪酶变体的表达米曲霉的转化(一般的方法)
将米曲霉孢子接种在100ml YPD(Sherman et al.，Methodsin Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory，1981)上，振动培养约24小时。经米拉合金布(miracloth)过滤收获菌丝体，并用200ml 0.6MμgSO4洗涤。将该菌丝体悬浮在pH5.8的15ml1.2MμgSO4、10mM NaH2PO4溶液中。将悬液在冰上冷却，加入含120mg批号为1687的Novozym234的1ml缓冲液。5分钟后，加入1ml 12mg/ml的BSA(希格玛H25型)，于37℃在轻轻搅拌下继续温育1.5-2.5小时，直到在显微镜监测下可见大量的原生质体。
用来拉合金布过滤悬液，将滤液转移至无菌管中，用5ml0.6M山梨醇、100mM Tris-HCl(pH7.0)溶液覆盖。在1000g下离心15分钟，从MgSO4缓冲层的顶部收集原生质体。将2倍体积的STC(1.2M山梨醇、10mM Tris-HCl(pH7.5)、10mMCaCl2)加入到原生质体悬液中，使混合物在1000g下离心5分钟。将原生质体沉淀再悬浮到3ml STC中，并再次制得原生质体沉淀。重复这一操作。最后，将原生质体再悬浮到0.2-1ml STC中。
将100μl原生质体悬液与5-25μg p3SR2(Hynes et al.，Mol.and Cel.Biol.，Vol.3，No.8,1430-1439中描述的一种携带构巢曲霉amdS基因的质粒)的10μlSTC溶液混合。将混合物置于室温下25分钟，加入0.2ml 60％PEG 4000(BDH 29576)、10mMCaCl2和10mM Tris-HCl(pH＝7.5)的溶液并小心搅拌(两次)，最后加入0.85ml相同的溶液并小心搅拌。混合物置于室温下25分钟，在2500g下离心15分钟。将沉淀再悬浮在2ml1.2M山梨醇中。在一次以上的沉降后，将原生质体铺覆到含有1.0M蔗糖(pH7.0)、10mM乙酰胺(氮源)和20mM CsCl(抑制本底生长)的小型平板(Cove，Biochem.Biophys.Acta 113(1966)51-56)上。在于37℃培养4-7天后，收集孢子，悬浮在无菌水中，将其分布开以获得单菌落。重复这一操作，在第二次再分离后，将单菌落的孢子作为指定的转化体贮存起来。
实施例5脂肪酶变体在米曲霉中的表达
经用以上实施例所述的含有构巢曲霉amdS基因的p3SR2其转化将以上所述质粒转化到米曲霉IFO4177中。按所述方法制备的原生质体与表达质粒和p3SR2的等量混合物(各使用约5μg)一起温育。再分离两次可使用乙酰胺作为唯一氮源的转化体。在YPD上生长三天后，用一项试验分析培养上清液的脂肪酶活性。选择出最好的转化体用于进一步的研究，使其在含200ml FG4培养基(3％黄豆粉、3％麦芽糖糊精、1％蛋白胨、用4M NaOH调pH至7.0)的1l摇瓶中于30℃生长4天。Lipolase和其变体的pI值
在pH值1-14的范围内基于残基ASP(D)、Glu(E)、Lys(K)、Arg(R)、His(H)和Tyr(Y)中可滴定基团的序列数确定了Lipolase和其修饰物的理论pI值。
所述pI值列表如下：脂肪酶野生型(Lipolase)                          pI4.7+D165R/D167K/D102K/D96K/E87K                    pI7.6+D165R/D167K/D102K/D96K/E87K/E210K              pI8.1+D165R/D167K/D102K/D96K/E87K/T199K/N200R        pI8.2+D165R/D167K/D102K/D96K/E87K/T199K/N200R/E210K  pI8.5
实施例7A
由EDC介导的LipolaseTM分别与氨基葡糖、聚赖氨酸和聚精氨酸的偶联
按照标准方法进行经碳化二亚胺介导的LipolaseTM(一种米曲霉表达和产生的脂肪酶，Novo Nordisk A/S Bagsvaerd，Denmark)生产和销售)分别与氨基葡糖、聚赖氨酸和聚精氨酸的偶联。
约50mg/ml的量将高纯度的LipolaseTM溶解在50mM硼酸/NaOH(pH9.0)中，由此制得酶储备溶液。用偶联缓冲液(含200mM NaCl的50mM MES(pH 5.0))稀释酶储备溶液。也将氨基葡糖、聚赖氨酸(MW 8200)和聚精氨酸(MW 6000)分别溶解在偶联缓冲液中。
用将酶和聚赖氨酸/聚精氨酸混合(使酶和氨基葡糖两者最终浓度均为3mg/ml)，接着按每mg酶5mg的量加入EDC(介导反应)的方法进行偶联反应。于室温和连续磁力搅拌的条件下使偶联反应持续2小时。
通过在5℃对0.1MNH4HCO3(pH8)(对聚赖氨酸和聚精氨酸)和在5℃对0.2M乙酸铵(pH6.9)(对氨基葡糖)充分透析除去过剩的反应物来终止反应。所得衍生物在5℃下贮存。
所制备的LipolaseTM-氨基葡糖衍生物由等电聚焦测得具有9.5的pI值并且与野生型LipolaseTM比较时具有21.7％的剩余LipolaseTM活性。所制备的LipolaseTM聚赖氨酸衍生物由等电聚焦测得具有9.5的pI值并且与野生型LipolaseTM比较时具有47.9％的剩余LipolaseTM活性。所制备的LipolaseTM-聚精氨酸衍生物由等电聚焦测得具有9.5的pI值并且与野生型LipolaseTM比较时具有27.1％的剩余LipolaseTM活性。
按照标准Novo Nordisk Lipolase方法AF-95-GB(可请求从Novo Nordisk A/S获得)测定所述活性。该方法在此一并作为参考。
实施例7B由EDC介导的Termamyl与氨基葡糖的偶联按标准方法进行由碳化二亚胺介导的Termamyl(地衣形芽孢杆菌菌株表达和产生的一种淀粉酶，Novo Nordisk A/S Bagsvaerd，Denmark生产和销售)与氨基葡糖的偶联。
由以约50mg/ml的量将高度纯化的Termamyl溶解在pH9的Britton-Robinson缓冲液(0.04M磷酸、乙酸、硼酸；用0.2NNaOH滴定来调节pH值)中制备酶储备溶液。用偶联缓冲液(含200mM氯化钠的50mM MES，pH5.0)稀释酶储备溶液。也将氨基葡糖溶解在偶联缓冲液中。
用将酶和氨基葡糖混合(使酶的最终浓度为3mg/ml，氨基葡糖的最终浓度为3、0.6和0.3mg/ml)，接着按每mg氨基葡糖5mg的量加入EDC的方法进行偶联反应。于室温和连续磁力搅拌的条件下将偶联反应进行2小时。
通过在5℃对0.2M乙酸铵(pH6.9)充分透析除去过剩的反应物来终止反应。所得衍生物在5℃下贮存。
用在Termamyl制剂中测定淀粉酶活性的标准Novo Nordisk方法AF-24-GB(可请求从Novo Nordisk A/S获得)测定所得淀粉酶的活性。该方法在此一并作为参考。制备了以下变体：
 TERMAMYL  氨基葡糖  淀粉酶活性     pI
衍生物#1   3mg/ml   3mg/ml   3.90KNU/ml     9.5
衍生物#2  3mg/ml  3mg/ml  8.80KNU/ml     9-9.5
衍生物#3  3mg/ml  3mg/ml  15.40KNU/ml     8.5-9
实施例7C在pH6下由EDC介导的Termamyl与氨基葡糖的偶联
按标准方法进行由碳化二亚胺导介的Termamyl(地衣形芽孢杆菌菌株表达和产生的一种淀粉酶)与氨基葡糖的偶联。
由以约50mg/ml的量将高度纯化的Termamyl溶解在pH9和Britton-Robinson缓冲液(0.04M磷酸、乙酸、硼酸，用0.2NNaOH滴定来调节pH值)中制备酶储备液。用偶联缓冲剂(含200mM NaCl的50mM MES，pH6.0)稀释酶储备溶液。也将氨基葡糖溶解在偶联缓冲液中。
用将酶和氨基葡糖混合(使酶的最终浓度为3mg/ml，氨基葡糖的最终浓度为3和1.5mg/ml)，接着按每mg氨基葡糖5mg的量加入EDC的方法进行偶联反应。于室温下和连续磁力搅拌的条件下将偶联反应进行2小时。
通过在5℃对0.2M乙酸铵(pH6.9)充分透析除去过剩的反应物来终止反应。所得衍生物在5℃下贮存。
用在Termamyl制剂中测定淀粉酶活性的标准Novo Nordisk方法AF-124-GB(可请求从Novo Nordisk A/S获得)测定所得淀粉酶的活性，该方法在此一并作为参考。
制备了下列变体：
TERMAMYL 氨基葡糖 淀粉酶活性     pI
衍生物#5  3mg/ml  3mg/ml  10.1 KNU/ml     8-9
衍生物#5  3mg/ml  1.5 mg/ml  15.3 KNU/ml     7.5-8.5
实施例7D
由EDC介导的Thermomyces lanuginosus木聚糖酶与氨基葡糖的偶联
按照标准方法进行Thermomyces lanuginosus木聚糖酶与氨基葡糖经碳化二亚胺介导的偶联。
由对用来平稳的偶联缓冲液透析制备酶储备溶液。用偶联缓冲液(含有200mM NaCl的50mM MES，pH5.0)稀释酶储备溶液。也将氨基葡糖溶解在偶联缓冲液中。
用将酶与氨基葡糖混合(使酶和氨基葡糖两者的最终浓度均为2mg/ml)，接着以每mg酶5mg的量加入EDC(介导反应)。在室温和连续磁力搅拌的条件下连续进行偶联反应2小时。
通过在5℃，pH7下对Britton-Robinson缓冲液(参见实施例1B)除去剩下的反应物来终止反应。所得衍生物在5℃下贮存。
按以上描述的方法制法备的木聚糖酶-氨基葡糖衍生物在用TSK-G2000SW柱进行大小排阻色谱时显示出是单体的，用等电聚焦测定时具有9的pI值，与野生型T.lanuginosus木聚糖酶相比具有3.8％的剩余木聚糖酶活性。用标准Novo Nordisk木聚糖酶方法AF-293.9/1-GB(可请求从Novo Nordisk获得)测定所述活性，该方法在此一并作为参考。
实施例8Lipolase和其氨基葡糖衍生物的界面活性
张力计上的测定显示，LipolaseTM的氨基葡糖化导致在碱性pH值下界面活性的明显增加。
用装有Wilhelmy Pt-盘的Sigma 70张力计(KSVFinland)进行测定。通过将25μl高纯酶(对LipodaseaTM和氨基葡糖衍生物(“Lipolase-GA”)两者都调至OD280nm＝1.66)加入到100ml缓冲溶液中，接着测定表面张力γ随时间的变化来进行实验。
于25℃在50mMTris(pH7)+500mM NaCl和50mM甘氨酸(pH10)+500mM NaCl中进行测定。为了增加酶在空气-水界面上的吸收，加入过量的中性盐。
在pH7时已显示出氨基葡糖化增加吸收程度(图1)。从pH7到10，天然LipolaseTM的吸收没有任何大的改变。另一方面，酶衍生物的pI引起其表面活性的明显增加(图2)。
实施例9在脂肪醇乙氧基化物存在下改进的脂解性能
使用一种单层装置(KSV-5000，KSVInstruments，Finland)证实，LiolaseTM的氨基葡糖化在长链脂肪醇乙氧基化物存在下大大提高这一脂肪酶的脂解作用。在大多数目前使用的去垢剂中存在的大量非离子表面活性剂是脂肪醇乙氧基化物(例如Dobanol 25-7)。实验
将一种全文充分说明过的组合物(由甘油三酯底物和单组分脂肪醇乙氧基化合物构成)的混合单层分布到水面下相上。将表面压力调节至所需值。向面下相加入充分限定过的量的脂肪酶。通过压缩单层以便在不渗性底物分子水解成更多的水渗性反应物过程中保持恒定的表面压力的流动屏障的速度来表明脂解作用。用这一试验，各脂肪酶被β(留下的未被脂肪酶水解的底物的最终区域部分)区别开。
下表说明，LipolaseTM的氨基葡糖和聚赖氨酸衍生物各自在有脂肪醇乙氧基化物存在下性能要好得多。此外，它还说明，当脂肪酶的净电荷增加时，在脂肪醇乙氧基化物存在下，脂肪酶的性能得到提高。氨基葡糖化后LipolaseaTM对脂肪醇乙氧化物的提高的耐受性酶                    βLipolaseTM(野生型)   59％野生型+E210R          56％野生型+T199K/N200R    53％野生型+D102K/S105K    49％氨基葡糖化的衍生物    0％聚赖氨酸衍生物        0％注：10mM甘氨酸缓冲液，底物：Dicaprin，10脂肪酶单位(LU)，pH10.0，25℃，30mN/m.
添加剂：七亚乙基单十八烷基醚
实施例10淀粉酶和其氨基葡糖衍生物的洗涤性能带有色淀粉的织物
为了肉眼观察本发明的酶制剂的去污性，按以下方法制备有色淀粉。将50g马铃薯淀粉溶解在500mlH2O中，加热到80℃。然后将5g染料Cibacron蓝3GA与100g硫酸钠和500ml去离子水一起加入。将混合物加热15分钟。接着加入5g磷酸三钠，将温度降至50℃，搅拌混合物75分钟，再冷却至室温。使用一个离心步骤除去剩余的未反应染料。
然后将100％棉织物浸入到溶液中，压过一个滚子，并衬板干燥(line dried)。然后测定在660nm下织物的减退，应在35-45的范围内。洗涤方法
在磁力搅拌器搅拌下，在玻璃烧杯中洗涤染过的织物的布条样品。
体积：        60ml
洗涤时间：    20分钟
漂洗时间：    15分钟
样本数：      6块直径为2.5cm的小块布样
温度：        55℃
去垢剂：      市售高pH的欧洲自动盘碟机去垢剂，38/l
pH值：        10.2
干燥方法：    衬板干燥(line dring)
重复次数：    1次酶
TermamylTM
氨基葡糖化Termamyl(TRMEDC1)，参见实施例7B评价
依据在660nm的减退分别检测在小块布样两侧的淀粉除去情况(仪器：Data Color、switzerland制造的Elrepho)。R值和标准偏差()
    酶    0 KNU/1     0.4 KNU/1     1.0 KNU/1     3.0 KNU/1
Termamy1    53.65(0.34)     68.55(0.34)     76.40(0.59)     82.86(0.12)
TRMEDC1    53.65(1.04)     73.50(0.58)     82.33(0.24)     86.20(0.15)
以上结果说明，氨基葡糖化酶的性能明显优于未修饰的Termamyl。实施例11在去垢剂存在下LipolaseTM的改进的性能
按实施例7A描述的方法制法备LipolaseaTM的高pI衍生物。按Lipolase对聚赖氨酸/聚精氨酸的重量比率1∶1进行LipolaseTM的衍生化。
EDC3：    与氯基葡糖偶联的LipolaseTM
EDC10：   与聚-L-精氨酸偶联的LipolaseTM
          (6.0KDa，Sigma P4663)
-EDC11：与聚赖氨酸偶联的LipolaseTM
        (8.2KDa，Sigma P6516)
用IEF证实衍生物的高pI。样品装到一个Ampholine工PAG-板(pH3.5-9.5)(Pharmacia)上，按制造商的说明进行实验。三种偶联物表现出具有9.5以上的pI。
采用标准Novo Nordisk LipolaseTM方法AF-95-GB(可请求从Novo Nordisk A/S获得)测定偶联物的剩余活性。
Lipolase衍生物的剩余活性示于下表中。
 酶     A280     LU/ml    LU/A208  产活性(％)
 Lipolase     1.0     4077     4077     100
 EDC3     1.61     1300     813     20
 EDC10     0.41     727     1773     43
 EDC11     0.57     811     1423     35
在使用棕榈酸对硝基苯酯(pNP-palmitate，SigmaN2752)为底物的试验中研究了在去垢剂存在下Lipolase偶联物的性能。在405nm测定随时间变化的由脂肪酶催化水解释放出的对硝基苯酚的吸收。试验在含有Dobanol 25-7(非离子去垢剂)或Ariel Ultra(全衣物洗涤剂，从Proeter&Gamble公司购得；加热除去酶活性)的0.1M Tris-HCl、0.352mMCaCl2，PH10中进行。Lipolase和其衍生物按一个活性基点(3.75LU/ml)确定剂量。结果示于下表中。结果说明，高pI偶联物具有大大提高的活性。下表中的改进因子IF定义为：IF＝(ΔA405衍生物)/(ΔA405野生型)30分钟后，表达出获得与野生型脂肪酶相同效果所需的脂肪酶变体蛋白质的量。
 酶  描述  剂量     IFDobanol25-7(4μg/ml)      IFAriel Ultra(100μg/ml)
 Lipolase  野生型  3.75LU/ml      1.0      1.0
 聚-Arg  WT+p-Arg(对照)  2.1μg/ml      1.0      1.0
 聚-Lvs  WT+p-Lys(对照)  2.6μg/ml      0.5      0.8
 氨基葡糖  WT+氨基葡糖  12.5mM      0.7      n.a.
 EDC3  氨基葡糖衍生物  3.75LU/ml      6.2      n.a.
 EDC10  聚-Arg衍生物  3.75LU/ml      4.5      2.7
 EDC11  聚-Arg衍生物  3.75LU/ml      6.3      3.5
n.a.：未获得到数据实施例12本发明的Lipolase和其衍生物的洗涤性能布样
按以下方法制法备含有脂肪(带有作为脂肪除去指示剂)的纺织品小块布样：漂白的棉布(Nordisk Tekstil生产的NT2116)剪成3.5×3.5cm的小片。在70℃下向猪油中加入0。075％(W/W)的苏丹红。混合物在5℃下保存，使用前加热到约70℃。将6μl猪油/苏丹红加到每一小块布样的中间。在70℃下温育小块布样30分钟，并在实验前保存一液。每次实验使用两小块布样。条件
在用磁力搅拌器搅拌下在玻璃烧杯中洗涤小块布样。
体积：    100ml
去垢剂：  欧洲型去垢剂
布样数：  6个布样
pH值：    10.2
洗涤时间：20分钟
漂洗时间：15分钟
温度：    30℃
干燥方法：衬板干燥
重复次数：3次酶
LipolaseTM
LipolaseTM-氯基葡糖(EDC3)，参见实施例7A和11
LipolaseTM-聚赖氨酸(EDC11)，参见实施例7A和11
LipolaseTM-聚赖氨酸(EDC10)，参见实施例7A和11评价
通过测定小块布样两边在460nm的减退(在Elrepho-meter上)评价酶的去污性。ΔR(减退)与没有酶对比
  300LU/1   750LU/1   1500LU/1   3000LU/1   10000LU/1
 Lipolase   3.5   4.8   5.6   5.5   7.0
 EDC3   4.5   5.8   5.2   6.7   7.8
 EDC10   4.1   6.1   7.3   7.9   11.6
 EDC11   5.0   6.0   8.2   9.3   11.3
另外，在下列条件下在一个三次循环的微量洗涤测定中试验LipolaseTM和其衍生物EDC10和EDC11酶：0、300、750、1500、3000、10000 LU/l布样/织物：参见上述布样标题下的内容去垢剂：含有1.17g/l线性烷基苯磺酸钠、0.15g/l AEO(Dobanol25-7)、1.25g/l三磷酸钠、1g/l硫酸钠、0.45g/l碳酸钠、0.15g/l硅酸钠的Heavy Duty Powder组合物，pH10.2。洗涤：在30℃下，6个布样在每个烧杯100ml水中洗涤20分钟，用流水冲洗15分钟，并在室温下干燥过液。评价：在每一洗涤循环后，测定布样两边在460nm下的反射能力。按实施例11中所述的方法计算改进因子IF。
获得了以下结果：
酶    IF
LipolaseTM 1.0
EDC10       1.5
EDC11       2.6实施例13用于牛皮纸浆的修饰的内木聚糖酶(半纤维素酶)
按SCAN C18在实验室制浆器中(10.000转)以1.5％的浓度将氧漂白的牛皮纸浆样品再制成纸浆。并在Büchner漏斗上过滤。用硫酸调节pH值。将样品稀释至10％浓度。将得自T.lanuginosus的纯化的内木聚糖酶制剂以765U/kg经率分别加入到pH为7和8.5的两种低浆样品中。一个U定义为每1分钟水解1μmol木聚糖聚合物中β1-4键的内木聚糖酶的量。也以765U/kg的比率向pH为7和8.5的另外两个样品中加入按本发明的方法修饰的T.lanuginosus内木聚糖酶(参见，例如实施例1D)。最后将两个对照样品的pH值分别调至7和8.5。
将6个纸浆样品在浸于60℃恒温水浴中的密闭的塑料袋中温育。在每15分钟揉捍该袋30秒钟。在温育3小时后，将纸浆样品排出。为了从纸浆中除去所有的纤丝，将水相样品滤过45μm滤器，测定最终pH值和在280nm的吸收。然后，用去离子水洗涤纸浆样品，剩余木质素的水平以卡伯值表示。下表给出了结果。每一数值中已减去了对照值。
   最终pH  释放的木质素  卡伯值降低
对照pH7     7.02     1.736     0.49
衍生物pH7     7.00     5.036     1.42
对照pH8.5     8.36     0.854     0.08
衍生物pH8.5     8.37     3.890     1.01
在pH7时，用修饰(衍生)内木聚糖酶处理的结果是释放的木质素的量增加2.9倍，且剩余木质素水平相应地降低(卡伯值减少)2.9倍。
在碱性pH8.5下，当使用修饰内木聚糖酶时，与未经修饰的对照酶相比，释放的木质素的量高于460％。与对照(未经修饰的酶)相比，用修饰内木聚糖时，卡伯值降低12.6倍以上。
这些结果表明，当按照本发明修饰(即衍生)时，内木聚糖酶的性能明显提高，在碱性pH范围内也是如此。
附图
本发明进一步用附图加以说明，其中
图1表示25℃、pH7时Lipolase和GA-lipolase在A/W界面的吸收；
图2表示25℃、pH10时Lipolase和GA-lipolase在A/W界面的吸收；
图3表示质粒pAO1；
图4表示质粒pAHL；
图5和图6表示三步PCR突变方法。

Claims (24)

1.一种包含修饰酶的酶制剂，所述修饰酶选自由淀粉酶、脂肪酶、氧化还原酶、果胶酶或半纤维素酶组成的组，由于经化学修饰或氨基酸取代获得的碱性pI和/或增加的表面活性，所述修饰酶具有改进的性能。
2.按照权利要求1的酶制剂，其中一种胺偶联到所述酶中的谷氨酸或天冬氨酸残基的羧基上。
3.按照权利要求2的酶制剂，其中所述的胺是胺化了的糖、胺化了的链烷烃、胺化了的醇、胺化了的多元醇或氨基酸、或者它们的酯或其它衍生物。
4.按照权利要求3的酶制剂，其中所述的胺化了的糖是氨基葡糖、其异构体、或者其低聚体或多聚体。
5.按照权利要求3的酶制剂，其中所述的胺化了的醇具有至少3个碳原子，例如氨基丙醇或氨基丁醇。
6.按照权利要求3的酶制剂，其中所述的胺化了的多元醇是D-葡糖胺、其异构体、或者其低聚体或多聚体。
7.按照权利要求3的酶制剂，其中所述的氨基酸是赖氨酸、精胺、亚精胺、腐胺、或者其聚合物，例如聚赖氨酸和聚精氨酸。
8.按照权利要求2的酶制剂，其中所述的胺与谷氨酸或天冬氨酸残基的羧基的偶联以能够结合羧基和氨基的交联剂为媒介。
9.按照权利要求8的酶制剂，其中所述的交联剂选自由碳化二亚胺、异噁唑鎓衍生物、氯甲酸酯或羰基二咪唑组成的组。
10.按照权利要求9的酶制剂，其中所述的交联剂是碳化二亚胺。
11.按照权利要求1的酶制剂，其中在所述酶中至少一个带阴电荷的或中性的氨基酸残基被带阳电荷的或中性的氨基酸残基取代。
12.按照权利要求1-11的任一酶制剂，其中所述的修饰酶的pI为至少8.0，优选地为至少8.5，更优选地为至少9.0。
13.按照权利要求1-12的任一酶制剂，其中所说的修饰酶的pI比母体酶的pI至少一个pI单位，更优选地为至少两个pI单位，最优选地为至少三个pI单位。
14.一种包含按照权利要求1-13的任一酶制剂的去垢添加剂，所述酶制剂是非粉化的颗粒、稳定化了的液体或带保护基的酶形式的。
15.一种包含按照权利要求1-13的任一酶制剂以及表面活性剂的去垢组合物。
16.按照权利要求15的去垢组合物，其中所述的酶制剂以相当于每升洗液0.01-100，优选地为0.05-60mg酶蛋白质的浓度存在。
18.按照权利要求16的去垢组合物，该组合物是洗涤盘碟的洗涤剂。
19.一种处理木质纤维素纤维的方法，其中用改进所述纤维性能有效量的按照权利要求1-13的任一酶制剂处理所述的纤维。
20.按照权利要求9的方法，其中所述的酶制剂包含一种果胶酶或一种半纤维素酶，优选地是一种内木聚糖酶，或者它们的组合体。
21.按照权利要求9或20的方法，其中所述的木质纤维素纤维是用降低纸浆中残余木质素含量实质上有效量的所述酶制剂处理的牛皮纸浆。
22.按照权利要求9或20的用于再循环纸浆酶促脱墨的方法，其中所述的酶制剂以对纤维表面有效脱墨有效的量使用。
23.改进烘烤食品用面粉性能有效量的按照权利要求1-13的任一酶制剂在所述面粉中的用途，优选的一种酶制剂包含木聚糖酶、脂肪酶和/或淀粉酶或者它们的混合物。
24.提高植物蛋白源的可消化性有效量的按照权利要求1-13的任一酶制剂在动物饲料中(或者摄食前的动物饲料的处理中)的用途，优选的一种酶制剂包含木聚糖酶、脂肪酶、漆酶、氧化酶或淀粉酶，或者它们的混合物。
25.获得柔软光滑织物有效量的按照权利要求1-13的任一酶制剂在纤维素织物制造上的用途，优选的一种酶制剂包含木聚糖酶和/或淀粉酶。
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