CN1283225A - 地衣芽孢杆菌果胶降解醇 - Google Patents

Abstract

来源于地衣芽孢杆菌或与地衣芽孢杆菌基于16srDNA序列比对至少99%同源的茅孢杆菌菌种或者它们内源性的果胶降解酶,其在pH8以上具有最佳活性。所述果胶降解酶属于果胶酸裂解酶(EC4.2.2.2)、果胶裂解酶(EC4.2.2.10)和多聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15),并可在碱性条件下应用于工业加工比如纺织品加工中,以及作为例如衣物洗涤剂和硬表面清洁产品的活性成分。

Description

地衣芽孢杆菌果胶降解酶

本发明涉及一种果胶降解酶制品；优选涉及微生物果胶降解酶，具体来说是在中性和碱性pH范围内显示出其主要酶活性是果胶降解活性的微生物酶，尤其涉及来源于地衣芽孢杆菌的克隆果胶降解酶；本发明还涉及这类酶的生产方法，以及将这些酶用于纺织品、洗涤剂和纤维素纤维加工工业的方法。

发明背景

果胶聚合物是植物细胞壁的重要组成成分。果胶是一种主链由交替的同聚半乳糖醛酸(平滑区)和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(毛状区)组成的杂多糖。所述平滑区是1，4-连接的α-D-半乳糖醛酸的线性聚合物。半乳糖醛酸残基可以在羧基基团被不同程度地甲酯化，通常是以非随机方式将聚半乳糖醛酸区完全甲酯化。

可以将果胶酶根据其优选底物(高度甲酯化的果胶或低甲酯化的果胶和聚半乳糖醛酸(果胶酸))以及反应机制(β-消除或水解)进行分类。果胶酶可以主要是内切作用，即在链内随机位置切割聚合物产生寡聚物混合物，或者它们可以是外切作用，从聚合物的一端进行攻击并产生单体或二聚体。酶命名法(1992)给出的酶分类中包括几种作用于果胶平滑区的果胶酶活性，比如果胶酸裂解酶(EC4．2．2．2)、果胶裂解酶(EC4．2．2．10)、多聚半乳糖醛酸酶(EC3．2．1．15)、外切多聚半乳糖醛酸酶(EC3．2．1．67)、外切多聚半乳糖醛酸裂解酶(EC4．2．2．9)和外切多聚α-半乳糖醛酸糖苷酶(EC3．2．1．82)。

已克隆了来自不同属细茵的果胶酸裂解酶，比如欧文氏杆菌、假单胞菌属、克雷伯氏菌属和黄单胞菌属。还描述过从枯草芽孢杆菌(Nasser等(1993)FEBS335：319-326)和芽孢杆菌YA-14(Kim等，(1994)生物科学、生物技术及生物化学58：947-949)克隆果胶酸裂解酶。已经报道过短小芽孢杆菌(Dave和Vaughn(1971)，细菌学杂志108：166-174)、多粘芽孢杆菌(Nagel和Vaughn(1961)，生物化学和生物物理学文献93：344-352)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Karbassi和Vaughn(1980)，加拿大微生物学杂志26：377-384)、一株芽孢杆菌(Hasegawa和Nagel(1966)，食品科学杂志31：838-845)、芽孢杆菌RK9(Kelly和Fogarty(1978)，加拿大微生物学杂志24：1164-1172)所产生的在pH8-10的范围内具有最佳活性的果胶酸裂解酶的纯化，但是没有发现关于自这些生物克隆果胶酸裂解酶编码基因的出版物。所有描述过的果胶酸裂解酶都需要二价阳离子以达到最大活性，钙离子是最具激活作用的。

WO98／45393公开了含有原果胶酶的洗涤剂组合物，对泥渍有显著的清洁力。

一般来说，产生果胶酶的微生物显示出广范围的果胶降解酶或修饰酶。这些微生物还经常产生纤维素酶和／或半纤维素酶，可能难以将得自这些微生物的复杂的多组分酶制品优化以用于各种用途，它们甚至可能含有具有害作用的酶。因此，本发明的一个目的是提供一种在例如洗涤剂或不同工业工艺中只显示期望效果的果胶降解酶。

发明概述

本发明人发现了几种果胶降解酶，尤其是碱性果胶降解酶，这些酶是芽孢杆菌属细菌菌株，更具体来说是地衣芽孢杆菌菌株的内源酶，并且已经成功地鉴定到编码这些酶的DNA序列。

相应地，本发明第一个方面涉及基本上由来源于一株地衣芽孢杆菌的或其内源性的果胶降解酶，或者来源于高度相关的芽孢杆菌菌种的或其内源性的果胶降解酶组成的酶制剂，优选所述酶是果胶酸裂解酶(EC4．2．2．2)、果胶裂解酶(EC4．2．2．10)或多聚半乳糖醛酸酶(EC3．2．1．15)。

本发明的两个果胶酸裂解酶的DNA序列分别以SEQ ID NO：3和SEQID NO：7列于序列表中，推测出的氨基酸序列分别以SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8列于序列表中。可以相信这些新酶根据酶命名法则应分类到EC4．2．2．2酶类中。但是，应当注意到本发明的酶除了EC4．2．2．2酶类常规的对果胶酸和多聚半乳糖醛酸的活性之外，还显示出对果胶(可以是酯化的)的催化活性。

本发明的一种果胶裂解酶的DNA序列以SEQ ID NO：1列于序列表中，推测出的氨基酸序列以SEQ ID NO：2列于序列表中。可以相信这种新酶根据酶命名法则应分类到EC4．2．2．10酶类中。

本发明的一种多聚半乳糖醛酸酶的DNA序列以SEQ ID NO：5列于序列表中，推测出的氨基酸序列以SEQ ID NO：6列于序列表中。可以相信这种新酶根据酶命名法则应分类到EC3．2．1．15酶类中。

相应地，本发明第二个方面涉及果胶酸裂解酶，该酶是ⅰ)由地衣芽孢杆菌ATCC14580产生的多肽，或者ⅱ)包含SEQ ID NO：8中28-341位所示氨基酸序列的多肽，或者ⅲ)ⅰ)或ⅱ)中限定的多肽的类似物，其与所述多肽至少45％同源；或者ⅳ)经取代、缺失或添加1或几个氨基酸而衍生自所述多肽，条件是保留233和238位的精氨酸，并且衍生的多肽与所述多肽至少42％同源，或者ⅴ)与针对纯化形式的所述多肽产生的多克隆抗体有免疫反应性。

本发明在一个方面内提供了一种分离的多核苷酸分子，其选自(a)编码具有果胶酸裂解酶活性之多肽，并包含SEQ ID NO：7中82到1026位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的物种同系物；(c)编码具有果胶酸裂解酶活性之多肽的多核苷酸分子，所述多肽与SEQ ID NO：8中28到341位氨基酸残基的氨基酸序列至少70％相同；(d)与(a)、(b)或(c)互补的分子；或(e)(a)、(b)、(c)或(d)的简并核苷酸序列。

包含编码本发明中氨基酸序列SEQ ID NO：8所示果胶酸裂解酶的多核苷酸分子(DNA 序列)的质粒pSJ1678已被转化到一株大肠杆菌中，该菌株根据“用于专利程序的国际认可的微生物保藏布达佩斯条约”于1997年9月25日保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，联邦德国，保藏号DSM11789。

本发明的第三个方面涉及一种果胶酸裂解酶，它是ⅰ)由地衣芽孢杆菌ATCC14580产生的多肽，或者ⅱ)包含SEQ ID NO：4中28-211位所示氨基酸序列的多肽，或者ⅲ)ⅰ)或ⅱ)中限定的多肽的类似物，其与所述多肽至少60％同源；或者ⅳ)经取代、缺失或添加1或几个氨基酸而衍生自所述多肽，条件是保留133和155位的赖氨酸及158位的精氨酸，并且衍生的多肽与SEQ ID NO：4中60-158位至少66％同源，或者ⅴ)与针对纯化形式的所述多肽产生的多克隆抗体有免疫反应性。

本发明在一个方面内提供了一种分离的多核苷酸分子，其选自(a)编码具有果胶酸裂解酶活性之多肽，并包含SEQ ID NO：3中82到666位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的物种同系物；(c)编码具有果胶酸裂解酶活性之多肽的多核苷酸分子，所述多肽与SEQ ID NO：4中28到221位氨基酸残基的氨基酸序列至少70％相同；(d)与(a)、(b)或(c)互补的分子；或(e)(a)、(b)、(c)或(d)的简并核苷酸序列。

本发明的第四个方面涉及一种果胶裂解酶，它是ⅰ)由地衣芽孢杆菌ATCC14580产生的多肽，或者ⅱ)包含SEQ ID NO：2中31-494位所示氨基酸序列的多肽，或者ⅲ)ⅰ)或ⅱ)中限定的多肽的类似物，其与所述多肽至少60％同源；或者ⅳ)经取代、缺失或添加1或几个氨基酸而衍生自所述多肽，条件是保留对应SEQ ID NO：2中373和383位的精氨酸，并且衍生的多肽与所述多肽至少60％同源，或者ⅴ)与针对纯化形式的所述多肽产生的多克隆抗体有免疫反应性。

本发明在一个方面内提供了一种分离的多核苷酸分子，其选自(a)编码具有果胶裂解酶活性之多肽，并包含SEQ ID NO：1中91到1485位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的物种同系物；(c)编码具有果胶裂解酶活性之多肽的多核苷酸分子，所述多肽与SEQ ID NO：2中31到494位氨基酸残基的氨基酸序列至少70％相同；(d)与(a)、(b)或(c)互补的分子；或(e)(a)、(b)、(c)或(d)的简并核苷酸序列。

包含编码本发明中氨基酸序列SEQ ID NO：2所示果胶裂解酶的多核苷酸分子(DNA序列)的质粒pSJ1678已被转化到一株大肠杆菌中，该菌株根据“用于专利程序的国际认可的微生物保藏布达佩斯条约”于1998年2月23日保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，联邦德国，保藏号DSM12031。

本发明的第五个方面涉及一种多聚半乳糖醛酸酶，它是ⅰ)由地衣芽孢杆菌ATCC14580产生的多肽，或者ⅱ)包含SEQ ID NO：6中1-415位所示氨基酸序列的多肽，或者ⅲ)ⅰ)或ⅱ)中限定的多肽的类似物，其与所述多肽至少70％同源，或经取代、缺失或添加1或几个氨基酸而衍生自所述多肽，或者与针对纯化形式的所述多肽产生的多克隆抗体有免疫反应性。

本发明在一个方面内提供了一种分离的多核苷酸分子，其选自(a)编码具有多聚半乳糖醛酸酶活性之多肽，并包含SEQ ID NO：5中1到1248位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的物种同系物；(c)编码具有多聚半乳糖醛酸酶活性之多肽的多核苷酸分子，所述多肽与SEQID NO：6中1到415位氨基酸残基的氨基酸序列至少70％相同；(d)与(a)、(b)或(c)互补的分子；或(e)(a)、(b)、(c)或(d)的简并核苷酸序列。

包含编码本发明中氨基酸序列SEQ ID NO：6所示多聚半乳糖醛酸酶的多核苷酸分子(DNA序列)的质粒pSJ1678已被转化到一株大肠杆菌中，该菌株根据“用于专利程序的国际认可的微生物保藏布达佩斯条约”于1998年2月23日保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，联邦德国，保藏号DSM12030。

本发明在一个方面内提供了一种表达载体，其包含下列可操纵地连接的元件：转录启动子；DNA片段，其选自(a)编码具有果胶酸裂解酶活性之多肽，并包含SEQ ID NO：7中82到1026位核苷酸所示核苷酸序列，或SEQ ID NO：3中82到666位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；或者编码具有果胶裂解酶活性之多肽，并包含SEQ ID NO：1中91到1485位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；或者编码具有多聚半乳糖醛酸酶活性之多肽，并包含SEQ ID NO：5中1到1248位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的物种同系物；(c)编码具有果胶酸裂解酶活性之多肽的多核苷酸分子，所述多肽与SEQ ID NO：8中28到341位氨基酸残基的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：4中28到221位氨基酸残基的氨基酸序列至少70％相同；或者编码具有果胶裂解酶活性之多肽的多核苷酸分子，所述多肽与SEQ ID NO：2中31到494位氨基酸残基的氨基酸序列至少70％相同；编码具有多聚半乳糖醛酸酶活性之多肽的多核苷酸分子，所述多肽与SEQ ID NO：6中1到415位氨基酸残基的氨基酸序列至少70％相同；(d)(a)、(b)或(c)的简并核苷酸序列；以及转录终止子。

在本发明另一个方面内提供了一种导入了如上所述的表达载体的培养细胞，该细胞表达所述DNA片段编码的多肽。

本发明的再一个方面提供了一种分离的具有果胶酸裂解酶活性的多肽，其选自(a)包含SEQ ID NO：8中28到341位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽分子；(b)包含SEQ ID NO：4中28到221位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽分子；或(c)(a)或(b)的物种同系物。

本发明的另一个方面提供了一种分离的具有果胶裂解酶活性的多肽，其选自(a)包含SEQ ID NO：2中31到494位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽分子；或(b)(a)的物种同系物。

本发明的另一个方面提供了一种分离的具有多聚半乳糖醛酸酶活性的多肽，选自(a)包含SEQ ID NO：6中1到415位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽分子；以及(b)(a)的物种同系物。

在本发明的另一个方面内，提供了一种包含本发明所述纯化多肽与其他多肽结合在一起的组合物。

在本发明的另一个方面内，提供了一种制备本发明所述多肽的方法，该方法包括培养其中已导入如上所述表达载体的细胞，从而所述细胞表达DNA片段所编码的多肽，以及纯化多肽。

本发明的新酶可用于处理纤维素材料，尤其是含有纤维素的纤维、纱线、机织或非机织织物，处理机械造纸纸浆或循环废纸，以及浸解纤维。所述处理过程可以在将纤维素材料加工为适于制作衣物或制作织物的材料时进行，例如在退浆或精练步骤中进行；或者在工业或家庭洗涤这些织物或衣物时进行。

相应地，本发明的另一个方面涉及包含具有实质性的果胶降解活性的酶的洗涤剂组合物；以及本发明的酶用于处理含有纤维素的纤维、纱线、机织或非机织织物的用途。

本发明的酶能非常有效地用于制备纤维素材料的酶促精练工艺，以便如在随后的染色操作中达到适当的响应。另外，预计包含该新酶的洗涤剂组合物能去除或漂白衣物上的某些污垢或污渍，尤其是含有半乳聚糖或阿拉伯半乳聚糖的食物、植物等造成的污垢和斑点。还预计用包含新酶的洗涤剂组合物进行的处理能防止某些污垢结合到纤维素材料上。本发明的酶还可用作硬表面清洁组合物的成分，所述组合物具有从需要清洗的硬表面上去除或协助去除某些污垢或污溃的效能。

定义

在更详细讨论本发明之前，首先定义以下术语：

术语“正同系物”(ortholog)(或“物种同系物”)代表从一个物种得到的，与得自一个不同物种的类似多肽或蛋白质有同源性的多肽或蛋白质。

术语“副同系物”(paralog)表示从一个给定物种得到的，与得自相同物种的不同多肽或蛋白质有同源性的多肽或蛋白质。

术语“表达载体”表示线性或环形的DNA分子，其中包含一个编码目的多肽的片段及与之可操纵地连接在一起用于其转录的附加片段。所述附加片段可以包括启动子和终止子序列，还可以任选包括1或多个复制原点、1或多个选择标记、增强子、多聚腺苷酸化信号等。表达载体通常来源于质粒或病毒DNA，或者可以含有这两类元件。本发明的表达载体可以是能方便地进行重组DNA操作的任何表达载体，载体的选择经常取决于该载体将要导入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制的载体，即以染色体外个体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例如质粒。可选择地，载体可以是当导入宿主细胞时，能整合到宿主细胞基因组中并与所整合的染色体一起复制的载体。

用于本文与多肽或蛋白质的表达相关的术语“重组体表达的”或“重组地表达的”是根据本领域的标准定义来限定的。重组地表达蛋白质通常是利用如上面刚刚描述的表达载体进行的。

术语“分离的”，用于多核苷酸分子时，表示该多核苷酸已被移离其天然遗传环境，因此不含其他外源或不需要的编码序列，并处于一种适用于基因工程化蛋白质表达系统的形式。这种分离的分子是那些脱离天然环境的分子，包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离的DNA分子不含在通常情况下与之相关联的其他基因，但可以包括天然的5’和3’非翻译区，比如启动子和终止子。相关联区域的鉴定对本领域技术人员是显而易见的(参见例如，Dynan和Tijan，自然316：774-78，1985)。术语“分离的多核苷酸”可以替代地称为“克隆的多核苷酸”。

当用于蛋白质／多肽时，术语“分离的”表示该蛋白质存在于其天然环境以外的情况下。在优选状态下，分离的蛋白质实质上不含其他蛋白质，尤其是其他同源蛋白质(即同源杂质，见下文)。优选以纯度在40％以上的形式提供蛋白质，更优选纯度在60％以上的形式。

甚至更优选的是以高度纯化形式提供所述蛋白质，即由SDS-PAGE确定的80％以上纯，更优选95％以上纯，还要优选的是99％以上纯。

术语“分离的蛋白质／多肽”可以替代地称为“纯化的蛋白质／多肽”。

术语“同源杂质”意味着任何来源于最初获得本发明所述多肽的同源细胞的杂质(如本发明多肽以外的其它多肽)。

用于本文与特定微生物来源联系在一起的术语“得自”，意味着多核苷酸和／或多肽由该特定来源产生，或者由其中插入了该来源的基因的细胞产生。

用于本文与特定微生物来源联系在一起的术语“内源”意味着多肽是由该特定来源中存在的一个天然基因而产生的，即一个并非重组地插入该来源的细胞中的基因。

术语“可操纵地连接在一起”指示DNA片段时，表示这些片段被排列成能一致地发挥其预期目的形式，例如，在启动子内起始转录并通过编码片段到达终止子。

术语“多核苷酸”表示脱氧核糖核酸或核糖核酸碱基的从5’到3’读码的单或双链聚合物。多核苷酸包括RMA和DNA，可以分离自天然来源，体外合成或者由天然和合成分子的组合形式来制备。

术语“多核苷酸分子的互补物”表示与参照序列相比，具有互补碱基序列并方向相反的多核苷酸分子。例如，序列5’ATGCACGGG3’与5’CCCGTGCAT3’互补。

术语“简并核苷酸序列”表示包括1或多个简并密码子的核苷酸序列(与编码多肽的多核苷酸参照序列相比)。简并密码子含有不同的核苷酸三联体，但编码相同的氨基酸残基(即GAU和GAC三联体均编码Asp)。

术语“启动子”表示基因的一部分，它含有提供RNA聚合酶结合和起始转录的DNA序列。启动子序列通常，但并不总是，位于基因的5’非编码区。

术语“分泌信号序列”表示编码多肽(“分泌肽”)的DNA序列，该多肽作为一更大多肽的一个成分，引导该更大多肽通过多肽在其中进行合成的细胞的分泌途径。通常更大的多肽在经过分泌途径转运的过程中被切割以去除分泌肽。

术语“果胶”表示果胶酸、多聚半乳糖醛酸和可能被更高或更低程度酯化的果胶。

术语“果胶降解酶”或“果胶酶”表示根据本领域定义的果胶酶酶类，它们是能切割果胶类物质(主要是多聚1，4-α-D-半乳糖醛酸和它们的衍生物中糖苷键的一组酶(Sakai等，1993)。

优选本发明的果胶酶是一种催化经反式消除来随机切割果胶酸(又称为多聚半乳糖醛酸)中的α-1，4糖苷键的果胶酶，比如多聚半乳糖醛酸裂解酶类(EC4．2．2．2)(PGL)，又称为多聚(1，4-α-D-半乳糖醛酸酐)裂解酶，又称为果胶酸裂解酶。还优选的是催化果胶酸中的α-1，4-糖苷键随机水解的果胶酶类，如多聚半乳糖醛酸酶类(EC3．2．1．15)(PG)，又称内切PG。还优选的是催化随机水解果胶中α-1，4糖苷键的果胶酶酶类，比如多聚半乳糖醛酸甲酯裂解酶(EC4．2．2．10)(PMGL)，又称内切PMGL，又称为多聚甲氧基半乳糖醛酸酐裂解酶，又称为果胶裂解酶。

发明详述

如何用本发明的序列得到其他相关序列：本文公开的涉及编码本发明所述果胶酸裂解酶的多核苷酸序列的序列信息可以用来作为鉴定其他同源果胶酸裂解酶的工具。例如，可以用聚合酶链反应(PCR)从各种微生物来源，尤其是不同的芽孢杆菌菌种来扩增编码其他同源果胶酸裂解酶的序列。

多核苷酸：

在本发明的优选实施方案中，本发明所述分离的多核苷酸能在至少是中等严谨条件下与SEQ ID NO：1、3、5或7中的类似大小的区域杂交，或者与其互补序列杂交。

具体来说，本发明的多核苷酸能在至少中度严谨条件下，但优选在高严谨条件下，与包含SEQ ID NO：1中91-1485位、SEQ ID NO：3中82-666位、SEQ ID NO：5中1-1248位或SEQ ID NO：7中82-1026位所示的全长序列(编码多肽的成熟部分)的变性双链DNA探针杂交，或者与任何分别包含SEQ ID NO：1、3、5或7的亚序列的探针杂交，所述亚序列具有至少约100个碱基对。

测定核苷酸探针和同源DNA或RNA序列之间在中等或高严谨度条件下的杂交情况的合适实验条件包括将含有待杂交的DNA片段或RNA的膜在5×SSC(氯化钠／柠檬酸钠，Sambrook等，1989)中预浸泡10分钟，并将膜在5×SSC、5×Denhardt’s溶液(Sambrook等，1989)、0．5％SDS和100μg／ml超声变性鲑精DNA(Sambrook等，1989的溶液)中预杂交，然后于约45℃在含有浓度为10ng／ml的随机引发(Feinberg A．P．和Vogelstein B．(1983)分析生化132：6-13)、³²P-dCTP标记的探针(比活度高于1×10⁹cpm／μg)的相同溶液中杂交12小时。然后将膜在2×SSC、0．5％SDS中于至少60℃(中等严谨度)，更优选在至少65℃(中等／高严谨度)、更优选在至少70℃(高严谨度)，还要优选的是在至少75℃(极高严谨度)洗两次，每次30分钟。

用X-光胶片检测寡核苷酸探针在这些条件下杂交上的分子。

如先前提到的，本发明的分离的多核苷酸包括DNA和RNA。分离DNA和RNA的方法是本领域公知的。可以利用本领域已知的方法从Gene Banks或DNA文库中克隆目的DNA和RNA编码基因。

然后可以通过例如杂交或PCR来鉴定和分离本发明所述编码具有果胶酸裂解酶活性之多肽的多核苷酸。

本发明还提供了来自不同细菌菌株的相应多肽和多核苷酸(正同系物或副同系物)。尤其有意义的是来自革兰氏阳性嗜碱菌株，包括芽孢杆菌菌种的果胶降解多肽。

可以利用本发明提供的信息和组合物，结合常规克隆技术来克隆显示本发明所述果胶降解活性的多肽的物种同系物。例如，可以用得自表达该蛋白质的细胞类型的染色体DNA克隆DNA。可以通过用从本文公开的序列设计的探针检测Northern印迹来鉴定合适的DNA来源。然后从阳性细胞系的染色体DNA制备文库。然后可以通过多种方法，比如用完整或部分DNA或者基于公开序列的1或多组简并探针进行检测来分离出编码具有本发明所述果胶降解活性之多肽的DNA。还可以用由本文公开的序列设计的引物，利用聚合酶链反应或PCR(Mullis，美国专利4683202)来克隆DNA。在另外的方法中，可以用DNA文库转化或转染宿主细胞，并可以用针对果胶酸裂解酶、果胶裂解酶或多聚半乳糖醛酸酶(克隆自地衣芽孢杆菌ATCC14580，如材料与方法以及实施例所述表达和纯化)产生的抗体(单克隆或多克隆抗体)来检测目的DNA的表达，或者通过与具有果胶降解活性的多肽相关的活性测定来检测表达。类似的技术也可以应用于分离基因组克隆。

克隆到存在于大肠杆菌DSM11789和大肠杆菌DSM12030以及大肠杆菌DSM12031中的pSJ1678质粒中的DNA序列之多肽编码部分和／或本发明的类似DNA序列可以克隆自地衣芽孢杆菌的一个菌株，优选是能产生有果胶降解活性的酶的菌株ATCC14580，或者如本文描述的其它或相关生物。

可选择地，可以依据可从大肠杆菌DSM11789、大肠杆菌DSM12030或大肠杆菌DSM12031中所存在质粒上获得的DNA序列构建类似序列，例如是其亚序列，和／或通过导入核苷酸取代构建，所述取代不会使DNA序列编码的果胶降解酶具有另一个氨基酸序列，但符合预期产生所述酶的宿主生物的密码子使用习惯，或者通过导入可以产生不同氨基酸序列(即本发明所述果胶降解酶的变体)的核苷酸取代而构建。

基于本文公开的序列信息，可以克隆编码本发明所述果胶酶，并分别包含SEQ ID NO：1、3、5或7所示DNA序列的全长DNA序列。可通过本领域已知的标准操作进行克隆，比如通过

从芽孢杆菌菌株制备基因组文库；

将该文库铺适当的底物平板；

利用分别基于SEQ ID NO：1、3、5或7的探针通过标准杂交技术；或者通过利用分别基于SEQ ID NO：1、3、5或7的序列信息设计的探针经反向PCR策略鉴定来自地衣芽孢杆菌ATCC14580基因组文库的克隆，从而鉴定包含本发明所述多核苷酸序列的克隆。涉及反向PCR的细节可参考M．J．MCPherson等(“PCR实用方法”Information Press Ltd，OxfordEngland)。

基于本文公开的序列信息(SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7和8)，对本领域技术人员来说，通过类似的策略使用来自相关微生物的基因组文库，尤其是来自芽孢杆菌属其他菌株的基因组文库(比如枯草芽孢杆菌)来分离编码本发明所述同源果胶酶的同源多核苷酸序列是一项常规工作。

可选择地，根据公知步骤，通过使用合成寡核苷酸探针，可从合适的来源(比如任何以下提及的生物)方便地克隆编码本发明所述果胶降解酶的DNA，所述探针是在可得自大肠杆菌DSM11789、大肠杆菌DSM12030或大肠杆菌DSM12031中的质粒的DNA序列基础上制备的。

相应地，可以从大肠杆菌DSM11789、大肠杆菌DSM12030或大肠杆菌DSM12031中分离本发明的多核苷酸分子，在这些菌中存有如上所述通过克隆得到的质粒。此外，本发明涉及大肠杆菌DSM11789、大肠杆菌DSM12030以及大肠杆菌DSM12031的各自基本上纯的分离的培养物。

多肽：

SEQ ID NO：4的28-221位氨基酸序列是成熟的果胶酸裂解酶序列；1-27位是前导序列。SEQ ID NO：8的28-341位氨基酸序列是成熟的果胶酸裂解酶序列；1-27位是前导序列。SEQ ID NO：2的31-494位氨基酸序列是成熟的果胶裂解酶序列；1-30位是前导序列。SEQ ID NO：6的1-415位氨基酸序列是成熟的多聚半乳糖醛酸酶序列。

本发明还提供了分别与SEQ ID NO：2、4、6和8的多肽以及它们的物种同系物(定向同源或正同系物)基本上同源的果胶降解多肽。术语“基本上同源”用于本文表示分别与SEQ ID NO：2、4、6和8所示序列，或者这些序列的定向同源或正同系物具有至少60％，优选至少70％，更优选至少85％，还要优选的是至少90％序列相同性的多肽。更优选这些多肽分别与SEQ ID NO：2、4、6和8所示序列，或者这些序列的定向同源物或正同系物至少95％相同，最优选98％或以上相同。序列相同百分比是通过常规方法，利用本领域已知的计算机程序，比如GCG程序包(Program Manual for Wisconsin Package，8版，1994年8月，GeneticComputer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA53711)中提供的GAP，按照Needleman S．B．Wunsch，C．D．(1970)(分子生物学杂志48：443-453，该文此处全文引作参考)公开的方法测定的。使用参数如下的GAP多肽序列比较：GAP形成罚分3．0，GAP延伸罚分0．1。

通过类似方法，利用参数如下的GAP进行DNA序列比较来确定多核苷酸分子的序列相同性：GAP形成罚分5．0，GAP延伸罚分0．3。

本发明部分基于发现了几种新的得自地衣芽孢杆菌菌株的多核苷酸序列，它们编码与其他微生物果胶酶氨基酸序列有同源性的多肽序列。

所述新的地衣芽孢杆菌果胶酶已被命名为：

Ⅰ：果胶酸裂解酶(EC4．2．2．2)

Ⅱ：果胶酸裂解酶(EC4．2．2．2)

Ⅲ：果胶裂解酶(EC4．2．2．10)

Ⅳ：多聚半乳糖醛酸酶(EC3．2．1．15)

本发明的新果胶酶多肽序列是首先通过查询典型的检索序列，具体说就是已知果胶酶的氨基酸序列，对地衣芽孢杆菌序列数据库进行检索以鉴定果胶酶的同源序列，从而鉴定到的。

利用一个常规序列相同百分比程序按照本文更详细的描述(见上文)，附录中的SEQ ID NO：2(Ⅲ)、4(Ⅰ)、6(Ⅳ)、8(Ⅱ)之氨基酸序列与现有技术中最接近的果胶酶的氨基酸序列相同性示于以下表1、2和3。

表 1：

果胶酸裂解酶(Ⅰ)氨基酸序列之间的同源性

与本发明所述果胶酸裂解酶(Ⅰ)同源性最高的果胶降解蛋白质是发现于以WO98／45393公开的国际专利申请中的芽孢杆菌菌株KSM-P15的SEQ ID NO：1，它与成熟蛋白质序列SEQ ID NO：4有58．8％同源。

表2：

果胶酸裂解酶(Ⅱ)氨基酸序列之间的同源性

类似性比较所用序列是来自TREMBLREL的蛋白质序列，位点列于表格中

Ⅱ：本发明的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)

B：o08454．sp-细菌Amycolata sp．果胶酸裂解酶

C：q00893 sp-真菌苹果枯腐病霉

        Ⅱ       B         C

Ⅱ   100％      40．8％    40．5％

B    40．8％    100％

C    40．5％    100％

表3：

果胶裂解酶(Ⅲ)氨基酸序列之间的同源性

与本发明的果胶裂解酶同源性最高的果胶裂解酶蛋白质是枯草芽孢杆菌果胶裂解酶034819和枯草芽孢杆菌果胶裂解酶P94449，两种蛋白质序列见于TREMBL数据库(EMBL／GENBANK／DDBJ DATA BANKS)。它们与蛋白质序列SEQ ID NO：2 55％和56％同源。

表4：

多聚半乳糖醛酸酶(Ⅲ)氨基酸序列之间的同源性

类似性比较所用序列是来自SWISSPROT的蛋白质序列，其位点列于表格中

Ⅳ：本发明的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)

B：p27644．swissprot-细菌 根癌农杆菌

C：p20041．swissprot-细茵茄伯克霍尔德氏菌

       Ⅳ          B          C

Ⅳ    100％      36．6％    30．2％

B     36．6％    100％

C     30．2％    100％

优选本发明的酶制品来源于微生物，优选来源于细菌、古细菌(archea)或真菌，尤其是来自属于芽孢杆菌属的细菌，优选属于嗜碱性的芽孢杆菌菌株，所述菌株可以选自地衣芽孢杆菌及其高度相关的芽孢杆菌菌种，其中所有菌种优选与地衣芽孢杆菌在16S rDNA序列比对中同源性至少99％。

基本上同源的蛋白质和多肽的特征在于有1或多个氨基酸取代、缺失或添加。优选这些变化是较小的变化，即保守性取代(见表2)和其他不会显著影响蛋白质或多肽折叠或活性的取代；小的缺失，通常是大约1-30个氨基酸的缺失；以及小的氨基端或羧基端延伸，比如氨基端甲硫氨酸残基，有多达约20-25个残基的小连接肽，或者可协助纯化的小延伸(亲合标记)，比如多组氨酸段，蛋白A(Nilsson等，EMBO杂志4：1075，1985；Nilsson等，酶学方法198：3，1991)。一般参见文献Ford等，蛋白质表达和纯化2：95-107，1991，该文此处全文引作参考。编码亲合标记的DNA可从供应商(例如，Pharmacia、Biotech、Piscataway，NJ；NewEngland Biolabs，Beverly，MA)那里获得。

表5

保守性氨基酸取代

碱性氨基酸：精氨酸

赖氨酸

组氨酸

酸性氨基酸：谷氨酸

天冬氨酸

极性氨基酸：谷氨酰胺

天冬酰胺

疏水性氨基酸：亮氨酸

异亮氨酸

缬氨酸

芳香族氨基酸：苯丙氨酸

色氨酸

酪氨酸

小氨基酸：    甘氨酸

丙氨酸

丝氨酸

苏氨酸

甲硫氨酸

除了20种标准氨基酸外，还可以用非标准氨基酸(比如4-羟基脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)取代本发明所述多肽的氨基酸残基。氨基酸残基可以被少数非保守性氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸以及非天然氨基酸取代。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后被修饰过，和／或在其侧链有与标准氨基酸不同的化学结构。非天然氨基酸可以化学合成，或者优选有商品销售，包括六氢吡啶羧酸、噻唑烷羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸以及3，3-二甲基脯氨酸。

本发明所述果胶酸裂解酶多肽中的关键氨基酸可以根据本领域已知步骤来鉴定，比如定点诱变或者丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，科学244：1081-1085，1989)。在后一项技术中，在分子的每个残基导入单个丙氨酸突变，并检测所得突变分子的生物活性(即果胶降解活性)，从而鉴定到对分子活性比较重要的氨基酸残基。还可参见，Hilton等，生物学化学杂志271：4699-4708，1996。也可以通过对结构进行物理分析来确定酶或其他生物学相互作用的活性部位，比如通过核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲合标记等技术，结合对推测接触部位的氨基酸进行的突变来确定。参见，例如de Vos等，科学255：306-312，1992；Smith等，分子生物学杂志224：899-904，1992；Wlodaver等，FEBS快报309：59-64，1992。关键氨基酸的鉴定也可以从对与本发明所述多肽有关的多肽进行的同源性分析来推断。

可以利用已知的诱变、重组和／或重排方法以及随后的适当筛选措施来制备和检测多重氨基酸取代，比如Reidhaar-Olson和Sauer(科学241：53-57，1988)、Bowie和Sauer(美国科学院学报86：2152-2156，1989)、WO95／17413或者WO95／22625中公开的方法。简而言之，这些作者公开了同时使多肽中的2或多个位点随机化的方法，或者不同突变的重组／重排方法(WO95／17413、WO95／22625)，随后选择功能多肽，然后将突变的多肽进行测序以便确定每个位点的可行取代范围。其他可用的方法包括噬菌体展示(例如，Lowman等，生物化学30：10832-10837，1991；Ladner等，美国专利5223409；Huse，WIPO公开文本WO92／06204)和区域定向诱变(Derbyshire等，基因46：145，1986；Ner等，DNA7：127，1988)。

以上公开的诱变／重排方法可以与高通量的自动筛选方法结合起来以检测宿主细胞中已克隆、诱变的多肽的活性。可以从宿主细胞中回收编码活性多肽的突变DNA分子并用现代仪器快速测序。这些方法使得能迅速确定目的多肽中单个氨基酸残基的重要性，并能用于结构未知的多肽。

使用上面讨论的方法，本领域技术人员可以鉴定和／或制备多种下述多肽，这些多肽与SEQ ID NO：2的31到494位残基(成熟蛋白质)、SEQ ID NO：4的28到221位残基、SEQ ID NO：6的1到415位残基以及SEQ ID NO：8的28到314位残基基本上同源，并且保留野生型蛋白质的果胶降解活性。

本发明在一个方面涉及果胶裂解酶，该酶具有SEQ ID NO：2之31-494位的氨基酸序列，或者经缺失、取代或添加1或多个氨基酸残基(以下称为突变)而由其衍生的氨基酸序列，条件是该果胶裂解酶未被失活并且突变保留了SEQ ID NO：2中377位的精氨酸和383位的精氨酸。同样，突变程度没有具体限定，只要保留上述377位和383位的精氨酸即可。优选地，这些天然或亲本果胶裂解酶的突变变体之间的同源性(由对应SEQ ID NO：2之31-375位氨基酸的部分序列计算得到)为56％或更高。更优选同源性是70％或更高，尤其是80％或更高。

另外，本发明一个方面涉及果胶酸裂解酶，该酶具有SEQ ID NO：4之28-221位的氨基酸序列，或者经缺失、取代或添加1或多个氨基酸残基(以下称为突变)而由其衍生的氨基酸序列，条件是该果胶裂解酶未被失活并且突变保留了SEQ ID NO：4中133和155位的赖氨酸以及158位的精氨酸。同样，突变程度没有具体限定，只要保留上述K133、K155和R158即可。优选，这些天然或亲本果胶裂解酶的突变变体之间的同源性(由对应SEQ ID NO：4之60-158位氨基酸的部分序列计算得到)为66％或更高。更优选，同源性是70％或更高，尤其是80％或更高。

另外，本发明一个方面涉及果胶酸裂解酶，该酶具有SEQ ID NO：8之28-341位的氨基酸序列，或者经缺失、取代或添加1或多个氨基酸残基(以下称为突变)而由其衍生的氨基酸序列，条件是该果胶裂解酶未被失活并且突变保留了SEQ ID NO：8中233和238位的精氨酸(R233和R238)。同样，突变程度没有具体限定，只要保留上述R233和R238即可。优选这些天然或亲本果胶裂解酶的突变变体之间的同源性(由对应SEQID NO：8之成熟序列计算得到)为42％或更高。更优选同源性是50％或更高，还要优选的是60％以上，尤其是70％或更高，特别是80％或更高。

除了包含催化结构域的酶核心，本发明的果胶降解酶还可以含有纤维素结合结构域(CBD)，所述纤维素结合结构域与酶核心(催化活性结构域)可操纵地连接在一起。纤维素结合结构域可以以所编码酶的组成部分而存在，或者可以将另一来源的CBD导入果胶降解酶从而形成杂合酶。在本文中，术语“纤维素结合结构域”应按照Peter Tomme等(“纤维素结合结构域：分类和特性”，《不溶性碳水化合物的酶法降解》，John N．Saddler和Michael H．Penner(编)，ACS论文集，No．618，1996)的定义来理解。该定义方法将120多个纤维素结合结构域分为10个家族(Ⅰ-Ⅹ)，并表明在各种酶，比如纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶和几丁质酶中都发现了CBD。CBD还可见于藻类，例如在红藻Porphyra purpurea中是一种非水解性的多糖结合蛋白质，见Tomme等，出处同前。但是，大多数CBD来自纤维素酶和木聚糖酶，CBD存在于蛋白质的氨基或羧基端或者在内部。杂合酶是本领域已知的，参见例如WO90／00609和WO95／16782，还可以这样来制备：将包含至少一个编码纤维素结合结构域的DNA片段，以及通过或不通过接头与之连接在一起的果胶降解酶编码DNA序列的DNA构建体转化到宿主细胞中，培养宿主细胞以表达融合基因。杂合酶可以用下式描述：

CBD-MR-X

其中CBD是对应至少纤维素结合结构域的氨基酸序列的氨基或羧基端区域；MR是中间区域(接头)，也可以是一个键，或者短的连接基团，该基团优选大约2到100个碳原子，更优选2到40个碳原子；或者优选是大约2到100个氨基酸，更优选2到40个氨基酸；X是本发明所述果胶降解酶的氨基或羧基端区域。

优选本发明的酶在pH至少为8时有最佳催化活性，更优选在至少pH8．5，更优选在至少pH9，更优选在至少pH9．5，更优选在至少pH10，还要优选的是在至少pH10．5，尤其是至少pH11时有最佳催化活性；并且优选在至少50℃，更优选在至少55℃达到酶的最佳活性。

蛋白质制备

本发明的多肽，包括全长蛋白质，其片段和融合蛋白质，可以依照常规技术在基因工程化的宿主细胞中产生。合适的宿主细胞是那些能用外源DNA转化或转染并培养生长的细胞类型，包括细菌、真菌细胞和培养的更高等的真核细胞。优选细菌细胞，尤其是革兰氏阳性生物的培养细胞。尤其优选来自芽孢杆菌属的革兰氏阳性细胞，比如枯草芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环形芽孢杆菌、B．clausii、灿烂芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、B．agaradhaerens，或者特另是地衣芽孢杆菌。ATCC14580是地衣芽孢杆菌的典型菌株。

Sambrook等，分子克隆：实验指南，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989；Ausubel等(编)，现代分子生物学方法，John Wiley和Sons，Inc．NY，1987；以及“枯草芽孢杆菌和其他革兰氏阳性细茵”Sonensheim等，1993，美国微生物学会，Washington D．C．(此处全文引作参考)公开了操作克隆DNA分子和将外源DNA导入各种宿主细胞的技术。

一般来说，编码本发明所述果胶酸裂解酶的DNA序列与其他为其表达所需的遗传元件在表达载体中可操纵地连接在一起，通常包括转录启动子和终止子。尽管本领域技术人员会认识到在某些系统中，选择标记可以在不同载体上提供，并且外源DNA的复制可以由整合到宿主细胞基因组来提供，但载体通常还含有1或多个选择标记和1或多个复制原点。启动子、终止子、选择标记、载体以及其他元件的选择对本领域技术人员来说是一项常规工作。许多这种元件在文献中已有描述，并可由供应商提供。

为了引导多肽进入宿主细胞的分泌途径，可在表达载体中提供一个分泌信号序列(又称为前导序列、前原序列或前序列)。分泌信号序列可以是多肽的序列，或者可以来源于另一分泌蛋白质或者是从头合成的。许多合适的分泌信号序列是本领域已知的，关于合适的分泌信号序列，尤其是用于芽孢杆菌宿主细胞中进行分泌的信号序列的更详细描述参见“枯草芽孢杆菌和其他革兰氏阳性细茵”(Sonensheim等，1993，美国微生物学会，Washington D．C．)和Cutting，S．M．(编)“芽孢杆菌的分子生物学方法”(John Wiley和Sons，1990)。分泌信号序列以正确读框与DNA序列连接。尽管某些信号序列可以位于目的DNA序列的其他位置，但通常它位于编码目的多肽的DNA序列的5’(参见例如，Welch等，美国专利5037743；Holland等，美国专利5143830)。

根据常规操作，将被转化或转染的宿主细胞培养在含有营养物和为所选宿主细胞生长所需的其他成分的培养基中。各种合适的培养基，包括确定成分培养基和复合培养基，是本领域已知的，通常包括碳源、氮源、基本氨基酸、维生素和矿物质。根据需要，培养基还可以含有生长因子或血清等成分。通常利用生长培养基选择含有外源加入的DNA的细胞，这是通过例如药物选择或者在培养基中缺乏可被表达载体携带或共转染到宿主细胞的选择标记所补偿的基本营养物达到的。

本发明的多肽还可以通过发酵属于芽孢杆菌属的野生型菌株来制备，优选所述菌株选自地衣芽孢杆菌及其高度相关的芽孢杆菌菌种，其中所有菌种与地衣芽孢杆菌至少99％同源(基于16S rDNA序列比对)。一个具体和极其优选的实例是地衣芽孢杆菌ATCC14580。

另外，本发明的多肽可以通过发酵由以上提及的菌株衍生的突变体或变异体来制备。可以通过使用常规技术并选择产生更高果胶酶活性的突变体来获得所述突变体。

可以通过于有氧条件下，在含有碳和氮源以及其他必要营养物质的营养基质中培养所述菌株来进行发酵，该培养基可根据已知工艺配制。培养基可以是复合丰富培养基或基本培养基。氮源可以是无机和／或有机种类的。合适的无机氮源是硝酸盐和铵盐。有机氮源中有许多经常用于发酵。实例是大豆粉、酪蛋白、玉米、玉米浸液、酵母提取物、尿素和白蛋白。合适的碳源是碳水化合物或含有碳水化合物的物质。优选营养基质含有果胶酸、多聚半乳糖醛酸和／或更高或更低程度酯化的果胶作为碳源，和／或果胶酶产生诱导物。可选择地，培养基含有富含果胶的物质，比如大豆粉、苹果浆或柑橘皮。

由于本发明的芽孢杆菌菌种是嗜碱的，故优选在碱性pH值，比如在至少pH 8或至少pH9进行培养，这可以通过在将生长培养基灭菌后添加合适的缓冲液(比如碳酸钠或碳酸钠和碳酸氢钠的混合物)来实现。

预计野生型菌株或突变体在合适培养基中的发酵能得到至少是0．5g果胶酶蛋白质／升培养液，或者甚至至少1g／l或2g／l。

蛋白质分离：

如果被表达的野生型或重组多肽被分泌出来，则可以从生长基质中纯化多肽。优选在纯化多肽前从培养基中除去表达宿主细胞(例如通过离心)。

如果被表达的重组多肽不被分泌到宿主细胞之外，则优选将宿主细胞破碎，多肽释放到提取液中，这是这类纯化技术的第一个阶段。优选在破碎细胞前从培养基中取出表达宿主细胞(例如通过离心)。

可以通过常规技术来破碎细胞，比如通过溶菌酶消化或使细胞受到高压。这类细胞破碎技术细节参见Robert K．Scobes，蛋白质纯化，第2版，Springer-Verlag。

无论被表达的重组多肽(或嵌合多肽)是否被分泌，都可以利用分级分离和／或常规的纯化方法和介质来纯化。

可以使用硫酸铵沉淀和酸或离液剂抽提来分级分离样品。典型的纯化步骤可以包括羟磷灰石、体积排阻、FPLC和反相高效液相层析。合适的阴离子交换介质包括衍生化葡聚糖、琼脂糖、纤维素、聚丙烯酰胺、特殊性能硅石等。优选PEI、DEAE、QAE和Q衍生物，尤其优选DEAEFast-Flow Sepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)。典型的层析介质包括那些由苯基、丁基或辛基基团衍生的介质，比如Phenyl-SepharoseFF(Pharmacia)、Toyopearl butyl 650(Toso Haas，Montgomeryville，PA)、Octyl-Sepharose(Pharmacia)等；或者聚丙烯树脂，比如AmberchromCG71(Toso Haas)等。合适的固体载体包括玻璃珠、硅基树脂、纤维素树脂、琼脂糖珠、交联琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、交联聚丙烯酰胺树脂等在使用条件下不溶的载体。可以用反应基团来修饰这些载体，所述基团能使蛋白质通过氨基、羧基、巯基、羟基和／或糖类部分进行附着。偶联化学反应的例子包括溴化氰活化、N-羟基琥珀酰亚胺活化、环氧化物活化、巯基活化、酰肼活化以及用于碳化二亚胺偶联反应的羧基和氨基衍生物。这些以及其他固体介质是本领域公知和广泛使用的，并可从供应商获得。

选择一种特定的方法是一项常规设计，部分取决于所选载体的特性。参见例如，亲合层析：原理和方法，Pharmacia LKB Biotechnology，Uppsala，Sweden，1988。

本发明的多肽或其片段还可以通过化学合成来制备。本发明所述多肽可以是单体或多聚体；糖基化或非糖基化的；PEG化或非PEG化的；可以包括或不包括起始甲硫氨酸残基。

相应地，在另一方面，本发明还涉及制备发明所述酶制品的方法，该方法包括在允许酶产生的条件下培养能产生果胶酸裂解酶的微生物，以及从培养物中回收酶。可以用常规的发酵技术进行培养，例如在摇瓶或发酵罐中能诱导产生果胶酸裂解酶的培养基中培养，并搅动以便保证充足的通气量。培养基可以含有常规的氮源，比如蛋白胨、酵母提取物或者酪蛋白氨基酸，减少量的常规碳源，比如右旋糖或蔗糖，以及诱导物比如果胶酸或果胶或composit植物底物比如谷糠(例如麦麸或大米壳)。可以利用常规技术进行纯化，例如通过沉淀或过滤来分离生物质和上清液，回收上清液或者破碎细胞(如果目的酶是胞内的)，可能随后如EP0406314所述进一步纯化或如WO97／15660所述进行结晶。

在另一方面，本发明还涉及一种分离的具有上述特性的果胶降解酶，它不含同源杂质，是用常规重组技术制备的。

转基因植物

本发明还涉及转基因植物、植物部分或植物细胞，它们已转化了编码发明所述果胶降解酶的DNA序列从而表达和产生可纯化量的酶。可以从植物或植物部分中纯化该酶。可选择地，可以使用含有重组酶的植物或植物部分本身。

所述转基因植物可以是双子叶植物或单子叶植物，简称为双子叶或单子叶。单子叶的实例是禾本科植物，比如牧草(莓系属牧草、早熟禾属)；饲用牧草比如羊茅、黑麦草；寒地型牧草如剪股颖，以及谷类植物，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱和玉米。

双子叶植物的实例是烟草、豆类(比如羽扇豆)、马铃薯、甜菜、豌豆、菜豆和大豆，以及十字花科(十字花科)，比如花椰菜、油籽油菜以及密切相关的模型生物拟南芥。

植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子和块茎。在本文中，还有特殊的植物组织，比如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体和细胞质也被认为是植物部分。另外，无论何种组织来源的任何植物细胞，也看作是植物部分。

本发明的范围内还包括这些植物、植物部分和植物细胞的后代。

表达本发明所述酶的转基因植物或植物细胞可以根据本领域已知方法来构建。简而言之，通过将1或多个编码本发明所述酶的表达构建体引入植物宿主基因组中，并使所得改变的植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞来构建所述植物或植物细胞。

比较方便的是，表达构建体是一个DNA构建体，它包含一个编码本发明所述酶的基因，以及与之可操作连接在一起的为在所选植物或植物部分中表达该基因所需要的合适的调控序列。另外，表达构建体可以包含选择标记(可用于鉴定其中已整合了表达构建体的宿主细胞)和将构建体导入目标植物必要的DNA序列(后者取决于所用的DNA导入方法)。

调控序列的选择，比如启动子和终止子序列以及任选的信号或转运序列是根据例如希望何时、何处以及如何表达酶来确定的。例如，编码本发明所述酶的基因的表达可以是组成型或诱导型的，或者是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可能是定向到特定组织或植物部分比如种子或叶片中的。例如Tague等，植物生理学86：506，1988描述了这样的调控序列。

对于组成型表达，可以使用35S-CaMV启动子(Franck等，1980，细胞21：285-294)。器官特异性启动子可以是例如来自储藏累积组织比如种子、马铃薯块茎和果实(Edwards&Coruzzi，1990，遗传学年评24：275-303)或者来自代谢累积组织比如分生组织(等，1994，植物分子生物学24：863-878)的启动子；种子特异性启动子比如来自水稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白或白蛋白启动子(Wu等，植物和细胞生理学39(8)：885-889(1998))，来自豆球蛋白B4以及Conrad U．(植物生理学杂志152(6)；708-711(1998))等描述的来自蚕豆种子的未知种子蛋白质基因的蚕豆启动子，来自菜籽油体蛋白的启动子(Chen等，植物和细胞生理学，39(9)：935-941(1998))、来自蔓菁的储存蛋白napA启动子或者任何其他本领域已知的种子特异性启动子，例如WO91／14772中所描述的。另外，所述启动子可以是叶特异性启动子，比如来自水稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等，植物生理学102(3)：991-1000(1993))，绿藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra，A．和Higgins，DW，植物分子生物学26(1)：85-93(1994))，或者来自水稻的aldP基因启动子(Kagaya等，分子与普通遗传学248(6)：668-674(1995))，或者伤口诱导启动子，比如马铃薯pin2启动子(Xu等，植物分子生物学22(4)：573-588(1993))。

可以利用启动子增强子在植物中获得酶的更高表达。例如，启动子增强子元件可以是插在启动子和编码酶的核苷酸序列之间的一个内含子。例如，Xu等(前引文章)公开了利用水稻肌动蛋白基因的第一个内含子来增强表达。

选择标记基因以及表达构建体的任何其他部分可以从本领域现有的进行选择。

依照本领域已知的常规技术，包括农杆菌介导的转化、病毒介导的转化、显微注射、颗粒轰击、基因枪转化以及电穿孔(Gasser等，科学244：1293；Potrykus，生物／技术8：535，1990；Shimamoto等，自然338：274，1989)将DNA构建体引入植物基因组。

目前，根癌农杆菌介导的基因转移(综述见Hooykas&Schilperoort，1992．植物分子生物学19：15-38)是产生转基因双子叶植物的首选方法，但是也可以利用它转化单子叶植物，尽管对这些植物通常优选其他转化方法。目前，产生转基因单子叶植物的首选方法是颗粒轰击(涂覆转化DNA的微小金颗粒或钨颗粒)胚性愈伤组织或发育的胚(Christou，1992，植物杂志2：275-281；Shimamoto，1994，生物技术评论5：158-162；Vasil等，1992，生物／技术学10：667-674)转化单子叶植物的一个替代方法基于Omirulleh S等(植物分子生物学21(3)：415-428(1993))描述的原生质体转化。

转化后，挑选出引入了表达构建体的转化子并根据本领域的公知方法再生为完整植株。

酶制品

在本发明文中，术语“酶制品”意味着常规的酶发酵产物，可能分离并纯化自微生物的一个种，这种制剂通常含有多种不同酶活性；或者意味着各单组分酶的混合物，优选通过利用常规重组技术来源于细菌或真菌菌种的酶，这些酶已经过发酵并且可能是独立地分离和纯化的，它们可能来源于不同菌种，优选真菌或细菌菌种；或者是作为表达重组果胶降解酶的宿主细胞之微生物的发酵产物，但这些微生物同时产生其他酶，例如其他果胶降解酶，蛋白酶或纤维素酶，它们是该微生物的天然发酵产物，即相应天然微生物常规产生的酶复合物。

本发明的果胶降解酶制品还可以包含1或多种选自下述的酶：蛋白酶、纤维素酶(内切-β-1，4-葡聚糖酶)、β-葡聚糖酶(内切-β-1，3(4)-葡聚糖酶)、脂酶、角质酶、过氧化物酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质素酶(ligninase)、支链淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、木葡聚糖酶(xyloglucanase)、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonase)、半乳聚糖酶(galactanase)、果胶酸裂解酶、果胶裂解酶、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶；或者这些酶的混合物。在一个优选实施方案中，利用重组技术产生酶制品中的1或多种或者全部酶，即酶是单组分酶，它们与其他酶混合形成一种具有所需酶配比的酶制品。

免疫交叉反应：

可以利用纯化的果胶降解酶来制备用于测定免疫交叉反应的多克隆抗体(对给定酶蛋白质是单一特异性的)。更具体地说，可以依照N．Axelsen等(定量免疫电泳指南，Blackwell ScientificPublications，1973，23章)或者A．Johnstone和R．Thorpe(实用免疫化学，Blackwell Scientific Publications，1982，尤其是27-31页)描述的步骤通过免疫兔子(或其他啮齿动物)来制备抗本发明所述果胶降解酶的抗血清。纯化的免疫球蛋白可以由抗血清获得，例如通过盐析((NH₄)₂SO₄)，随后经透析和离子交换层析(例如在DEAE-Sephadex上)获得。蛋白质的免疫化学鉴定可以通过Outcherlony双向扩散分析(O．Outcherlony，实验免疫学手册(D．M．Weir编，Blackwell ScientificPublications，1967，655-706页))、交叉免疫电泳(N．Axelsen等，同前，3和4章)或者火箭免疫电泳(N．Axelsen等，2章)进行。

在洗涤剂或清洁工业中的用途

在另外的方面，本发明涉及一种包含本发明所述果胶降解酶或酶制品的洗涤剂组合物，涉及织物的机械处理方法，包括用含有本发明所述果胶降解酶或酶制品的洗涤液在机洗过程的一个洗涤循环中处理织物，还涉及清洁组合物，包括衣物、硬表面清洁剂、个人清洁和口腔／牙齿组合物，这些组合物中包含本发明所述果胶降解酶或酶制品，能提供优良的清洁效果，即优良的去污效果。

不局限于这一理论，据信本发明的甘露聚糖酶能有效地降解或水解任何含有半乳糖甘露聚糖的泥溃或斑点，因此也能清洁带有这种泥渍或斑点的衣物。

本发明的清洁组合物必须含有至少一种附加洗涤剂成分。这些附加成分的确切特性及其掺入水平取决于组合物的物理形态和它将用于何种清洁操作。

优选本发明的清洁组合物还包含选自表面活性剂、另一种酶、助洗剂和／或漂白体系的洗涤剂成分。

根据本发明的清洁组合物可以是液体、糊状、胶状、条状、片状、雾液、泡沫状、粉末或颗粒。颗粒组合物还可以是致密形式的，液体组合物也可以是浓缩形式的。

本发明的组合物可以配制成例如手工和机械洗碗组合物；手工和机械衣物洗涤组合物，其中包括洗衣添加组合物和适用于浸泡和／或预处理污损织物的组合物；漂洗添加的织物柔顺剂组合物以及用于一般家庭硬表面清洁操作的组合物。含有这些糖酶的组合物还可以配制成卫生产品，隐形眼镜清洗剂和健康及美容保健产品，比如口腔／牙齿保健和个人清洁组合物。

当配制成用于人工洗碗方法的组合物时，本发明的组合物优选含有表面活性剂，最好还含有选自有机多聚化合物、增泡剂、Ⅱ族金属离子、溶剂、助溶物和另外的酶的其他去污化合物。

当配制成用于洗衣机洗涤方法的组合物时，本发明的组合物优选含有表面活性剂和助洗剂化合物，以及附加的l或多种洗涤剂成分，其优选选自有机多聚化合物、漂白剂、附加的酶、抑泡剂、分散剂、钙皂分散剂、污垢悬浮和防再污染剂以及防腐蚀剂。洗衣组合物还可以含有柔顺剂作为附加的洗涤剂成分。这些含有糖酶的组合物被配制成衣物清洁组合物时，可以提供织物清洁、去污、维持亮白、柔顺、彩色外观、抑制染料转移和卫生的作用。

本发明的组合物还可以作成固体或液体形式的去污添加产品使用。这些添加产品用来补充或促进传统去污组合物的效果，可以在清洁过程的任何阶段加入。

如果需要的话，此处所述衣物洗涤剂组合物的密度在20℃测量为400到1200g／l，优选在500到950g／l组合物。

此处所述“致密”形式的组合物最好地反映在密度上，就组合物来说，反映在无机填充盐的量上；无机填充盐是粉末形式的洗涤剂组合物的常规成分；在常规洗涤剂组合物中，填充盐大量存在，通常是组合物总重量的17-35％。在致密组合物中，填充盐的量不超过组合物总重量的15％，优选不超过10％，最优选不超过5％。无机填充盐，例如本发明组合物中所称的填充盐，选自碱和碱土金属的硫酸盐和氯化物。一种优选的填充盐是硫酸钠。

根据本发明的液体洗涤剂组合物可以处于一种浓缩形式，在这种情况中，本发明的液体洗涤剂组合物与常规液体洗涤剂相比含有较低量的水。通常浓缩液体洗涤剂的水含量优选低于洗涤剂组合物重量的40％，更优选低于30％，最优选低于20％。

用于此处的合适的特定洗涤剂化合物选自WO97／01629(此处全文引作参考文献)中描述的特定化合物。

优选以纯酶为组合物重量的0．0001％到2％、更优选0．0005％到0．5％、最优选0．001％到0．1％的水平将甘露聚糖酶加入本发明清洁组合物中。

可用于本发明的纤维素酶包括细菌或真菌纤维素酶。优选地，它们的最佳pH在5到12之间，比活在50CEVU／mg(纤维素粘度单位)以上。合适的纤维素酶公开于美国专利4435307、JP61078384和WO96／02653中，其中分别公开了由Humicola insolens、木霉属、梭孢壳属和侧孢属产生的真菌纤维素酶。EP739982描述了分离自一种新芽孢杆菌菌种的纤维素酶。在GB-A-2075028、GB-A-2095275、DE-OS-2247832和WO95／26398中还公开了合适的纤维素酶。

这类纤维素酶的实例是由一株Humicola insolens(灰色腐质霉变种thermoidea)，尤其是Humicola insolens DSM1800产生的纤维素酶。其他的合适的纤维素酶是来源于Humicola insolens，分子量大约50KD，等电点5．5，含有415个氨基酸的纤维素酶；以及来源于Humicolainsolens DSM1800的约43KI内切-β-1，4-葡聚糖酶；一种优选的纤维素酶具有PCT专利申请WO91／17243中公开的氨基酸序列。同样合适的纤维素酶是WO94／21801中描述的来自Trichoderma longibrachiatum的EGⅢ纤维素酶。特别合适的纤维素酶是有护色作用的纤维素酶。这类纤维素酶的实例是WO96／29397、EP-A-0495257、WO91／17243、WO91／17244和WO91／21801中描述的纤维素酶。其他适用于织物保养和／或清洁的纤维素酶有WO96／34092、WO96／17994和WO95／24471中描述的酶。

所述纤维素酶通常以纯酶为洗涤剂组合物重量的0．0001％到2％的水平加入洗涤剂组合物中。

优选用于本发明目的的纤维素酶是碱性纤维素酶，即在pH7到12具有最大活性的至少25％，更优选至少40％的酶。更优选的纤维素酶是在pH7到12具有最大活性的酶。优选的碱性纤维素酶是Novo Nordisk A／S以Carezyme^的商品名出售的纤维素酶。

可以包括淀粉酶(α和／或β)以便去除基于碳水化合物的污渍。公开于1994年2月3日的WO94／02597(Novo NordiskA／S)描述了一种加有淀粉酶变体的清洁组合物。还可参见公开于1995年4月20日的WO95／10603 (Novo Nordisk A／S)。其他已知用于清洁组合物的淀粉酶包括α和β-淀粉酶。α-淀粉酶是本领域已知的，包括美国专利5003257、EP252666、WO91／00353、FR2676456、EP285123、EP525610、EP368341和英国专利说明书1296839 (Novo)中公开的α-淀粉酶。其他合适的淀粉酶是1994年8月18日公开的WO94／18314和1996年2月22日公开的WO96／05295(Genencor)中描述的稳定性提高的淀粉酶，以及公开于1995年4月的WO95／10603中公开的在Novo Nordisk A／S销售的直接亲本中带有附加修饰的淀粉酶变体。同样合适的是在EP277216、WO95／26397和WO96／23873(均为Novo Nordisk提出的申请)中描述的淀粉酶。

商品α-淀粉酶的实例是来自Genencor的Purafect Ox Am^NovoNordisk A／S(丹麦)销售的Termamyl^、Ban^、Fungamyl^、Duramyl^。WO95／26397描述了其他的合适淀粉酶：特征在于在25℃到55℃的温度范围内、pH在8到10时，通过Phadebas^α-淀粉酶活性检测法测定，该淀粉酶的比活比Termamyl^的比活至少高25％。合适的有WO96／23873 (Novo Nordisk)中描述的上述酶的变体。其他的在活性水平以及热稳定性和高活性水平两方面都提高的淀粉水解酶在WO95／35382中有描述。

用于本发明目的的优选淀粉酶是以商品名Termamyl、Duramyl和Maxamyl出售的淀粉酶，和／或在WO96／23873中以SEQ ID NO：2公开的表现出热稳定性增强的α-淀粉酶变体。

优选用于特定用途的淀粉酶是碱性淀粉酶，即在pH7到12，具有最大活性的至少10％，优选至少25％，更优选至少40％酶活的酶。更优选的淀粉酶是在pH7到12具有最大活性的酶。

以纯酶为组合物重量的0．0001％到2％，优选0．00018％到0．06％，更优选0．00024％到0．048％的水平将淀粉水解酶加入本发明洗涤剂组合物。

术语木葡聚糖酶包括Wageningen大学Vincken和Voragen(Vincken等(1994)植物生理学104：99-107)描述的一族酶，如Hayashi等(1989，植物生理与植物分子生物学40：139-168)中描述的，它们能降解木葡聚糖。Vincken等表明纯化自绿色木霉的木葡聚糖酶(内切-Ⅳ-葡聚糖酶)能从分离的苹果细胞壁的纤维素上去除木葡聚糖包被。该酶促进对细胞壁包埋的纤维素的酶促降解，并与果胶酶协同作用。得自Gist-Brocades的Rapidase LIQ+含有木葡聚糖酶活性。

以纯酶为组合物重量的0．0001％到2％，更优选0．0005％到0．5％，最优选0．001％到0．1％的水平将木葡聚糖酶加入本发明的清洁组合物中。

优选用于特定应用的木葡聚糖酶是碱性木葡聚糖酶，即在pH7到12，具有最大活性的至少10％，优选至少25％，更优选至少40％酶活的酶。更优选的木葡聚糖酶是在pH7到12具有最大活性的酶。

上述酶可以是任何合适的来源，比如蔬菜、动物、细菌、真菌和酵母来源。酶来源还可以是嗜温或极端细茵(嗜寒、嗜冷、嗜热、嗜压、嗜碱、嗜酸、嗜盐等)。可以使用这些酶的纯化或非纯化形式。目前，经蛋白质或遗传工程技术来修饰野生型酶以便优化其在本发明所述清洁组合物中的效力是一种普通作法。例如，可以设计变体以使酶与这类组合物中的常用成分的相容性提高。或者，可以设计变体以使酶变体的最适pH、漂白或螯合剂稳定性、催化活力等适合具体的清洁用途。

尤其是，在漂白稳定性的情况中，应当把注意力集中在氨基酸对氧化的敏感性上，对于表面活性剂相容性，应当把注意力集中在表面电荷上。可以通过取代某些带电氨基酸来改变这些酶的等电点，例如等电点增加可能有助于提高与阴离子表面活性剂的相容性。可以通过产生例如附加的盐桥和加强金属结合位点从而提高螯合剂稳定性来进一步增加酶的稳定性。

在纺织品和纤维素纤维加工工业中的用途

本发明的果胶降解酶可以单独或者与其他碳水化合物降解酶(例如阿拉伯聚糖酶、木葡聚糖酶、甘露聚糖酶)联合用于生物制备纤维或者与洗涤剂联合用来清洁纤维。棉纤维由含有果胶的初生细胞壁层和主要含有纤维素的次生细胞壁层组成。在棉制备或棉精炼时，部分初生细胞壁被去除。本发明涉及在棉精炼过程帮助去除初生细胞壁，或者在棉清洗过程去除残存的果胶物质并防止纺织品变灰。

在本发明文中，术语“纤维素类材料”意指纤维、缝制或未缝制的织物，包括从棉、混合棉或者天然或人工纤维素(例如来源于含有木聚糖的纤维素纤维，比如来源于木浆)或者它们的混合物制得的针织物、机织物、粗斜纹布、纱线和毛巾布。混合物的实例是棉或人造丝／粘胶纤维与1或多种伴生材料，比如毛、合成纤维(例如，聚酰胺纤维、丙烯酸类纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚偏二氯乙烯纤维、聚氨酯纤维、聚脲纤维、芳族聚酰胺纤维)和含有纤维素的纤维(例如，人造丝／粘胶纤维、苎麻、大麻、亚麻／亚麻布、黄麻、乙酸纤维素纤维、lyocell)的混合物。

本发明的酶或酶制品可以用来在纤维素纤维加工工业中预处理或从大麻、亚麻或亚麻布中浸解纤维。

纺织工业中纤维素材料，例如棉纤维加工为适于制表的材料，包括几个步骤：将纤维纺成纱线；由纱线编织成机织织物或针织织物以及后续的准备、染色和整理操作。机织物品是通过在一系列经纱间织入纬纱来构造的；所述纱线可以是两种不同类型的。针织物品是通过由一根连续纱线形成双罗纹环来构造的。纤维素纤维还可以用于非机织织物。

准备工序使纺织品在染色操作中产生良好的反应。准备工序包括的次级步骤是：

d．在纺织前加入类似聚合物大小的物质，例如淀粉、CMC或PVA来进行退浆(对于机织物品)，以便提高经纱速度；在进一步加工前必须将这些材料去除。

e．精练，其目的是从棉纤维中去除非纤维素材料，尤其是表皮(主要含有蜡)和初生细胞壁(主要由果胶、蛋白质和木葡聚糖组成)。恰当地去除蜡是得到高吸湿力所必须的，是取得良好染色效果的一个量度。去除初生细胞壁-尤其是果胶能提高蜡去除性，并保证更均匀的染色。另外该步骤能提高漂白过程中的亮白度。用于精炼的主要化学物质是浓度高达70g／kg棉的氢氧化钠，并在高温(80-95℃)进行；以及

f．漂白；通常精练后要进行漂白，以过氧化氢作为氧化剂以便得到完全漂白的织物或者保证染料色泽清晰。

工业上还使用将精练／漂白过程组合在一起的一步法。虽然准备工序最普遍是在织物阶段进行，但也可以在纤维或纱线阶段进行精练、漂白和染色操作。

对于平幅或绳状形式，处理过程可以通过处理液流间歇或连续地与织物接触。连续操作通常使用饱和器，在此按每份织物重量近似等量的化学液体将其施加给织物，随后在一个加热的停留室中进行化学反应。然后由洗涤区预备织物进入下一个处理步骤。间歇操作通常在一个处理浴中进行，在此用近似织物重量8-15倍的化学浴与织物进行接触。一段反应时间后，排出化学品，冲洗织物并加上下一种化学品。非连续的浸轧-堆放回苏工序涉及饱和器，在此按每份织物重量近似等量的化学液体将其施加给织物，随后停留一段时期，对于冷浸轧-堆放回苏工序，停留时间可能是1或多天。

机织物品是纺织织物构造的普遍形式。机织过程需要将经线上浆以防止磨损。因其供应量和价格，淀粉、聚乙烯醇(PVA)、羧甲基纤维素、蜡和丙烯酸粘合剂是通常使用的上浆化学品的实例。浆料必须在机织过程后，作为制备机织物品的第一步去除。将上过浆的平幅或绳状织物与含有退浆剂的处理液接触。采用的退浆剂取决于要去除的浆料的类型。对于PVA浆料，经常使用热水或氧化型处理方法。最常用于棉织物的上浆剂基于淀粉。因此最经常地，将热水、水解淀粉的α-淀粉酶与润温剂或表面活性剂联合起来给机织棉织物退浆。使纤维素材料与退浆化学品保持足够长的“持续时间”以便完成退浆。持续时间取决于处理方式的类型和温度，可以在15分钟到2小时，或者在某些情况中达到几天。通常，将退浆化学品加入饱和器浴中，后者一般在大约15到55℃。然后将织物盛在能提供充足热量(通常在大约55到100℃)的装置中，比如J型箱中，从而提高退浆剂的活性。持续期结束后将化学品，包括被去除的浆料从织物上洗去。

为了保证高白度或良好的吸湿力以及由此导致的可染性，必须彻底清除浆料化学品和其他使用的化学物质。一般认为充分的退浆对以下的准备工序：精练和漂白非常重要。

精练过程能去除棉纱中天然存在的大多数非纤维素化合物。除了天然的非纤维素杂质，精练还可以去除尘土、污垢和制造过程引入的残存物质比如纺纱、络筒或浆纱润滑剂。精练工序使用氢氧化钠或相关的苛性剂比如碳酸钠、氢氧化钾或其混合液。通常该过程要加入一种碱性稳定的表面活性剂以便提高疏水化合物的溶解性和／或防止它们再次沉积在织物上。该处理通常在高温(80-100℃)进行，采用强碱溶液(pH13-14)作为精练剂。由于化学品处理的非特异属性，不仅是杂质，纤维素本身也会被作用，导致织物的强度或其他理想特性被损害。纤维素织物的柔软性是残存天然棉蜡的函数。高温强碱性精练方法的非特异性不能区分所需的天然棉润滑剂和制造过程引入的润滑剂。另外，传统的精练方法由于来自这些过程的强碱性废水会导致环境问题。精练阶段为织物在漂白过程达到最佳响应做准备。没有充分精练的织物在随后的漂白阶段会需要更大量的漂白化学品。

漂白工序脱去天然棉色素并去除所有在轧花、梳理或精练过程中没有完全去除的残留天然木质棉杂质成分。目前主要使用的方法是碱性过氧化氢漂白。在许多情况中，特别是不需要非常高的白度时，可以将漂白与精练结合进行。

在以下实施例中，显示了可以用本发明的果胶酸盐裂解酶或果胶酸盐裂解酶制品在大约50到80℃，约pH7-11进行精练步骤，从而取代或补充那些高度腐蚀剂的作用。经过优化的酶促过程可确保达到高的果胶去除效果和饱满的吸湿性。

植物材料的降解或改变

由于本发明所述酶具有高植物细胞壁降解活性，故优选用本发明的酶或酶制品作为降解或改变植物细胞壁或任何来源于植物细胞壁的含有果胶的材料的试剂。

本发明的果胶酸盐降解酶可以单独或与其他酶如葡聚糖酶、果胶酶和／或半纤维素酶联合使用，以便提高从富含油的植物材料中提取油，如从大豆中提取豆油，从橄榄中提取橄榄油，或从油菜籽中提取菜籽油，或从向日葵中提取葵花油。

本发明的果胶降解酶可以用于分离植物细胞材料的成分。尤其有意义的是将富含糖或淀粉的植物材料分离为非常有经济价值的成分(如从甜菜中分离蔗糖或从马铃薯中分离淀粉)和价值低的成分(如果渣或壳部分)。同样，很有意义的是将富含蛋白质或富含油的作物分离为有价值的蛋白质和油以及无价值的壳部分。可以采用本领域的已知方法进行分离操作。

本发明的果胶降解酶还可以用于制备水果或蔬菜汁制品以便提高产量，用于酶促水解例如酒或果汁生产中各种来源于植物细胞壁的材料或废料，或者农业残余物比如蔬菜壳、豆壳、甜菜渣、橄榄渣、马铃薯渣等。

可以将植物材料降解以便改善不同种类的加工过程，协助纯化或提取半乳聚糖以外的其他成分，如从柑橘中纯化果胶，提高食用价值，降低结合水的能力，提高废水车间的降解力，提高植物材料转化为青储饲料等。

利用本发明的酶制品，就有可能调节加工过的水果或蔬菜的稠度和外观。已经证明稠度和外观是加工所用酶的实际组合方式的结果，即与本发明所述果胶酸盐裂解酶组合的酶的特异性有关。实例包括由例如苹果、梨或草莓制备的澄清果汁；例如由苹果、梨、草莓、柑橘或西红柿制备的稳定絮状果汁；以及例如由胡萝卜和西红柿制备的果酱。

本发明的果胶降解酶可以用于改变来源于植物细胞壁的材料的粘度。例如，可以用果胶降解酶降低含有半乳聚糖的饲料的粘度，并促进含有半乳聚糖的粘性材料的加工。可以通过用本发明的酶制品，在适于完全或部分降解含有半乳聚糖的材料的条件下处理所述植物材料从而降低其粘度。

可以将果胶降解酶例如与其他酶联合使用来从植物纤维中去除果胶物质。该去除步骤在例如生产纺织品纤维或其他纤维素材料时非常重要。为此，用适当量的本发明所述果胶降解酶在适于完全或部分降解与植物纤维材料相关的果胶物质的条件下处理植物纤维材料。

动物饲料添加剂

本发明的果胶降解酶可以用于改变动物饲料，并且可以在体外(通过改变饲料成分)或体内发挥作用。所述果胶降解酶尤其适合添加到含有大量阿拉伯半乳聚糖或半乳聚糖的动物饲料组合物中，例如，含有来自大豆、油菜籽、羽扇豆等的植物材料的饲料中。当加入饲料中时，果胶降解酶可显著地提高植物细胞壁物质在体内的降解，从而使动物能更好地利用植物养分。因此，能提高动物的生长率和／或饲料转化率(即摄取的饲料重量比上动物增重)。例如，果胶酸盐裂解酶与例如β-半乳糖苷酶联合使用，可将动物不能消化的半乳聚糖降解为能被动物消化的半乳糖或半乳糖寡聚物，从而提高饲料的可用能量。同样，通过降解半乳聚糖，果胶酸盐裂解酶能提高非碳水化合物饲料组分，比如蛋白质、脂肪和矿物质的消化力和吸收。

进一步的描述可以参考PCT／DK 96／00443以及本文的实施例。

酒类和果汁加工

本发明的酶或酶制品可以用于蔬菜或水果果汁，尤其是苹果或梨汁的脱果胶化和降低粘度。通过用本发明的酶制品(其用量能有效降解水果或蔬菜汁所含的含有果胶的物质)处理水果或蔬菜汁可以达到该目的。

可以用所述酶或酶制品处理水果和蔬菜泥以便提高它们的提取或降解力。例如，可以将酶制品用于生产果汁中处理苹果和梨泥，用于酒类生产中处理葡萄泥。

果胶降解酶的催化活性测定

粘性检测法APSU

APSU单位：APSU单位检测是一种使用多聚半乳糖醛酸作为底物，不加钙的粘度测量法。

将底物5％多聚半乳糖醛酸钠盐(Sigma P-1879)溶解在0．1M甘氨酸缓冲液(pH10)中。将4ml底物于40℃预保温5分钟。加入酶(250μl体积)并在混合器上以最大转速混合10秒钟，然后于40℃温育20分钟。做标准曲线时，将浓度为5APSU／ml到100APSU／ml以上范围内的酶稀释溶液测定两次，最少有4个浓度在10到60APSU／ml之间。用Sofraser公司，45700 Villemandeur，France的MIVl600测定粘度。10秒后，以mV测定粘度。

为了计算APSU单位，使用上述酶标准溶液来制得标准曲线：

APSU／ml	mV
		0．004．009．0014．0019．0024．0034．0049．0099．00	300276249227206188177163168

用GrafPad Prism程序进行计算，该程序使用单相指数衰减并有坪值的非线性拟合。坪值加跨度是不含酶得到的mV。坪值是酶浓度100APSU以上的mV，在两个实例中都发现粘度的半减值是12APSU单位，标准误差为1．5APSU。

裂解酶检测(于235nm)

为了测定β-消除，用溶解在0．1M甘氨酸缓冲液(pH10)中的0．1％多聚半乳糖醛酸钠盐(Sigma P-1879)作为底物测量235nm处吸收值的增加。计算催化速率时，每分钟235nm处吸收值增加5．2对应着形成1μmol不饱和产物(Nasuna和Starr(1966)，生物学化学杂志241：5298-5306；以及Bartling、Wegener和Olsen(1995)微生物学141：873-881)。

稳定态条件为在HP二极管阵列比色仪上的1cm光路中，使用温控比色杯架中的0．5ml比色杯连续测量235 nm处吸收值。对于稳定态，用至少200秒的线性增加来计算催化速率。用它转换为每分钟形成的μmol产物。

琼脂检测法

可以通过向琼脂平板(比如，例如LB琼脂)上制成的4mm小孔中加入含有0．7％w／v多聚半乳糖醛酸钠(Sigma P1879)的检测溶液来测量果胶酸盐裂解酶活性。然后将平板于特定温度(比如，例如75℃)保温6小时。然后将平板在(ⅰ)1M CaCl₂中浸0．5小时或者(ⅱ)1％混合溴化烷基三甲基铵(MTAB，Sigma M-7635)中浸1小时。这两个过程均导致多聚半乳糖醛酸盐在琼脂中沉积。通过在沉积的多聚半乳糖醛酸盐背景中出现透明区来检测果胶酸盐裂解酶活性。用果胶酸盐裂解酶标准品的稀释溶液可以校正该检测方法的灵敏度。

端点分析-235nm处果胶酸盐裂解酶的反式消除(高钙法：在最终的保温体系中有1mM钙)

在本方法中，将底物和酶于37℃保温20分钟，然后测量235nm处双键的形成。最后，在摩尔消光系数的基础上，计算降解速率，以TransUnit表示。

步骤：

将0．5ml酶稀释液与0．5ml 2*底物溶液混匀。

底物：购自Sigma P-1879、批号为77H3784的多聚半乳糖醛酸。

缓冲液2X：0．1 M甘氨酸pH10+2．0 mmol CaCl₂

终止试剂：0．02 M H₃PO₄

保温温度：37℃

反应时间：20分钟

反式消除的消光系数：0．0052μmol cm^-1。

将酶在无离子水中稀释至0．5到5 APSU／ml。实验主值两份各0．5ml。两种溶液于37℃水浴中预保温5分钟后，将2％w／v底物于2X缓冲液中的溶液与0．5ml稀释过的酶混匀。保温20分钟。用5ml终止试剂终止反应，并混匀。空白中首先将酶与终止试剂混匀，然后加入相同体积的底物。

酶0．5ml

底物0．5ml

终止试剂5ml

总体积6ml

在1cm比色杯中于235nm测量光吸收值。

使用消光系数0．0052μmol cm^-1计算每分钟反式消除的形成量。

公式：[(主值加主值)／2-空白]0．0052*6*2*酶稀释度／20分钟/1000ml=μmol/分钟。

端点分析-果胶裂解酶在pH9．0于235nm的反式消除。

按照以上描述的端点分析-235nm处果胶酸盐裂解酶的反式消除(高钙法)进行本方法，但使用以下底物和缓冲液：

底物：购自Sigma P-9561 lot 125H0123的柑橘酯化果胶。

缓冲液2X：0．1M硼酸盐pH9．0，5mM EDTA。

材料与方法

菌株

地衣芽孢杆菌ATCC14580

枯草芽孢杆菌PL2306。该菌株是apr和npr基因被破坏的枯草芽孢杆菌DN1885(Diderichsen，BWedsted，UHedegaard，LJensen，B．RSjoholm，C．(1990)“编码α-乙酰乳酸脱羧酶：来自短芽孢杆菌的胞外酶的aldB的克隆”，细菌学杂志172：4315-4321)，上述基因在已知的枯草芽孢杆菌纤维素酶基因转录单元中被破坏，形成纤维素酶阴性细胞。破坏方法基本上按照(A．L．Sonenshein，J．A．Hoch和RichardLosick(1993)编，枯草芽孢杆菌及其他革兰氏阳性细菌，美国微生物学会，618页中)描述的进行。

按照Yasbin，R．EWilson，G．A．和Young，F．E．(1975)(枯草芽孢杆菌溶源茵株中的转化和转染：前噬菌体在感受态细胞中的选择性诱导的证据，细菌学杂志121：296-304)的描述制备感受态细胞并进行转化。

质粒

pMOL944：

该质粒是pUB110的衍生质粒，基本上含有使质粒能在枯草芽孢杆菌中增殖的元件、卡那霉素抗性基因并有一个克隆自地衣芽孢杆菌ATCC14580的amyL基因的强启动子和信号肽。所述信号肽含有SacⅡ位点，使它便于克隆编码蛋白质的成熟部分的DNA以与信号肽融合在一起。这会导致表达一个被引导到细胞外的前蛋白质。

利用以下简单描述的常规遗传工程技术构建该质粒。

构建pMOL944：

用单切点限制酶NciⅠ消化pUB110质粒(McKenzie，T．等，1986，质粒15：93-103)。由质粒pDN1981(P．L．Jorgensen等，1990，基因96：37-41)上编码的amyL启动子扩增到的PCR片段用NciⅠ消化并插入NciⅠ消化过的pUB110中，得到质粒pSJ2624。

所用的两个PCR引物具有以下序列：# LWN5494 5＇-GTCGCCGGGGCGGCCGCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC -3＇# LWN5495 5＇-GTCGCCCGGGAGCTCTGATCAGGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAA

          TGAGGCAGCAAGAAGAT - 3 ＇

引物#LWN5494向质粒插入了NotⅠ位点。

然后用SacⅠ和NotⅠ消化质粒pSJ2624，并用SacⅠ和NotⅠ消化由质粒pDN1981上编码的amyL启动子扩增到的一个新PCR片段，将这个DNA片段插入SacⅠ-NotⅠ消化过的pSJ2624中，得到质粒pSJ2670。

该克隆过程将第一个amyL启动子替换为相反方向的相同启动子。用于PCR扩增的两个引物具有以下序列：#LWN5938   5｀-GTCGGCGGCCGCTGATCACGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT -3＇#LWN5939   5｀-GTCGGAGCTCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC   -3＇

用限制酶PstⅠ和BclⅠ消化质粒pSJ2670，并用PstⅠ和BclⅠ消化由编码碱性淀粉酶SP722的克隆DNA序列(在公开为WO95／26397(此处全文引作参考文献)的国际申请中公开)扩增到的一个PCR片段，插入质粒得到pMOL944。用于PCR扩增的两个引物具有以下序列：#LWN7864      5｀-AACAGCTGATCACGACTGATCTTTTAGCTTGGCAC-3＇#LWN7901      5｀-AACTGCAGCCGCGGCACATCATAATGGGACAAATGGG-3＇

引物#LWN7901向质粒中插入了SacⅡ位点。

一般分子生物学方法

除非特别提及，采用标准的分子生物学方法(Sambrook等，(1989)分子克隆：实验指南，Cold Spring Harbor labCold Spring Harbor，NY；Ausubel，F．M．等，(编)“分子生物学通用方案”，John Wiley和Sons，1995，；Harwood，C．R．和Cutting，S．M．(编)“芽孢杆菌的分子生物学方法”John Wiley 和Sons，1990)进行DNA操作和转化。

根据供应商的说明使用DNA操作酶(例如限制性内切核酸酶，连接酶等可从New England Biolabs，Inc．购买)。

培养基

TY(如Ausubel，F．M．等(编)“分子生物学通用方案”，John Wiley和Sons，1995中描述的)。

LB琼脂(如Ausubel，F．M．等(编)“分子生物学通用方案”，JohnWiley和Sons，1995中描述的)。

LBPG是补充0．5％葡萄糖和0．05 M磷酸钾(pH7．0)的LB琼脂。

BPX培养基在EP0506780(WO91／09129)中有描述。

以下实施例用于阐述本发明。

实施例1

来自地衣芽孢杆菌的果胶酸裂解酶(Ⅱ)的克隆、表达、纯化和鉴定

制备基因组DNA

在ATCC(美国典型培养物保藏中心，USA)中指定的液体培养基3中增殖地衣芽孢杆菌菌株ATCC14580。于37℃、300rpm培养18小时后，收集细胞，通过Pitcher等(Pitcher，D．GSaunders，N．AOwen，R．J．(1989)用异硫氰酸胍快速提取细菌基因组DNA，应用微生物学快报8：151-156)等描述的方法分离基因组DNA。

用以下两个寡核苷酸的PCR引物组扩增本发明所述果胶酸裂解酶Ⅱ(见上文，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示)的DNA编码序列：Pecl．B．lich．upper． SacⅡ5＇-CTA ACT GCA GCC GCG GCA GCT TCT GCC TTA AAC TCG GGC -3＇Pecl．B．lich．lower．NotⅠ5＇-GCG TTG AGA CGC GCG GCC GCT GAA TGC CCC GGA CGT TTC ACC -3＇

限制位点SacⅡ和NotⅠ加有下划线。

用如上所述分离自地衣芽孢杆菌ATCC14580的染色体DNA作为PCR反应的模板，反应依照制造商的说明使用Amplitaq DNA聚合酶(PerkinElmer)。在含有200μM各种dNTP、2．5单位Amplitaq DNA聚合酶(Perkin-Elmer，Cetus，USA)和100 pmol每种引物的PCR缓冲液(10mMTris-HCl，pH8．3，50mM KCl，1．5mM MgCl₂，0．01％(w／v)明胶)中进行PCR反应。

用DNA热循环仪(Landgraf，Germany)进行PCR反应。于94℃保温1分钟，然后做30个PCR循环，所用循环方案是94℃变性30秒，60℃退火1分钟，72℃延伸2分钟。在0．7％琼脂糖凝胶(Nusieve，FMC)中经电泳分析5μl扩增产物试样。出现一个1．0kb大小的DNA片段，表明基因片段被正确扩增。

PCR片段的亚克隆

用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，USA)依照制造商的说明提纯如上制得的45μl PCR产物试样。将纯化的DNA洗脱到50 μl 10mMTris-HCl(pH8．5)中。用SacⅡ和NotⅠ消化5μgpMOL944和25μl纯化过的PCR片段，在0．8％低凝结温度琼脂糖(SeaPlaque GTG，FMC)凝胶中电泳，从胶上切下相关的片段，用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，USA)依照制造商的说明进行纯化。然后将分离的PCR DNA片段连接到用SacⅡ-NotⅠ消化过并纯化了的pMOL944上。于16℃用0．5μg各DNA片段、1U T4 DNA连接酶和T4连接酶缓冲液(Boehringer Mannheim，Germany)连接过夜。

用连接体系转化感受态枯草芽孢杆菌PL2306。转化后的细胞铺在LBPG-10μg／ml卡那霉素平板上。于37℃培养18小时后，将几个克隆在新鲜琼脂板上划线，同时在含有10μg／ml卡那霉素的液体TY培养基中生长，于37℃保温过夜。第二天用Qiaprep Spin质粒微量制备试剂盒#27106，依照制造商对枯草芽孢杆菌质粒制备的建议用1ml细胞来分离质粒。这些质粒DNA用作DNA测序的模板。

保留一个含有果胶酸裂解酶基因的克隆，该克隆命名为MB541。

经引物步行法通过DNA测序来鉴定与果胶酸裂解酶成熟部分对应的DNA，测序使用Taq脱氧终止循环测序试剂盒(Perkin-Elmer，USA)、荧光标记的终止试剂和适当的寡核苷酸作为引物进行。

按照Devereux等(1984，核酸研究12：387-395)对序列资料进行分析。在枯草芽孢杆菌中表达克隆的DNA序列，在上清液中出现的蛋白质对应SEQ ID NO：8所示成熟蛋白质。

纯化

使MB541在500ml带有双挡板的摇瓶内含有10μg／ml卡那霉素的25x 200ml BPX培养基中于37℃、300rpm生长5天，从而得到3500ml培养液。在搅拌过程中用醋酸将pH调至5．0，并加入100ml阳离子试剂(C521)和200ml阴离子试剂(A130)进行絮凝。絮凝的物质使用Sorval RC 3B离心机于6℃、10000rpm离心30分钟来分离。所得的上清液含有370APSU／ml，总体积为3600 ml。

用Whatman玻璃滤器GF／D和C澄清上清液，最后在一个分子截留为10kDa的filtron UF膜上进行浓缩。将总体积2000ml调至pH8．5。将50克DEAE A-50 Sephadex(Pharmacia)在2000ml 50mM Tris(pH8．5)中溶胀。弃去多余的缓冲液，将清澈的浓缩酶溶液与浆液混合15分钟。通过Buchner漏斗吸滤来从离子交换材料上分离酶。所得溶液在分子截留为10kDa的filtron上浓缩至终体积为800ml。

为了得到高度纯化的果胶酸裂解酶，用S-Sepharose阳离子交换层析进行终步骤。用醋酸将50ml 950APSU／ml的溶液(见上文)调至pH5．0。将它上样到用50mmol醋酸钠(pH5．0)平衡过的、含有S-Sepharose(Pharmacia)的50ml柱子上。果胶酸裂解酶发生结合，用0．5M氯化钠梯度洗脱。

鉴定

纯酶在SDS-PAGE中给出35kDa的单一条带，等电点在6．1左右。

采用摩尔消光系数57750(基于由序列推测的氨基酸组成)测定蛋白质的浓度。

利用检测由于形成双键(可以在235nm测量)而导致的裂解的方法得到以下数据：

1．(条件：pH10；甘氨酸缓冲液；不含钙；多聚半乳糖醛酸SigmaP-1879作为底物)：1μmol／min／mg。

2．(条件：pH10；甘氨酸缓冲液；不含钙；DE35(35％酯化的果胶)作为底物)：4μmol／min／mg。

将纯酶在pH8．0(20mM Tris pH8．0)和pH10(20mM甘氨酸pH10)对EDTA透析，用圆二色性分析酶，有和没有EDTA时的光谱没有发现差别。

4份样品的差示扫描量热法DSC显示酶在pH8．0最稳定，在Tris(pH8．0)中的熔解温度为70℃左右，对EDTA透析后约为75℃。在pH10，有和没有EDTA时该酶均在55℃熔解。

在与底物温育过程中有EDTA存在时，果胶酸裂解酶的催化活性被抑制，但如果在与底物温育时将EDTA清除，则对EDTA透析过的酶仍有活性。二价阳离子，如Fe++、Li++、Mg++、Cu++、Mn++对催化活性没有影响。

用以下缓冲液测定不同pH值时β-反式消除活性(用235nm处的裂解酶检测法)，作为40℃的稳态动力学：

pH6．0：Na-MES 0．1M

pH 6．5、7．0&7．5：Na-MOPS 0．1M

pH 8．0&8．5：Tris 0．1M

pH 9．0、9．5、10．0&10．5：甘氨酸钠0．1M

pH：11-11．5：碳酸钠0．1M

MES：购自Sigma编号M-8250(2[N-吗啉代]乙烷磺酸)

MOPS：购自Sigma编号M-1254(3[N-吗啉代]丙烷磺酸)

Tris：购自Merck No．1．08382

甘氨酸购自Merck，碳酸钠购自Merck No．6392。

将相对活性(比率)计为最大活性的百分比，得到以下结果：

pH     活性％

6．5    1

7       5

7．5    4

8       4

8．5    4

9       6

9．5    23

10      100

10．5   未做

11      52

11．2   0

相应地，在不同温度的相对活性(pH10)为：

温度℃    活性％

40        65

50    87

55    87

60    100

65    90

洗涤剂中的活性：用商品洗涤剂代替缓冲液，与多聚半乳糖醛酸钠盐(Sigma P-1879)于40℃温育20分钟，随后测定还原糖，相对在甘氨酸缓冲液中测定的活性，在European商品去污粉Ariel Futur中酶有44％的相对活性，在US Tide商品粉末中酶有51％相对活性，在US Tide液体洗涤剂中酶有30％相对活性。洗涤剂浓度为推荐使用浓度，在European条件下是在18度(German硬度)的自来水中，在美国条件下是在9度的自来水中使用。

免疫学特性：在Danish公司DAKO，用常规技术培育抗高度纯化的果胶酸裂解酶的兔多克隆单一特异性血清。血清与本发明的果胶酸裂解酶在琼脂糖凝胶中形成很好的单一沉淀物，并且对地衣芽孢杆菌粗产物(如购自Novo Nordisk A／S的Pulpzyme HC批号CKF0054或批号CKN00009)只有一个沉淀弧。

实施例2

来自地衣芽孢杆菌的果胶酸裂解酶(Ⅰ)的克隆、表达、纯化和鉴定

制备基因组DNA

在按ATCC(美国典型培养物保藏中心，USA)指定的液体培养基3中增殖地衣芽孢杆菌菌株ATCC14580。于37℃、300rpm培养18小时后，收集细胞，通过Pitcher等描述的方法(Pitcher，D．GSaunders，N．AOwen，R．J．(1989)，用异硫氰酸胍快速提取细菌基因组DNA，应用微生物学快报8：151-156)分离基因组DNA。

限定本发明的序列

由以下两个引物限定所述序列，这两个引物可以用于随后的PCR反应以便扩增本发明的果胶酸裂解酶的完整开放读码框：Pecl3．orf． PstⅠ5＇-CAC ATC TGCAGC ATG AAG AGA TTA GCA GGT ACG GTT ATT TTG TC-3＇Pecl3．Licheniformis．lower． NotⅠ5＇- CTC ATC ATG CGG CCG CAG GGG CCT TTA TTT GCA ATC AGT G -3＇

用于克隆的限制位点加有下划线。

完整的orf可以用上述引物按照实施例1中的描述经PCR进行克隆。出现0．7kb大小的DNA片段表明基因片段被正确扩增。该DNA片段可以克隆到任何适合在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或其他菌株中进行克隆的载体中。该片段以PstⅠ-NotⅠ片段形式克隆。当对PCR片段或克隆片段进行DNA测序时，出现的DNA序列的开放读码框示于SEQ ID NO：3。

在枯草芽孢杆菌中亚克隆和表达果胶酸裂解酶

用以下两个寡核苷酸的PCR引物组对本发明所述果胶酸裂解酶编码DNA序列(SEQ ID NO：3)进行PCR扩增：Pecl3．Licheniformis．upper． PstⅠ5＇-CAC ATC TGC AGC CGC GGC AGC CGA GGT CGT TCA CAA AAC G -3＇Pecl3．Licheniformis．lower．NotⅠ5＇-CTC ATC ATG CGG CCG CAG GGG CCT TTA TTT GCA ATC AGT G -3＇

限制位点PstⅠ和NotⅠ加有下划线。

将如上所述分离自地衣芽孢杆菌的染色体DNA作为模板按照实施例1的描述进行PCR反应。出现0．6kb大小的DNA片段表明基因区段被正确扩增。

PCR片段的亚克隆如实施例1所述进行，但用PstⅠ和NotⅠ消化纯化过的PCR片段。从过夜培养液中分离质粒DNA来对几个克隆进行分析。

将一个这样的阳性克隆在如上使用的琼脂平板上做几次划线，该克隆称为MB750。该克隆在TY-10μg／ml卡那霉素培养基中37℃生长过夜，第二天用Qiaprep Spin质粒微量制备试剂盒#27106，依照制造商对制备枯草芽孢杆菌质粒的建议，用1ml细胞来分离质粒。将这些DNA做测序，显示该DNA序列对应果胶酸裂解酶的成熟部分，即附录中SEQ ID NO：3中的85-666位碱基对。推测出来的蛋白质序列列在SEQ ID NO：4中。

发酵和纯化

将如上获得的克隆MB750在500ml带有双挡板的摇瓶内含有10 μg／ml卡那霉素的200ml BPX培养基中于37℃、300rpm生长5天。

用阳离子絮凝剂C521(10％溶液)和0．1％阴离子试剂A130进行絮凝：于室温下，边搅拌边向pH6．0的1300ml发酵培养基中同时加入10mlC521(10％)和20ml A130(0．1％)。使用Sorval RC 3B离心机于10，000rpm离心30分钟来分离絮凝物质。用MW截留量为10kDa的filtron超滤将液体浓缩至200 ml。用40％甘油将产物稳定后用于应用实验(批号#9845，含有193Trans Units／ml或者1．97mg活性果胶酸裂解酶／ml)。

用25mM醋酸钠缓冲液(pH5．5)平衡过的阳离子层析S-Sepharose柱子过柱，用NaCl梯度洗脱酶从而获得高纯度的酶，最后的纯化步骤是在Superdex 200柱子上于0．1M醋酸钠缓冲液中进行的大小层析。

鉴定

纯酶MW为22kDa，pI为6．2。

酶在pH10的最适温度(相对活性)为40℃。

在40℃时，在pH9．5和10．5之间的相对活性高于50％。

在pH6．0，酶的DSC给出伸展温度为61℃。

纯化的果胶酸裂解酶的氨基端有以下序列：AEVVHKTIV(始于SEQ IDNO：4之氨基酸序列的29位)。

该酶属于多糖裂解酶第3族。

实施例3

来自地衣芽孢杆菌的果胶裂解酶(Ⅲ)的克隆、表达、纯化和鉴定

克隆地衣芽孢杆菌果胶裂解酶编码基因

用以下两个寡核苷酸的PCR引物组对本发明所述果胶裂解酶编码DNA序列(SEQ ID NO：1)进行PCR扩增：Pect．upper． PstⅠ5＇-CAT AAA TCT GCA GCC GCG GCA GCA AAC GAA GAT TAT CCG GAA C -3＇Pect．lower．NotⅠ5＇-GAA AGG AAA AGC GGC CGC CAA ATA TTG AAA AGT GAG CGC AAT GTCG-3＇

限制位点PstⅠ和NotⅠ加有下划线。

将如上所述分离自地衣芽孢杆菌的染色体DNA作为模板按照实施例1的描述进行PCR反应。出现约1．5kb大小的DNA片段表明基因区段被正确扩增。

PCR片段的亚克隆

如实施例1所述进行亚克隆，但用PstⅠ和NotⅠ消化纯化过的PCR片段。通过从过夜培养液中分离质粒DNA来对几个克隆进行分析。

将一个这样的阳性克隆在如上使用的琼脂平板上做几次划线，该克隆称为MB588。使克隆MB588在TY-10 μg／ml卡那霉素培养基中37℃生长过夜，第二天用Qiaprep Spin质粒微量制备试剂盒#27106，依照制造商对制备枯草芽孢杆菌质粒的建议用1ml细胞来分离质粒。将这些DNA做测序，结果显示该DNA序列对应附录中DNA序列SEQ ID NO：1的果胶裂解酶的成熟部分，并对应附录中蛋白质序列SEQ ID NO：2的蛋白质序列。

发酵和纯化

将如上获得的克隆MB588在500ml带有双挡板的摇瓶内含有10μg／ml卡那霉素的25x 200ml BPX培养基中于37℃、300rpm生长5天。

用阳离子絮凝剂C521(10％溶液)和阴离子试剂A130的0．1％溶液进行絮凝：于室温，边搅拌边向pH6．0的2000ml发酵培养基中同时加入20mlC521(10％)和40ml A130。使用Sorval RC 3B离心机于10，000rpm离心30分钟来分离絮凝物质。用F号Whatman玻璃滤器将上清液澄清。

用MW截留为10kDa进行的filtron超滤将液体浓缩至300 ml，含有2，262，OOTrans Units on Pectin。滤液用醋酸调至pH5．5，并上样到用50mM醋酸钠缓冲液(pH5．5)平衡过的S-Sepharose柱子。利用NaCl梯度将结合的果胶裂解酶洗脱为纯蛋白质。

鉴定

纯酶MW为55kDa，pI为9．3。

在40℃时，相对活性在pH8．5和9．3之间高于50％(果胶在9．3以上不能稳定酯化)。

该酶属于多糖裂解酶第1族。

实施例4

构建和表达果胶酸裂解酶和CBD的融合蛋白质

用以下两个寡核苷酸的PCR引物组对来自热纤维梭茵菌株YS(PooleD M；Morag E；Lamed R；Bayer EA；Hazlewood GP；Gilbert HJ(1992)热纤维梭菌菌株YS的多纤维素酶体亚单位S1之纤维素结合域的鉴定，Fems微生物学快报78(2-3)：181-186)的CipB基因的CBD编码DNA序列进行做PCR扩增：CIPCBD．upper． PECL．SalⅠ5＇-CGA CAA TGT CGA CAA TGT AAA ATC AAT CGT CAA GCA AAA TGC CGGAGT CGG CAA AAT CCA GCG CAG ACC GCC AAC ACC GAC CCC GAC TTC ACCGCC AAG CGC AAA TAC ACC GGT ATC AGG CAA TTT G -3＇CIPCBD．lower．NotⅠ5＇-GCG TTG AGA CGC GCG GCC GCT ATA CCA CAC TGC CAC CGG GTT CTTTAC-3＇

限制位点SalⅠ和NotⅠ加有下划线。

按照Poole D M；Morag E；Lamed R；Bayer EA；Hazlewood GP；GilbertHJ(1992)热纤维梭菌菌株YS的多纤维素酶体亚单位S1之纤维素结合域的鉴定，Fems微生物学快报78(2-3)：181-186的描述获得编码CBD的染色体DNA。将编码CBD的DNA样品作为模板如实施例1的描述进行PCR反应。出现一个近似0．5kb大小的DNA片段表明该基因区段被正确扩增。

PCR片段的亚克隆

如实施例1所述进行亚克隆，但用SalⅠ和NotⅠ消化纯化过的PCR片段。通过从过夜培养液中分离质粒DNA来对几个克隆进行分析。

将一个这样的阳性克隆在如上使用的琼脂平板上做几次划线，该克隆称为MB914。使克隆MB914在TY-10 μg／ml卡那霉素培养基中37℃生长过夜，第二天用Qiaprep Spin质粒微量制备试剂盒#27106，依照制造商对制备枯草芽孢杆菌质粒的建议用1ml细胞来分离质粒。将这些DNA做测序，显示出有果胶酸裂解酶-接头-cbd融合蛋白质所对应的DNA序列(如SEQ ID NO：9所示)，蛋白质序列示于SEQ ID NO：10中。

表达和检测果胶酸裂解酶-接头-cbd融合蛋白质

使克隆MB914在TY培养基中37℃、250rpm生长20小时。取1ml无细胞上清液与200μl 10％Avicel (Merck，Darmstadt，Germany)的Millipore水溶液混匀。将混合物在0℃放置半小时。果胶酸裂解酶-接头-cbd融合蛋白质与Avicel结合后，将结合有蛋白质的Avicel在5000g旋转5分钟。将沉淀重悬于100 μl SDS-PAGE缓冲液中，于95℃煮沸5分钟，5000g旋转5分钟，取25 μl加入4-20％Laemmli Tris-Glycine，SDS-PAGE NOVEX胶(Novex，USA)上。在Xcell^TM Mini-Cell(Novex，USA)中按照制造商的建议将样品电泳，以下包括用考马斯蓝染色、脱色和干燥的所有凝胶处理步骤均按制造商的描述进行。

出现近似55kDa的蛋白质条带表明在枯草芽孢杆菌中表达了质粒pMB914上编码的果胶酸裂解酶-接头-cbd融合蛋白质。

实施例5

用果胶酸裂解酶处理纤维素类材料：

温度对果胶去除和吸湿力的影响

将100％棉斜纹机织物(脱浆实验织物#428U，代表典型的纤维素类材料)用包含实施例1的地衣芽孢杆茵果胶酸裂解酶的酶溶液(酶用量为9APSU／g织物)在pH9以液体比率15∶1进行处理。处理时间为2小时，温度在35-75℃之间。酶处理后将织物彻底冲洗，干燥然后用钌红染色。比色法测量染料的吸收，并作为纤维上残存的果胶的量度。将起始材料的染料吸收计作100％残存果胶，彻底化学法精练和漂白过的织物的染料吸收计作0％，由此计算残存果胶的百分比。结果示于表6。另外，测量吸湿性(滴落实验-测量一滴水被织物吸收需要的时间，以秒计)并与不含酶的对照进行比较。结果示于表7。

表6(％残存果胶)

温度℃	35	45	55	65	75
						不含酶	100	100	93	90	85
酶	52	40	32	28	26

-碱性精练通常留下20-25％的残存果胶

表7

温度℃	35	45	55	65	75
						不含酶	32	29	29	12	11
酶	15	10	7	5	3

-目标吸湿性通常＜5秒

两个反应中都可以清楚地看出升高温度的有益效果。

实施例6

用果胶酸裂解酶处理纤维素类材料：

pH对果胶去除的影响

将100％棉斜纹机织物(脱浆实验织物#428U，代表典型的纤维素类材料)用包含实施例1中的地衣芽孢杆菌果胶酸裂解酶的酶溶液(酶用量为9APSU／g织物)按液体比率15∶1进行处理。处理时间为2小时，温度为55℃，pH在8-11之间。酶处理后将织物彻底冲洗，干燥然后用钌红染色。比色法测量染料的吸收，并作为纤维上残存果胶的量度。将起始材料的染料吸收计作100％残存果胶，彻底化学精炼和漂白过的织物的染料吸收计作0％，由此计算残存果胶的百分比。结果示于表8。

表8

pH	8	9	10	10．5	11
						％残存果胶	35	32	30	48	61

发现酶的最适pH在9．5左右，但在非常宽的碱性区间都显示良好的活性。

实施例7

本发明的酶在洗涤剂中的应用

按照实施例1的描述获得的纯化酶(批号9751)在利用普通商品液体洗涤剂进行的微量洗涤实验中，以1ppm的含量检测时表现出清洁效果的提高。实验在常规北美洗涤条件下进行。

实施例8

糖酶对香蕉污渍的棉纺织品的效果

方法

将3个香蕉捣碎，在一台Ultra Turrax中用40ml水匀浆。将Style400 cotton (Testfabrics，Inc．)在该溶液中浸泡，在两个辊子间挤压并过夜干燥。

在商品液体洗涤剂(Ariel Futur)中于欧洲洗涤条件下洗涤染污的棉纺织品，分别向洗涤剂液体中加入0．1ppm、0．2ppm、1ppm和10ppm实施例1中的果胶酸裂解酶。重复实验。

结果

Ariel液体：香蕉污渍的去除％(100％是污溃被全部去除)

	实验A	实验B
			不含酶10ppm酶，exl1ppm酶，exl0．1ppm酶，exl	26％59％47％35％	32％58％48％34％

文献

Lever，M．(1972)“比色测定碳水化合物的一个新反应”，分析生物化学47：273-279。

N．C．Carpita和D．M．Gibeaut(1993)植物杂志3：1-30。

Diderichsen，BWedsted，UHedegaard，LJensen，B．RSjoholm，C．(1990)编码α-乙酰乳酸脱羧酶：来自短芽孢杆菌的胞外酶的aldB的克隆，细菌学杂志172：4315-4321。

Sakai等，“果胶、果胶酶和原果胶酶：制备、特性及应用”，应用微生物学进展39：213-294，1993。

序列表(1)一般资料：

(ⅰ)申请人：

(A)姓名：NOVO NORDISK A／S

(B)街道：Novo Alle

(C)城市：Bagsvaerd

(E)国家：丹麦

(F)邮政编码：DK-2880

(G)电话：+45 44 44 88 88

(H)传真：+45 44 44 88 88

(ⅱ)发明题目：地衣芽孢杆菌果胶降解酶

(ⅲ)序列数：10

(ⅴ)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC可兼容机

(C)操作系统：PC-DOS／MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1．0，Version#1．30(EPO)(2)SEQ ID NO：1的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：1485个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

(Ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：1：ATGAAACTGA TCAAAAACGC ATCTTTTATC ATTTCTTTTT TGGCTGCGGC CGGCATTTAT       60TTTTTATTAG GTACAGTCGC TGCTTCTGCG GCAAACGAAG ATTATCCGGA ACAGATGATC       120AGGCTGGAAA GCTCATCAGG CTTAAATATT ACGCCCGCCG GGAATCAAGA CAACGCACCG       180TTAACAGCAA AACAGACGAG CGGAGAAAAA GAAGAAAGAT GGAGGCTTGA TACGTCTGAC       240GGCAAACAAT TCAAAATCAG AAATATGGAT AGCGGCAAAA TTATCATCCC TGCCCATTAC       300GCACTGTCAG ACAATAATCC GGCTGTGGTC TACTATGACA ATTCACGGAA GGAAGAGTTG       360TGGAATATCA TCGGGGCCGA CAAAGACGGA AACGGAGATT TTATCACGTA TAAAATCGTC      420AGTGCACAAA ACAGCAGCCT TGCACTGACA CTGGACGGCA GCGGAGTGAA GCTTGCCAAA      480TATACGGGCA GCTCCGTCCA AAAGTGGAAG CTTCCAAGCG ACGGGCTCGA AGGTTTCGCA      540GGCTATGCAA GGGAAACGAA CGGCAAGCAG AAAACAGGCA CAACCGGCGG CCTGCTTGGA      600AAAGTCGTCT ATGTCAATAA TCTGGGCGAA CTGAAGGCCA ATATTGAAGA TTCAACGCCG      660CGCACGATTG TCGTCTCCAG CAATATCGGC GCTTCAGCCA AAACGGTATT AACGGTGGGC      720GCCAATAAAA CAATCATCGG CTCGTATGAA AAACATAAGC TGAATAACAT TTACTTTAAA      780ACAAAAGCGG ACTCTGGCAA CGTTATTTTC AAAAATCTGG TCATTGCACA TGATGCATCC      840ATAAATGAAA ACAATGACAT CCCTGTTTAC ATTACCGATT CGAGAAACTA CTGGATTGAC      900CATGTCACAT TCCAAGGCCA CAGCTATACG GCAAACGGCC ACGATCTCGA CAAGCTCTTA      960TACGTCGGCG CTAAAGCCGA TTACGTCACA CTGTCGCACA GCACATTCAC AGACCACAGG      1020TACGGCCTGA TTCTCGGCTG GCCTCAAGAT GACAAGCAAT ACCACAGTAT ATATAATGGC      1080TATCCGCGGA TGACAATCAG CCACAATCGC TTTGAGAATC TCTATGTCAG GGCGCCCGGG      1140TTGATGCGTT ACGGCTATTA TCACGTGAAA AGCAATTATA TCAACAATTA CCACCTTGGC      1200TTCACGATTA CGACATTGGC GAAAATATAT TCTGAAGCCA ATTACTTCGG CACGGGCAAT      1260GAGAAAGGCA TACTGGATGA TTACGGAGAC GGCGCGTTTA AAGATGTCGG GTCATATCCG      1320GCGATAAAGG GGCAGAAATC GCCTGAGACA AGCTGGACAC CTTCATCCAA CTACAGCTAT      1380CGGACGATGA AGGCCGGCAA TGCCAAAGCT TTTGCCAAAC GGTACGCAGG TGCGCAGCGC      1440ACCGCTCTGT ACTATGCGAA TTACAGCCAG TTTAAAAAAG ACTAA                      1485(2)SEQ ID NO：2的资料：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：494个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(Ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Lys Leu Ile Lys Asn Ala Ser Phe Ile Ile Ser Phe Leu Ala Ala1               5                   10                   15Ala Gly Ile Tyr Phe Leu Leu Gly Thr Val Ala Ala Ser Ala Ala Asn20                   25                  30Glu Asp Tyr Pro Glu Gln Met Ile Arg Leu Glu Ser Ser Ser Gly Leu35                 40                   45Ash Ile Thr Pro Ala Gly Asn Gln Asp Asn Ala Pro Leu Thr Ala Lys50                 55                   60Gln Thr Ser Gly Glu Lys Glu Glu Arg Trp Arg Leu Asp Thr Ser Asp65                  70                 75                   80Gly Lys Gln Phe Lys Ile Arg Asn Met Asp Ser Gly Lys IIe Ile Ile85                   90                  95Pro Ala His Tyr A la Leu Ser Asp Asn Asn Pro Ala Val Val Tyr Tyr100                  105                  110Asp Asn Ser Arg Lys Glu Glu Leu Trp Asn Ile Ile Gly Ala Asp Lys115                 120                 125Asp Gly Asn Gly Asp Phe Ile Thr Tyr Lys Ile val Ser Ala Gln Asn130                135                 140Ser Ser Leu Ala Leu Thr Leu Asp Gly Ser Gly Val Lys Leu Ala Lys145                150                  155                 160Tyr Thr Gly Ser Ser Val Gln Lys Trp Lys Leu Pro Ser Asp Gly Leu165                  170                 175Glu Gly Phe Ala Gly Tyr Ala Arg Glu Thr Asn Gly Lys Gln Lys Thr180                  185                 190Gly Thr Thr Gly Gly Leu Leu Gly Lys Val Val Tyr Val Asn Asn Leu195                 200                  205Gly Glu Leu Lys Ala Asn Ile Glu Asp Sar Thr Pro Arg Thr Ile Val210                 215                  220Val Ser Ser Asn Ile Gly Ala Ser Ala Lys Thr Val Leu Thr Val Gly225               230                    235                240Ala Asn Lys Thr Ile Ile Gly Ser Tyr Glu Lys His Lys Leu Asn Asn245                 250                  255Ile Tyr Phe Lys Thr Lys Ala Asp Ser Gly Asn Val Ile Phe Lys Asn260                 265                  270Leu Val Ile Ala His Asp Ala Sar Ile Asn Glu Asn Asn Asp Ile Pro275                 280                  285Val Tyr Ile Thr Asp Ser Arg Asn Tyr Trp Ile Asp His Val Thr Phe290                 295                 300Gln Gly His Ser Tyr Thr Ala Asn Gly His Asp Leu Asp Lys Leu Leu305                 310                 315                 320Tyr Val Gly Ala Lys Ala Asp Tyr Val Thr Leu Ser His Ser Thr Phe325                  330                 335Thr Asp His Arg Tyr Gly Leu Ile Leu Gly Trp Pro Gln Asp Asp Lys340                   345                 350Gln Tyr His Ser Ile Tyr Ash Gly Tyr Pro Arg Met Thr Ile Ser His355                  360                  365Asn Arg Phe Glu Asn Leu Tyr Val Arg Ala Pro Gly Leu Met Arg Tyr370                  375                 380Gly Tyr Tyr His Val Lys Ser Asn Tyr Ile Asn Asn Tyr His Leu Gly385                390                  395                 400Phe Thr Ile Thr Thr Leu Ala Lys Ile Tyr Ser Glu Ala Asn Tyr Phe405                 410                 415Gly Thr Gly Asn Glu Lys Gly Ile Leu Asp Asp Tyr Gly Asp Gly Ala420                 425                 430Phe Lys Asp Val Gly Ser Tyr Pro Ala Ile Lys Gly Gln Lys Ser Pro435                 440                 445Glu Thr Ser Trp Thr Pro Ser Ser Asn Tyr Ser Tyr Arg Thr Met Lys450                 455                 460Ala Gly Asn Ala Lys Ala Phe Ala Lys Arg Tyr Ala Gly Ala Gln Arg465               470                   475                  480Thr Ala Leu Tyr Tyr Ala Asn Tyr Ser Gln Phe Lys Lys Asp485                  490(2)SEQ ID NO：3的资料：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：666个碱基对

(B)类型：核酸

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(A)长度：1248个碱基对

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(A)长度：415个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

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(A)长度：1026个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(Ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：7：ATGAAGAAAT TAATCAGCAT CATCTTTATC TTTGTATTAG GGGTTGTCGG GTCATTGACA               60GCGGCGGTTT CGGCAGAAGC AGCTTCTGCC TTAAACTCGG GCAAAGTAAA TCCGCTTGCC               120GACTTCAGCT TAAAAGGCTT TGCCGCACTA AACGGCGGAA CAACGGGCGG AGAAGGCGGT               180CAGACGGTAA CCGTAACAAC GGGAGATCAG CTGATTGCGG CATTAAAAAA TAAGAATGCA               240AATACGCCTT TAAAAATTTA TGTCAACGGC ACCATTACAA CATCAAATAC ATCCGCATCA               300AAGATTGACG TCAAAGACGT GTCAAACGTA TCGATTGTCG GATCAGGGAC CAAAGGGGAA               360CTCAAAGGGA TCGGCATCAA AATATGGCGG GCCAACAACA TCATCATCCG CAACTTGAAA               420ATTCACGAGG TCGCCTCAGG CGATAAAGAC GCGATCGGCA TTGAAGGCCC TTCTAAAAAC               480ATTTGGGTTG ATCATAATGA GCTTTACCAC AGCCTGAACG TTGACAAAGA TTACTATGAC               540GGATTATTTG ACGTCAAAAG AGATGCGGAA TATATTACAT TCTCTTGGAA CTATGTGCAC               600GATGGATGGA AATCAATGCT GATGGGTTCA TCGGACAGCG ATAATTACAA CAGGACGATT               660ACATTCCATC ATAACTGGTT TGAGAATCTG AATTCGCGTG TGCCGTCATT CCGTTTCGGA               720GAAGGCCATA TTTACAACAA CTATTTCAAT AAAATCATCG ACAGCGGAAT TAATTCGAGG               780ATGGGCGCGC GCATCAGAAT TGAGAACAAC CTCTTTGAAA ACGCCAAAGA TCCGATTGTC               840TCTTGGTACA GCAGTTCACC GGGCTATTGG CATGTATCCA ACAACAAATT TGTAAACTCT               900AGGGGCAGTA TGCCGACTAC CTCTACTACA ACCTATAATC CGCCATACAG CTACTCACTC               960GACAATGTCG ACAATGTAAA ATCAATCGTC AAGCAAAATG CCGGAGTCGG CAAAATCAAT               1020CCATAA                                                                          1026(2)SEQ ID NO：8的资料：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：341个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(Ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：8：Met Lys Lys Leu Ile Ser Ile Ile Phe Ile Phe Val Leu Gly Val Val1                5                   10                  15Gly Ser Leu Thr Ala Ala Val Ser Ala Glu Ala Ala Ser Ala Leu Asn20                  25                  30Ser Gly Lys Val Asn Pro Leu Ala Asp Phe Ser Leu Lys Gly Phe Ala35                  40                   45Ala Leu Asn Gly Gly Thr Thr Gly Gly Glu Gly Gly Gln Thr Val Thr50                 55                    60Val Thr Thr Gly Asp Gln Leu Ile Ala Ala Leu Lys Asn Lys Asn Ala65                  70                   75                  80Asn Thr Pro Leu Lys Ile Tyr Val Asn Gly Thr Ile Thr Thr Ser Asn85                  90                  95Thr Ser Ala Ser Lys Ile Asp Val Lys Asp Val Ser Asn Val Ser Ile100                  105                 110Val Gly Ser Gly Thr Lys Gly Glu Leu Lys Gly Ile Gly Ile Lys Ile115                  120                 125Trp Arg Ala Asn Asn Ile Ile Ile Arg Asn Leu Lys Ile His Glu Val130                 135                  140Ala Ser Gly Asp Lys Asp Ala Ile Gly Ile Glu Gly Pro Ser Lys Asn145                150                  155                 160Ile Trp Val Asp His Asn Glu Leu Tyr His Ser Leu Asn Val Asp Lys165                 170                  175Asp Tyr Tyr Asp Gly Leu Phe Asp Val Lys Arg Asp Ala Glu Tyr Ile180                  185                 190Thr Phe Ser Trp Asn Tyr Val His Asp Gly Trp Lys Ser Met Leu Met195                 200                  205Gly Ser Ser Asp Ser Asp Asn Tyr Asn Arg Thr Ile Thr Phe His His210                 215                 220Asn Trp Phe Glu Asn Leu Asn Ser Arg Val Pro Ser Phe Arg Phe Gly225                 230                    235              240Glu Gly His Ile Tyr Asn Asn Tyr Phe Asn Lys Ile Ile Asp Ser Gly245                     250                 255Ile Asn Ser Arg Met Gly Ala Arg Ile Arg Ile Glu Asn Asn Leu Phe260                     265                  270Glu Asn Ala Lys Asp Pro Ile Val Ser Trp Tyr Ser Ser Ser Pro Gly275                 280                  285Tyr Trp His Val Ser Asn Asn Lys Phe Val Asn Ser Arg Gly Ser Met290                295                  300Pro Thr Thr Ser Thr Thr Thr Tyr Asn Pro Pro Tyr Ser Tyr Ser Leu305                310                  315                 320Asp Asn Val Asp Asn Val Lys Ser Ile val Lys Gln Asn Ala Gly Va1325                 330                 335Gly Lys Ile Asn Pro340(2)SEQ ID NO：9的资料：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：1482个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(Ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：9：GCTTCTGCCT TAAACTCGGG CAAAGTAAAT CCGCTTGCCG ACTTCAGCTT AAAAGGCTTT               60GCCGCACTAA ACGGCGGAAC AACGGGCGGA GAAGGCGGTC AGACGGTAAC CGTAACAACG               120GGAGATCAGC TGATTGCGGC ATTAAAAAAT AAGAATGCAA ATACGCCTTT AAAAATTTAT               180GTCAACGGCA CCATTACAAC ATCAAATACA TCCGCATCAA AGATTGACGT CAAAGACGTG               240TCAAACGTAT CGATTGTCGG ATCAGGGACC AAAGGGGAAC TCAAAGGGAT CGGCATCAAA               300ATATGGCGGG CCAACAACAT CATCATCCGC AACTTGAAAA TTCACGAGGT CGCCTCAGGC               360GATAAAGACG CGATCGGCAT TGAAGGCCCT TCTAAAAACA TTTGGGTTGA TCATAATGAG               420CTTTACCACA GCCTGAACGT TGACAAAGAT TACTATGACG GATTATTTGA CGTCAAAAGA               480GATGCGGAAT ATATTACATT CTCTTGGAAC TATGTGCACG ATGGATGGAA ATCAATGCTG               540ATGGGTTCAT CGGACAGCGA TAATTACAAC AGGACGATTA CATTCCATCA TAACTGGTTT               600GAGAATCTGA ATTCGCGTGT GCCGTCATTC CGTTTCGGAG AAGGCCATAT TTACAACAAC               660TATTTCAATA AAATCATCGA CAGCGGAATT AATTCGAGGA TGGGCGCGCG CATCAGAATT               720GAGAACAACC TCTTTGAAAA CGCCAAAGAT CCGATTGTCT CTTGGTACAG CAGTTCACCG               780GGCTATTGGC ATGTATCCAA CAACAAATTT GTAAACTCTA GGGGCAGTAT GCCGACTACC               840TCTACTACAA CCTATAATCC GCCATACAGC TACTCACTCG ACAATGTCGA CAATGTAAAA               900TCAATCGTCA AGCAAAATGC CGGAGTCGGC AAAATCCAGC GCAGACCGCC AACACCGACC             960CCGACTTCAC CGCCAAGCGC AAATACACCG GTATCAGGCA ATTTGAAGGT TGAATTCTAC             1020AACAGCAATC CTTCAGATAC TACTAACTCA ATCAATCCTC AGTTCAAGGT TACTAATACC             1080GGAAGCAGTG CAATTGATTT GTCCAAACTC ACATTGAGAT ATTATTATAC AGTAGACGGA             1140CAGAAAGATC AGACCTTCTG GTGTGACCAT GCTGCAATAA TCGGCAGTAA CGGCAGCTAC             1200AACGGAATTA CTTCAAATGT AAAAGGAACA TTTGTAAAAA TGAGTTCCTC AACAAATAAC             1260GCAGACACCT ACCTTGAAAT AAGCTTTACA GGCGGAACTC TTGAACCGGG TGCACATGTT             1320CAGATACAAG GTAGATTTGC AAAGAATGAC TGGAGTAACT ATACACAGTC AAATGACTAC             1380TCATTCAAGT CTCGTTCACA GTTTGTTGAA TGGGATCAGG TAACAGCATA CTTGAACGGT             1440GTTCTTGTAT GGGGTAAAGA ACCCGGTGGC AGTGTAGTAT AG                                1482(2)SEQ ID NO：10的资料：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：493个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(Ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：10：Ala Ser Ala Leu Asn Ser Gly Lys Val Asn Pro Leu Ala Asp Phe Ser1                5                  10                   15Leu Lys Gly Phe Ala Ala Leu Asn Gly Gly Thr Thr Gly Gly Glu Gly20                 25                   30Gly Gln Thr Val Thr Val Thr Thr Gly Asp Gln Leu Ile Ala Ala Leu35                 40                   45Lys Asn Lys Asn Ala Asn Thr Pro Leu Lys Ile Tyr Val Asn Gly Thr50                  55                   60Ile Thr Thr Ser Asn Thr Ser Ala Ser Lys Ile Asp Val Lys Asp Val65                  70                  75                   80Ser Asn Val Ser Ile Val Gly Ser Gly Thr Lys Gly Glu Leu Lys Gly85                  90                   95Ile Gly Ile Lys Ile Trp Arg Ala Asn Asn Ile Ile Ile Arg Asn Leu100                 105                  110Lys Ile His Glu Val Ala Ser Gly Asp Lys Asp Ala Ile Gly Ile Glu115                 120                 125Gly Pro Sar Lys Asn Ile Trp Val Asp His Asn Glu Leu Tyr His Ser130                135                  140Leu Asn Val Asp Lys Asp Tyr Tyr Asp Gly Leu Phe Asp Val Lys Arg145                150                 155                  160Asp Ala Glu Tyr Ile Thr Phe Ser Trp Asn Tyr Val His Asp Gly Trp165                 170                      175Lys Ser Met Leu Met Gly Ser Ser Asp Ser Asp Asn Tyr Asn Arg Thr180                 185                 190Ile Thr Phe His His Asn Trp Phe Glu Asn Leu Asn Ser Arg Val Pro195                 200                 205Ser Phe Arg Phe Gly Glu Gly His Ile Tyr Asn Asn Tyr Phe Asn Lys210                 215                 220Ile Ile Asp Ser Gly Ile Asn Ser Arg Met Gly Ala Arg Ile Arg Ile225                230                  235                 240Glu Asn Asn Leu Phe Glu Asn Ala Lys Asp Pro Ile Val Ser Trp Tyr245                 250                 255Ser Ser Ser Pro Gly Tyr Trp His Val Ser Asn Asn Lys Phe Val Asn260                  265                 270Ser Arg Gly Ser Met Pro Thr Thr Ser Thr Thr Thr Tyr Asn Pro Pro275                  280                 285Tyr Ser Tyr Ser Leu Asp Asn Val Asp Asn Val Lys Ser Ile Val Lys290                 295                 300Gln Asn Ala Gly Val Gly Lys Ile Gln Arg Arg Pro Pro Thr Pro Thr305                    310                    315          320Pro Thr Ser Pro Pro Ser Ala Asn Thr Pro Val Ser Gly Asn Leu Lys325                 330                  335Val Glu Phe Tyr Asn Ser Asn Pro Ser Asp Thr Thr Asn Ser Ile Asn340                 345                  350Pro Gln Phe Lys Val Thr Asn Thr Gly Ser Ser Ala Ile Asp Leu Ser355                 360                 365Lys Leu Thr Leu Arg Tyr Tyr Tyr Thr Val Asp Gly Gln Lys Asp Gln370                 375                  380Thr Phe Trp Cys Asp His Ala Ala Ile Ile Gly Ser Asn Gly Sar Tyr385                 390                 395                 400Asn Gly Ile Thr Ser Asn Val Lys Gly Thr Phe Val Lys Met Ser Ser405                  410                 415Ser Thr Asn Asn Ala Asp Thr Tyr Leu Glu Ile Ser Phe Thr Gly Gly420                  425                 430Thr Leu Glu Pro Gly Ala His Val Gln Ile Gln Gly Arg Phe Ala Lys435                 440                 445Asn Asp Trp Ser Asn Tyr Thr Gln Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Lys Ser450                 455                 460Arg Ser Gln Phe Val Glu Trp Asp Gln val Thr Ala Tyr Leu Asn Gly465                 470                 475                480Val Leu Val Trp Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Val Val485                490

Claims (28)

1．一种基本上由果胶降解酶组成的酶制品，所述酶来源于地衣芽孢杆菌ATCC14580或是该菌的内源酶，或者来源于与地衣芽孢杆菌基于16SrDNA序列比对有至少99％同源的芽孢杆菌菌种，或是这些菌种的内源酶。

2．权利要求1的酶制品，其中所述果胶降解酶在pH8以上具有最佳活性，优选在pH9以上具有最佳活性。

3．权利要求1的酶制品，其中所述果胶降解酶选自果胶酸裂解酶(EC4．2．2．2)、果胶裂解酶(EC4．2．2．10)和多聚半乳糖醛酸酶(EC3．2．1．15)。

4．一种果胶酸裂解酶，它是

ⅰ)由地衣芽孢杆菌ATCC14580产生的多肽，或者

ⅱ)包含SEQ ID NO：8中28-341位所示氨基酸序列的多肽，或者

ⅲ)ⅰ)或ⅱ)中限定的多肽的类似物，其与所述多肽至少45％同源；或者

ⅳ)经取代、缺失或添加1或几个氨基酸而衍生自所述多肽，条件是保留233和238位的精氨酸，并且衍生的多肽与所述多肽至少42％同源，或者

ⅴ)与针对纯化形式的所述多肽产生的多克隆抗体有免疫反应性。

5．一种编码具有果胶酸裂解酶活性之多肽的分离的多核苷酸分子，其选自：

(a)包含SEQ ID NO：7中82到1026位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；

(b)编码与SEQ ID NO：8中28到341位氨基酸残基之序列至少70％相同的多肽的多核苷酸分子；或

(c)(a)或(b)的简并核苷酸序列。

6．一种果胶酸裂解酶，它是

ⅰ)由地衣芽孢杆茵ATCC14580产生的多肽，或者

ⅱ)包含SEQ ID NO：4中28-221位所示氨基酸序列的多肽，或

ⅲ)ⅰ)或ⅱ)中限定的多肽的类似物，其与所述多肽至少60％同源；或者

ⅳ)经取代、缺失或添加1或几个氨基酸而衍生自所述多肽，条件是保留133和155位的赖氨酸及158位的精氨酸，并且衍生的多肽与SEQ IDNO：4中60-158位至少66％同源，或者

ⅴ)与针对纯化形式的所述多肽产生的多克隆抗体有免疫反应性。

7．一种编码具有果胶酸裂解酶活性之多肽的分离的多核苷酸分子，其选自：

(a)包含SEQ ID NO：3中82到666位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；

(b)编码与SEQ ID NO：4中28到221位氨基酸残基之序列有至少70％相同的多肽的多核苷酸分子；或

(c)(a)或(b)的简并核苷酸序列。

8．一种果胶裂解酶，它是

ⅰ)由地衣芽孢杆菌ATCC14580产生的多肽，或者

ⅱ)包含SEQ ID NO：2中31-494位所示氨基酸序列的多肽，或者

ⅲ)ⅰ)或ⅱ)中限定的多肽的类似物，其与所述多肽至少60％同源；或者

ⅳ)经取代、缺失或添加1或几个氨基酸而衍生自所述多肽，条件是保留对应于SEQ ID NO：2中377和383位的精氨酸，并且衍生的多肽与所述多肽至少60％同源，或者

ⅴ)与针对纯化形式的所述多肽产生的多克隆抗体有免疫反应性。

9．一种编码具有果胶裂解酶活性之多肽的分离的多核苷酸分子，其选自：

(a)包含SEQ ID NO：1中91到1395位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；

(b)编码与SEQ ID NO：2中31到494位氨基酸残基之序列至少70％相同的多肽的多核苷酸分子；或

(c)(a)或(b)的简并核苷酸序列。

10．一种多聚半乳糖醛酸酶，它是

ⅰ)由地衣芽孢杆茵ATCC14580产生的多肽，或者

ⅱ)包含SEQ ID NO：6中1-415位所示氨基酸序列的多肽，或者

ⅲ)ⅰ)或ⅱ)中限定的多肽的类似物，其与所述多肽至少40％同源；或者经取代、缺失或添加1或几个氨基酸而衍生自所述多肽；或者与针对纯化形式的所述多肽产生的多克隆抗体有免疫反应性。

11．一种编码具有多聚半乳糖醛酸酶活性之多肽的分离的多核酸分子，其选自：

(a)包含SEQ ID NO：5中1到1248位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；

(b)编码与SEQ ID NO：6中1到415位氨基酸残基之序列至少40％相同的多肽的多核苷酸分子；或

(c)(a)或(b)的简并核苷酸序列。

12．权利要求5、7、9或11的分离多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子是DNA。

13．一种表达载体，其中包含下列可操纵地连接在一起的元件：转录启动子；DNA片段，其选自(a)编码具有果胶酸裂解酶活性之多肽，包含SEQ ID NO：7中1到1026位核苷酸所示核苷酸序列，或SEQ ID NO：3中82到666位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子，(b)编码具有果胶酸裂解酶活性、并与SEQ ID NO：8中28到341位氨基酸残基之序列或与SEQ ID NO：4中1到221位氨基酸残基之序列至少70％相同的多肽的多核苷酸分子，(c)编码具有果胶裂解酶活性之多肽，包含SEQ ID NO：1中91到1485位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子，(d)编码具有果胶裂解酶活性、并与SEQ ID NO：2中31到494位氨基酸残基之序列至少70％相同的多肽的多核苷酸分子，(e)编码具有多聚半乳糖醛酸酶活性之多肽，并包含SEQ ID NO：5中1到1248位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；(f)编码具有多聚半乳糖醛酸酶活性、并与SEQ ID NO：6中1到415位氨基酸残基之序列至少70％相同的多肽的多核苷酸分子，或者(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的简并核苷酸序列；以及转录终止子。

14．导入了权利要求12的表达载体的培养细胞，其中所述细胞表达该DNA片段编码的多肽。

15．一种分离的多肽，其选自下组：

(a)具有果胶酸裂解酶活性、包含SEQ ID NO：8中28到341位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽分子；

(b)具有果胶酸裂解酶活性、与SEQ ID NO：8中28到341位氨基酸残基所示氨基酸序列至少70％相同的多肽分子；

(c)具有果胶酸裂解酶活性、包含SEQ ID NO：4中1到221位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽分子；

(d)具有果胶酸裂解酶活性、与SEQ ID NO：4中1到221位氨基酸残基所示氨基酸序列至少70％相同的多肽分子；

(e)具有果胶裂解酶活性、包含SEQ ID NO：2中31到494位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽分子；

(f)具有果胶裂解酶活性、与SEQ ID NO：2中31到494位氨基酸残基所示氨基酸序列至少70％相同的多肽分子；

(g)具有多聚半乳糖醛酸酶活性、包含SEQ ID NO：6中1到415位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽分子；

(h)具有多聚半乳糖醛酸酶活性、与SEQ ID NO：6中1到415位氨基酸残基所示氨基酸序列至少70％相同的多肽分子；以及

(i)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)和(h)的物种同系物。

16．一种酶制品，其中包含纯化的权利要求15所述多肽。

17．一种制备具有果胶降解活性的多肽的方法，该方法包括培养其中已导入权利要求13的表达载体的细胞，从而所述细胞表达该DNA片段所编码的多肽；以及回收多肽。

18．一种具有果胶降解活性的分离的酶，其特征在于该酶(ⅰ)不含同源杂质，并且(ⅱ)由权利要求16或17的方法产生。

19．权利要求1或16的制品，其中还包含一或多种选自下组的酶：蛋白酶、纤维素酶(内切葡聚糖酶)、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、脂酶、过氧化物酶、漆酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、角质酶、果胶酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质素酶、支链淀粉酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、半乳聚糖酶、果胶裂解酶、其他果胶酸裂解酶、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶；或者这些酶的混合物。

20．一种洗涤剂组合物，其中包含权利要求1或16所述酶制品，或者权利要求4、6、8或10所述酶，以及表面活性剂。

21．一种清洁硬表面的方法，包括用含有权利要求1或16所述酶制品，或者权利要求4、6、8或10所述酶的清洁溶液处理硬表面。

22．一种机械处理织物的方法，该方法包括在机洗工序中的一个洗涤循环中用含有权利要求1或16所述酶制品，或者权利要求4、6、8或10所述酶的洗涤溶液处理织物。

23．一种改善纤维素纤维、纱线、机织或非机织织物特性的方法，该方法中用有效量的权利要求1或16所述酶制品，或者权利要求4、6、8或10所述酶处理纤维、纱线或织物。

24．权利要求23的方法，其中所述酶制品或酶用于精练工艺步骤。

25．一种降解或改变植物材料的方法，该方法中用有效量的权利要求1或16所述制品，或者权利要求4、6、8或10所述酶处理植物材料。

26．权利要求25的方法，其中所述植物材料是循环废纸、机械造纸纸浆或者进行浸解处理的纤维。

27．一种制备动物饲料的方法，其中将有效量的权利要求1或16的酶制品，或者权利要求4、6、8或10的酶作为动物饲料添加剂加入普通动物饲料成分中。

28．一种加工酒类或果汁的方法，其中用有效量的权利要求1或16的酶制品，或者权利要求4、6、8或10的酶处理酒类或果汁。