PL175670B1 - Oczyszczona i wyizolowana sekwencja DNA kodująca polipeptyd wykazujący aktywność enzymu poligalakturonazy (PGX) z Aspergillus tubigensis - Google Patents

Abstract

1. Oczyszczona i wyizolowana sekwencja DNA kodujaca polipeptyd wykazujacy akty- wnosc enzymu poligalakturonazy (PGX) z Aspergillus tubigensis, znamienna tym, ze zawie- ra a) sekwencje nukleotydowa kodujaca enzym PGX majacy sekwencje aminokwasowa o numerze SEQ ID No. 4 lub b) sekwencje nukleotydowa kodujaca enzym PGX przy czym wspomniana sekwencja nukleotydowa hybrydyzuje z sekwencjaz punktu a) w warunkach hy- brydyzacji w 6XSSC w temperaturze 65°C, lub w równowaznych warunkach. PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest izolowana, rekombinantowa sekwencja DNA kodująca egzo-poligalakturonazę. Korzystnie, enzym ten uzyskuje się z rodzaju Aspergilli korzystniej z Aspergillus tubigensis albo Aspergillus niger.

Przedmiotem wynalazku jest również kaseta ekspresyjna zawierająca sekwencję DNA kodującą tę egzo-poligalakturonazę. Taka kaseta ekspresyjna posiada odpowiednie rejony regulacyjne, takie jak rejon promotora, ewentualnie rejon wzmacniający i rejon zakańczania. Kaseta ta może również zawierać marker selekcyjny dla genu kodującego.

W następnym aspekcie wynalazku, kaseta ekspresyjna stanowi część wektora.

Przedmiotem wynalazku sąponadto komórki rekombinantowego gospodarza, transformowane wektorem zawierającym DNA kodującym egzo-poligalakturonazę.

Przedmiot wynalazku stanowi również izolowana, rekombinantowa egzo-poligalakturonaza.

Ujawniony jest również sposób wytwarzania egzo-poligalakturonaz a także sposób ich oczyszczania.

W opisie ujawniony jest również sposób wytwarzania kwasu galakturonowego polegający na użyciu egzo-poligalakturonazy.

Opisane jest ponadto zastosowanie egzo-poligalakturonazy do obróbki pektyny. Na fig. 1 przedstawione są mieszaniny oligonukleotydowe wyprowadzone z N-terminalnych sekwencji aminokwasowych z traktowanych bromocyjanem fragmentów egzo-poligalakturonazy PGX pochodzących z A. tubigenesis. Te sondy DNA zostały użyte do prób hybrydyzacji prowadzonych w celu wykrycia genu pgaX. Na fig. 2 przedstawionajest mapa restrykcyjna genu pgaX z A. tubigenesis. Strzałka wskazuje na miejsce i orientację tego genu. Na fig. 3 i 4 przedstawione sąwyni176 670 ki użycia enzymu egzo-PG w porównaniu z odpowiednim handlowym enzymem “Rohament PL” do obniżenia wrażliwości pektyny najony wapnia. Na osi X odłożone sązmiany mas cząsteczkowych (w kilodaltonach) a na osi Y odłożonajest lepkość (w centypauzach). Przy punktach z naniesionymi danymi podane są dawki enzymu wyrażone w mg/g pektyny.

O = Rohament PL, + = egzo=PG, =£= średnia ze ślepych f^r^ób.

W niniej szym wynalazku ujawnione sąoczyszczone i izolowane sekwencji DNA kodujące polipeptyd wykazujący aktywność enzymu poligalakturonazy (PGX) z Aspergillus tubigenesis, które to sekwencje DNA charakteryzują się obecnością sekwencji kodującej SEQ ID NR: 1. Zakresem wynalazku objęte są również genetyczne warianty sekwencji DNA dla sekwencji SEQ ID NR: 1, gdyż istnieją sekwencje DNA kodujące tę samą sekwencję aminokwasową lecz zmienione, zgodnie z prawem degeneracji kodu genetycznego.

Przedmiotem wynalazku są również sekwencje DNA zdolne do hybrydyzacji z sekwencją DNA dla sekwencji SEQ ID NR: 1 lub z częścią tej sekwencji.

W wynalazku są również ujawnione konstrukcje DNA zawierające sekwencję DNA kodującą PGX, w których to konstrukcjach sekwencja kodująca białko jest operacyjnie związana z rejonami regulacyjnymi kierującymi ekspresjątej sekwencji DNA w organizmie odpowiedniego gospodarza.

Opisane sąrównież wektory DNA zawierające te konstrukcje DNA kodujące białko PGX.

Ujawnione są ponadto transforimowane komórki mikroorganizmu gospodarza, zawierające te wektory. Wykazano, że komórki te wytwarzają egzo-poligalakturonazę w odpowiednich warunkach hodowli.

W niniejszym wynalazku ujawniony jest sposób uzyskiwania ekspresji egzo-poligalakturonazy polegający na hodowli mikroorganizmu gospodarza w warunkach, w których zachodzi ekspresja klonowanego genu. Ujawniony jest również sposób otrzymywania egzo-poligalakturonazy składający się z etapu hodowli transformowanego mikroorganizmu gospodarza w warunkach pobudzających ekspresję tej sekwencji DNA i z etapu odzyskania polipeptydu.

Opis wynalazku ujawnia również użycie polipeptydu otrzymanego w wyniku ekspresji sklonowanego genu pgaX do degradowania pektyny. Wykazano, że peptynę można poddawać specjalnej obróbce stosując wytworzoną w powyższy sposób egzo-poligalakturonazę. Ujawniono, że enzym ten zmniejsza wrażliwość pektyny na jony wapnia nie zmniejszając jednocześnie jej masy molowej.

Ponadto, przedmiotem wynalazku sąoczyszczone i izolowane rejony regulacyjne ekspresji i transkrypcji, obecne z niekodujących sekwencjach 5' genu pgaX z Aspergillus tubigensis.

W niniejszym wynalazku opisany jest sposób otrzymywania genu kodującego egzopoligalakturonazę pochodzącą z Aspergillus. Sposób ten można streścić następująco: Szczep Aspergillus, wyselekcjonowany spośród A.niger, A. awamori i A. tubigensis hoduje się w warunkach, w których ogranicza się źródło węgla i jako substrat dodaje się pektynę lub jej fragmenty. Takie warunki wzrostu pobudzaj ą wytwarzanie enzymów degradujących pektyny.

Po odpowiednim czasie wzrostu pozwalającym na nagromadzenie się różnych enzymów, zbiera się komórki i izoluje się enzymu z brzeczki. Po identyfikacji, egzo-poligalakturonazę oczyszcza się i poddaje sekwencj onowaniu. Sekwencj onowanie to można prowadzić wychodząc z całej cząsteczki białka albo zjej fragmentów uzyskanych po seperacji peptydów powstałych po trawieniu całkowitego białka peptydazą. Po oznaczeniu tej sekwencji aminokwasowej lub jej części, selekcjonuje się odpowiednie sekwencje w celu doboru sond DNA. Sondy te testuje się wobec banku genomowego żądanego szczepu Aspergillus. Selekcjonuje się klony hybrydyzujące i sekwencjonuje się zawarte w nich fragmenty DNA. Taką sekwencję następnie uzupełnia się przez dodanie reszty tej sekwencji.

Następnie, w kierunku 5' od rejonu kodującego klonuje się odpowiednie sekwencje regulujące ekspresją. Ich rodzaj zależy od korzystnej komórki gospodarza ekspresyjnego. Taka procedura sprawia, że ekspresja jest konstytutywna.

175 670

Sklonowany gen poddaje się ekspresji. Do degradacji pektyny pożywkę można stosować jako taką. Korzystnie jednak, białko to najpierw się izoluje i dopiero wówczas stosuje się do żądanego procesu.

Znane są alternatywne drogi klonowania, detekcji, skriningu i ekspresji genu, które powinny dawać podobne wyniki. Wśród tych sposobów są takie, w których łączy się klonowanie ekspresyjne z detekcją immunologiczną. W innym sposobie można byłoby wykorzystać reakcję enzymatycznej amplifikacji in vitro (reakcję PCR) do amplifikacji DNA kodującego gen egzopoligalakturonazy, jednak w tym przypadku zakłada się, że przynajmniej część sekwencji tego genu jest znana.

Reakcja egzo-poligalakturonazy według wynalazku z pektyną lub substratami pektyno-podobnymi prowadzi do powstania kwasów galakturonowych w formie monomerów lub dimerów. Kwas galakturonowy stosuje się na przykład do produkcji kwasu askorbinowego. W odróżnieniu od znanych procesów, przy stosowaniu egzo-poligalakturonazy w czystej formie powstaje mniej produktów ubocznych.

Ponadto, egzo-poligalakturonazę według wynalazku można stosować w połączeniu z pektynoesterazą, pektynaząi z innymi enzymami degradującymi pektynę. W przykładach zilustrowany jest fakt, że jeśli do obróbki pektyny stosuje się taką egzo-poligalakturonazę, to w wyniku obróbki obniża się lepkość pektyny bez obniżenia masy cząsteczkowej tego polimeru.

W przykładach zastosowano następujące szczepy i wektory:

Szczepy

E. coli JM101 (Yanisch-Perron i wsp., 1985):

thi, O(lac-supE, p roAB), [F, traD36, pro AB, Haci^qZĆ5 Ml5]

E/coli Le 392 (Murray, 1977);

F, hsdR574 (r+k, m⁺k), sup44, supF58, lacY1, albo (2)(1ηζ1ΖΥ)6, galK2, gal222, metB 1, trp>R55, λ'

Aspergillus niger N402: cs6At

Aspergillus niger N593: cspA1, pyrAD

Aspergillus tubigensis NW756

Aspergillus tubigensis NW218: pyr^A22

Aspergillus nidulans G191: pabaA1, pyrG89, fwA1, uaY9

Wektory pEMBL 18/pEMBL 19 (Dente i wsp., 1983)

Przykład 1

Oczyszczanie i charakteryzacja egzo-poligalakturonazy PGX pochodzącej z Aspergillus tubigensis

Przykład 1.1

Oczyszczanie egzo-poligalakturonazy PGX pochodzącej z Aspergillus tubigensis

Przesącz z hodowli (3000 ml) uzyskano w wyniku hodowli Aspergillus niger, szczep NW756 (później przeklasyfikowanego jako bardziej prawdopodobnie należącego do gatunku Aspergillus tubigensis (Kusters-van Someren i wsp., 1991 ) w pożywce o wartości pH 6.0, zawierającej wjednym litrze 7.5 gNH4NO3,1.5 g KH2PO4,0.5 g KCl, 0.5 g ZigSO₄.7H2O,2.g wyciągu drożdżowego, pierwiastki śladowe według Vishniac'a i SanteFa (1957) i jako źródło węgla, 10 g kwasu ppligalakturpnpwego. Degradację kwasu poligalakturonowego prowadzono następująco: ilość 40 g kwasu ppligalakturpnowego (dostarczonego przez “United States Biochemical Corp.”) rozpuszczono w dwóch litrach buforu o stężeniu 20 mM octanu sodowego o pH 4.8 i inkubowano w czasie 24 godzin w temperaturze 30°C z 4000 jednostkami oczyszczonej endoppligalakturpnazy II z A. niger (oczyszczanie tego enzymu opisali Kester i Visser, 1990).

Wartość pH pożywki ustawiano na 6.0 i następnie pożywkę tę zaszczepiano ilością 1(0 spor/ml i w czasie 5 5 godzin prowadzono inkubacj ę w temperaturze 3 0°C we wsstrząsarce orbitalnej pracującej z prędkością250 obrotów/minutę. Następnie, płyn hodowalny sączono przez gęste płótno, przesącz rozcieńczano do stężenia octanu sodowego wynoszącego 10 mN i doprowadza175 670 no pH do wartości 4.0. Tak przygotowany roztwór wprowadzano w 20 mM buforze octanu sodowego o pH 4.0 na kolumnę o pojemności 100 ml wypełnioną sieciowanym alginianem.

Niezwiązaną frakcję zawierającą mieszaninę resztkowej aktywności endo-PG i egzopoligalakturonazy zatężano metodą wsadową, adsorbując ją na żywicy DEAE Sephadex A-50 (200 g mokrej żywicy) przy pH 6,0 i eluując metodą pulsacyjną 1 M roztworem NaCl w buforze 20 mM fosforanu sodowego o pH 6.0. Następnie roztwór dializowano wobec tego samego buforu ale bez soli. Dializat wprowadzano na kolumnę o szybkim przepływie, “Fast Flow” o wymiarach 2,5x10 cm, wypełnioną żywicąDEAE-Sepharose, zrównoważonąbuforem 10 mM bis/Tris/HCl o wartości pH 5.5.

Po eluowaniu liniowym gradientem chlorku sodowego (0 - 0.5 M) w ilości 800 ml, we frakcjach oznaczano aktywność poligalakturonazy i przeprowadzono skrining na aktywność egzopoligalakturonazy metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC). Metoda ta polega na inkubowaniu próbek pobranych z frakcji schodzących z kolumny razem z kwasem poligalakturonowym dodanym w ilości 1% wagowo-objętościowego w buforze -0.1 M octanu sodowego o pH 4.2, w temperaturze 30°C i na analizowaniu produktów reakcji metodą TLC opisaną przez Kestefa i Vissefa (1990).

Frakcje wykazujące aktywność egzo-poligalakturonazy łączono, dializowano wobec buforu 20 mM octanu sodowego o pH 4.0 i wprowadzano - na kolumnę “Fast Flow” o wymiarach 2,5 x 7 cm, wypełnioną żywicą S-Sepharose, zrównoważoną tym samym buforem. Eluowanie prowadzono liniowym gradientem chlorku sodowego (0 - 0,5 M) w ilości 600 ml.

Końcowe oczyszczenie polegało na wielokrotnej chromatografii na kolumnie MONO Q (Pharmacia, Upsala, Szwecja) w buforze 20 mM chlorowodorku piperazyny o pH 6.0. Frakcje zawierające egzo-poligalakturonazę rozcieńczano pięciokrotnie wodą, wprowadzano na kolumnę i eluowano z szybkością2 ml/minute liniowym gradientem chlorku sodowego (0 - 0.2 M) w ilości 40 ml. W tabeli I podane są wyniki oznaczeń aktywności właściwej i odzysku enzymu podczas oczyszczania.

Tabela P

Oczyszczanie egzo-poligalakturonazy PGX pochodzącej z A. tubigensis NW756

Etap	Całkowita objętość (ml)	Całkowita aktywność (jedn.)	Specyf. białko (mg)	Aktywność (jednfmg)	Wydajność (%)
Płyn hodowlany	3000	5230	300	17,4	100
Sieciowany alginian	210	3100	212	14,6	59
DEAE-Sepha- rose	90	846	98	8,6	16
S-Sepharose	72	188	8.8	21,4	3,6
MONO-Q	10,8	121	3.1	39,0	2,3

Aktywność poligalakturonazy oznaczano przez pomiar uwalniania cukrów redukujących w mieszaninie reakcyjnej zawierającej 0.25% wagowo-objętościowych kwasu poligalakturonowego w buforze 0.1 M octanu sodowego o pH 4.2, wtemperaturze 30°C. Końcowe grupy redukujące oznaczano metodą z użyciem neokuproiny, opisaną przez Stephens'a i wsp. (1974). Jednostkę aktywności zdefiniowano jako ilość enzymu wytwarzającąjeden pmol cukrów redukujących na minutę.

Pozorna masa cząsteczkowa egzo-poligalakturonazy PGX oznaczona metodą SDS-PAGE w 10 procentowym żelu wynosi 78 kDaltonów. Po deglukozydacji enzymu N-glikanazą (dostarczoną przez firmę Genzyme, Cambridge, Mass.) prowadzonej zgodnie z instrukcją dostawcy, masa cząsteczkowa obniżyła się do 52 kDaltonów.

175 670

Ogniskowanie w punkcie izoelektrycznym, w zakresie pH od 3.7 do 4.4 dało pięć odrębnych pasm. Wszystkie te pasma wykazywały aktywność egzo-poligalakturonazy.

Przykład 1.2

Oznaczanie sekwencji aminokwasowych N-końców peptydów uwalnianych z egzopoligalakturonazy PGX metodą z użyciem bromocyjanu.

Ilość około 150 pg oczyszczonej według przepisu podanego w przykładzie 1.1 egzopoligalakturonazy PGX poddawano wyczerpuj ącej dializie wobec wody destylowanej, liofilizowano i rozpuszczano w 100 μΐ mieszaniny 70% objętościowych kwasu mrówkowego z wodą. Do tego roztworu białka dodawano 500 μg bromocyjanu (2500 nadmiar molowy) rozpuszczonego w powyższej mieszaninie kwasu mrówkowego i wody. Reakcję prowadzono w czasie 24 godzin, w temperaturze pokojowej, po czym mieszaninę reakcyjnąrozcieńczano 10 - krotnie wodąi poddawano liofilizacji. Około połowę ilości mieszaniny reakcyjnej poddawano elektroforezie w 15% żelu poliakryloamidowym i następnie przenoszono na filtry Immobilon-P (dostarczane przez Irrmę Millipore) metodaplamowania, postępując w sposób opisany przez Matsudaira'ę (1987). Wycinki filtrów zawierające fragmenty o masie cząsteczkowej odpowiednio 30 kD (CB 1), 27.5 kD (CB 2) i 23,5 kD (CB 3) poddano sekwencjonowaniu w fazie gazowej w aparacie do sekwencjonowania białek “Applied Biosystems model 470A, SON, Leiden”, stosując program opisany przez Ammons' (1987). Oznaczono następujące N-terminalne sekwencje aminokwasowe:

CB 1 (L2278):

10

Ala-(Arg)-Ile-Lys-Val-(Trp)-Pro-Gly-Thr-Pro-Ser-Ala-(Leu)-?(Ala) (Wzór 1) ⁼ (^{SEQ ID N0:}

CB 2 (L1742):

10 (Gly)-Ile-Ile-Gly-Leu-Asn-Gly-Gly-Thr-Ile-Gly-Pro-Leu-Lys15 20

Leu-(Arg)-Tyr-Ser-Pro-Gln (Wzór 2) = (SEQ ID NO: 2)

175 670

CB 3 (L1743):

10

Phe-Ser-(Leu)-Ser-?-Glu-Ala-Ala-(Thr)-Gly-Pro-Lys-Lys(Pro)-Phe-?-? Leu-(Leu) (Wzór 3) = (SEQ ID NO: 3)

Przykład 2

Skrining genomowego banku Aspergillus niger DS16813 (CBS 323.90, później sklasyfikowanego jako Aspergillus tubigensis) na obecność genu egzo-poligalakturonazy (pgaX) i izolowanie tego genu.

Przykład 2.1

Synteza fragmentu swoistego wobec pgaX w reakcji enzymatycznej amplifikacji z udziałem polimerazy (PCR), z użyciem mieszanin oligonukleotydów wyprowadzonych z sekwencji aminokwasowych PGX.

Do syntezy mieszanin oligonukleotydów odpowiadających kodującym i niekodującym niciom DNA użyto sekwencje aminokwasowe oznaczone w przykładzie 1.2 (wzory 1, 2 i 3). Oligonukleotydy te syntetyzowano metodą fosforynoamidową w syntetyzerze oligonukleotydów firmy Applied Biosystems.

Uzyskane mieszaniny oligonukleotydów (fig. 1) użyto w reakcji enzymatycznej amplitikacji z udziałem polimerazy (PCR), stosując jako matrycę chromosomalny DNA z A. tubigensis NW756. W reakcjach PCR wykorzystano wszystkie możliwe kombinacje tych dwóch mieszanin oligonukleotydowych (stosowanych w ilości po 100 pmoli). Mieszaniny reakcyjne zawierały ponadto po 0.5 pg chromosomalnego DNA z A. tubigenesis NM756, 200 μΜ dNTP, bufor Taq (Sphaero-Q) i 0.5 jednostek Taq DNA polimerazy (SuperTaą, Sphaero-Q). Wszystkie reakcje PCR prowadzono w 25 cyklach z topieniem w temperaturze 94°C przez minutę, zgrzewaniem w temperaturze 40°C przez minutę i polimetyzacjąprowadzonąw temperaturze 72°C przez 2 minuty.

Produkty reakcji analizowano metodą elektroforezy w 2% żelu agarozy TAE. Jedynie w kombinacji mieszaniny oligonukleotydowej nr 3059 i 3062 otrzymywano produkt reakcji o długości łańcucha około 600 par zasad. Ten fragment reakcji PCR oczyszczano w aparaturze do oczyszczania DNA, “Magie PCR Preps DNA” firmy Promega, postępując według instrukcji producenta.

Przykład 2.2

Znakowanie fragmentów DNA fosforem ³²P.

Po oczyszczeniu, oznaczano stężenie DNA we fragmencie PCR, opisanym w przykładzie 2.1. Ilość 50 ng tego fragmentu znakowano przez losowe wbudowanie primera, w zestawie “Prime-a-Gene” z firmy Promega. W celu usunięcia z mieszaniny niewbudowanego a-32P-dATP, zwiększano objętość roztworu do 100 μΐ dodając buforu TE po czym usuwano ten niewbudowany a-32P-dATP przez frakcjonowanie na kolumnie wypełnionej żywicą Sephadex G50. Frakcje zawierające znakowany radioaktywnie DNA denaturowano przez inkubację przez 3 minuty w temperaturze 100°C i otrzymywano DNAjednoniciowy przez szybkie schłodzenie na lodzie. Następnie roztwory dodawano do buforu hybrydyzacyjnego zawierającego 6 x SSC, 5 x roztwór Denhardta, 0.1% pirofosforan sodowy i 100 μg/ml denaturowanego ciepłem DNA ze spermy śledzia. Tę sondę użyto do skriningu banku genomowego (przykład 2.3) i do analizy technikąprzeniesienia Southema (przykłady 2.4, 2.5 i 5.1).

175 670

Przykład 2.3

Skarining banku genomowego Aspergillus tubigensis na obecność genu pgaX.

W celu skriningu na obecność genu pgaX w banku genomowym Aspergillus tubigensis przygotowanym według przepisu podanego w opisie zgłoszenia patentowego europejskiego nr EP 0.463.706 Al (przykład 2), na osiem płytek o średnicy 85 mm wypełnionych 1.2% agarem LM nanoszono 5 x 103 jednostek pfu/płytkę w roztworze wierzchniej agarozy LM o stężeniu 0.7%, w sposób opisany przez Maniatisa i wsp. (1982, str. 64). Jako bakterie, na płytki posiewano bakterie E. coli LE392.

Po dobowej inkubacji płytek w temperaturze 37°C wykonano po dwie repliki każdej płytki na filtrach nitrocelulozowych (Schleicher i Schull BA85) w sposób opisany przez Maniatisa i wsp. (1982, str. 320- 321).

Po spiekaniu filtrów w czasie 2 godzin w temperaturze 80°C, filtry te poddawano wstępnej hybrydyzacji w temperaturze 65°C w czasie 2 godzin w buforze do prehybrydyzacji zawierającym 6 x SSC, 0.5% SDS, 10 x roztworu Denhardta i 100 pg/ml denaturowango ciepłem DNA ze spermy śledzia (Boehringer). Następnie dodawano denaturowaną ciepłem sondę i hybrydyzowano materiał na filtrach w czasie 18 godzin w temperaturze 65°C.

Po hybrydyzacji, filtry przemywano początkowo roztworem o składzie: 2 x SSC, 0.5% SDS a następnie roztworem o składzie 0.2 x SSC, 0.5% SDS w temperaturze 65°C. Wysuszone na powietrzu filtry nakładano na arkusz bibuły Whatmann 3MM wykonując znaki atramentem radioaktywnym, po czym bibułę Whatmann i filtry zawijano taśmą“Saran Wrap™”. Łysinki hybrydyzacyjne identyfikowano przez ekspozycję na filmie czułym na promieniowanie X marki Kodak XAR przez 18 godzin w temperaturze-70°C, stosując ekran wzmacniający.

Zidentyfikowano dwanaście łysinek (oznaczonych symbolami od X_pga 1 do X_pga 12), hybrydyzujących z sondami wykonanymi w reakcjach PCR, pojawiających się w duplikacie na filtrach - replikach. Każdąłysinkę dającąreakcję dodatniąpobierano zpłytki pipetąPastera i z wyciętych walców agaru eluowano fagi w 1ml buforu SM zawierającego 20 μΐ chloroformu, w sposób opisany przez Maniatisa i wsp. (1982, str. 64). Otrzymane fagi oczyszczano przez powtarzanie opisanej powyżej procedury, stosując filtry - repliki z płytek zawierających 50 - 100 łysinek izolowanych fagów·'.

Po oczyszczeniu fagi te namnażano przez posiewanie na płytki z pożywką LM w ilości 5 x 10³ fagów/płytkę. Po dobowej inkubacji w temperaturze 37°C, otrzymano płynące płytki, z których eluowano fagi przez dodanie 5 ml buforu SM i przechowywanie płytek przez 4 godziny w temperaturze 4°C z okresowym wstrząsaniem. Po zebraniu supematantu z roztworu usuwano bakterie przez wirowanie z szybkością4,000 g w czasie 10 minut w temperaturze 4°C. Do supernatanu dodano chloroform w ilości 0,3% i oznaczono ilość jednostek p.f.u. Te zapasy fagów zawierały po około 10^w p.f.u./ml roztworu.

Przykład 2.4

Izolowanie DNA z bakteriofaga lambda

Osiem spośród wyizolowanych fagów, czyli k_pgax 12,4,5,6,7,8 i 11 namnażano w sposób opisany w przykładzie 2.2, stosując pięć płytek dla każdego faga. Następnie, z otrzymanego supematantu (25 ml) strącano fagi przez dodanie równej objętości roztworu zawierającego 20% wagowo-objętościowych PEG-2000 i 2 MNaCl, dokładnie mieszano i inkubowano na lodzie w czasie 60 minut.

Strącone fagi zbierano przez wirowanie z szybkością 14,000 g w temperaturze 4°C ' w czasie 20 minut. Płyn znad osadu zbierano przez zasysanie. Fagi ostrożnie zawieszano w 4 ml buforu SM i poddawano jednokrotnej ekstrakcji chloroformem.

Przed ekstrakcjąDNA z cząsteczek faga, usuwano DNA i RNA pochodzący z ' lizy bakterii przez inkubację tej zawiesiny fagów z DNA-zai RNA-zą A (po 100 μg/ml) w ' czasie 30 minut w temperaturze 37°C. Następnie uwalniano fagowy DNA z fagów przez ekstrakcję równą objętością mieszaniny (1:1) fenolu i chloroformu. Po rozdziale faz metodą wirowania w wirówce typu Sorvall z szybkością 14,000 g w czasie 10 minut, fazę wodną poddano jednokrotnej ekstrakcji równą objętością chloroformu. Fazy rozdzielano przez wirowanie w wirówce Sorvall z szybko175 670 ścią 14,000 g w czasie 10 minut i następnie z fazy wodnej strącano DNA przez dodanie 0.1 objętości 3 M roztworu octanu sodowego i 2 objętości etanolu. Po zmieszaniu, odzyskano DNA przez wirowanie w wirówce Sorvall z szybkością 14,000 g w czasie 10 minut w temperaturze 4°C.

Supernatant usuwano przez zasysanie i następnie zawieszano DNA w 400 μ buforu TE. Z tego roztworujeszcze raz strącano DNA przez dodanie 0.1 objętości roztworu octanu sodowego i 2 objętości etanolu. DNA zbierano przez wirowanie w temperaturze 4°C z szybkością 14,000 g w czasie 10 minut, Supernatant usuwano przez zasysanie, pozostałą peletkę krótko suszono pod zmniejszonym ciśnieniem, po czym zawieszano DNA w 125 μΐ buforu TE zawierającego 0.1 fg/ml RNA-zy A. W tej procedurze oczyszczania izolowano około 10-50 μg DNA z każdego faga.

Przykład 2.5

Analiza restrykcyjna fagów zawierających pgaX

Wyizolowany DNA z fagów 12,4,5,6,7,8 i 11 analizowano metodąSouthema stosując enzymy restrykcyjne PvuII i HincII. DNA trawiono w czasie 3 godzin w temperaturze 37°C w mieszaninie reakcyjnej złożonej z następujących roztworów: 3 μΐ (około 1 μg) roztworu DNA, 10 μ1 odpowiedniego buforu 10 x React (BRL), 20 jednostek enzymu restrykcyjnego (BRL) i sterylnej wody destylowanej dodanej w ilości potrzebnej do uzupełnienia roztworu do objętości 100 μ.

Po trawieniu strącano DNA przez dodanie 0.1 objętości 3 M roztworu octanu sodowego i 2 objętości etanolu. DNA zbierano po wirowaniu w czasie 10 minut w temperaturze pokojowej z szybkością 14,000 g. Supematant usuwano przez zasysanie, pozostają peletkę krótko suszono pod zmniejszonym ciśnieniem i zawieszano w sterylnej wodzie destylowanej.

Po dodaniu 4 μΐ buforu do nanoszenia DNA, próbki inkubowano przez 10 minut w temperaturze 65°C i szybko schładzano na lodzie. Następnie próbki nanoszono na 0.6% żel agarozowy w buforze TAE. Fragmenty DNA rozdzielano metodą elektroforezy przy potencjale elektrycznym 25 V w czasie 15-18 godzin.

Po elektroforezie przenoszono DNA na filtr nylonowy (Gene Bind 45 wytwarzany przez firmę Pharmacia LKB) metodą Southema w sposób opisany przez Maniatisa i wsp. (1982) i poddawano prehybrydyzacji i hybrydyzacji stosując znaczony fragment uzyskany z reakcji PCR w sposób opisany w przykładzie 2.1, prowadząc proces w warunkach hybrydyzacji podanych w przykładzie 2.2. Po ekspozycji na film czuły na promieniowanie X, Kodak XAR-5, w czasie 18 godzin w temperaturze -70°C z filtrem wzmacniającym, otrzymano pasma hybrydyzacyjee.

Otrzymane wyniki wskazują, że DNA ze wszystkich wyizolowanych klonów hybrydyzuje z fragmentem PCR. Dwa klony okazały się identyczne i zawierały bardzo duży, hybrydyzuj ący fragment PvuII. Nie wykryto hybrydyzującego fragmentu HincII, co świadczy o tym, że ten fragment jest zbyt mały i wycieka z żelu. W sześciu klonach znaleziono fragmenty pochodzące z tego samego rejonu genomowego. W wyniku bardziej wyczerpującej analizy Southema z użyciem enzymów XhoI, PvuII, Pst I, BglII, SalI, EcoRI i BamHI skonstruowano częściową mapę restrykcyjną tego rejonu genomowego. Na podstawie tego doświadczenia wyciągnięto wniosek, że fragment XhoI o wielkości 5.8 kb zawiera' gen pgaX A. tubigensis.

Przykład 2.6

Subklonowanie genu pgaX z A. tubigensis

Z faga λ pgaX7 izolowano fragment XhoI o wielkości 5.8 kilozasad przez trawienie fagowego DNA enzymem XhoI i rozdział fragmentów w sposób opisany w przykładzie 2.4. Fragment ten wycinano z żelu agarozowego i odzyskiwano go z agarozy w aparaturze GeneClean (Bio101), postępując zgodnie z instrukcją. producenta. DNA rozpuszczano w 10 μΐ sterylnej wody i oznaczano jego stężenie metodą elektroforezy w agarozie, stosując lambda DNA o znanym stężeniujako wzorzec i barwienie bromkiem etidium dla detekcji DNA. Uzyskany fragment poddawano ligacji z wektorem pEMBL 19 uprzednio trawionym enzymem SalI i poddanym

175 670 defosforylacji alkaliczną fosfataząw sposób następujący: ilość 1 μΐ roztworu pEMBL 19 o stężeniu 1 pg/pl mieszano z 2 μ! 10 x roztworu React 10 (BRL), 1 μΐ roztworu enzymu Sali o stężeniu 1 jednostki/pl i 16 .ul sterylnej wody destylowanej. DNA trawiono przez godzinę w temperaturze 37°C i następnie dodawano 0.5 pl alkalicznej fosfatazy (o stężeniu 1 jednostki/μΐ) firmy Pharmacia LKB i prowadzono inkubację w temperaturze 37°C przez następne 10 minut.

FragmentXhol o wielkości 5.8 kilozasad poddawano ligacji z wektorem uzyskując plazmid pIM362, postępując następująco: ilość 100 ng fragmentu pEMBL 19 mieszano z ilością 100 ng fragmentu XhoI o wielkości 5.8 kilozasad i 4 pl 5 x buforu do ligacji (BRL) po czym do tej mieszaniny dodano 1 μΐ roztworu ligazy DNA o stężeniu 1.2 jednostki/pl (BRL). Całkowita końcowa objętość mieszaniny wynosiła 20 pl. Po inkubacji prowadzonej w czasie 16 godzin w temperaturze 4°C 10 u1 tej mieszaniny do transformowania kompetentnych komórek E. coli JM101 przygotowanych metodą CM1, CM2 w sposób opisany w poradniku “Pharmacia Manual” dla układu klonowania i sekwencjonowania M13. Jedną z otrzymanych kolonii hodowano przez dobę w pożywce LB zawieraj ącej 100 μg ampicyliny w ml. Z hodowli tej izolowano plazmidowy DNA metodąlizy alkalicznej opisanej przez Maniatisa i wsp. (1982, str. 368-369) i ten DNA użyto w analizie restrykacyjnej opisanej w przykładzie 2.4, w celu sprawdzenia, czy został on wbudowany do żądanego plazmidu. Plazmidowy DNA izolowano na dużą skalę z ilością 500 ml zawierającej plazmid pIM362 hodowli E. coli JM 101, rosnącej na pożywce LB z dodatkiem 100 pg/ml ampicyliny (Maniatis i wsp., 1982, str. 86). Plazmid ten oczyszczano przez wirowanie w gadiencie gęstości chlorku cezu, działano fenolem, strącano etanolem i rozpuszczano w 400 p1 buforu TE. Wydajność wynosiła około 500 pg.

Podobnie, z faga 7 izolowano fragment PvuII o wielkości 4.0 kilozasad, umiejscowiony w obrębie fragmentu XhoI o wielkości 5.8 kilozasad i subklonowano go w plazmidzie pEMBL 19, trawionym uprzednio enzymem SmaI, otrzymując plazmid pIM361. Plazmid pIM361 analizowano dalej, działając enzymami restrykcyjnymi i opracowano mapę restrykacyjną przedstawioną na fig. 2.

Plazmidy pIM361 i pIM362 zawierające gen dla egzo-PG zdeponowano w bakterii E. coli IM101 w muzeum Central Bureau de Schimmelcultures in Baam w Holandii pod numerami akcesyjnymi odpowiednio CBS 101.93 i CBS 102.93.

Przykład 3

Charakteryzacja genu pgaX z Aspergillus tubigensis

Przykład 3.1

Oznaczanie sekwencji genu pgaX z Aspergillus tubigensis

Sekwencję genu pgaX z Aspergillus tubigensis oznaczano metodą subklonowania fragmentów z pIM362 w plazmidzie pEMBL18/19, w połączeniu z użyciem specyficznych oligonukleotydów jako primerów w reakcjach sekwencj onowania.

W celu analizy sekwencji nukleotydowych, izolowano fragmenty restrykcyjne w sposób opisany w przykładzie 2.5 i następnie klonowano je w wektorach pEMBL 18/19 uprzednio trawionych odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi, jak to opisano w przykładzie 2.5. Sekwencje nukleotydowe oznaczano metodą zakańczania łańcucha didezoksynukleotydowego w sposób opisany przez Sangera i wsp. (1977) w zastawie do sekwencj onowania z użyciem polimerazy T₇ firmy Pharmacia. Analizę komputerowąprzeprowadzono korzystając z programu PC/GENE firmy Intelligenetics Inc., Madison WI. Sekwencję tę oznaczano w 98% wydruku sekwencji w obydwu orientacjach. Zawiera ona około 640 par zasad sekwencji 5' i 655 par zasad sekwencji 3'.

Przykład 3.2

Struktura genu pgaX z A. tubigensis

W genie tym występuje prawdopodobnie 6 intronów. Hipoteza ta jest oparta na występowaniu kodonów stopu w zgodnej fazie odczytu we wszystkich tych intronach i na obecności intronowych sekwencji “consensus” (tabela II).

175 670

Tabela II

Sekwencje intronowe w genie pgaX.

	pozycja	długość	miejsce 5'	pętla	miejsce 3'
Intron I	948-1004	57	GTGctT	ACTAAC	CAG
Intron II	1372-1423	52	GTGcGT	ACTGAC	TAG
Intron III	1483-1540	58	GTAaTG	tCTAAC	CAG
Intron IV	1942-1991	50	GTtaGT	GCTAtC	TAG
Intron V	2094-2145	52	GTAaGT	gCTGAC	TAG
Intron VI	2221-2273	53	GTGaGT	ACTAAC	CAG
“consensus”	GTPuNTG	PuCTPuAC	PyAG

Gen pgaX koduje białko wydzielane z komórki o wielkości 47.1 kD, charakteryzujące się punktem izoelektrycznym 4.11. Jego wyliczona masa cząsteczkowa jest niższa od oznaczonej metodą elektroforezy SDS-PAGE, równej 78 kD, nawet po deglikozylacji (52 kD). W PGX istnieje 12 możliwych miejsc N-glikozylacji. Również dla innych białek wykazano różnice między wyliczoną a oznaczoną masą cząsteczkową. W sekwencji tej znaleziono wszystkie trzy fragmenty CNBr. Wydaje się, że LI743 reprezentuje N-końcową sekwencję aminokwasową dojrzałego białka egzo-PG, gdyż nie wykryto metioniny bezpośrednio poprzedzającej fenyloalaninę (F), czego można byłoby oczekiwać, jeśli byłby to prawdziwy fragment CNBr. Znaleziono natomiast sekwencję z cechami charakterystycznymi sekwencji sygnalnej. Według wyliczeń programu komputerowego PC-GENE, korzystne miejsce składania sekwencji sygnalnej znajduje się między seryną (S 24) a argininą (R 26), ponieważ jednak te aminokwasy znajdują się w dojrzałym białku, nie jest to ten przypadek. Miejsce składania między alaniną (A 22) a fenyloalaniną (23) jest drugim z kolei najlepszym.

Przykład 4

Ekspresja genu pgaX w Aspergillus niger N593, Aspergillus tubigensis NW218 i Aspergillus nidulans G191

Przykład 4.1

Wprowadzanie genu pgaX do Aspergillus niger N593, Aspergillus tubigensis NW218 i Aspergillus nidulans G191 metodą kotransformacji.

Uzyskane w przykładzie 2.5 plazmidy pIM361 i pIM362 wprowadzano do A. niger, A. tubigensisiA. nidulans przez kotransformacj ę odpowiednio A. nigerN593, A. tubigensisNW2\8 i A. nidulans G191 stosuj ąc w oddzielnych doświadczeniach gen pyrA z A. niger zawarty w plazmidzie pGW635 jako marker selekcyjny (Goosen i wsp., 1989) oraz plazmidy pIM361 i pIM362 jako plazmidy kotransformujące.

Protoplasty preparowano z grzybni po 20 godzinnej hodowli A. niger N593 i A. tubigensis NW218 w temperaturze 30°C na pożywce minimalnej wzbogaconej ilością 0.5% wyciągu drożdżowego, 0.2% cas-aminokwasów, 50 mM glukozy i 10 mM urydyny. W celu przygotowania protoplastów A nidulans G191, mikroorganizm ten hodowano w temperaturze 37°C na tej samej pożywce wzbogaconej ilością 1.35 ml/litr p-aminobenzoesanu. Procedury preparowania protoplastów i transformacji prowadzono w sposób opisany przez Goosen’a i wsp., 1987. W otrzymanych transformantach pyr+ oznaczano ekspresję genu pgaX metodąprzeniesienia typu Western.

Przykład 4.2

Skriningowe badania ekspresji genu pgaX w transformantach.

Analizowano transformanty uzyskane w przykładzie 4.1 pod kątem powstawania produktu genupgaX, czyli białka PGX. Wyselekcjonowano n0transformain^<^^'^vplM361 i 10 transforman14

175 670 tów pIM362 A. niger, 5 transformantów pIM361 i 5 transformantów pIM362 A. tubigensis oraz 10transiOrmantówp'lM361 i 10 transformantów pIM362 A. nidulans. Transformanty te hodowano w czasie 24 godzin na pożywce zawierającej wjednym litrze 10 g kwasu poligalakturonowego degradowanego za pomocąPGII, 7.5 gNH4NO₃,0.5 gKCl,0.5 gMgSO4x7H₂0,1.5 gKH₂PO₄, 0.2% wyciągu drożdżowego, 1 ml/litr roztworu Vishniac’a i 1.35 mg/litr p-aminobenzoesanu (tylko dla A. nidulans). Wartość pH pożywki wynosiła 6.0.

Po wzroście (24 godziny od czasu inokulacji) grzybnię usuwano przez filtrację i analizowano białka w przesączu hodowli metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS stosując żel zawierający 10% akryloamidu.

Białko PGX wykrywano na nitrocelulozie po przeniesieniu na filtr nitrocelulozowy za pomocą prądu elektrycznego i inkubacji z przeciwciałami poliklonalnymi przeciw-białku PGX oczyszczonemu według przykładu 1.1. Związane przeciwciała wykrywano po inkubacji z anty-mysim przeciwciałem kozim skoniugowanym z alkalicznąfosfatazą, postępując według przepisu podanego z poradniku Biorad.

Tabela III

Transyormanty wykazujące wzmożone wytwarzanie PGX.

	t = 24
A. tubigensis (pIM361)4 (>IM361)6 (PM362)7 A. nidulans (ΓΜ361)6 (1361)9 (pIM362)2	++ +++ + ++ +++ ++

Ilość wytwarzanego PGX oceniano na podstawie analizy typu Western.

+++ - wysoki nadmiar w porównaniu do odpowiedniego szczepu typu dzikiego.

+ - niski nadmiar w porównaniu do odpowiedniego szczepu typu dzikiego.

Tabela III przedstawia wyniki analizy typu Western. Jedynie transformanty A. tubigensis i A. nidulans wytwarzają wysoki nadmiar białka PGX wykrywanego tą metodą. Białko to jest wydzielane do pożywki. Spośród analizowanych transformantów A. tubigensis wyselekcjonowano jeden, który dawał najwyższe wydajności białka PGX. Był to transformanty. tubigensisNW218 (pIM361)6.

W następnym doświadczeniu, szczep A. tubigensis NW218 transformowano ilością 1 pg plazmidu pGW613 zawierającego gen pyrA z A. niger i ilością40 pg plazmidu pIM361. Najwyższy poziom wytwarzanego białka wykazał w tym doświadczeniu transformant NW218 (pIM361)22.

Przykład 4.3

Wzmożona ekspresja białka PGX w transformantachA tubigensis i oczyszczanie i charakteryzacja tego białka.

PGX oczyszczano ze szczepuA tubigensisNW756. Hodowlę szczepu\W756prowadzono w czasie 48 godzin w temperaturze 30°C na pożywce (pH = 6.0) zawierającej 7.5 g azotanu amonowego, 1.5 g KH₂PO₄, 0.5 g KC1, 0,5 g MgSO₄ x 7 H20,2 g wyciągu drożdżowego, pierwiastki śladowe i 1% kwasu galakturonowego degradowanego za pomocąPGII. Po hodowli zbierano przesącz przez filtrację i początkowąwartość pH (pH=6.8) ustawiano na 6.0. Następnie przesącz hodowli mieszano przez godzinę z żywicą DEAE-Sephadex A50 (300 g wilgotnej masy), zrównoważoną w buforze 10 mM fosforanu sodowego o pH 6.0. Żywicę jono-wymienną zebrano, umieszczono w kolumnie i eluowano związane białko jednym impulsem 1 M roztworu

175 670

NaCl w buforze. Po dializie wobec buforu 20 mM octanu sodowego (pH = 4.2), roztwór podawano na kolumnę o wymiarach: 5 cm średnicy i 8 cm wysokości, wypełnioną sieciowanym alginianem w tym samym buforze i eluowano dwoma impulsami 0.3 M i 1 M NaCl w buforze. Część aktywności egzo-PG wiązała się z sieciowanym alginianem; eluowano ją impulsem 0.3 M roztworuNaCl (pula 1). Niezwiązanąfrakcję dializowano wobec buforu 20 mM cytrynianu sodowego (pH = 3.5) i podawano na kolumnę o szybkim przepływie, “Fast Flow” wypełnioną żywicą S-Sepharose (średnica: 2.5 cm, wysokość: 25 cm) zrównoważoną w tym samym buforze. Eluowanie prowadzono ilością600 ml roztworuNaCl podawanego w gradiencie od 0 do 0.6 M (pule I, II i III). Wszystkie te pule z kolumny z S-Sepharoząwykazywały aktywność egzo-PG i wszystkie za wyjątkiem puli I, wykazywały aktywność endo-PG.

Wszystkie cztery pule zatężano do objętości 5 ml metodą adsorpcji na małej kolumnie z szybkim przepływem (Fast Flow) o wymiarach 1.5 cm x 5 cm, wypełnionej żywicąDEAE-Sepharose, przy pH - 6.0. Produkty eluowano pulsacyjnie 1M roztworem NaCl w buforze 10 mM fosforanu sodowego (pH = 6.0). Końcowe oczyszczanie prowadzono metodą chromatografii żelowej na kolumnie o wymiarach 2.5 cm x 90 cm wypełnionej żywicąSephacryl-S 200, stosując bufor 0.1 M octanu sodowego (pH - 4.8).

W końcowych próbkach nie wykrywano aktywności endo-PG ani galakturonazy PL.

	objętość	jedn./ml	mg/ml	A.Wł.
kontrola ogólna pula I/chrom, żelowa/zatęż.	9.8	19.4	0.54	36
S-Sepharoza pula II/chrom, żelowa	22.7	1.28	0.017	75
S-Sepharoza pula III/ chrom, żelowa/ zatężanie	6.5	14.4	0.31	46.5

A.Wł. = aktywność właściwa

Oczyszczanie PGX z transiormuntuNW©^ (pIM361)22.

Hodowlę transformantu prowadzono przez 50 godzin w temperaturze 30°C na pożywce minimalnej z dodatkiem azotanu amonowego jako źródła azotu i degradowanego 1 procentową PG II, 1% kwasu poligalakturonowego jako źródła węgla. Przy detekcji prowadzonej metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS z bawieniem kwasowym błękitem “Coomassie Brilliant Blue”, po 24- i 50-godzinnej hodowli w płynie hodowlanym wykrywano tylko jedno główne białko. Całkowite białko w przesączu płynu hodowlanego zatężono metodą wsadowej adsorpcji na DEAE-Sepharozie A50 przy pH 6.0 z następnym pulsacyjnym eluowaniem 1 M roztworem NaCl w buforze 20 mM fosforanu sodowego o pH 6.0.

Po wyczerpującej dializie wobec buforu 20 mM octanu sodowego (pH 3.6) dializat nanoszono na kolumnę o szybkim przepływie (Fast Flow), o wymiarach 2.5 x 20 cm, wypełnioną S-Sepharozą zrównoważoną w tym samym buforze. Eluowanie prowadzono w liniowym gradiencie od 0 do 0.5 M NaCl (800 ml).

We frakcjach oznaczano białko metodą elektroforezy żelowej SDS PAGE i w oparciu w wyniki zebrano dwie połączone frakcje (pule), które użyto do dalszej analizy.

175 670

	Jedn./ml	mg/ml	jedn./mg	mg	Jednostek ogółem
Pula I	39.5	0.87	45.4	61	2.765
Pula Π	400	5.1	78	790	12.900

Powyższe wyniki wykazują, że poziom enzymu PGX wytwarzanego przez ten transformowany szczep (około 180 mg/litr) jest 80 krotnie wyższy od poziomu enzymu wytwarzanego przez szczep typu dzikiego, NW756.

Po jednym etapie oczyszczania preparat nie jest całkowicie czysty, jednak nie wykrywa się w nim aktywności liazy pektynowej ani endo-PG. Pula I zawiera niwielki poziom aktywności pektynoesterazy.

Przykład 4.4

Deregulowana ekspresja genu pgaX z A. tubigensis

W celu dokonania fuzji promotora pki z A. niger N400 z genem pgaX z A. tubigensis DS16813, przygotowano fragment reakcji PCR, stosując primer zawierający miejsce pki SmaI i drugi primer zawieraj ący pki ATG z A. niger oraz pierwszych 12 nukleotydów z genu pgaX (sekwencje pgaX są oznaczone małymi literami):

pki Smal

3’ 3’

Pk»5’

TTTTCCTTCCCGGGGAC sensowna

SEQ ID NR: 6

GTTATGAGGCAGTTCTACA.Ctgagtgcg-tg antysensoana

SEQ ID NR: 7

Podobnie przygotowano fragment PCR stosując oligonukleotyd komplementarny do opisanego powyżej promera pki-pgaX i drugi primer zawierający miejsce NcoI w miejscu 165 par zasad w kierunku 5' w rejonie kodującym genu pgaX:

pk i-pqaX

5’ pqaX NcoI

3’ 3’

5’

CAATCATCCGTCCAAGATGGaac-Łcacgcac sensowna

SEQ ID NR: 8 cgg-Łacc-Łc-taccg-tga antysnnsowna

SEQ ID NR: 9

Następnie, obydwa fragmenty PCR zastosowano w trzeciej reakcji PCR, dodając jedynie primer pki SmaI i primer pgaX NcoI. Otrzymano fragment o długości około 300 par zasad, który trawiono enzymami SmaI i NcoI, uzyskując żądane lepkie końce. Fragment ten poddano dalszemu oczyszczaniu.

175 670

Plazmid pIM361 trawiono enzymem BamHI przecinającym go w miejscu poliłącznika pEMBL. Do tego plazmidu klonowano fragment BamHI zawierający promotor pki i gen pe1B z A. niger. Trawienie enzymami NcoI i SmaI wycina gen pe1B oraz koniec 5' genu pgaX i koniec 3' z promotora pki. Opisana powyżej ligacja fragmentu PCR Smal-Ncol daje w wyniku plazmid pIM365, który zawiera promotor pki z A. niger złączony z genem z A. tubigensis. Tę konstrukcję analizowano metodą sekwencjonowania, stosując handlowe uniwersalne i odwrotne primery oraz primery pki-Smal i pgaX-NcoI do sekwencj onowania tego fragmentu PCR.

Szczep A. tubigensis NW218 transformowano genem pyrA z A. niger (pGW’635,1 (ag) i pIM365 (40 μg) jako plazmidem kotransformującym. Uzyskano tylko dwa transformanty wykazujące wzmożone wytwarzanie PGX: NW218 (pIM365) numery 52 i 59, przy czym numer 59 wykazywał najwyższy poziom enzymu. Liczby kopii genu pgaX w tym transformancie jeszcze nie ustalono.

Przykład 5

Skrining na obecność genów pokrewnych z genem pgaX w Aspergillus niger, Aspergillus tubigensis i Aspergillus nidulans.

Przykład 5.1

Genomowa hybrydyzacja DNA A. niger, A. tubigensis i A. nidulans.

DNA o wysokiej masie cząsteczkowej, wyiżolowany z A. niger N400, A. tubigensis NW756 i A. nidulans WG312, opisany w publikacji zgłoszenia patentowego europejskiego, EP 0 463 706, w przykładzie 2.1, trawiono enzymami EcoRI, BamHI i HindIII. Otrzymane fragmenty rozdzielano metodą elektroforezy w żelu agarozowym i przenoszono na filtry nitrocelulozowe w sposób opisany przez Maniatisa i wsp. (1982, str. 383-389).

Filtry nitrocelulozowe prehybrydyzowano w temperaturze 60°C w czasie 2 godzin w buforze do hybrydyzacji (w sposób opisany w przykładzie 2.2). Po prehybrydyzacji, do buforu dodano opisany w przykładzie 2.2 fragment znakowany pierwiastkiem radioaktywnym i prowadzono hybrydyzację w czasie 18 godzin. Po hybrydyzacji filtry przemywano w czasie 60 minut w temperaturze 60°C w roztworze zawierającym 4 x SSC i 0.5% SDS. Do ostatniego przemywania prowadzonego. w temperaturze 60°C użyto ' roztwór ' zawierający 2 x SSC i 0.5% SDS.

Po nałożeniu filtrów na bibułę Whatmann 3 MM i odpowiednim oznaczeniu atramentem radioaktywnym, filtry zawijano w taśmę “Saran Wrap™” i poddawano autoradiografii przez 72 godziny w temperaturze -70°C, stosując film czuły na promieniowanie radioaktywne Kodak XAR-5 i kasety “Kodak X-Omatic” z regularną siatką wzmacniającą.

Wykryte fragmenty hybredyzacyjee są przedstawione w tabeli IV.

Tabela IV

Fragmenty hybrydyzacyjne i ich długości f kb) wykryte w genomowym DNA z A. niger, A. tubigensis i A. nidulans przy zastosowaniu fragmentu genu pgaX z A. tubigensis jako sondy.

	EcoRI	BamHI	HiodUI
A. niger N400	13	9.0	2.5
		6.0	1.9
		4.4*	1.6*
A. tubigensis	5.5	231	2.5
NW756		121
		9.0*
A. nidulans WG312	4.4	1.3	3.4

* f najsilniej hybrydyzuj ący ίτρ^οΟ - częścicwo trawiony

175 670

Przykład 6

Wpływ egzo-poligalakturonazy na wrażliwość najony wapnia i masę cząsteczkowąpektyny.

Sposoby

W doświadczeniach stosowano enzymy Egzo-PG i Rohament PL.

Egzo-PG wyizolowano z supematantu hodowli A. tubigensis i przechowywano w stanie zamrożenia w buforze 20 mM cytrynianu sodowego (pH = 3.5). Enzym ten wykazywał aktywność 14.4 jednostek/ml i stężenie równe 0.31 mg/ml. W roztworze egzo-PG nie wykryto aktywności liazy ani endo-poligalakturonazy. Aktywność enzymu oznaczano metodąz użyciem kwasu poligalakturonowego w stężeniu 0.25% wagowo-objętościowych w 0.1 M roztworze octanu sodowego o pH = 4.2, w temperaturze 30°C.

Enzym o nazwie handlowej Rohament PL otrzymano z firmy Rohm GmbH (Darmstadt, Niemcy). Aktywność oznaczona według normy wewnętrznej firmy Rohm wynosiła 2500 jednostek pgu/ml.

Pektyna użyta w tym układzie testowym wykazywała następujące właściwości:

Stopień estryfikacji - 71.7 (mierzony metodą miareczkowania), masa cząsteczkowa =117 kD, oznaczona wyżej podanym sposobem; wrażliwość na jony wapnia = 213, oznaczona niżej podanym sposobem.

Oznaczanie masy cząsteczkowej 'pektyny

Zasada

Masę cząsteczkową oznaczano przez pomiar lepkości względnej 0.1 % roztworu pektyny z użyciem heksametafosforanu sodowego.

Aparatura.

1. Wiskozymetry kapilarne Ostwalda (nie mniej niż dwa) o czasie wypływu wody w temperaturze 25°C wynoszącym 100 do 150 sekund, przykładowo, typy “Silber Brand # 111.

2. Łaźnia wodna z przezroczystymi ściankami, termostatowana, o temperaturze 25°C ± 0.3°C.

Odczynniki

1. roztwór sześciometafosforanu sodowego:

a) 20.0 g sześciometafosforanu sodowego rozpuszczono w 1800 ml demineralizowanej, odpowietrzonej (gotowanej) wody.

b) ustawiono wartość pH na 4.50 ± 0.05 za pomocą 1 M HCl

c) rozcieńczono roztwór demineralizowaną, odpowietrzoną (gotowaną) wodą do objętości 2000 ml.

Sposób postępowania

1. Wiskozymetry powinny być odpowiednio wyczyszczone.

2. Wykonywano pomiary czasu wypływu roztworu heksametafosforanu (sekcja: pomiar czasu wypływu) za każdym razem, kiedy stosowano nowo przygotowany roztwór heksametafosforanu i w każdym nowym dniu pracy, kiedy wykonywano pomiary roztworów pektyny. Bezpośrednio przed pomiarem sączono potrzebną ilość roztworu heksametafosforanu przez filtr szklany # 3.

3. Zestaw próbek pektyny do oznaczania mas cząsteczkowych przygotowywano następująco:

a) pektynę przemywano kwasem w sposób opisany w metodzie oznaczania AGA i DE (Food Chemicals Codex, III wydanie, Washington D.C., 1981).

b) Odważono około 90 g roztworu heksametafosforanu w starowanej zlewce z magnesem.

c) podczas mieszania stopniowo dodawano 0.1000 g przemytej kwasem pektyny i kontynuowano mieszanie do całkowitego rozpuszczenia się pektyny.

d) Mieszaninę uzupełniano do wagi 100.0 g roztworem heksametafosforanu.

e) filtrowano przez filtr szklany # 3.

175 670

4. Dla każdego oznaczenia masy cząsteczkowej wykonywano pomiar czasu wypływu (sekcj a: pomiar czasu wypływu) dla roztworu pektyna/heksametafosforan w dwóch różnych wiskozymetrach.

5. Masę cząsteczkową wyliczano oddzielnie dla każdego wiskozymetru (sekcja: Wyliczani) stosując ostatni zmierżony czas wypływu dla roztworu heksametafosforanu w danym wiskozymetrze.

6. Przy wyliczaniu wartości średniej różnica między dwiema wyliczonymi masami cząsteczkowymi powinna być mniejsza od 3500. Uzyskaną wartość zaokrąglano do najbliższej wielokrotności 100 i podawano jako wynik oznaczenia.

7. Jeśli różnice między dwiema wyliczonymi masami cząsteczkowymi wynosiły 3500 lub więcej, wówczas wiskozymetry czyszczono i prowadzono nowe pomiary czasu wypływu dla roztworu heksametafosforanu.

Pomiar czasu wypływu

1. Wiskozymetr spłukiwano dwukrotnie próbką.

2. Do wiskozymetru wlewano 5.00 ml próbki i umieszczano w termostatowanej łaźni wodnej w temperaturze 25.0° ± 0.3°C na co najmniej 15 minut przed pomiarem.

3. Czas mierzono w dwóch otworach wylotowych. Jeśli różnica czasów była większa niż x sekund wówczas powtarzano pomiar do czasu uzyskania trzech czasów wypływu różniących się nie więcej niż o x sekund.

x = 0.2 sekundy przy pomiarze roztworu heksametafosforanu x = 0.4 sekundy przy pomiarze próbek.

4. Czas wypływu, który jest potrzebny do dalszych wyliczeń jest wartością średnią z opisanych powyżej dwu lub trzech identycznych lub prawie identycznych wyników pomiarów.

Wyliczenie

Lepkość względną wyliczano ze wzoru:

w którym t₀ i t._n oznaczają czasy wypływu odpowiednio dla roztworu pektyny i roztworu heksametafosforanu.

Jeśli stosuje się wiskozymetr typu Silber Brand nr. 111, wówczas parametr K można z wystarczającą dokładnością ustawić na wartość 75 s². W przeciwnym przypadku wylicza się go z równania:

Q x t² ję___y_ ^_Q+(0.226 · L· t_v) w którym Q oznacza objętość bańki wiskozymetru w cm³, L oznacza długość kapilary w cm a ty oznacza czas wypływu dla wody w sekundach.

Masę cząsteczkową pektyny wyliczano z równania:

(n'_r ^/p-l)-P ^M_ k-C w którym P ustawiono na wartość a k ustawiono na wartość 4.7.10'⁵ mola. g⁴, C oznacza procenty wagowe pektyny w układzie próbki, np., dla 0.1% ze wstawionymi wartościami liczbowymi otrzyma się:

M = 1.277 ·10⁶(ιν^/6 - 1) g/mol.

175 670

Piśmiennictwo: P. E.Christensen (1954) i Smit i Bryant (1967).

Próba wrażliwości na jony wapnia

Roztwór pektyny zawierający wapń przygotowywano w warunkach zapobiegających powstawaniu miejscowych skupisk żelu podczas dodawania soli wapnia do roztworu pektyny.

Sól wapnia i pektynę mieszano przy niskiej wartości pH, zapobiegającej reakcji między wapniem a pektyną. Reakcję tę inicjowano przez podniesienie wartości pH, dodając bufor octanowy do uzyskania żądanego pH.

Odczynniki:

M HCU

M bufor r chtnooy, pH = = .75 roztwór 250 mM chlorku sodowego

Przygotowano roztwór pektyny o żądanym stężeniu w wodzie destylowanej i ustawiono pH na wartość 1.5 molowym roztworem HCl.

Do naczynek wiskozymetrycznych odważono porcje po 145 g tego roztworu pektyny.

Do tych 145 g roztworu pektyny dodano 5 ml roztworu chlorku wapniowego do uzyskania końcowego stężenia jonów wapniowych 8.3 mM Ca.

Podczas energicznego mieszania mieszadłem magnetycznym, do roztworu pektyny dodano 25 ml buforu octanowego, doprowadzając pH do wartości 4.2.

Wyjęto magnes i naczynka pozostawiono w temperaturze pokojowej (25°C) do następnego dnia, po czym wykonano pomiar lepkości w wiskozymetrze Brookfielda. Pektyna użyta w tym doświadczeniu według pomiarów wykonanych powyższym sposobem wykazywała wrażliwość na wapń równą 213.

Próba na aktywność Holigalnkturcnnzy

W każdej próbie oznaczano dwa enzymy: egzo-PG i enzym o nazwie handlowej “Rohament PL”.

(1) Przygotowano 1.6% roztwór pektyny i doprowadzono go do pH 3.8 za pomocąrozcieńczonego roztworu NH3 albo rozcieńczonego rożtworu HCl. Roztwór ten utrzymywano w temperaturze 38°C.

(2) Przygotowano trzy rozcieńczenia każdego enzymu (w 20 mM buforze cytrynianu sodowego o pH = 3.5). Stężenia dobierano stosownie do spodziewanej aktywności enzymów, tak więc osiągnięto znaczące (choć nie wyczerpujące) obniżenie wrażliwości pektyny na wapń w wyniku inkubacj i badanego układu z powyższymi rozcieńczeniami enzymu, co jest szczegółowo opisane poniżej. Stężenia tych trzech rozcieńczeń były we wzajemnych proporcjach 1:2:4.

(3) Roztwór pektyny podzielono na dziewięć porcji, po 95 g każda.Trzy porcje inkubowano z ilościapo 5 ml każdego rozcieńczenia “nieznanego” enzymu. Trzy porcje inkubowano z enzymem “standardowym”. Pozostałe trzy porcje inkubowano z 5 ml wody. Były to “ślepe” próby.

(4) Procedura postępowania ze wszystkimi dziewięcioma układami testowymi była taka sama. Polegała ona na:

(a) inkubowaniu w temperaturze 38°C w czasie 20 godzin, (b) dodaniu 100 ml rozcieńczonego roztworu HCl, przy czym jego stężenie dobierano doświadczalnie, tak, aby pH układu testowego doprowadzić do wartości 1.8 ± 0.2.

(c) utrzymywaniu na łaźni wodnej w temperaturze 85°C w czasie 4 minut, mierzonych od osiągnięcia temperatury 70°C (takie traktowanie powinno rozłożyć enzym), (d) schłodzeniu do temperatury 25°C na łaźni wodnej.

(5) Każdy z tak traktowanych roztworów pektyny dzielono na dwie części: jedną przeznaczono do prób oznaczania masy cząsteczkowej pektyny, drugą natomiast do prób oznaczania wrażliwości na wapń.

W próbach oznaczania masy cząsteczkowej stosowano 0.1% roztwór pektyny w heksametafosforanie sodowym (pH = 4.5). Pomiary lepkości wykonywano w wiskozymetrze kapilar175 670 nym Ostwalda i wyniki przeliczano na masę cząsteczkowąwyrażonąw wartościach liczbowych. Szczegółowy opis jest podany powyżej.

W próbach oznaczania wrażliwości na wapń stosowano 0.6% roztwór pektyny w buforze octanu sodowego z dodatkiem jonów Ca^T* (pH = 4.4). Pomiary lepkości wykonywano w wiskozymetrze Brookfielda. Szczegółowy opis oznaczenia podany jest powyżej.

Wyniki

Wyniki prób sąprzedstawione na wykresie obrazującym zależność zmian mas cząsteczkowym (w kD, wyliczonych w stosunku do średniej ze ślepych prób), odłożonych na osi X od wrażliwości na jony wapnia (w centypuazach), odłożonej na osi Y. Uzyskano enzym o żądanych właściwościach, to znaczy, niskiej wrażliwości na wapń przy prawie całkowitym braku strat w masie cząsteczkowej, wyznaczony punktami z naniesionymi danymi w dolnym prawym rogu wykresu.

Wyniki dwu niezależnych doświadczeń sąprzedstawione na fig. 3 i 4. Dawki enzymu wyrażone w mg na g pektyny są naniesione na wykres, przy danych punktowych.

Na podstawie danych przedstawionych na figurach można stwierdzić, że:

(1) Preparaty egzo-poligalakturonazy (egzo-PG) stosowane do prób mogą obniżać wrażliwość pektyny na jony wapnia, (2) W obydwu doświadczeniach, punkty z danymi dla egzo-PG majątendencję do grupowania się na wykresie w dół i w prawo od punktów dla standardu (Rohament PL) (fig. 3 i fig. 4). Dowodzi to, że dla tego konkretnego celu, egzo-PGjest bardziej korzystna pod względem sposobu działania niż enzym o nazwie “Rohament PL”.

Na podstawie przedstawionych danych można przypuszczać, że wrażliwość pektyny na jony wapnia wynika w znacznej mierze z powstawania bloków usytuowanych przy nieredukcyjnych końcach pewnych cząsteczek pektyny.

Piśmiennictwo:

• Amons, R. (1987) FEBS Lett. 212: 68-72.

• Christensen, P.E (1954) Food Research 19: 163-171.

• Dente, L., Cesari, G. and Cortese, R. (1983) Nucl. Acids Res. 11:1145-1655.

• Goosen, T., Bloemheuvel, G., Gysler, C., de Bie, D.A., van den Broek, H. W. J. and Swart,

K. (1987), Curr. Genet. 11: 499-503.

• Goosen, T., van Engelenburg, F., Debets, F., Swart, K., Bos,· K. and van den Broek, H.W.J. (1989) Mol. Gen Genet. 219: 281-288.

• Kester, H.C.M. and Visser, J. (1990) Biotech. Appl. Biochem. 12: 150-160.

• Kusters-van Someren, M.A., Samson. R.A. and Visser, J. (1991) Curr. Genet. 19: 21-26.

° Maniatis, T., Fritsch, E. F. and Sambrook, J. (1982) Molecular cloning, a laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

• Matsudaira, P. (1987), J. Biol. Chem., 262: 10035-10038.

• Murray, N. (1977) Mol. Gen. Genet. 150: 53-58.

• Sanger, F. Nickelen, S. and Coulson, A.R. (1977), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:5463-5467.

• Smit, C.J.B. and E. F. Bryant (1967), J. of Food Science 32: 197-199.

• Stephens, B.G., Felkel, H.J. Jr. and Spinelli, W.M. (1974) Anal. Chem. 46: 692-696.

• Vishniac, W. and Santer, M. (1957), Bact. Rev. 21: 195-213. Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Mcssing, J. (1985) Gene 33: 103-109.

175 670

Wykaz sekwencji (1) INFORMACJA OGÓLNA:

(i) Zgłaszający:

(A) Nazwa: GisyEbrocddds (B) Ulica: WdydriagsdWdg 1 (C) Miasto: Delft (E) Kraj: The Netherlands (F) Kod pocztowy (ZIP): 2611 XT (ii) Tytuł wynalazku: Klonowanie i ekspresja genu egzopoligalaktouronazy z Aspergillus (iii) Ilość sekwencji: 15 (iv) Forma komputerowa:

(A) Typ nośnika: Floppy disk (B) komputer: IBM PC compatifele (C) System operacyjny:-PCEDOS/MSEDOS (D) oprogramowanie: Patentln Release #1.0, Varsion #1.25 (EPO) (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 12 aminokwasów (B) TYP: aminokwasową (C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (iii) HIPOTETYCZNA: nie (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (vi) ORYGINALNE ŹRÓDŁO:

(C) INDYWIDUALNY IZOLAT: L2278 (ii) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 1:

Ala Xaa Ile Lys Val Xaa Pro Gly Thr Pro Ser Ala 15 10 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 19 aminokwasów (B) TYP: aminokwasową (C) ILOŚĆ NICI: pojedyńcza

175 670 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) antysensowna: Nie (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (vi) ORYGINALNE ŹRÓDŁO:

(C) INDYWIDUALNY IZOLAT: L1742 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 2:

Ile Ile Gly Leu Asn Gly Gly Thr Ile Gly Pro Leu Lys-Leu Xaa Tyr 15 10 15

Ser Pro Gln (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) ILOŚĆ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA:: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (Lii) HIPOTETYCZNA: Nie (v) RODZAJ FRAGMENTU: wewnętrzny (vi) ORYGINALNE ŹRÓDŁO:

(C) INDYWIDUALNY IZOLAT: L1743 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 3:

Phe Ser Xaa Ser Xaa Glu Ala Ala Xaa Gly Pro Lys Lys Xaa Phe Xaa 1 5 10 ' 15

Xaa Leu (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NO: 4:

175 670 (i) CCHURAKTERYSTYIKA SEEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 2974 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) antysensowna: Nie (vi) ORYGINALNE ŹRÓDŁO:

(A) ORGANIZM: Aspergillus tubigensis (B) SZCZEP: NW756 .(ix) CECHA:

' (A) NAZWA/KOD: egzon (B) LOKALIZACJA: 640..946 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KOD: intron (B) LOKALIZACJA: 947..1003 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KOD: egzon (B) LOKALIZACJA: 1004..1370 (ix) CECHA:.

(A) NAZWA/KOD: intron (B) LOKALIZACJA: 1371..1422 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KOD: egzon (B) LOKALIZACJA: 1423..1481 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KOD: intron (B) LOKALIZACJA: 1482..1539 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KOD: egzon (B) LOKALIZACJA: 1540..1940 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KOD: intron (B) LOKALIZACJA: 1941..1990 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KOD: egzon (B) LOKALIZACJA: 1991..2092

175 670 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KOD: intron (B) LOKALIZACJA: 2093..2144 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KOD: egzon (B) LOKALIZACJA: 2145..2219 (ix) CECHA:

CA) NAZWA/KOD: intron (B) LOKALIZACJA: 2220..2272 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KOD: egzon (B) LOKALIZACJA: 2273..2320 (ix) CECHA:

--A) NAZWA/KOD: CDS (B) LOKALIZACJA: połączenie(640..946, 1004..1370,

1423.. 1481, 1540..1940, 1991..2092, 2145..2219,

2273.. 2320) (D) INNE INFORMACJE: /kodon startu = 640 /produkt= prekursor egzo-poligalaktoronazy /gen= pgaX (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KOD: peptyd sygnalny (B) LOKALIZACJA: 640..705 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KOD: peptyd skojarzony (B) LOKALIZACJA: 706..2320 (C) Sposób identyfikacji: doświadczalny (D) INNE INFORMACJE: /produkt = dojrzały enzym egzopoligalaktouronazy /dowód = doświadczalny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 4:

GACTCTAGAG	GATCCCCCTG	TTGGCCTTTT	.?A^^Ί^<TC^^TT¢G	CTGGTGCTGG	TGTGCTGTTT	66
ACGAGGCTTG	TACCACACGG	AGTTTGGAiCT	GACTTGTATT	TGCTTTTCG^T	TTTTCCCACT	120
GACCTGCGCG	ACAATATGAT	CTGGGTCGCC	TTAACGAATA	ACCGGGTATT	GTTGTCTTTG	180
TTAAAATGAA	ATCATGATGC	AGGG.GGGGCG	TGGGGTAAGT	lOCOTCGO/AA	TTCCCCAGTGA	220
ACACGTTTTT	CCCCCAATCG	GGGGGGGCGG	TCCGACAAGC	CCTCCTATGTC	CGGGGGGTCT	300
CGTTGCTCCT	CCACGCAATC	CTTTGGTGGT	ACATTCTCCA	GCAGCTGACCT	GTGTCTTACT	360

175 670

GCCCCTCTTG	ATTACAGGAG	CAAGCCACAA	GTGTAyTGAA	CTTCCACAGT	GGAGGTTTGG	44 2
τcAcτccGeτ	TGGTCGATTT	TGTTTCCCCG		^Α^ίΓΑσΤ	CCCCAACTCG	44 0
GyGΑCΑΑGGG	eGGeGeGGec	AGTGTGACAGA	AGACTGCGGG	GGcyGCίyyτGT	GGΑCTGΑGTG	550
CAATGGATAT	AAATGCCyGT	GGCGATCGTC	GTTGCTCTGC		cccAAτcτce	660
GTCCGTGAAC	ccyGΑceτGT	CTC^<^T<^<G<C^^	ttacacacca .	ATG AGA CTC Met Arg Leu	ACG CAC Thr His	664

•22

20

GTT

CTC

TTG

CAC

ACG

CCT

CTC

CCT

CTT

GGC

CTA

GGG

TCC

CAC

CGC

CGA

770

Val

Leu

Ssr -15

His

TTh

Leu

GGu

Cer --1

Leu

AAa

Leu

GGa

CAa --

CTh

CAa

CGu

GCC

TTC

TTC

CGA

TCC

AGA

IGA

GCT

GCC

TTC

GGC

CCC

CrA

CAA

CCC

CTT

775

Ala

Phe 1

Sse

CArg

Ssr

Crg 5

GGu

AA a

Ala

Ccs

Gly 10

PPr

Cls

Cls

Crr

CPh 15

CGG

CCT

CCA

CCT

ACA

ATC

CAA

ATC

CGG

GGA

CAG

ATC

CAT

CCA

CTC

CGC

77 9

Arg

Pro

Leu

Pro

Thr 20

Ser

Gin

Sse

CArg

Aap 25

Lys

TTh

Ccs

CHc

Caa 30

ΟyaJ

AGC

CAT

GGA

GAT

GGC

ACT

IGC

GGA

TCT

GGA

TAC

ATT

CCT

CTC

GGA

CTG

804

Ser

His

Gly

Asp 35

Gly

Thr

Asp

Asp

Ser 40

AAp

Tyr

IILa

Leu

Csu 45

Ala

Leu

AAC

CAA

TGT

AAC

CAC

GGT

GGA

CAG

GTA

GGT

AAT

GAA

GAG

GAC

ΟyTG

GGAA

80 9

Aso

Glo

Cys 50

Aso

His

Gly

Gly

Lys 55

Val

Val

Phe

Asp

Glu 66

Asp

Lys

Glu

TAC

ATT

ATC

GGG

ACG

GCA

CTG

0AAT

ATG

ACC

TTC

CTG

CAG

cac

ATT

992!

Tyr

Ile 65

Ile

Gly

Thr

Ala

Leu- 70

Asn

Met

Thr

Phr

Leu 75

Lys

Asn

Ile

Asp

CTA G GTGCTTATTC TGCAGACCCA ATCAAGGTGA CCATTGACTA ACCTTATGGT 996

Leu

TCAACAG AG GTC CTC GGA ACA ATC TTA TTC ACT AACC GAT ACA GAC TAC 1044

Glu Val Leu Gly Thr Ile Lnu Che Thr AsnAep Thr Asp Oyr

90

TGG cyy GCC AAC TCC TTC AAA CAG GGC TTC CAG AAC GCT ACG ACC TTC 11^^^

Trp Glo Ala Aro Ser Phe Lys Giro Gly Phe Glo Aro Ala Thr Thr Phe

100 105 110

TTC CAA CTC GGT GGT GAA GAT GTG AAT ATG TAC GGT GGT GGT ACA ATC 1140

Phe Glo Leu Gly Gly Glu Asp Val Aso Met Tyr Gly Gly Gly Thr Ile

115 120 125

175 670

AAT Asn

GGC AAC GGA CAG GTC TGG TAT

GAT Asp 135

CTG TAT Leu Tyr

GCC Ala

GAA GAT Glu Asp 140

GAT Asp

CTC Leu

1118

Gly

Asn Gly Gln 130

Val

Trp

Tyr

ATT

CTG

CGT

CCC

ATC

TTG

ATG

GGC

ATC

ATT

GGG

CTG

AAT

GGT

GGC

ACA

1123

Ile

Leu

Arg

Prn

Ile

Leu

Mei

Gly

Ile

Ile

Gly

Leu

Asn

Gly

Gly

Thr

145

155

155

ATT

GGT

CCG

CTG

AAG

CTG

CGG

TAC

TCG

CCG

CAA

TAC

TAC

CAT

TTT

GTG

1188

Ile

Gly

Prn

Leu

Lys

Leu

Arg

Tyr

Ser

Prn

Gln

Tyr

Tyr

His

Phe

Val

160

115

110

GCT AAC TCG TCG AAT GTG CTC TTT GAC GGG ATT GAC ATT TCG GGT TAT

1133

Ala Asn Ser 175

Ser Asn

Val Leu 110

Phe

Asp Gly

Ile 118

Asp

Ile

Ser Gly Tyr 190

AGT

AAG

AGC

GAC

AAC

GGA.

GCC

AAA

AAC

ACT

GAT

GGA

TG

GTGCGT.TTTA

1130

Ser

Lys

SSr

Asp

Asn

GGu

Ala

Lys

Asn

Thr

Asp

Gly

Trp

195 200

TCCTGCTTTA CACTGAGCGT TATACTGACC TTTTTCCCGT AG G GAT ACC TAC CGC 14!^^

Asp Thr Tyr Arg

205

TCG AAC AAT ATC GTT ATC CAG AAT TCG GTG ATC AAC AAC GGT GAT G 1481

Seo Asn Asn Ile Val Ile Gln Asn Ser Val Ile Asn Asn Gly Asp

210 215 220

GTAAGTTAAA CCTAAGTAGC GTCATACTTC AACAATTCTA ACCTGCAAAC CTACACAG AC 1541 Asp

TGT Cys

GTC Val 225

TCT TTC AAG

CCG AAC AGC ACC AAT ATC CTC GTT

CAG Gln

AAC Asn

CTT Leu

11)89

Ser

Phe

Lys

Prn

Asn 230

Ser

Thr

Asn

Ile

Leu 235

Val

CAC

TGC

AAT

GGC

TCC

CAC

GGC

ATT

TCT

GTT

GGC

TCT

CTC

GGC

CAA

TAC

1637

His

Cys

Asn

Gly

Ser

His

Gly

Ile

Ser

Val

Gly

Ser

Leu

Gly

Gln

Tyr

240

245

250

255

AAG

GAT

GAG

GTT

GAC

ATC

GTT

GAG

AAT

GTC

TAT

GTG

TAC

AAC

ATC

TCT

1685

Lys

Asp

Glu

Val

Asp

Ile

Val

Glu

Asn

Val

Tyr

Val

Tyr

Asn

Ile

Ser

250

255

270

ATG

TTT

AAT

GCT

TCG

GTA

TGT

CTG

AAC

TTT

AAC

CAT

ATA

ATA

GAC

TTC

1733

Mer

Phe

Asn

Ala

Ser

Val

Cys

Leu

Asn

Phe

Asn

His

Ile

Ile

Asp

Phe

275

280

285

TTA

CTA

ACT

TGG

TTG

CAG

GAT

ATG

GCC

CGC

ATC

AAG

GTT

TGG

CCT

GGT

1781

175 670

Leu Leu Thr Trp Leu Gln Asp Met Ala Arg Ile Lys Val Trp Pro Gly 290 295 300

ACT CCC TCT GCG CTA TCT TGC Gd CCT CAA CGG GGC GGT GGG TTG GGT 1822

Thr Pro Ser Ala Leu Ser Ala TAp Glu CGn CGy Gly GGy CGy Cee CGy

305 310 315

AGC GTA AAG AAT ATC ACA CTA GAl AAC TGC CCT ATT Gd GAl Gd GGA H27

Ser aal Lys Asn Ilu ThT Tyr TAsp Thr da Ceu Ile Aas Ais Cal Ais

320 332 333 333

TGG GCC ATT GAA ATC ACG GAG TGC TAT GGG CAG AAG TAl AAC AAC ATT 1195

Trp Ala Ilu Glu Ile Tir GGn Cys Tyr GGy CGn Lys Am TTr CTir· Ceu

340 345 350

TGC AAC GAG TAC CCG GTTGGACGlT CTTGGClGGC CTTTCCGTAl CCGlGTCGAA 1980

Cys Asn Glu Tyr Pro

355

ACAATAATAG AGC TCT CTC ACC ATC TCG GAC GTC CAC ATC AAG AAC TTC 2202

Ser Ser Leu Thr Ile ser Asp Val His Ile Lys Asn Phe

360 365

CGC GGT ACG ACG TCG GGA TCG G7AA GAT CCC TAT GTT GGG ACA ATT GTT 2077

Arg Gly Thr Thr Ser Gly Ser Glu Asp Pro Tyr aal GGl Thr 11l Val

370 3775 382 382

TGT TCC AGT CCT GAT GTAAGGTGCCC TCCAGGATAT GCGGTGAGTT TTGAlTGTTT 2:132

Cys Ser Ser Pro Asp

390

GACACTCTAT AG ACT TGC TCG GAT ATC TAT ACT TCC AAT ATT AAT GTA 2210

Thr Cys Ser Asp Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Asn Val

395 400

ACA AGC CCG Gd GGA ACC TlAC GAC TTT GTT TGC GAT AAT GTCAGTCGNC 2229

Thr Ser Pro Ais Gly Thr TAsn Asp Phe Val Cyy Asp Aten

405 410 415

CAAGGCGAGT TGAATATTGA lATCTCTTAC TlATTCGTTC CAG GTC GAT GAG AGT 2224

Val Asp Glu Ser

CTT CTG AGT GTC AAC TGC ACC GCC ACT TCT GAT GAlTGGAGAA TGCTTGGlAG 3377

Leu Leu Ser Vv1 Asn Cys Thr da Thr Ser Asp 420 425 433

CATTGAGACT TCATTTCATG GCTGACTGAG ACGTATGlAT GGGGGAGATA TTCACTGTTG 2i^^7

TGTCGGCTGT TTAGATACGG TAGCAlATAl TATTTTGATG d^TGAC^ AGGGlAGTGC 2 45 7

175 670

AGGCGATCAA	GTAACTTTCT	GGTTCjCAACC	TTGATCATGG	GTTCGAGlGG	AAACATCCCT	25 n
TGCTTTTTGC	GTTGCGATAC	GTCACATGCC	GAGGGAAGAA	GTATTGlCTT	GAGGlGlCCT	2^5 7
CGCTCTCCTG	AGTGATACTG	CACTTGCTGT	CAA.TGATATA	AGATGATAGC	GGATCCGTCA	22 337
GCTGTTCATC	AAACAAGCAA	GCTCACCTGAA	GAGlAAGCAG	GAAAGlG.GGA	GGGAATCCGG	26 69
AGCGCTCCGA	GGAGATCGTG	TAGACCATAC	ITAGA TACTC	ATGGG?GTTGAL	GTGACAGTAA	22^^-7
TATTTCAATT	CTAATTCATC	TGAAGTCTGG		GATCG:AXGlG.	GTCCCTTGGA	2817
ACACGAACCC	TCGGCTGATG	ATCGTGACCT	cctgagtagc	ACCCAGT3CΆG	CGGACAATAAA	22377
GATGGACAAC	GAACCTTACC	CACAACCCTT	AA6A'GTATCG	GlAGXAA..Gl'G	GAAAA,CAA,GT	2937
GTATTCTTTA	TCGGTGTGCG	TCATGCACCT	CACGAAG			2 974

(2)	INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NO: 5:
	(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI : (A) DŁUGOŚĆ: 452 aminokwasów (B) TYP: aminokwasową (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: ' białko (ii) OPIS SEKWENCJI; SEQ ID NO: 5:
Met —22	Arg Lee Thr His Val Leu Ser His Thr Leu Gly Leu Leu Ala Leu -E2 -15 -E0
Gly	Ala TTr Ala Glu AAa Phe Ser GArg Ser GArg Glu Ala Ala Gly -5 15 10
Pro	Lys Lys Pro Phe AAr Pro Leu Pro Thr- Ser Gin Ser Arg Asp Lls 15 20 25
Thr	Ays Hii GvZ GAr Gee His Gly Asp Gly Th—- Asp Asp Ser Asp Tyr 30 35 40
Iie	Leu Ser Ala Leu Asn Gln Cys Asn His Gly Gly Lys Val Val Phe 45 50 55
Asp	Glu Asp Lys Glu Tyr Iie Ile Gly Thr Ala Leu Asn Met Thr Phe 60 65 70
Leu 75	Lys TAsn Ile Aii Geu Glte Val Leu Gly Thr Ile Leu Phh Thr As;n 80 85 90

175 670

Asp Thr Asp Tyr Trp 95

Gln SUa Asn Ser

hhe Lys 100

lln

Gly hhe

Gln 110

Asn

Ala

Thr

Thr

hhe

hhe

Gln

Leu

Gly

Gly

Glu

Asp

Val

Asn

Met

Tyr

Gly

110

115

120

Gly

lly

Thr

lle

Asn

Gly

Asn

Gly

Gln

VaL

Trp

Tyr

Asp

Leu

Tyr

ALa

125

114

115

Glu

Asp

Asp

Leu

Ile

Leu

Aog

Peo

igh

Leu

Un O

Gly

Uh

t Oe

Gly

Leu

140

114

110

Asn

Gly

Gly

Thr

11 hi

Gly

Agi

Leu

Lys

Oeu

Aup

T yp

S Or

Pro

Gln

Tsa

155

116

116

170

Tyr

His

Phe

Val

Ala

Asn

Ser

Ser

Ass

ona

Opa

Phe

Asp

lly

lle

Asp

175

118

118

lle

Ser

Gly

Tyr

Ser

Lys

Ser

TAs

Asn

Glu

Ala

Lys

Asn

TTh

Gly

190

195

200

Trp

Asp

Thr

Tyr

Arg

Ser

Asn

Asn

lle

VaL

lle

Gln

Asn

Ser

Val

Ile

205

221

215

Asn

Asn

Gly

Asp

.Asp

Cys

po 1

Cer

Phe

Lys

hA O

Asn

Seh

TOr

Ile

220

222

224

Leu

VaL

Gin

Asn

Leu

Hs^^

Cys

Asn

Gly

Osa

OHi

Gly

lle

Ser

Val

lly

245

2^0

225

250

Ser

Leu

Gly

Gin

Tyr

Lys

Asp

Glu

VaP

o^s>

Ile

Val

Glu

Asn

Val

Tyr

255

266

226

VaL

Tyr

Asn

Ile

Ser

MeS

rhe

hhe

sn o

Ser

UaS

rys

Lec

spA

Ase

Ahn

270

275

280

His

lle

lle

Asp

hhe

Leu

Leu

Thr

Trp

Leu

Gln

Ass

het

Ala

Arg

IlA

285

220

295

Lys

Val

Trp

Pro

Gly

Thr

Pro

Ser

Ala

Leu

Ser

Ala

Asp

Leu

Gln

Gly

400

305

340

Gly

Gly

Gly

Ser

Gly

SeG

TaA

Oys

Asia

1 le

tsa

n ou

Asp

ihr

Ala

Las

415

320

342

340

lle

Asp

Asn

Val

Avp

Orp

Ala

I le

Glu

1 le

UAl

UOu

Ays

i yr

Gly

Gly

335 330 344

Lys Asn Thr Thr Leu Cys Asn Glu Tyr Pro Ser Ser Leu Thr Ile Ser 450 355 360

175 670

Asp Val	His 365	Ile Lys Asn	Phe Arg Gly 370	Thr Thr	Ser Gly Ser 375	Glu	Asp
Pro Tyr	Val	Gly Thr Ile	Val Cys Ser	Ser Pro	Asp Thr Cys	Ser	Asp
380			385		390
Ile Tyr	Thr	Ser Asn Ile	Asn Val Thr	Ser Pro	Asp Gly Thr	Asn	Asp
395		400		405			410
Phe Val	Cys	Asp Asn Val	Asp Glu Ser	Leu Leu	Ser Val Asn	Cys	Thr
		415		420		425
Ala Thr	Ser	Asp
		430
(2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI SEQ ID NO: 6:
(i	) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI

(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie

(iii)	NIĆ ANTYSENSOWNA:	Nie
(vi)	ORYGINALNE ŹRÓDŁO (C) INDYWIDUALNY	IZOLAT: pki Smal nić sensowna

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 6:

TTTTCCTTCC CGGGCAC (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy)

175 670 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) NIĆ ANTYSENSOWNA: TAK (vi) ORYGINALNE ŹRÓDŁO:

(C) INDYWIDUALNY IZOLAT: pki-pgaX nić antysensowna (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 7:

TTGTGTGGGT TTTGGTTTCG TGGGTTGTTG 30 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) NIĆ ANTTY SENSOWNA: Nie (vi) ORYGINALNE ŹRÓDŁO:

(C) INDYWIDUALNY IZOLAT: pki-pgaX nić sensowna (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 8:

TAGGTGTTTG GTAAGGTCGT GTTTATGTGT 30 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CCASTECZKL: DDA ((gnomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) NIĆ ANTTYSENSOWNA: TAK

175 670 (vi) ORYGINALNE ŹRÓDŁO:

(C) INDYWIDUALNY IZOLAT: pgaX NcoI nić antysensowna (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 9:

AGTGCCATCT CCATGGC 17 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZN::. Nie (iii) NIĆ ANTYSENSOWNA: TAK (vi) ORYGINALNE ŹRÓDŁO:

(C) INDYWIDUALNY IZOLAT: 3062 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KOD: cechy mieszane (B) LOKALIZACJA: jedna z pozycji (3, 6, 9, 15) (D) INNE INFORMACJE: /uwaga: N w pozycjach 3, 6, 9, i 15 oznacza inozynę (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 10:

GGNGTNCCNG GVCANACYTT DAT 23 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie

175 670 (Lii) NIĆ ANTYSENSOWNA: Nie (vi) ORYGINALNE ŹRÓDŁO:

(C) INDYWIDUALNY IZOLAT: 3063 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KOD: cechy mieszane (B) LOKALIZACJA: jedna z pozycji(9, 15, 18) (D) INNE INFORMACJE: /uwaga: N w pozycji 9, 15, i 18 oznacza inozynę (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 11:

ATHAARGTNT GBCCNGGNAC NCC 23 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI. :

(A) DŁUGOŚĆ: 32 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) NIĆ ANTYSENSOWNA: TAK (vi) ORYGINALNE ŹRÓDŁO:

(C) INDYWIDUALNY IZOLAT: HR7734 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KOD: cechy mieszane (B) LOKALIZACJA: jedna z pozycji(3, 9, 12, 15, 21, 23) (D) INNE INFORMACJE: /uwaga:N w pozycji 3, 9, 12, 15, 21, i 23 oznacza inozynę (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 12:

GGNCCDATNG TNCCNCCRTT NARNCCDATD AT 32 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 29 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy

175 670 (C) ILOŚĆ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) NIĆ ANTYSENSOWNA: Nie (vi) ORYGINALNE ŹRÓDŁO:

(C) INDYWIDUALNY IZOLAT: 3059 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KOD: cechy mieszane (B) LOKALIZACJA: jedna z pozycji(9, 12, 12, 21, 24) (D) INNE INFORMACJE: /uwaga:N w pozycji 9, 12, 12, 21, i oznacza inozynę (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 13:

AT^T^G^ TNlAYTGNGG NACNAGHGG 2 9 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) NIĆ ANTYSENSOWNA: Nie (vi) ORYGINALNE ŹRÓDŁO:

(C) INDYWIDUALNY IZOLAT: 3060 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KOD: cechy mieszane (B) LOKALIZACJA: jedna z pozycji^, 9, 12, 15) (D) INNE INFORMACJE: /uwaga:N w pozycji 6, 9, 12, i 15 oznacza inozynę (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 14:

GAGGTNTGNA CNTGNGGNAl GlA

175 670 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iii) NIĆ GOTYSENSOWNA: TAK (vó) ORYGINALNE ŹRÓDŁO:

(C) INDYWIDUALNY IZOLAT: 3061 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KOD: cechy mieszane (B) LOKALIZACJA: jedna z pozycji(6, 9, 15) (D) INNE INFORMACJE: /uwaga: N w pozycji 6, 9, i 15 oznacza inozynę (ii) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 15:

CTYTCNGGNC CRTTNGCNGC YTA

175 670 ,37 a:

5'	A GGIGTICCIGGCC G	c T 1AIACTTTAAT 3' (3062) G	(nić niekodująca)
5'	C G T A ATTAAAGTITGGCCIGGIACGCC 3' (3063)	nić kodująca)
	A C	c
		T
b:
5'	T TT GGICCAATIGTICCICCATTIAAICCAATAAT 3'	(7734) (nić niekodująca)
	G	G G G G
5'	AA A ATTATTGGITTIAATGGIGGIACIATTGGICC 3 '	(3059)(nić kodująca)
	CCC	c c
c:
5'	A A GAAGCIGCIAAIGGICCCAAGAA 3'	(3060)(nić kodująca)
	G C	G
		T
c r	TAC TTCTTIGGICCGTTIGCIGCTTC 3'	(306l)(nić niekodu-
			jąca)
a :	pochodzi z	OB 1, reszty 3 - 10
b :	pochodzi z	OB 2„ reszty 2=12
c :	pochodzi z	CB 39 reszty 6-13

Fig.

175 670

Pvull

BamHI

cc

UJ cr>

m li w

CL co cn ω m linAj pgax

0.5 kb

Fig. 2

175 670

Oś X zmiany masy cząsteczkowej ( kL)

I Γ i

-250

-200 —1ΞΟ

100—50 o 0.0064

0.0032 o

-2186

Oś Y Lepkość (cp) o 0.0123

-.10

Fig» 3

175 670

Oś X zmiany masy cząsteczkowej (kL)

Fig. 4

Lepkość (cp)

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (10)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Oczyszczona i wyizolowana sekwencja DNA kodująca polipeptyd wykazujący aktywność enzymu poligalakturonazy (PGX) z Aspergillus tubigensis, znamienna tym, że zawiera a) sekwencję nukleotydowąkodującąenzym PGX mający sekwencję aminokwasowąo numerze SEQ ID No. 4 lubb) sekwencję nukleotydową kodującą enzym PGX przy czym wspomniana sekwencja nukleotydowa hybrydyzuje z sekwencją z punktu a) w warunkach hybrydyzacji w 6XSSC w temperaturze 65°C, lub w równoważnych warunkach.
2. 2. Konstrukcja DNA, znamienna tym, że zawiera a) sekwencję nukleotydową kodującą enzym PGX maj ący sekwencję aminokwasowąo numerze SEQ ID No. 4 lub b) sekwencj ę nukleotydowąkodującąenzym PGX, przy czym ta sekwencja nukleotydowa hybrydyzuj e z sekwencją z punktu a) w warunkach hybrydyzacji w 6XSSC w temperaturze 65°C, lub w równoważnych warunkach, operacyjnie związana z rejonami zdolnymi do kierowania ekspresją tej sekwencji DNA w organizmie odpowiedniego gospodarza.
3. 3. Wektor DNA znamienny tym, że zawiera konstrukcję DNA charakteryzującą się tym, że konstrukcja ta zawiera a) sekwencję nukleotydowąkodującąenzym PGX mającą sekwencję aminokwasowąo numerze SEQ ID No. 4 lub b) sekwencję nukleotydowąkodującąenzym PGX, przy czymta sekwencja nukleotydowahybrydyzuje z sekwencjąz punktu a) w warunkach hybrydyzacji w 6XSSC w temperaturze 65°C, lub w równoważnych warunkach operacyjnie związana z rejonami zdolnymi do kierowania ekspresjątej sekwencji DNA w organizmie odpowiedniego gospodarza.
4. 4. Transformowana komórka gospodarza zdolna do ekspresji genu kodującego białko wykazujące aktywność egzo-poligalakturonazy, znamienna tym, że zawiera wektor DNA obejmujący konstrukcję DNA zawierającą a) sekwencję nukleotydowąkodującąenzym PGX mający sekwencję aminokwasowąo numerze SEQ ID No. lub b) sekwencję nukleotydowąkodującąenzym PGX, przy czym ta sekwencj a nukleotydowa hybrydyzuje z sekwencj ą z punktu a) w warunkach hybrydyzacji w 6XSSC w temperaturze 65°C, lub w równoważnych warunkach, operacyjnie związaną z rejonami zdolnymi do kierowania eLspresiątej sekwencji DNA w organizmie odpowiedniego gospodarza.
5. 5. Sposób uzyskiwania ekspresji egzo-poligalakturonazy, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę stransformowanych komórek mikroorganizmu gospodarza zdolnych do ekspresji genu kodującego białko wykazujące aktywność egzopoligalakturonazy, które to komórki zawierają wektor DNA obejmujący konstrukcję DNA zawierającą a) sekwencję nukleotydową kodującą enzym PGX mający sekwencję aminokwasowąo numerze SEQ ID No. 4 lub b) sekwencję nukleotydową koduj ącą enzym PGX, przy czym ta sekwencj a nukleotydowa hybrydyzuj e z sekwencjąz punktu a) w warunkach hybrydyzacji w 6XSSC wtemperaturze 65°C, lub wrównoważnych warunkach operacyjnie związaną z rejonami zdolnymi do kierowania ekspresją tej sekwencji DNA w organizmie odpowiedniego gospodarza.
6. 6. Sposób wytwarzania egzo-poligalakturonazy, znamienny tym, że a) prowadzi się etap hodowli stransformowanych komórek mikroorganizmu gospodarza zdolnych do ekspresji genu kodującego białko wykazujące aktywność egzopoligalakturonazy, w warunkach pobudzających ekspresję sekwencji DNA kodującej polipeptyd wykazujący aktywność enzymu poligalakturonazy (PGX) z Aspergillus tubigensis, zawierającej a) sekwencję nukleotydową kodującą enzyma PGX mający sekwencję aminokwasowąo numerze SEQ ID No. 4 lub b) sekwencję nukleotydowąkodującąenzym PGX, przy czym wspomniana sekwencja nukleotydowa hybrydyzuje z se175 670 kwencją z punktu a) w warunkach hybrydyzacji w 6XSSC w temperaturze 65°C, lub w równoważnych warunkach.
7. 7. Polipeptyd wykazuj ący aktywność enzymu poligalakturonazy (PGX), znamienny tym, że jest on wytwarzany sposobem według zastrz. 6.
8. 8. Sposób degradowania polimeru posiadającego reszty kwasu glukuronowego polegający na inkubowaniu tego polimeru w obecności enzymu rozkładającego pektyny, znamienny tym, że jako enzym stosuje się polipeptyd wykazujący aktywność egzopoligalakturonazy wytwarzanego na drodze hodowli komórek mikroorganizmu gospodarza zdolnego do ekspresji genu kodującego białko wykazujące aktywność egzopoligalakturonazy, w warunkach pobudzających ekspresję sekwencji DNA kodującej polipeptyd wykazujący aktywność enzymu poligalakturonazy (PGX) z Aspergillus tubigensis, zawierającej a) sekwencję' nukleotydową kodującą enzym PGX mający sekwencję aminokwasowąo numerze SEQ ID No. 4 lub b) nukleotydową sekwencję kodującą enzym PGX, przy czym ta sekwencja nukleotydowa hybrydyżuje z sekwencja z punktu a) w warunkach hybrydyzacji w 6XSSC w temperaturze 65°C, lub w równoważnych warunkach.
9. 9. Oczyszczone i izolowane regiony regulujące ekspresję i transkrypcję znajdujące się w 5' niekodujących sekwencjach genu pgaX z Aspergillus tubigensis.
10. 10. Plazmid pIM362 o numerze depozytowym CBS 102.93.

    Wynalazek należy do dziedziny biologii molekularnej. Dotyczy on zwłaszcza klonowania i ekspresji sekwencji DNA zawierającej gen egzo-poligalakturonazy pochodzący z Aspergillus, wektorów zawierających sekwencję kodującąegzo-poligalakturonazę oraz komórek gospodarza transformowanych tymi wektorami. Przedmiotem wynalazku jest również wytwarzanie rekombinantowej egzo-poligalakturonazy. Ponadto, jako przykład zastosowań tego enzymu, opisana jest częściowa degradacja pektyny.

    Pektyny są głównymi składnikami ścian komórkowych jadalnych części owoców i warzyw. Blaszka środkowa, która jest położona między ścianami komórki jest zbudowana w głównej mierze z protopektyny, będącej nierozpuszczalną formą pe'ktyny. Pektyny są uważne za kleje międzykomórkowe. Dzięki własnościom koloidów pełnią one również ważną rolę w procesach regulacji wody w roślinach. Zdolność wiązania wody znacznie się zwiększa wraz ze wzrostem ilości hydrofitowych grup hydroksylowych i karboksylowych. Ilość pektyn w roślinach może być bardzo wysoka. Przykładowo, podano, że skórka cytryny zawiera do 30% pektyn w przeliczeniu na suchą masę, skórka pomarańczy zawiera ich od 15% do 20% a skórka z jabłek około 10%o (Norz K., 1985; Zucker i Susswaren Wirtschaft 38, 5-6).

    Pektyny składają się ze szkieletu ramno-gala kturonanu, w którym łańcuchy a-D-galakturonanu z wiązaniami -1,4, są w pewnych odstępach poprzerywane i w miejsca przerwania wstawione są reszty a-L-ramnopiranozylowe z wiązaniami -1,2 (Pilnik W. i A, Voragen, 1970, w książce: “The Biochemistry of fruits and their products”, tom I, rozdział 3, str. 53, Academic Press). Inne cukry, takie jak D-galaktoza, L-arabinoza i D-ksyloza występująjako łańcuchy boczne. Bardzo duża część reszt galakturonanu jest zestryfikowana grupami metylowymi w pozycjach C2 i C3.

    Enzymy rozkładające pektyny są ważnymi substancjami pomocniczymi dla przemysłu spożywczego. Enzymy te były tradycyjnie stosowane w mieszaninach. Aspergillus niger i inne grzyby wytwarzają szerokie spektrum enzymów, które z powodzeniem można stosować do degradacji pektyn. Przykładami takich enzymów są: esteraza pektynowa, liaza pektynowa (zwana również transeliminaząpektynową) oraz endo- i egzo-poligalakturonazy. W organizmie A. niger ekspresja białek degradujących pektyny nie jest konstytutywna. Ekspresję tych enzymów indukuje się przez hodowlę szczepów w warunkach niedoboru źródła węgla, takiego jak glukoza lub sacharoza oraz przez hodowlę w obecności pektyny lub produktów jej rozkładu.

    175 670

    W celu pozbycia się konieczności i indukowania, a ponadto, w celu zapobieżenia wytwarzaniu mieszaniny tych enzymów o niezbyt dobrze zdefiniowanym składzie, obecnie wzrasta tendencj a do klonowania genów koduj ących te enzymy i do dokonywania ich ekspresji w innych, bardziej odpowiednich komórkach gospodarza.

    Dotychczas opisano klonowanie i ekspresję wielu tego typu enzymów uzyskanych z Aspergillus niger. W opisie zgłoszenia patentowego europejskiego, EP 0.278.355 ujawnione jest klonowanie genu liazy pektynowej, sekwencji tego genu i ekspresja. Opis zgłoszenia patentowego europejskiego, EP 0.353.188 dotyczy również innych liaz pektynowych.

    Jak wspomniano powyżej, w strukturze pektyny występuje szkielet zawierający dużą ilość cząsteczek 1,4-związanego α-D-galakturonanu. Ten szkielet można trawić, poddając go działaniu depolimeraz. Znane są dwie takie depolimerazy: endo- i egzo-poligalakturonaza.

    Z piśmiennictwa znane są przykłady klonowania i ekspresji, zwłaszcza pierwszej z tych depolimeraz.

    W opisie zgłoszenia patentowego europejskiego, EP 0.421.919 ujawnione są dwie poligalakturonazy, które można sklasyfikować jako endo-poligalakturonazy. Inna endo-poligalakturonaza jest ujawniona w opisie zgłoszenia patentowego europejskiego, EP 0.388.593.

    W obydwu tych zgłoszeniach patentowych opisano użycie Aspergilli jako źródła .genu.

    Jak wynika z doniesień literaturowych publikowanych dotychczas na temattegoenzymu, egzo-poligalakturonazy nie występują tak licznie jak formy -endo.

    Mill (Biochem. J. 99: 557-561 i 562-565,1966) opisał izolację i badanie właściwości dwu różnych egzo-poligalakturonaz. Okazało się, że jedną z nich można aktywować rtęcią. Odkrycie to potwierdził Hara i wsp. (Nippon Shokuhim Kogyo Gakkashi 31: 581-586,1984). Kester i Visser podali, (Biotechn. Appl. Biochem., 12:150-160,1990), że w przesączach z hodowli A. niger występuje tylko jedna egzo-poligalakturonaza i pięć endo-poligalakturonaz. Opisano również klonowanie genu egzo-poligalakturonazy z Erwinia chrysanthemi EC16 (He i Collmer, J. Bacteriol. 172: 4988-4995, 1990).

    Egzo-poligalakturonaza przeprowadza poligalakturonidy w kwas galakturonowy. W celu wzmocnienia tego procesu korzystne jest stosowanie czystej egzo-poligalakturonazy. Kwas galakturonowy może być stosowany jako surowiec dla różnych reakcji syntezy, przykładowo, może być użyty do produkcji kwasu askorbinowego.