CN102037122A - 果胶分解酶在水果和蔬菜糊状物的处理中的用途及其酶序列 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种或多种果胶分解酶在水果或蔬菜糊状物的处理中的用途，以及包括加入一种或多种果胶分解酶的步骤的用于水果或蔬菜糊状物的酶处理的方法，其中至少一种果胶分解酶可从里氏木霉获得，以及涉及包括用于水果或蔬菜糊状物的酶处理的方法的用于水果或蔬菜汁的制备的方法。此外，本发明公开了编码具有内切多聚半乳糖醛酸酶活性的多肽、具有外切多聚半乳糖醛酸酶活性的多肽、具有外切鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶活性的多肽和具有木半乳糖醛酸聚糖酶活性的多肽的重组DNA分子。

Description

果胶分解酶在水果和蔬菜糊状物的处理中的用途及其酶序列

本发明涉及具有果胶分解活性的果胶分解酶或多肽在水果或蔬菜糊状物处理中的用途。本发明还涉及果胶分解酶在水果或蔬菜汁的制备中的用途。至少一种酶可从里氏木霉(Trichoderma reesei)获得。此外，本发明涉及具有适合于水果或蔬菜糊状物的处理的果胶分解活性的多肽序列以及编码所述多肽序列的多核苷酸。具体而言，本发明涉及来自里氏木霉的多聚半乳糖醛酸酶在水果或蔬菜糊状物，尤其是苹果糊状物的处理中的用途，以及所述酶在水果或蔬菜汁，尤其是苹果汁的制备中的用途。

果胶聚合物是植物细胞壁的重要成分。果胶是水果或蔬菜胞间层(lamella)和细胞壁的主要结构多糖。水果或蔬菜的纹理取决于果胶的数量和特性。一般，未成熟水果包含不溶性原果胶，而成熟水果包含较多可溶性果胶。果胶是具有由交替的同型半乳糖醛酸聚糖(平滑区)和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(毛状区)组成的主链的杂多糖。平滑区是1，4-连接的α-D-半乳糖醛酸的线性聚合物。半乳糖醛酸残基可以在羧基上被甲酯化。

水果包含在成熟过程中和成熟后参与天然离析过程的果胶分解酶。工业果胶酶用于加工饲料和食物中的水果和蔬菜。为了水解果胶和在压榨水果或蔬菜时增加汁液、降低粘度以能够浓缩浑浊汁液或为了澄清汁液而完全降解果胶和将汁液浓缩，在工业方法中将酶用于例如水果或蔬菜加工。

可以通过压榨操作或通过液化方法产生水果和蔬菜汁，尤其是用苹果制成的汁。两种方法都得到使用果胶水解酶的支持。一般，在压榨前碾碎整个水果并用果胶分解酶处理，以松弛细胞壁和促进汁液的自由流动。压榨后，通常加热汁液，灭活汁液中的所有酶。然后将汁液转移至澄清池，于其中向汁液加入其他酶，以在过滤前脱果胶(depectinize)和水解淀粉。然后在随后的汁液的巴氏灭菌过程中或在浓缩过程中在蒸发器中灭活酶。例如，在苹果汁的产生中，好的压榨结果需要糊状物的某种结构。引起所谓的不溶性果胶的降解或离析的果胶酶是不利的，因为它们增加汁液中的固体。若该结构被完全破坏，则获得所谓的苹果酱效应且压榨后汁液非常浑浊。果胶酶初步作用于可溶性果胶，从而导致汁液测定的较低粘度和非常易于流走。在酱(puree)的制备中优选离析特性。

在现有技术中，已经通过使用包含平滑区和毛状区果胶酶的果胶分解酶来制备水果糊状物/水果汁。“平滑区”果胶酶包含果胶酯酶(或果胶甲酯酶)、多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂合酶(或果胶反式消除酶)。“毛状区”果胶酶主要包含内切阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、阿拉伯半乳聚糖酶等。两类酶都存在于衍生自黑曲霉(Aspergillus niger)的标准果胶酶制剂中。在现有技术方法中，因不建议搅拌，在压碎苹果的过程中加入果胶酶以达到酶在糊状物中的适合的分布。30-120分钟的保留时间后，通过卧式或压带式系统压榨糊状物。过滤所获得的汁液以分离粗粒子。然后在真空蒸发器中进行汁液的巴氏杀菌或香精解吸(essence-stripped)。再冷却至约48-52℃后，进行汁液处理以脱果胶和降解淀粉。该处理进行约1-2小时，然后进行过滤方法，即超滤。

由“平滑区”和“毛状区”果胶酶组成的现有技术的果胶酶制剂(果胶酶组合物)不适合用于所描述的这类压榨方法，因为它们液化糊状物和引起汁液中固体量高。特异性多聚半乳糖醛酸酶与高果胶酯酶组合的专一性应用提供更好的压榨结果，即更短的压榨周期、更高的压榨产率和汁液中更低的固体量。此外，汁液包含更少的残留果胶或无残留果胶，其改进随后的脱果胶和过滤。

在加工澄清汁液时，需要称为“脱果胶”的第二次加工步骤，其中通常使用“平滑区”和“毛状区”果胶酶二者。原则上，为了达到最佳的超滤方法，有必要降解所有存在的高分子量物质(主要是果胶、淀粉等)。在它们在更高温度的性能或所获得的汁液的质量方面，现有技术方法中使用的果胶酶不能令人满意。

目前不可得到在更高温度(＞60℃)有活性的果胶酶。此外，目前不能令人满意地得到用于在压榨后直接产生澄清汁液而无残留果胶的糊状物处理的果胶酶。从现有技术已知果胶分解酶。曲霉属(Aspergillus)果胶酶公开于例如WO 94/14952和WO 94/14966中。Carbohydrate Research 338(2003)，515-524描述了隶属于糖基水解酶家族28的两种里氏木霉(ATCC 26920)多聚半乳糖醛酸酶同种型的分离和表征。根据其pH和温度特性表征该酶。未描述所述多聚半乳糖醛酸酶的具体用途。

因此，在温度特性和该方法的进行方面更易于操作方面，现有技术中已存在对适合用于水果或蔬菜糊状物处理的果胶分解酶的需要。

因此，本发明的目的是提供改进的用于水果或蔬菜汁的制备的方法。具体而言，本发明的目的是提供改进的用于水果或蔬菜糊状物的制备的方法。按照最终所获得的汁液，本发明的方法将导致更好的产率和质量。此外，本发明的方法将可在宽的温度范围内实施，且当在高温实施该方法时还将导致好的结果。本发明的方法将改进糊状物的可提取性或可降解性和从而改进其压榨容量。它将导致压榨后具有低残留果胶含量的汁液，即将改进所获得的汁液的清澈性，从而避免费力的过滤。本发明的方法将适合用于不同水果。

本发明的另一个目的是提供编码果胶分解酶的基因以及提供具有适合于上述方法的果胶分解活性的多肽的序列。具体而言，本发明的序列将编码果胶分解酶，其具有宽的应用范围并导致糊状物的处理和水果或蔬菜汁的制备的方法中的改进。

现已令人惊奇地发现，来自里氏木霉的果胶酶在水果或蔬菜糊状物的处理中，且尤其是在来自包含可溶性或低酯化果胶的水果的糊状物的处理中显示优良的性能。具体而言，已发现里氏木霉多聚半乳糖醛酸酶(PGA1)在苹果糊状物处理中显示优良的性能。已令人惊奇地发现，可将里氏木霉多聚半乳糖醛酸酶(PGA1)作为唯一的酶用于来自包含可溶性或低酯化果胶的水果的糊状物的处理，且该方法可有利地在提高的温度进行。还已发现，里氏木霉多聚半乳糖醛酸酶PGA1可以有利地与其他果胶分解酶如果胶甲酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶裂合酶、果胶酸裂合酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、内切阿拉伯聚糖酶或鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶组合使用，以改进甚至来自具有高酯化或不可溶性果胶的水果的水果糊状物的处理，由此必须在与所使用的酶相容的温度进行该方法。

本发明涉及一种或多种果胶分解酶在水果或蔬菜糊状物的处理中的用途，其中至少一种果胶分解酶可从里氏木霉获得。具体而言，本发明涉及来自里氏木霉的多聚半乳糖醛酸酶在苹果糊状物的处理中的用途。此外，本发明涉及包括加入一种或多种果胶分解酶的步骤的用于水果或蔬菜糊状物的酶处理的方法，以及包括所述用于水果或蔬菜糊状物的酶处理的方法用于水果或蔬菜汁的制备的方法，其中至少一种果胶分解酶可从里氏木霉获得。具体而言，本发明涉及用于苹果糊状物的酶处理的方法，其中使用具有SEQ ID NO：2的来自里氏木霉的多聚半乳糖醛酸酶。

此外，本发明涉及在原核或真核宿主细胞中表达时编码具有内多切聚半乳糖醛酸酶活性的多肽的重组DNA分子，所述重组DNA分子包含选自以下的DNA序列：a)具有或包含SEQ ID NO：1(pga1)的DNA序列；b)在严格条件下与a)的DNA序列杂交的DNA序列；c)与a)的序列具有70％-98％的同一性程度的DNA序列；或d)由于遗传密码的简并性而与a)、b)或c)的序列相关的DNA序列。

此外，本发明涉及在原核或真核宿主细胞中表达时编码具有外切多聚半乳糖醛酸酶活性的多肽的重组DNA分子。该重组DNA分子包含选自以下的DNA序列：a)具有或包含SEQ ID NO：3(pgx1)的DNA序列；b)在严格条件下与a)的DNA序列杂交的DNA序列；c)与a)的序列具有60％-98％的同一性程度的DNA序列；或d)由于遗传密码的简并性而与a)、b)或c)的序列相关的DNA序列。

此外，本发明涉及在原核或真核宿主细胞中表达时编码具有外切鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶活性的多肽的重组DNA分子，该重组DNA分子包含选自以下的DNA序列：a)具有或包含SEQ ID NO：5(rgx1)的DNA序列；b)在严格条件下与a)的DNA序列杂交的DNA序列；c)与a)的序列具有60％-98％的同一性程度的DNA序列；或d)由于遗传密码的简并性而与a)、b)或c)的序列相关的DNA序列。

本发明还涉及在原核或真核宿主细胞中表达时编码具有木半乳糖醛酸聚糖酶活性的多肽的重组DNA分子，该重组DNA分子包含选自以下的DNA序列：a)具有或包含SEQ ID NO：7(xga1)的DNA序列；b)在严格条件下与a)的DNA序列杂交的DNA序列；c)与a)的序列具有60％-98％的同一性程度的DNA序列；或d)由于遗传密码的简并性而与a)、b)或c)的序列相关的DNA序列。

本发明还涉及具有果胶分解活性且包含选自以下的氨基酸序列的多肽：a)包含与PGAI多肽的序列(SEQ ID NO：2)具有至少77％同一性、优选至少80％同一性、更优选至少85％同一性、还更优选至少90％同一性、还更优选至少95％同一性和还更优选至少98％同一性的氨基酸序列的多肽；b)包含具有果胶分解活性的片段的a)的变体；和c)具有果胶分解活性的a)或b)的片段。

本发明还涉及具有外切多聚半乳糖醛酸酶、外切鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶或木半乳糖醛酸聚糖酶活性且包含选自以下的氨基酸序列的多肽：a)包含与多肽SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的序列具有至少60％同一性、优选至少70％同一性、更优选至少80％同一性、还更优选至少90％同一性和还更优选至少95％同一性的氨基酸序列的多肽；和b)a)的变体。

为了本发明的目的，术语“果胶分解酶”将包含果胶酶、果胶酯酶(或果胶甲酯酶)、多聚半乳糖醛酸酶、果胶裂合酶(或果胶反式消除酶)、果胶酸裂合酶(或果胶酸反式消除酶)、阿拉伯呋喃糖苷酶、内切阿拉伯聚糖酶或鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶。

制备本发明的水果或蔬菜糊状物时，首先压碎所讨论的水果或蔬菜，然后用本发明的果胶分解酶处理糊状物，然后压榨糊状物和从而对所获得的汁液任选地进行巴氏杀菌和任选地用果胶分解酶和/或用适合用于该方法的进行的其他酶进一步处理。关于这一点，在该方法在较高温度的总体进行方面应考虑到待使用的其他酶的温度特征。

在压碎过程中或压碎之后以本领域中的常用量直接加入果胶分解酶。优选的应用是使用由在1-5％溶液中的50,000-100,000PGU/mg组成的果胶酶制剂。建议的酶剂量是50-100g/t水果。建议的反应温度是10-30℃，反应时间是30-120分钟。糊状物的平均pH是3.2-3.6。

可以以方便的和与该方法的进行相容的任意形式加入果胶分解酶。

优选将果胶分解酶作为浓缩或稀释的液体溶液加入。

优选地，该果胶分解酶是具有序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8之一的果胶分解酶。最优选的是具有SEQID NO：2的来自里氏木霉的多聚半乳糖醛酸酶。

上述方法适合用于任意水果或蔬菜糊状物的处理。适合的水果选自苹果、梨、葡萄、白葡萄、红葡萄、浆果和李子。该方法适合用于在低温(例如10-30℃)加工的水果和在高温(例如50℃)加工的水果二者。适合的蔬菜选自胡萝卜和西红柿。其他可加工的材料可以包含咖啡或可可豆和胡椒。

水果糊状物是苹果糊状物且所使用的酶是来自里氏木霉的多聚半乳糖醛酸酶时获得最有利的结果。水果糊状物是来自包含低酯化和可溶性果胶的水果如草莓或李子的糊状物时获得尤其有利的结果。已发现在这种情况下，通过木霉属(Trichoderma)PGA1作为单一酶的使用可以获得高产率和高质量的汁液。在包含高度酯化和/或不可溶性果胶的水果的情况下，在制备对应汁液的方法中使用其他果胶分解酶可以是必要的。

本发明还涉及来自里氏木霉的新的果胶分解酶的DNA和蛋白质序列。那些序列是内切多聚半乳糖醛酸酶(pga1)、外切多聚半乳糖醛酸酶(pgx1)、外切鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶(rgx1)和木半乳糖醛酸聚糖酶(xga1)。序列作为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8在所附序列表中给出。

本发明还包含所述DNA序列的变体和衍生物，只要它们编码具有所要求的活性的多肽。本发明尤其包含在严格条件下杂交至各序列的DNA序列。严格条件的实例是于65℃在硫酸葡聚糖溶液(GenescreenPlus，Dupont)中杂交18小时，漂洗滤膜30分钟，先用6x SSC洗、用2x SSC洗两次、用3x SSC洗3次、用0.1％SDS洗和然后用0.2x SSC于65℃洗(膜转移和检测方法，Amersham)。

优选地，本发明涉及与pga1的序列(SEQ ID NO：1)具有至少70％、优选至少80％、更优选至少85％、还更优选至少90％、还更优选至少95％、还更优选至少98％的同一性程度的多核苷酸。

优选地，本发明涉及与选自pgx1(SEQ ID NO：3)、rgx1(SEQ ID NO：5)和xga1(SEQ ID NO：7)的序列之一具有至少60％、优选至少70％、更优选至少75％、还更优选至少80％、还更优选至少85％、还更优选至少90％、还更优选至少95％和还更优选至少98％的同一性程度的多核苷酸。

此外，本发明涉及由于遗传密码的简并性而与本发明的序列相关的DNA序列以及它们的所有等位变体。遗传密码的简并性可以产生自天然简并性或尤其是产生自密码子的选择使用。可以通过使用公知的分子生物学技术，如聚合酶链反应(PCR)或杂交技术鉴定天然存在的等位变体。

可以用编码本发明的多肽的DNA序列转化任意宿主细胞，如真菌、酵母、细菌、植物或哺乳动物的细胞。

优选通过检测参与比较并在另一序列中具有“适当的”对应物的较短序列的残基数来测定同一性程度。在这方面，同源性定义为同一性程度。为了本发明的目的，优选通过使用标准算法以通常方式测定同一性。根据本发明，仅使用各蛋白质的cDNA进行比较，并利用已知的计算机程序将相似的、优选同一的序列对应物测定为同源序列。这种程序的实例是Clone Manager Suite，其是包含程序部分Align Part的程序，由Scientific & Educational Software，Durham，NC，USA出售。在选项“局部比对”下，该程序通过使用FastScan-MaxScore法或Needleman-Wunsch法和通过保留默认值来进行如上文所定义的两条DNA序列的比较。根据本发明，尤其使用包含功能“Compare Two Sequences/Global/Compare DNA sequences”的程序版本“Clone Manager 7 Align Plus 5”来确定同一性程度。在这种情况下，使用可从以下来源获得的算法：Hirschberg，D.S.(1975)A linear space algorithm for computing longest common subsequences，Commun.Assoc.Comput.Mach.18：341-343；Myers，E.W.和W.Miller.(1988)Optimal alignments in linear space，CABIOS 4：1，11-17；Chao，K-M，W.R.Pearson和W.Miller.(1992)Aligning two sequences within a specified diagonal band，CA-BIOS 8：5，481-487。

所克隆的基因序列的表达导致所希望的蛋白质的产生，或导致该蛋白质的片段的产生。该表达可以在转化的细胞中以连续的方式或以受控的方式发生。

片段理解为长度足以具有所希望的酶特性或编码所述的果胶分解多肽或其生物学活性片段的多肽或核酸分子的部分。优选地，片段序列是无信号序列的各成熟多肽序列。

本发明还涉及具有与以上多肽序列SEQ ID NO：2、4、6或8或其片段或它的部分具有至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、还更优选至少90％和最优选至少95％的同一性程度的序列的多肽，只要该多肽保留各自的果胶分解活性。优选地，本发明涉及与PGA1多肽(SEQ ID NO：2)的序列具有至少77％、优选至少80％、更优选至少85％、还更优选至少90％、还更优选至少95％和还更优选至少98％的同一性程度的多肽。

本文中所用的术语多肽的“同一性”指相互比较的两条氨基酸序列之间从由对应基因编码的第一个氨基酸至最后一个氨基酸的总体同一性。通过用以下参数使用在EMBOSS(European Molecular Biology Open Software Suite；Rice等，2000)程序包3.0.0版上的Needleman-Wunsch总体比对程序测量全长序列的同一性：EMBLOSUM62，空位罚分10.0，延伸罚分0.5。该算法描述于Needleman和Wunsch(1970)Journal of Molecular Biology 48，443-453中。

术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可以互换。具有内切多聚半乳糖醛酸酶、外切多聚半乳糖醛酸酶、外切鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶或木半乳糖醛酸聚糖酶活性的多肽或酶指根据本领域所建立的测定法具有所述活性的酶。本发明还包含所述酶的变体，只要它们保留其原有活性。本发明的变体包括通过对天然蛋白质N端和/或C端的一个或多个氨基酸的缺失或添加、对天然蛋白质中一个或多个位点的一个或多个氨基酸的缺失或添加或对该酶中一个或多个位点的一个或多个氨基酸的置换所衍生的多肽变体。这类变体的产生一般为本领域技术人员公知。多肽的氨基酸序列的变体可以例如通过DNA中的突变产生。诱变的方法和核苷酸序列中的改变为本领域技术人员公知(参见例如Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：488(1985)；Kunkel等，Methods in Enzymol.，154：367(1987)；美国专利号4,873,192；Walker和Gaastra，编辑，Techniques in Molecular Biology，Mac Millan Publishing Company，纽约(1983))。有关对蛋白质的重要生物学活性无负面影响的适合的氨基酸置换的参考文献可以见于来自Dayhoff等，Atlas of Protein Sequence and Structure，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.(1978)的模型。优选保守置换，如通过具有相似特性的另一个氨基酸交换一个氨基酸。

可在组内互换的这种氨基酸列于但不限于下表。

本发明还涉及分离的或基本上纯化的核酸制剂(组合物)或蛋白质制剂(组合物)。在这方面，分离的和纯化的多核苷酸/多肽或其片段指从其天然环境分离的多核苷酸或多肽或其片段。分离的多核酸或多肽的片段可以存在于纯化的形式中或可以存在于非天然环境中，如转基因宿主细胞中。

本发明还涉及可以用来将编码本发明的果胶分解酶的可读框引入宿主细胞的表达盒。它们优选包括连接至所希望的DNA序列的可读框的具有转录起始区的启动子。这种表达盒可以包含多种限制性切割位点用于可读框和/或其他DNA例如转录调节区和/或选择标记基因的插入。在转录的5’→3’方向上，该表达盒包含具有转录和翻译起始区的启动子、所希望的DNA序列和翻译和转录终止区。这种表达盒在微生物细胞中是功能性的。终止区可以是该启动子或所讨论的DNA天然的或可以衍生自任意不同来源。

术语“可读框”(ORF)指编码序列的翻译起始密码子和终止密码子之间编码的氨基酸序列。术语“起始密码子”和“终止密码子”指编码序列中三个连续核苷酸(密码子)的单位，其指定蛋白质合成(mRNA翻译)的链起始和链终止。

在核酸这一点上，“功能性连接”指化合物作为相同核酸分子的部分在适当位置并且具有与该分子的转录起始适当的取向。功能性连接至启动子的DNA处于该启动子的转录起始调节之下。编码序列可以以有义取向或反义取向功能性连接至调节序列。对于多肽，“功能性连接”指作为相同多肽的部分的连接，即利用肽键。

根据本发明可以使用任意启动子。通常，关于编码序列，启动子指核苷酸序列的上游，其通过RNA聚合酶的识别和进行正确转录必需的其他因子控制编码序列的表达。本发明所使用的启动子可以包括最小启动子，即来自TATA框和其他序列的短DNA序列，所述其他序列指定转录起始位点，其中调节元件与所述转录起始位点结合进行表达。

本发明的启动子还可以包括含有最小启动子和调节元件的核苷酸序列；该最小启动子可以检验编码序列或功能性RNA的表达。

本发明还涉及包含本发明的DNA的载体。这些载体包括双链或单链、线性或环状形式的任意质粒、粘粒、噬菌体和其他载体；这些载体自身可以传递或转移，且可以通过整合入细胞基因组转化原核或真核宿主或它们存在于染色体外(例如具有复制起点的自主复制质粒)。

本发明可以使用的载体的构建由于前述公开内容(参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory manual(第二版，冷泉港实验室出版社，Plainview，纽约(1989))而为技术人员已知。本发明的表达盒可以包含一个或多个限制酶切割位点，以插入在调节序列的调节下编码果胶分解酶的核苷酸序列。该表达盒还可以包含功能性连接至多核苷酸的终止信号，以及多核苷酸正确翻译必需的调节序列。

选择适当的表达载体取决于宿主细胞。酵母或真菌的表达载体可以包含复制起点、适当的启动子和增强子以及任意必需的核糖体结合位点、多聚腺苷化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和非转录的5’侧翼序列。

适当的宿主细胞的实例是：曲霉属、根霉属(Rhizopus)、木霉属、肉座菌属(Hypocrea)、脉孢霉属(Neurospora)、毛霉属(Mucor)、青霉属(Penicillium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、毁丝霉属(Myceliophthora)、镰孢霉属(Fusarium)等属的真菌细胞，如克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、丝孢酵母属(Trichosporon)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)和该种类的其他属的酵母。适当的宿主系统是例如：如曲霉属(例如黑曲霉(ATCC 9142)、无花果曲霉(Aspergillus ficuum)(NRLL 3135))或木霉属(例如里氏木霉QM6a及其衍生物)的真菌和如酵母属(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))或毕赤酵母属(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))或汉逊酵母属(例如多形汉逊酵母(H.polymorpha)(DSMZ 70277))的酵母。可以从公认的保藏机构获得这类微生物，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS)[皇家荷兰生物科技研究所培养物保藏中心]或Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)[德意志微生物保藏中心]或任意其他保藏机构。

除特殊启动子的使用外，其他类型的元件也可以影响所克隆的基因的表达。尤其是已显示内含子具有增强基因表达的潜能。

表达盒还可以包含其他元件，如可以通过内源或外源元件如锌指蛋白质(包含天然存在的锌指蛋白质或嵌合锌指蛋白质)调节的元件。

本发明所使用的表达盒还可以包含增强子元件或上游启动子元件。

可以以这样的方式构建本发明使用的载体使其包含增强子元件。因此，本发明的构建体包括与作为终止转录和允许如此获得的mRNA的多聚腺苷化的信号的3’DNA序列一起的目的基因。可以使用使得可能从所选择的宿主生物分泌的任意信号序列。最优选的用于从丝状真菌分泌的信号序列是来自黑曲霉的葡糖淀粉酶(glaA)或肌醇六磷酸酶信号序列、来自米曲霉(A.oryzae)的TAKA淀粉酶信号序列和来自里氏木霉的纤维二糖水解酶I信号序列，或衍生自这些信号序列的信号序列。备选地，可以使用所希望的蛋白质的信号序列。

还可能使用特殊的前导序列，因为转录起始位点和编码序列的起点之间的DNA序列(即非翻译的前导序列)可以影响基因表达。优选的前导序列包含控制所连接的基因的最佳表达的序列，即它们具有提高或保持mRNA稳定性并避免不适当的翻译起始的优选的共有前导序列。此类序列的选择是本领域技术人员公知的。

一旦获得本发明的表达盒或DNA序列，就可以利用已知的方法将其插入载体，以在适当的宿主系统中过量表达所编码的多肽。但是，也可以用DNA序列本身转化本发明的适当的宿主系统，以获得所编码的多肽的过量表达。

一旦本发明的DNA序列在适合的培养基中在适当的宿主细胞中表达，就可以通过已知方法或者从培养基(若该酶分泌至培养基中)或者从宿主生物(若该酶存在于细胞内或周质空间中)浓缩和/或分离所编码的酶。分离培养基的生物量和固体的已知方法后接着浓缩酶的方法可以用来产生浓缩酶溶液或作为用于该酶的脱水制剂。

本发明还涉及包含本发明的多肽的制剂。一般，这些制剂是液体或干燥的。液体制剂优选包括纯化或富集形式的酶。但是，可以加入佐剂如具有丙三醇、山梨醇或丙二醇、硼酸盐的稳定剂、添加剂如盐类、糖、防腐剂、用于调节pH值的工具等。通常的液体制剂是含水或含油的悬液。如在本文中所使用，“酶制剂”指包含至少一种本发明的果胶分解酶的任意酶产品。因此，这种酶制剂可以是用过的培养基或滤液。用过的培养基指包含所产生的酶的宿主的培养基。优选地，在产生后从所述培养基分离宿主细胞。如果希望，这类制剂可以喷雾干燥、粒化或冻干或可以浓缩和/或稳定该制剂用于保存。如果需要，可以按照常规方法进一步纯化所希望的酶，如提取、沉淀、层析、电泳等。

但是，本发明的优势是可以将具有宿主细胞或无宿主细胞的培养基不经进一步纯化即如此用作酶制剂，因为本发明的果胶分解酶可以分泌入培养基并在用过的培养基的环境条件中显示活性。提供和使用这类酶制剂非常经济，因为不必从培养基分离具体的酶。

除果胶分解酶外，酶制剂可以包含一种或多种其他酶，其可以是例如其他纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、半纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶和/或氧化酶如漆酶和过氧化物酶。

除果胶分解酶外，酶制剂可以包含添加剂如稳定剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂和/或培养基成分。优选的添加剂是这样的添加剂，其常用于预期用于使用酶制剂的应用的酶制剂中。

干燥制剂可以包括冷冻干燥制剂、喷雾干燥制剂、速溶制剂、颗粒制剂或挤出制剂，其可以仅包含酶或具有添加剂如淀粉、糊精、糖、面粉、蛋白质或油。

附图将更详细地阐述本发明。

图1.为了过量产生果胶酶蛋白质而在里氏木霉原生质体的转化中使用的表达盒的示意图。果胶酶基因处于里氏木霉cbh1(cel7A)启动子(pcbh1)的控制下并通过使用里氏木霉cbh1终止子序列(t cbh1)来确保转录的终止。包含amdS基因或pyr4基因作为转化选择标记。

图2A-C)在各种pH值(40℃，60分钟)测定的现有技术曲霉属PG1(2A)、曲霉属PG2(2B)和本发明的过量产生的粗制木霉属PGA1制剂(2C)的pH依赖性。

图2D-F)在各种温度(2D和2E pH 4.5，2F pH 5.0，60分钟)测定的现有技术曲霉属PG1(2D)、曲霉属PG2(2E)和本发明的过量产生的粗制木霉属PGA1制剂(2F)的温度依赖性。

图3.里氏木霉PGA1蛋白质的SDS-PAGE分析。MW：分子量标记，泳道1：实施例3中所述的过量产生木霉属PGA1的转化体的培养物上清液。通过用考马斯亮蓝染色显现蛋白质带。木霉属PGA1的大小是大约38kDa。

图4.A)压榨酶处理的苹果糊状物制剂后的汁液产率。在实验中使用100ppm剂量的混合物，该混合物包含均添加2000PE单位/克的黑曲霉果胶甲酯酶的50 000PG单位/毫克的木霉属PGA1(F050183和F050200)或现有技术的曲霉属PG1(参考)。在糊状物试验之一中未加入酶(空白)。酶孵育时间是在25℃孵育60分钟。

B)显示每一压榨步骤后的汁液产率的压榨图。

图5.酶处理和压榨后汁液的浊度(测量为NTU)。在实验中使用100ppm剂量的混合物，该混合物包含均添加2000PE单位/克的黑曲霉果胶甲酯酶的50 000PG单位/毫克的木霉属PGA1(F050183和F050200)或现有技术的曲霉属PG1(参考)。在糊状物试验之一中未加入酶(空白)。酶孵育时间是在25℃孵育60分钟。

图6.酶处理和压榨后的样品汁液的照片。样品从左至右：空白(无酶)、F050183、F050200和作为参考的现有技术曲霉属PG1。

图7.用里氏木霉PGA1处理后从不同水果/蔬菜糊状物的压榨获得的汁液的产率(％)。

包含质粒pALK1958(RF 6249)的大肠杆菌(E.coli)菌株于2006年7月19日保藏于德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，Germany并分配保藏号DSM18450。pALK1958在克隆入经类似切割的pBluescript II SK+载体的1690bp的SacII-XhoI片段(包含基因3′区的305bp)上携带木霉属pga1基因(表2)。

以下非限制性实施例旨在详细说明本发明的主题。

实施例1：里氏木霉果胶分解酶的全基因组筛选

在DNA(质粒、DNA片段)的分离和酶处理、大肠杆菌转化等中使用标准分子生物学方法。所使用的基本方法描述于标准的分子生物学手册中，例如Sambrook等(1989).Molecular cloning，a laboratory manual.冷泉港实验室，纽约，美国和Sambrook和Russell(2001).Molecular cloning，a laboratory manual.冷泉港实验室，纽约，美国。

通过使用tBlastn程序(Altschul等，1990.Basic local alignment search tool.J.Mol.Biol.215：403-410)，用各种曲霉属果胶酶的序列(表1)检索里氏木霉(Hypocrea jecorina的无性型)基因组数据库(http://gsphere.lanl.gov/trire1/trire1.home.html)。

仅用黑曲霉内切多聚半乳糖醛酸酶、塔宾曲霉(A.tubingensis)外切多聚半乳糖醛酸酶、黑曲霉推定的外切鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶和塔宾曲霉内切木半乳糖醛酸聚糖酶检索产生具有显著相似性(在其全长的至少80％内低于e-20)的命中，这导致四个不同可读框(表2)的鉴定。这些序列的完整编码区获自http://gsphere.lanl.gov/trire1/trire1.home.html。

表1.用于里氏木霉基因组数据库挖掘的曲霉属果胶酶基因序列。

表2.从里氏木霉基因组数据库鉴定的推定的果胶酶编码基因

用InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/，Apweiler等，2000Bioinformatics 16(12)：1145-50)对所产生的蛋白质序列的分析将它们鉴定为糖苷水解酶家族28(GH28；InterPro检索号PF00295)的成员。推定的来自里氏木霉的果胶酶编码序列都显示与来自涉及果胶降解的其他真菌的酶最接近的同源性(Blastp检索，Altschul等，1990.Basic local alignment search tool.J.Mol.Biol.215：403-410，表2)，并因此命名为pga1(内切多聚半乳糖醛酸酶)、pgx1(外切多聚半乳糖醛酸酶)、xga1(木半乳糖醛酸聚糖酶)和rgx1(外切鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶)。通过系统发生方法(Mega 3.1，Kumar等，2004MEGA3：Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment.Briefings in Bioinformatics.5：150-163)进一步验证了该鉴定。系统树的三个“非内切多聚半乳糖醛酸酶”部分从而形成四个分支。PGX1见于还包含已经表征过的来自黑曲霉、塔宾曲霉和炭色旋孢腔菌(Cochliobolus carbonum)的外切多聚半乳糖醛酸酶的分支中。XGA1最类似于小分支，其中塔宾曲霉木半乳糖醛酸聚糖水解酶是唯一表征的酶。XGA1与该分支中的其他序列具有比这些序列彼此显示的相似性低的相似性，因此里氏木霉酶可能已发展出一些独特特征。相同的情况适用于RGX1，其与推定的外切鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶显示最高程度的序列同一性。在对应的分支中，仅已经关于其功能性测试了来自黑曲霉的酶而未测定精确的反应机制(Martens-Uzunova，E.S.，Zandleven，J.S.，Benen，J.A.，Awad，H.，Kools，H.J.，Beldman，G.，Voragen，A.G.，Van den Berg，J.A.& Schaap，P.J.(2006)A new group of exo-acting family 28 glycoside hydrolases of Aspergillus niger that are involved in pectin degradation，Biochem J.400，43-52)。

实施例2：所鉴定的里氏木霉果胶酶基因的克隆

用具有2mM MgCl₂和0.4μM表3中所示的序列特异性引物的GoTaq

系统(Promega，美国)从里氏木霉基因组DNA扩增pga1、pgx1、rgx1和xga1基因。PCR反应的条件如下：在95℃2分钟的起始变性步骤，然后在95℃1分钟、在引物特异的温度(表3-TP)退火45秒、在72℃延伸2分钟的28个循环和最后在72℃延伸5分钟。分离预期大小的DNA片段，然后克隆至pBlueScript II SK+载体(Stratagene，美国)。通过测序表征插入序列。

表3.用来扩增里氏木霉果胶酶基因的引物。将里氏木霉QM9414的基因组DNA用作PCR反应中的模板。显示了包含扩增的基因片段的质粒的名称。

^(a用来扩增里氏木霉果胶酶基因的退火温度。

^(b由两个质粒组成的全长rgx1基因的编码区。

关于果胶酶基因和推断的蛋白质序列的相关信息分别总结在表4和表5中。

表4：里氏木霉果胶酶基因的总结。

^(a包含终止密码子。

^(b不包含终止密码子。

表5：推断的里氏木霉果胶酶序列的总结。

^(a用程序SignalP V3.0(Nielsen等，1997.Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites.Protein Engineering 10：1-6；Bendtsen等，2004.Improved prediction of signal peptides：SignalP 3.0.J.Mol.Biol.340：783-795)进行关于信号序列(ss)的预测；用神经网络获得NN值，并用隐蔽马尔科夫模型(hidden Markov model)获得HMM值。

^(b不包含预测的信号序列。用ExPASy服务器上的Compute pI/MW工具(Gasteiger等，2003.ExPASy：the proteiomics server for in-depth protein knowledge and analysis.Nucleic Acids Res.31：3784-3788)进行预测。

^(c序列N-X-S/T的数目。

^(d在删除两条可能的信号序列后计算为RGXI所标记的值。

还在里氏木霉PGAI、PGXI和XGAI中鉴定了报道为对黑曲霉内切多聚半乳糖醛酸酶II的催化作用重要的氨基酸残基(van Santen等，1999.1.68-A crystal structure of endopolygalacturonase II from Aspergillus niger and identification of active site residues by site-directed mutagenesis.J.Biol.Chem.274：30474-30480；Armand等，2000.The active site topology of Aspergillus niger endopolygalacturonase II as studied by site-directed mutagenesis.J Biol Chem.275：691-696)。这表明里氏木霉果胶酶与黑曲霉果胶酶相似的催化特性。除GH28糖苷水解酶典型的活性部位标签外，PGAI、PGXI和XGAI还包含一些PbH1(平行β螺旋重复)结构域，其也见于一些类型的果胶分解酶(Jenkins & Pickersgill，2001.The architecture of parallel beta-helices and related folds.Prog Biophys Mol Biol.77：111-175.)中。该发现进一步确认了本文所示里氏木霉基因的果胶分解特征。

实施例3：果胶酶基因在里氏木霉中的过量表达

构建表达质粒用于里氏木霉果胶酶基因的过量表达。所构建的表达质粒在表6中列出。将包含其自身信号序列的pga1、pgx1、rgx1和xga1基因精确融合至里氏木霉cbh1(cel7A)启动子。通过里氏木霉cel7A终止子确保转录终止，并按Paloheimo等(2003)High-yield production of a bacterial xylanase in the filamentous fungus Trichoderma reesei requires a carrier polypeptide with an intact domain structure.Appl.Env.Microbiol.69：7073-7082中所述用构巢曲霉amdS标记基因进行转化体的筛选。NotI消化后从载体主链分离线性表达盒(图1)并转化入里氏木霉RF5455原生质体(编码两种主要的纤维素酶CBHI/Cel7A和EGII/Cel5A的基因被缺失的菌株)。

还通过将里氏木霉pyr4基因座的4.7kb的XbaI-HindIII基因组片段连接至质粒中cel7A终止子之后，为pga1基因构建了包含内源pyr4标记基因的表达质粒。NotI消化后从载体主链分离线性表达盒并转化入里氏木霉RF5514原生质体(菌株的编码两种主要的纤维素酶CBHI/Cel7A和EGII/Cel5A的基因缺失且还是嘧啶营养缺陷型的)。

选择乙酰胺作为唯一氮源(amdS标记基因)或无尿苷补充(pyr4标记基因)，按具有Karhunen等(1993，High frequency one-step gene replacement in Trichoderma reesei.I.Endoglucanase I overproduction.Mol.Gen.Genet.241：515-522)中所述的修改的

等(1987，A versatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei.Gene 61：155-164)中的方法进行转化。将转化体在PD上进行孢子形成之前，通过单个分生孢子在筛选平板上纯化转化体。

表6.构建来在里氏木霉中过量产生果胶酶蛋白质的表达盒。表达盒的总体结构如图1中所描述。将所克隆的pga1、pgx1、rgx1和xga1基因精确融合至里氏木霉cbh1/cel7A启动子。

^(a通过使用NotI消化从载体主链分离用于里氏木霉转化的表达盒。

^(b终止密码子之后的基因组cbh1终止子区的核苷酸数目。切割基因组基因片段中使用的3′端限制酶位点包含于括号中。

^(c构建了pga1基因的两个表达质粒；pALK1967质粒包含amdS标记基因用于转化体筛选，pALK1960包含pyr4标记基因。

从摇瓶培养(50ml)的培养物上清液分析转化体的果胶酶产生。将转化体在用5％KH₂PO₄缓冲的复合的基于乳糖的纤维素酶诱导培养基(Joutsjoki等1993.Transformation of Trichoderma reesei with the Hormoconis resinae glucoamylase P(gamP)gene：production of a heterologous glucoamylase by Trichoderma reesei.Curr.Genet.24：223-228)中培养7天。按专利EP0388593中所述，用柑桔果胶(哥本哈根果胶X-2955，丹麦)为底物，通过黏度测定法测定多聚半乳糖醛酸酶活性。一个多聚半乳糖醛酸酶活性单位(PGU)定义为在标准条件下引起15nPas^-1的黏度降低的酶量。通过使用DNA印迹确认所选择的转化体的基因型，其中包含几种基因组消化液并用各自的表达盒作为探针。通过SDS-PAGE后进行考马斯亮蓝染色来分析PGAI、PGXI、RGXI和XGAI蛋白质的过量表达。PGAI蛋白质在里氏木霉中显著地过量产生(见图3)，而未检测到PGXI、RGXI和XGAI转化体的PGU活性或在SDS-PAGE中可见的蛋白质过量产生，但这些转化体显示包含整合的表达盒。这表明里氏木霉中产生极低量的PGXI、RGXI和XGAI蛋白质。

将所选择的PGAI转化体在实验室生物反应器中于28℃在上文所示培养基中控制pH为4.4±0.2(NH₃/H₃PO₄)培养3-4天，以获得用于应用测试的材料。通过离心并经Seitz-K 150和EK滤器(Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH，Bad Kreuznach，德国)过滤回收上清液。以相同的酶谱(PGA1+++，CBHI-，EGII-)产生了两种制剂。用RF5514衍生的转化体产生F050183，用RF5455衍生的转化体产生F050200；前者用pyr4标记筛选，后者用amdS标记筛选。因此前一菌株仅携带同源DNA。

实施例4：里氏木霉PGAI酶的表征

按照最适pH和热稳定性表征粗制的里氏木霉PGAI酶。

通过将0.1M的柠檬酸和0.2M的Na₂HPO₄(均补充100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)(Fluka，目录号05470))混合至所希望的pH制备样品缓冲液，在3.0-8.0的pH范围内测定过量产生的里氏木霉PGAI蛋白质(样品F050183)的pH依赖性。以60分钟的孵育在所希望的pH测定活性。图2A-C显示了结果。曲霉属酶具有约4.5的最适pH，而木霉属PGA1具有在pH 5.0的轻微偏中性的最适pH。木霉属PGA1在pH 5.5仍保留约70％活性，曲霉属PG1在该pH仅保留最大活性的30％。曲霉属PG2在pH 5.5丧失其活性。

在40℃-75℃的范围内在pH 5.0测定过量产生的木霉属PGAI蛋白质(样品F050183)的温度依赖性，并与在它们的最适pH 4.5测定的现有技术曲霉属PG1和PG2比较。令人惊奇地，木霉属PGA1具有在约65℃的高的最适温度，且在70℃仍具有最大活性的60％，而曲霉属酶在65℃基本上无活性保留(图2D-F)，且具有其约50℃的最适温度(比木霉属PGA1低约15℃)。

用于PG活性的比色法

对于pH依赖性测定，测定在底物和样品缓冲液的所希望的pH于40℃进行60分钟。对于温度依赖性测定，对曲霉属样品(’13和’22)在pH 4.5，对里氏木霉PGA1样品在pH 5.0进行测定。测定在所希望的温度进行60分钟。

底物：0.7％(w/v)果胶酸钾(Fluka，目录号51186)。将0.7g底物溶解于100ml热水中。冷却至室温后用醋酸或氢氧化钠调节pH值。

酶溶液：将酶稀释于样品缓冲液中。

PAHBAH试剂：

贮存液(5％)：将50g 98％的对羟基苯酰肼(Fluka，目录号54600)溶解于1000ml 0.5M盐酸中。

工作液：将0.233g Titriplex III溶解于30ml 0.5M氢氧化钠中。

加入5ml贮存液并用0.5M NaOH补充至50ml。

测定体积：

底物：0.25ml

酶：0.1ml  

PAHBAH：0.65ml

颜色孵育的温度：80℃

颜色孵育的时间：15分钟

样品值：

将底物吸入测试管。通过加入酶溶液起始反应。混合批次并在40℃孵育60分钟。孵育后通过加入PAHBAH试剂终止反应。将样品在80℃孵育15分钟进行颜色产生。然后将样品在冰浴中冷却约5分钟并离心(2分钟，13000转/分)。在412nm针对空白样品对上清液进行光度测量。

空白：

混合底物和PAHBAH试剂。加入酶溶液后将样品在40℃孵育60分钟，然后在80℃孵育15分钟进行颜色产生。关于样品值进行冷却、离心和光度测量。

实施例5：苹果汁的制备

在苹果汁制备中测试无细胞的培养物上清液。为了此目的，研磨苹果(品种金冠(Golden Delicious))，并将500g产生的苹果糊状物用于实验中。加入酶后将糊状物在室温(25℃)孵育60分钟，然后用实验室压榨机(Hafico)压榨糊状物。压榨程序分别是于50、100、150和200巴2分钟，然后于300和400巴1分钟。

将两种木霉属PGA1制剂F050183(里氏木霉RF5514/pALK1960/#4)和F050200(里氏木霉RF5455/pALK1967/#4)与包含曲霉属PGI的现有技术产品(参考样品)比较。三种样品均补充曲霉属果胶甲酯酶。按上文和专利EP0388593中所述，用柑桔果胶(哥本哈根果胶X-2955，丹麦)为底物，通过黏度测定法测定多聚半乳糖醛酸酶活性。1多聚半乳糖醛酸酶活性单位(PGU)定义为在标准条件下引起15nPas^-1的黏度降低的酶量。在实验中使用100ppm剂量的混合物，该混合物具有补充2000PE单位/克(专利EP0388593)的50000PG单位/毫克的木霉属PGA1或参考。在糊状物试验之一中未加入酶(空白样品)。

汁液产率结果(图4)显示，木霉属PGA1等同于或优于现有技术果胶酶制剂。具体而言，木霉属PGA1处理的样品浊度较优，即与现有技术曲霉属PG处理的汁液相比，木霉属PGA1处理的汁液更清澈和透明(图5)。结果清晰可见(图6)。

残留果胶的醇测试(1+1体积的汁液和无水乙醇)显示，在25℃孵育6小时后，木霉属PGA1处理的汁液不含残留果胶，而曲霉属PG处理的汁液包含一些残留果胶。在空白样品中发现大量残留果胶。

实施例6：木霉属PGA1在来自不同水果和蔬菜的汁液制备中的测试

在不加入果胶甲酯酶的情况下，在来自水果和蔬菜的汁液的制备物中测试按实施例3中所述产生的木霉属PGA1制剂F050183。

用金属装置手工捣碎草莓和木莓。用绞肉机机械捣碎李子和胡萝卜。通过在95℃微波加热漂白胡萝卜。将1000g糊状物置于2000ml瓶中，并在加入酶溶液前调节温度20分钟。反应温度为65℃，反应时间为60分钟。通过用纺织滤布在Hafico实验室压榨器中压榨进行酶反应后的捣碎。将所获得的汁液收集在Imhoff瓶中进行沉降。

酶和剂量：

剂量基于本领域中的一般建议：30.000PGU/mg的200ppm对应于6*10⁶PGU/kg胡萝卜、李子、草莓和木莓。酶制剂FEA 2005027的活性为10300PGU/mg。因此每1000g胡萝卜的酶制剂FEA 2005027的剂量为0.58g。空白测试无酶剂量。

所使用的压榨图如下：

装填1分钟-0巴2分钟-50巴2分钟-100巴2分钟-150巴2分钟-200巴2分钟-300巴1分钟-400巴1分钟。

用Dr Lange LTP5实验室浊度光度计在860nm进行浊度测量(NTU)。根据DIN 38404法将值报告为NTU(Neophelometric浊度单位)。结果显示于表7中。

表7：来自木莓、草莓、李子和胡萝卜汁液制备物的测试结果。

以上表7显示，在无果胶酯酶和其他果胶分解活性的情况下用木霉属PGA1处理草莓和李子提高了汁液产率和白利糖度(糖含量)。

结果图示于图7中。图7显示用里氏木霉PGA1处理后从不同水果/蔬菜糊状物的压榨获得的汁液的产率。与各自的空白值对比显示结果。

令人惊奇地，木霉属PGA1对包含低酯化和可溶性果胶的水果产生较优的结果。根据以上所示的结果，可能在无任何其他果胶酶的情况下，仅用木霉属PGA1酶在65℃在1小时内进行所述水果糊状物的处理。此较优的结果不是预料中的。

Claims (26)

1.一种或多种果胶分解酶在水果或蔬菜糊状物的处理中的用途，其中至少一种果胶分解酶可从里氏木霉获得。

2.权利要求1的用途，其中所述果胶分解酶选自果胶酶、果胶甲酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶裂合酶、果胶酸裂合酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、内切阿拉伯聚糖酶或鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶。

3.权利要求2的用途，其中所述果胶分解酶是来自里氏木霉的多聚半乳糖醛酸酶。

4.权利要求3的用途，其中所述多聚半乳糖醛酸酶具有SEQ ID NO：2的22-379的氨基酸序列。

5.权利要求1-4之一的用途，其中所述水果或蔬菜选自苹果、梨、葡萄、浆果、胡萝卜或西红柿。

6.权利要求5的用途，其中所述水果是苹果。

7.权利要求1-5之一的用途，其中所述果胶分解酶是具有SEQ ID NO：2的22-379的氨基酸序列的来自里氏木霉的多聚半乳糖醛酸酶且所述水果是苹果。

8.用于水果或蔬菜糊状物的酶处理的方法，其包括加入一种或多种果胶分解酶的步骤，其中至少一种果胶分解酶可从里氏木霉获得。

9.权利要求8的方法，其中所述果胶分解酶选自果胶酶、果胶甲酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶裂合酶、果胶酸裂合酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、内切阿拉伯聚糖酶或鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶。

10.权利要求9的方法，其中所述果胶分解酶是来自里氏木霉的多聚半乳糖醛酸酶。

11.权利要求10的方法，其中所述多聚半乳糖醛酸酶具有SEQ ID NO：2的22-379的氨基酸序列。

12.权利要求8-11之一的方法，其中所述水果或蔬菜选自苹果、梨、葡萄、浆果、胡萝卜或西红柿。

13.权利要求12的方法，其中所述水果是苹果。

14.权利要求8-12之一的方法，其中所述果胶分解酶是具有SEQ ID NO：2的22-379的氨基酸序列的来自里氏木霉的多聚半乳糖醛酸酶且所述水果是苹果。

15.用于水果或蔬菜汁的制备的方法，其包括权利要求8-14之一的用于水果或蔬菜糊状物的酶处理的方法。

16.重组DNA分子，其在原核或真核宿主细胞中表达时编码具有内切多聚半乳糖醛酸酶活性的多肽，所述重组DNA分子包含选自以下的DNA序列：

a)具有或包含SEQ ID NO：1(pga 1)的DNA序列；

b)在严格条件下与a)的DNA序列杂交的DNA序列；

c)与a)的序列具有70％到98％的同一性程度的DNA序列；或

d)由于遗传密码的简并性而与a)、b)或c)的序列相关的DNA序列。

17.具有内切多聚半乳糖醛酸酶活性且由权利要求16的重组DNA分子编码的多肽。

18.具有果胶分解活性且包含选自以下的氨基酸序列的多肽：

a)包含与PGAI多肽的序列(SEQ ID NO：2)具有至少77％同一性、优选至少80％同一性、更优选至少85％同一性、还更优选至少90％同一性、还更优选至少95％同一性和还更优选至少98％同一性的氨基酸序列的多肽；

b)包含具有果胶分解活性的片段的a)的变体；和

c)具有果胶分解活性的a)或b)的片段。

19.重组DNA分子，其在原核或真核宿主细胞中表达时编码具有外切多聚半乳糖醛酸酶、外切鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶或木半乳糖醛酸聚糖酶活性的多肽，所述重组DNA分子包含选自以下的DNA序列：

a)具有或包含SEQ ID NO：3(pgx 1)、SEQ ID NO：5(rgx 1)或SEQ ID NO：7(xga 1)的DNA序列；

b)在严格条件下与a)的DNA序列之一杂交的DNA序列；

c)与a)的序列具有60％到98％的同一性程度的DNA序列；

d)由于遗传密码的简并性而与a)、b)或c)的序列相关的DNA序列。

20.具有外切多聚半乳糖醛酸酶、外切鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶或木半乳糖醛酸聚糖酶活性且由权利要求19的重组DNA分子编码的多肽。

21.具有外切多聚半乳糖醛酸酶、外切鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶或木半乳糖醛酸聚糖酶活性且包含选自以下的氨基酸序列的多肽：

a)包含与多肽SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的序列具有至少60％同一性、优选至少70％同一性、更优选至少80％同一性、还更优选至少90％同一性和还更优选至少95％同一性的氨基酸序列的多肽；

b)a)的变体。

22.具有转化宿主细胞的能力的载体，该载体包含至少一个权利要求16或19之一的重组DNA分子。

23.权利要求22的载体，其是以保藏号18450保藏于DSMZ的pALK1958。

24.选自真菌、酵母、细菌或哺乳动物细胞的转化的宿主细胞，其包含至少一个权利要求16或19之一的重组DNA分子，且具有表达具有各自活性的多肽的能力。

25.权利要求24的转化的宿主细胞，其属于克鲁维酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、裂殖酵母属、曲霉属、根霉属、木霉属、肉座菌属、毁丝霉属、金孢子菌属、脉孢霉属、毛霉属、青霉属、酵母属或镰孢霉属的种类。

26.包含权利要求17、18、20和21之一的一种或多种多肽，任选地以及其他酶和/或赋形剂的制剂。

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