PL181397B1 - Sekwencja DNA kodujaca chloroperoksydaze wanadowa, wektor ekspresyjny i sposób wytwarzania haloperoksydazy wanadowej PL - Google Patents

Sekwencja DNA kodujaca chloroperoksydaze wanadowa, wektor ekspresyjny i sposób wytwarzania haloperoksydazy wanadowej PL

Info

Publication number
PL181397B1
PL181397B1 PL95341279A PL34127995A PL181397B1 PL 181397 B1 PL181397 B1 PL 181397B1 PL 95341279 A PL95341279 A PL 95341279A PL 34127995 A PL34127995 A PL 34127995A PL 181397 B1 PL181397 B1 PL 181397B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
chloroperoxidase
vanadium
dna sequence
expression vector
gene
Prior art date
Application number
PL95341279A
Other languages
English (en)
Inventor
Philip Barnett
Dirk H Hondmann
Lambertus H Simons
Steeg Pieter F Ter
Ronald Wever
Original Assignee
Unilever Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Unilever Nv filed Critical Unilever Nv
Publication of PL181397B1 publication Critical patent/PL181397B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09D—COATING COMPOSITIONS, e.g. PAINTS, VARNISHES OR LACQUERS; FILLING PASTES; CHEMICAL PAINT OR INK REMOVERS; INKS; CORRECTING FLUIDS; WOODSTAINS; PASTES OR SOLIDS FOR COLOURING OR PRINTING; USE OF MATERIALS THEREFOR
    • C09D5/00—Coating compositions, e.g. paints, varnishes or lacquers, characterised by their physical nature or the effects produced; Filling pastes
    • C09D5/16—Antifouling paints; Underwater paints
    • C09D5/1606—Antifouling paints; Underwater paints characterised by the anti-fouling agent
    • C09D5/1612—Non-macromolecular compounds
    • C09D5/1625—Non-macromolecular compounds organic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38654—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing oxidase or reductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

1. Sekwencja DNA zawierajaca gen struktury kodujacy chloroperoksydaze wanadowa z Curvularia inae- gualis CBS 102.42. 2. Sekwencja DNA zawierajaca gen struktury dla chloroperoksydazy wanadowej Curvularia inaequalis CBS 102.42, jak pokazano na fig. 2. 3. Wektor ekspresyjny zawierajacy poczatek replikacji, sekwencje kontrolujace transkrypcje i terminacje oraz co najmniej czesc sekwencji DNA zawierajacej gen struktury kodujacy chloroperoksydaze wanadowa z Cu- rvularia inaequalis CBS 102.42. 4. Wektor ekspresyjny zawierajacy poczatek replikacji, sekwencje kontrolujace transkrypcje i terminacje oraz co najmniej czesc sekwencji DNA gen struktury dla chloroperoksydazy wanadowej z Curvularia inaequalis CBS 102.42, jak pokazano na fig. 2 5. Sposób wytwarzania haloperoksydazy wanadowej, znamienny tym, ze transformuje sie odpowiednie- go gospodarza wektorem ekspresyjnym zawierajacym poczatek replikacji, sekwencje kontrolujace transkrypcje i terminacje oraz co najmniej czesc sekwencji DNA zawierajacej gen struktury kodujacy chloroperoksydaze wa- nadow a z Curvularia inaequalis CBS 102.42, hoduje sie gospodarza w warunkach, które pozwalaja na ekspresje genu struktury i izoluje sie haloperoksydaze wanadowa. 6. Sposób wytwarzania haloperoksydazy wanadowej, znamienny tym, ze transformuje sie odpowiednie- go gospodarza wektorem ekspresyjnym zawierajacym poczatek replikacji, sekwencje kontrolujace transkrypcje i terminacje oraz co najmniej czesc sekwencji DNA zawierajacej poczatek replikacji, sekwencje kontrolujace transkrypcje i terminacje oraz co najmniej czesc sekwencji DNA gen struktury dla chloroperoksydazy wanado- wej z Curvularia inaequalis CBS 102.42, jak pokazano na fig. 2, hoduje sie gospodarza w warunkach, które po- zwalaja na ekspresje genu struktury i izoluje sie haloperoksydaze wanadowa. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sekwencja DNA kodująca chloroperoksydazę wanadową, wektor ekspresyjny i sposób wytwarzania haloperoksydazy wanadowej.
Podstawa i stan techniki
Różne enzymatyczne środki przeciwbakteryjne są znane w technice. Przykładowo, WOA-94/04217 ujawnia stabilizowane środki do czyszczenia zębów, które mają zdolność do wytwarzania jonów podtiocyjaninowych (OSCN') w stężeniach skutecznych przeciwbakteryjnie. Środki zawierają oksydoreduktazę dla wytwarzania nadtlenku wodoru oraz enzym peroksydazę zdolny do utleniania jonów tiocyjanianowych, które są normalnie obecne w ślinie, do przeciwbakteryjnych jonów podtiocyjaninowych (OSCN'). Odpowiednie peroksydazy obejmują laktoperoksydazę, mieloperoksydazę, peroksydazę ze śliny oraz chloroperoksydazę.
Enzymatyczne środki przeciwbakteryjne zawierające haloperoksydazę są również ujawnione w EP-A-500 387 (Exoxemis). Opisano, że haloperoksydazy wiążą selektywnie i hamują wzrost docelowych mikroorganizmów w obecności nadtlenku i halogenku. Jako odpowiednie haloperoksydazy EP-A-500 387 wymienia mieloperoksydazę (MPO), oksydazę z eozynofili (EPO), laktoperoksydazę (LPO) oraz chloroperoksydazę (CPO). Donoszono, że strosunek halogenku do nadtlenku wodoru jest krytycznym czynnikiem w odniesieniu do stabilności i działania haloperoksydaz. Przy bardzo niskim stosunku, nadtlenek wodoru może hamować działanie haloperoksydazy, podczas gdy przy bardzo wysokich stosunkach halogenek może blokować reak181 397 cję enzymatyczną. Stosunek może zmieniać się w szerokim zakresie, ale korzystnie jest utrzymywany powyżej około 50.
Z powodu niepożądanych reakcji ubocznych nadtlenku wodoru, rzeczywiste stężenie nadtlenku wodoru w środku przeciwbakteryjnym może być niższe niż oczekiwane. A zatem autorzy wynalazku stwierdzili, że bardziej pożądane jest dysponowanie możliwościąużycia wysokiego wyjściowego stężenia nadtlenku wodoru w środku przeciwbakteryjnym w połączeniu ze zwykłą ilością halogenku.
Ponadto, istnieje zapotrzebowanie na enzymatyczne środki przeciwbakteryjne mające spektrum aktywności przeciwbakteryjnej, różniące się od znanych enzymatycznych środków przeciwbakteryjnych. Korzystnie, środki powinny mieć zdolność do wykazywania aktywności przeciwbakteryjnej wobec mikroorganizmów, które są trudne do zwalczenia, np. Streptococcus faecalis. W innych okolicznościach może być pożądane zwalczanie także mikroorganizmów niepatogennych, ponieważ mogą one powodować psucie się produktów żywnościowych.
Sekwencja DNA według wynalazku zawiera gen struktury kodujący chloroperoksydazę' wanadową z Curvularia inaequalis CBS 102.42, korzystnie jak to przedstawiono na fig. 2.
W zakres wynalazku wchodzi też wektor ekspresyjny, który zawiera początek replikacji, sekwencje kontrolujące transkrypcję i terminację oraz co najmniej część sekwencji DNA zawierającej gen struktury kodujący chloroperoksydazę wanadową z Curvularia inaequalis CBS 102.42, korzystnie jak przedstawiono na fig. 2.
Wynalazek obejmuje również sposób wytwarzania haloperoksydazy wanadowej, który polega na tym, że transformuje się komórki gospodarza powyższym wektorem ekspresyjnym, hoduje się stransformowane komórki w warunkach, które pozwał ająna ekspresję genu struktury i izoluje się haloperoksydazę wanadową.
Wytworzona w ten sposób haloperoksydaza wanadowa może być stosowana jako składnik enzymatycznych środków przeciwbakteryjnych, które oprócz haloperoksydazy zawiei^ćyiąźródło halogenku i nadtlenku wodoru lub źródło nadtlenku wodoru. Takie środki mogą być użyte do czyszczenia twardych powierzchni i prania tkanin, jak również higieny i czyszczenia w zastosowaniach przemysłowych/instytucjach, takich jak szpitale i do czyszczenia i dezynfekcji sprzętu medycznego. Innym zastosowaniem jest przemysł mleczarski, gdzie mogą być stosowane do dezynfekcji sprzętu mleczarskiego. Środki przeciwbakteryjne mogą być również z powodzeniem użyte w dezodorantach ze względu na ich zdolności do zwalczania bakterii, które powodują przykry zapach.
Wynalazek jest zilustrowany następującymi przykładami.
Przykład I.
Sposób określenia sekwencji kodującej genu dla chloroperoksydazy (cDNA) i genu z Curvularia inaequalis (Centraal Bureau voor Schimmelcultures, 25 Netherlands, strain No 102.42) i możliwe systemy ekspresyjne.
Chloroperoksydaza była izolowana i oczyszczana z hodowli płynnych C. inaequalis jak opisano przez Van Schijndel i wsp., 1993), z tą różnicą, że po chromatografii DEAE wykonano dwa dodatkowe etapy oczyszczania stosując system FPLC (Pharmacia LKB). Najpierw użyto kolumny opartej o oddziaływania hydrofobowe z fenylo-sefarozą C1-4B dla związania enzymu w obecności 2 M NaCl w 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), i następnie elucji zstępującym gradientem od 2M NaCl w 50 mM Tris-HCl (pH 8,3). Dla ostatecznego oczyszczenia do związania enzymu użyto anionowymiennej kolumny MonoQ HR 5/5 (z Pharmacia LKB), po czym wymywanie gradientem od 0 M do 0,5 M NaCl w 20 mM piperazynie-HCl (pH 5,4). Następujące po tym zatężanie enzymu przeprowadzono stosując rotacyjne odparowanie, a następnie dializę wobec buforu 50 mM Tris-SO4 (pH 8). Oczyszczana chloroperoksydaza była trawiona enzymatycznie odpowiednio, proteazami ze Staphylococcus V8 i trypsyną, zgodnie ze standardowymi sposobami znanymi w tej dziedzinie lub przecinana chemicznie CNBr (Gross, E.(1967), Methods Enzymology 11,238-255). Uzyskane peptydy rozdzielano stosując SDS-PaGe według Laemmli (Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 680-685) lub w żelu z tricyną według Sehagger i Von Jagow (1987), a następnie przenoszono na filtry PVDF (Immobilon-P z Millipore), stosując bufor do przenoszenia CAPS (10 mM kwas 3-[cykloheksyIamino]-1-propanosulfonowy, 10% methanol, pH 11), jak opisano przez Matsudaira (1987). Po elektroforetycznym wymyciu filtr płukano przez 5 min wodą dejonizowaną, barwiono 0,1% Błękitem Coomassie R-250 w 50% metanolu przez 5 min i odbarwiano w 50% metanolu, 10% kwasie octowym przez 10 min w temperaturze pokojowej i suszono na powietrzu. Prążki białkowe były poddawane automatycznemu sekwencjonowaniu Edmana w urządzeniu do sekwencjonowania białek Porton LF 3000 (Beckman Instruments, Inc., USA).
Wyniki oznaczania sekwencji aminokwasowej są zebrane na fig. 1.
W oparciu o sekwencję aminokwasową peptydów zaprojektowano całkowicie zdegenerowane oligonukleotydy przedstawione w poniższej tabeli.
Tabela
Startery oligonukleotydowe (20-mery), oparte na sekwencjach aminokwasowych z chloroperoksydazy wanadowej z Curvularia inaeąualis.
I: inozyna
A/G: w tej pozycji użyta jest w równych ilościach mieszanina A i G.
C/T: w tej pozycji użyta jest w równych ilościach mieszanina C i T.
G/A/T/C: w tych pozycjach użyta jest w równych ilościach mieszanina G, A, C i T.
Oligo 1:
5'-T A C/T A T G A A A/G C C I G TI G A A/G C A -3'
Oligo 2:
5' - A G/A T/C T G I G C G/A T AI G C G/A T T G/A T C-3'
Oligo 3:
5' - G A C/T G A A/G A CI G C IG A A/G T A C/T G A-3'
Oligo 4:
5' - A G/A I G C T/C T G I G C I C C G/A/T/C C C C A T-3'
Te zdegenerowane startery zostały użyte w łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR), w której stosowano jako matrycę pierwszą nić cDNA. Pierwszą nić cDNA przygotowano jak następuje:
Celem wyizolowania RNA, sporami C. inaeaąualis inokulowano podłoże fermentacyjne zawierające 4 g ekstraktu drożdżowego i 2 ml roztworu mikroelementów (Van Schijndel i wsp., 1993) na litr. Po kilku dniach hodowli grzybnia była zbierana poprzez filtrowanie i liofilizowana. Zliofilizowaną grzybnię C. inaeąualis mielono w ciekłym azocie. RNA ekstrahowano poprzez dodanie buforu do ekstrakcji RNA (42 mM cytrynian sodu pH 7,83% N-sarkozynian laurynowy, 50 mM beta-merkaptoetanol, 1% Triton Χ-100 i 4 M izotiocyjanian guanidyny) i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dodawano 0,1 objętości 2 M octanu sodu (pH 4) i 1 objętość fenolu : chloroformu : alkoholu izoamylowego (25:24:1) i mieszaninę umieszczano w lodzie na 15 minut. Po odwirowaniu prze 10 min. przy 10000 x g (4°C) zbierano fazę wodną, dodawano 1 objętość absolutnego alkoholu i mieszanina była inkubowana przez 1 godzinę w-20°C, a następnie krótko odwirowywana przy 10000 x g. Osad zawieszano w odpowiedniej objętości buforu do ekstrakcji RNA i frakcjonowano poprzez ultrawirowanie w gradiencie chlorku sodu. (Sambrook i wsp., 1989). Osad starannie przemywano przechowywano w 75% roztworze etanolu w -70°C. Celem izolowania mRNA, RNA był wytrącany i zawieszany w wodzie wolnej od RNAzy, po czym mRNA był ektrahowany przy zastosowaniu zestawu do izolacji mRNA polyAtract (Promega Corporation, USA). Syntezę pierwszej nici cDNA przeprowadzono na mRNA wyizolowanym z C. inaeąualis stosując zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA Pharmacia (Pharmacia Biotech).
W oparciu o sekwencję aminokwasową peptydów chloropeptydazy zaprojektowano cztery 20-nukleotydowe Ollgomikleotydy (patrz również tabela VII) i użyto jak startery w reakcjach łańcuchowych polimerazy z pierwszą nicią cDNA z C. ineaqualis jako matrycą. Reakcje łańcuchowe polimerazy wykonano stosując termocykler (Eppendorf mastercykler 5330) i polimerazę Taq (Promega Corporation). Dla optymalnej amplifikacji cDNA kodującego chloro181 397 peroksydazę przy zastosowaniu zdegenerowanych starterów reakcja łańcuchowa polimerazy była przeprowadzana w 46°C (etap przyłączania) przez 30 cykli. Dwa uzyskane specyficzne fragmenty były poddawane ligacji z wektorem pUC18, klonowane i sekwencjonowane z obu nici. W oparciu o wyniki sekwencjonowaniaDNA zaprojektowano następujące dwa specyficzne startery:
5'- CATAGCGATAGCGACGCGGA-3' i
5'-CTAACCCCGGCGCCAACATC-3'
Te dwa startery zostały użyte w reakcji łańcuchowej polimerazy z pierwszą nicią cDNA jako matrycą. W ten sposób otrzymano specyficzny dla genu fragment DNA, łącząc dwie znane sekwencje DNA. Fragment ten został sklonowany w wektorze pUC 18, a następnie ustalono jego sekwencję. Dla uzyskania regionu 5' mRNA kodującego chloroperoksydazę użyto zestaw 5'-Amplifmder RACE kit (Clonetech Corporation). Gen dla chloroperoksydazy z genomu C. ineaqualis izolowano jak następuje:
Genomowy DNA C. ineaqualis izolowano ze zliofilizowanej grzybni, która była mielona w ciekłym azocie i ekstrahowana odpowiednią ilością buforu do ekstrakcji (200 mM Tris-HCl, pH 8,5,25 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1 % SDS i 0,2 mg na ml proteinazy K). Po całonocnej inkubacji w temperaturze pokojowej dodawano 0,7 objętości fenolu i 0,3 objętości chloroformu i energicznie mieszano. Probówki odwirowywano przy 10000 x g i warstwę wodną przenoszono do czystej probówki. Genomowy DNA wytrącano 2 objętościami absolutnego etanolu. Po odwirowaniu przez 5 min przy 5000 x g osad zawieszano w 2 ml. 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA i traktowano RNAzą (Boehringer Mannheim), tak jak zalecał producent. Roztwór zawierający genomowy DNA ekstrahowano mieszaniną fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (25:24:1) i po wytraceniu etanolem ostatecznie rozpuszczano w odpowiedniej objętości buforu 10 mM Tris-HCl, pH 8,1 mM EDTA. Do analizy metodą Southema, DNA genomowy był trawiony kilkoma kombinacjami enzymów restrykcyjnych i po elektroforezie w żelu agarozowym przeniesiony na filtr nitrocelulozowy (Sambrook i wsp., 1989).
Hybrydyzację przeprowadzono stosując wyznakowany radioaktywnie fragment genu (namnożony przy użyciu dwóch specyficznych starterów opisanych powyżej), który wytworzono poprzez losowe startery, stosując dATP wyznakowany alfa-32P (Sambrook i wsp., 1989). W oparciu o otrzymane wyniki sporządzono minibibiotekę, stosując genomowy DNA strawiony Pst I, który wstawiono do wektora pUC18. Bibiotekę poszukiwano taką samą sondą, jak opisana przy technice Southema. Klon pozytywny izolowano i również częściowo sekwencjonowano z dwóch nici dla potwierdzenia wyników dotyczących sekwencji cDNA. Gen kodujący chloroperoksydazę C. inaequalis i jego postulowany produkt są przedstawione na fig. 2.
System wytwarzania chloroperoksydazy w Saccharomyces cerevisiae został utworzony jak następuje:
Dobrze znany indukowany promotor drożdżowy GALI otrzymano jako fragment Eco R1 Bam HI z genu GALI z dzikiego szczepu S.cerevisiae (Molecular i Cellular Biology 10, 47574769,1990) i sklonowano w miejscach EcoRl i BamHl, odpowiednio w plazmidach YCplac33 i YEplac95 (Gietz i Sugino (1988) Gene 74, 527-534). Otrzymane plazmidy nazwano odpowiednio TNT1 i TNT2. Przed początkiem 5' genu dla chloroperoksydazy C. inaequalis utworzono miejsce restrykcyjne BamHł poprzez przeprowadzenie reakcji PCR, stosując jako matrycę, fragment 5' Pst I i Eco RI genu dla chloroperoksydazy C. inaequalis subsklonowany w pUC 18 i jako startery: 22 nukleotydowy starter do sekwencjonowania M13/pUC lewy (ang. revers) oraz starter:
5' GAG AGA GGA TCC ACT CAC TAC TTA CAA TCA CAC 3'
Namnożony fragment był trawiony Bam HI i Eco RI. Fragment Eco RI Pvu II genu dla chloroperoksydazy z C. inaequalis, zawierający część 3' genu był klonowany w pUC18 strawionym Eco RI Sma I. Z tego klonu, po strawieniu go Eco RI i Xba I, oczyszczono fragment zawierający część 3' genu dla chloroperoksydazy C. inaequalis. Wykonano potrójną ligację, która obejmowała bądź TNT1, bądź TNT2, każdy strawiony Bam HI i Xba I, i fragment 5' Bam
181 397
HI Eco RI oraz fragment 3' Eco RI Xba I. Otrzymane po ligacji i klonowaniu plazmidy sprawdzono, czy są właściwe. Otrzymane w ten sposób plazmidy zostały nazwane odpowiednio TNT3 (pochodzący z TNT1) i TNT4 (pochodzący z TNT2).
Szczep drożdży BJ1991 transformowano odpowiednio plazmidami TNT3 i TNT4, zgodnie ze znanymi w tej dziedzinie sposobami i selekcjonowano transformanty ura+. Transformanty ura+ replikowano na płytki-YP zawierające bądź glukozę (2%), bądź galaktozę (2%) . Po wyrośnięciu, z płytek pobierano trochę komórek i zawieszano w 200 μΐ 20 mM Tris-HCl pH 8,1. Po 5-minutowej inkubacji pobierano 10 μΐ płynu i nakraplano na filtr nitrocelulozowy. Filtry nitrocelulozowe inkubowano w buforze: 100 mM octan sodu (pH 5,5), 1 mM orto-dianizydyna, 100 mM KBr i 2 mM H2O2. Powstawanie wyraźnego zabarwienia obserwowano dla wszystkich plam pochodzących ze szczepów rosnących na galaktozie, podczas gdy brak powstawania zabarwienia obserwowano dla drożdży rosnących na glukozie. Pokazuje to, że skonstruowano indukowany galaktozą system wytwarzania produktu dla genu chloroperoksydazy z Curvularia inaeąualis w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Podobny test, z wykorzystaniem buforu 100 mM fosforan potasu (pH 6,5), 100 mM KBr, 1 mM H2O2 i 40 pM czerwień fenolowa (BDH), wyraźnie pokazuje powstawanie błękitnego/purpurowego zabarwienia z płytami z drożdży rosnących na galaktozie, podczas gdy zmiana koloru nie zachodziła dla płynów z drożdży rosnących na glukozie. Celem dalszego potwierdzenia, że stworzony został system ekspresji genu dla chloroperoksydazy C. inaeąualis w drożdżach, który wytwarza chlorperoksydazę o takim samym działaniu jak chloroperoksydaza C. inaeąualis, zrekombinowany enzym oczyszczano z zaindukowanych galaktozą szczepów drożdży transformowanych TNT3 lub TNT4. Po hodowli w podłożu zawierającym galaktozę, komórki drożdży były zbierane i zawieszane w 20 mM Tris-HCl (pH 8,1).
Następnie dodawano jałowe kulki, po czym zawiesina była energicznie wytrząsana. Po odwirowaniu przez 15 minut przy 10000 x g zbierano supernatant i nakładano na kolumnę z DEAE i zrekombinowany enzym oczyszczano, stosując zasadniczo taki sam sposób oczyszczania jak dla enzymu z dzikiego szczepu C. inaeąualis (patrz wyżej). Po oczyszczeniu otrzymano zrekombinanowaną chloroperoksydazę o aktywności specyficznej 22 jednostki na mg białka (oznaczonej w buforze 100 mM octanu sodu pH 5,0,1 mM H2O2,5 mM chlorek potasu i 50 pM MCD, patrz również van Schijndel o wsp., 1993), która bardzo dobrze przypomina aktywność specyficzną około 20 jednostek na białko, otrzymaną dla oczyszczonej (patrz wyżej) chloroperoksydazy z samego C. inaeąualis. Profile aktywności przy różnych wartościach pH dla chloroperoksydazy typu dzikiego i zrekombinowanej chloroperoksydazy pochodzącej z drożdży są pokazane na fig. 3. Figura 3 dostarcza dalszych danych, że zrekombinowany enzym wytwarzany w drożdżach ma taką charakterystykę funkcjonalną, jak enzym dzikiego typu.
Przykład 2
Poszukiwanie odpowiednich haloperoksydaz w mikroorganizmach
Mikroorganizmami użytymi w tym przykładzie są Curvularia inaeąualis (CBS 102.42), Drechslera biseptata (CBS 371.72), Drechsleraffugax (CBS 509.77), Drechslera nicotiae (CBS 655.74), Drechslera subpapendorfii (656.74), Embelisia hyacinthi (416.71), Embelisia didymospora (CBS 766), Ulocladium chartarum (200.67) i Ulocladium botrytis (452.72). Różne grzyby hodowano na płytkach agarowych. Po zakończeniu wzrostu białka zewnątrzkomórkowe przenoszono (przeniesienie metodą replik) na filtr nitrocelulozowy, który był uprzednio namoczony w buforze 50 mM Tris-HCl (pH 8.3). Po 15 minutach inkubacji na płytkach agarowych, filtr był testowany na aktywność haloperoksydazy poprzez zanurzenie filtru w 100 mM octanie sodu (pH 5,5) lub fosforanie potasu (pH 6,5 i 7,5), 1 mM ortodianizydynie, 2 mM nadtlenku wodoru w obecności i nieobecności 0,1 M bromku potasu. W ten sposób mogło być wykrywane wytwarzanie bromoperoksydazy i/lub chloroperoksydazy'. Celem zbadania, czy wytwarzana haloperoksydaza jest haloperoksydazą zawierającąwanad, opisany powyżej test był powtarzany w obecności i nieobecności 10 i 100 pM wanadanu sodu.
W przypadku haloperoksydazy zawierającej wanad, w sytuacji, gdy dodawany jest wanadan, można obserwować zwiększenie sygnału. Celem zbadania, czy zidentyfikowana chloro181 397 peroksydaza jest rzeczywiście podobna do haloperoksydazy wanadowej, z C. inaegualis. niewielka ilość chloroperoksydazy była oczyszczana (zasadniczo jak opisano w van Schijndel i wsp., 1993) z Ulocladium chartarum, Embelisia didymospora i Drechslera subpapendorfii. Optima pH tych enzymów wahały się od pH 4,5 do 5,5. Aktywność chlorująca tych enzymów zwiększała się po dodaniu wanadami, co wyraźnie wskazuje, że enzymy te są rzeczywiście haloperoksydazami wanadowymi. Celem dalszego zbadania podobieństwa zidentyfikowanych enzymów z chloroperoksydazą wanadową z C. inaeąualis, jedna ze zidentyfikowanych haloperoksydaz była dalej charakteryzowana. Wybrana do tego została chloroperoksydaza wytwarzana przez grzyba. Drechslera biseptata (CBS 371.72). Ma ona własności podobne do chaloperoksydazy z Curvularia inaeąualis, to jest wysoką termostabilność i wysokie powinowactwo do substratu. Śledzono również spektrum EPR dla oczyszczonego enzymu.
Jak w przypadku innych haloperoksydaz wanadowych (de Boer wsp., 1988; Wever wsp.,
1988) , utleniony enzym nie daje sygnału przy pomiarze EPR; jednakże po redukcji ditianianem sodu obserwuje się typowe spektrum, wanadylowe EPR (dane nie pokazane). Izotropowe parametry EPR g0 wynoszące 1,969 i Ao o wartości 9.0 mT są prawie takie same, jak stwierdzane dla enzymu z C. inaeąualis (Wever i wsp, 1985). Ponadto, oczyszczony enzym został rozdzielony na peptydy przy użyciu proteaz i bromocyj anu. Mapy peptydowe wykazywały te same wzory, sugerujące, że te dwa enzymy maja dużąhomologię sekwencji. Rzeczywiście, tak jest, ustalono sekwencję dwóch rodzielonych pochodzących z enzymów peptydów, które zostały otrzymane poprzez działanie na enzym proteazą, i które oczyszczono. Sekwencje wykazały dużąhomologię. a zatem można wyciągnąć wniosek, że te dwa enzymy są bardzo podobne.
Sekwencja aminokwasowa poptydu z C. inaeąualis:
(Asp)-leu-arg-gln-pro-tyr-asp-pro-thr-ala-pro-ile-glu-asp-gln-pro-gly-ile-val-arg-thrSekwencja aminokwasowa podobnego peptydu z D. biseptata:
Asp-leu-arg-gln-pro-tyr-asp-pro-thr-ala-pro-ile-glu-glu-gln-pro-gly-gly-ile-val-arg-thrOdpowiednie haloperoksydazy zawierające wanad mogą być zatem identyfikowane poprzez zastosowanie techniki replik, w której badane jest zwiększenie aktywności po dodaniu wanadanu, i/lub poprzez (częściowe) oczyszczenie enzymu i szukanie zwiększenia aktywności po dodaniu wanadanu.
Przykład 3
Poszukiwanie odpowiednich haloperoksydaz w innych mikroorganizmach.
W tym przykładzie opisano, w jaki sposób sonda radioaktywna pochodząca a genu dla chloroperoksydazy z Curvularia inaeąualis może być użyta do wykrywania homologicznych genów w innych mikroorganizmach. Wykonano to jak następuje:
Chromosomalny DNA z C. inaeąualis (CBS 102.42), Embelissia didymospora (CBS 766.79) i Drechlera biseptata (CBS 371.72) oczyszczano zasadniczo jak opisano dla chromosomalnego DNA C. inaeąualis (jak opisano w przykładzie 1). Do analizy genomowego DNA metodą Southema, DNA był trawiony kilkoma kombinacjami enzymów restrykcyjnych i po elektroforezie w żelu agarozowym przeniesiony na filtr nitrocelulozowy (Sambrook i wsp.,
1989) . Hybrydyzację przeprowadzono stosując wyznakowany radioaktywnie fragment genu, który wytworzono przy użyciu losowych starterów, stosując dATP wyznakowany alfa-32P (Sambrook i wsp., 1989). Użyty specyficzny dla genu fragment był namnażany (przed znakowaniem radioaktywnym) w reakcji łańcuchowej polimerazy, stosując pierwszą nić cDNA (patrz przykład 1) jako sondę i wykorzystując stertery:
5' - CACGATGGGGTCCGTTACAC i 5' - GTACCGCTATCGCTGCGCCTG Warunki hybrydyzacji były następujące:
Do prehybrydyzacji i hybrydyzacji używano jako buforu 6 x SSPE 5 x roztwór Denhardta, 0,5% SDS i 10 mg DNA ze spermy łososia. Prehybrydyzację prowadzono przez 1 godzinę w 55°C, a następnie sonda radioaktywna była gotowana przez 1 min, po czym bezpośrednio dodawana. Następnie hybrydyzację kontynuowano przez noc. Autoradiogram, który otrzymano dla DNA z Curvularia inaeąualis i Drechlera biseptata jest przedstawiony na fig. 4. Na fig. ścieżka 1:
181 397
DNA lambda; ścieżka 2: nie trawiony genomowy DNA z C. inaequalis; ścieżka 3: to samo, trawienie Eco RI; ścieżka 4: trawienie Bam HI; ścieżka 5: Eco RI i Bam HI; ścieżka 6 trawienie Xbal; ścieżka 7 Pst I; ścieżka 8 Xbal i Pst I; ścieżki 9-14: to samo, stosując D. biseptata. Jak widać na figurze pozytywny sygnał otrzymano dla chromosomalnego DNA z Drechslera biseptata, co wskazuje na wysoki stopień podobieństwa obu genów. Podobne wyniki otrzymano dla DNA z Embellisia didymospora. Wnioskujemy zatem, że gen dla chloroperoksydazy, lub części pochodzące z tego genu, lub sondy oparte o sekwencję genu dla chloroperoksydazy z C. inaequalis, mogą być użyte do wykrywania odpowiedniej haloperoksydazy wanadowej z innych mikroorganizmów-·.
181 397
Fig.1.
Sekwencje peptydowe pochodzące z chloroperoksydazy wanadowej sekwencja sposób cięcia
C. ina.egua.lis
1ML- -LYMKPVEQPNPNPGANISDNAYAQLGLVLDRSVLEAa CNBr (S) NADETAEYDDAVRVAIAMGGAOALNSa
3(G)YHPTPGRYKFDDEP
4IDEPEEYN (D)LRQPYDPTAPIEDQPGIVRTb
D. biseptata
LNGLNRDLRQP YDPTAPIEEQPGIVb asekwencje podkreślone są użyte < zdegenerowanych starterów DNA. bhomologiczne sekwencje pomiędzy wytłuszczone.
Trypsyną
Trypsyną
Trypsyną
Trypsyną
V8 prot. zaproj ektowania .inaegualis i D.biseptata są
181 397
o UO O CN r~H o oo O ’Τ Cs| o o m o uo m O CM •n· o co •n· o «σ m o o uo O UO uo o CM r* o co Γ o vf· co O o σλ
α to to to tf 0 to 0 0 to 0 0 0 tf tj·
u to 0 0 2 d to to 0 0 tf to 0 0 •A, r \
tf 0 0 0 0 0 0 tf to 0 0 to 0 0 r\
o to 0 tf 0 0 0 0 to 0 to 0 0 0 tj·
0 to 0 0 tf to to 0 tf 0 tf tf 0 r j
2 tf to to 0 0 to to 0 0 0 0 0 tf tt*
o 0 0 0 to 0 0 to to to 0 0 0 to ri
tf tf d to 0 to 0 0 0 0 to tf tf 0 f
to 0 0 0 0 0 0 d 0 tf to 0 0 0
O to 0 0 to 0 to 0 tf to to 0 to 0 \-Z H
tf 0 to to d 0 to 0 0 0 0 0 tf tf C_|
O tf 0 to 0 0 0 0 0 0 0 tf to 2 u* gj·
*5 2 0 0 to 0 0 tf to 2 0 0 0 0 Γ)
to to 0 «3? tf d 0 0 2 to tf tf 0 £-1
o 0 tf tf 2 2 0 to 0 0 tf 0 0 tf 0
u 0 to 0 2 0 to 0 to to 0 0 0 0 □
0 0 0 0 0 to 0 d tf tf 2 0 0 0
u 0 0 tf 0 d O 0 0 0 2 tf 0 to 2
tf 0 0 0 to 0 to tf 0 0 0 to 0 0 2
2 tf to to 0 d tf 0 tf tf 0 0 0 tf o
o d 0 to 0 to to 0 tf 0 0 0 tf tf £-(
to 0 to 0 to 0 to 0 0 to to to 0 0 0
tf to 0 tf d to 0 tf to to 0 to tf to 0
O 0 0 0 2 0 0 0 0 to 0 to 0 0 0
O < 0 0 to tf 0 0 0 tf to to 0 to H
to 2 0 0 0 0 tf to to 2 tf 0 tf 0
tf 0 d tf 0 to 2 0 0 2 2 0 0 0 0
0 0 0 0 0 to 0 0 tf to to 0 0 0 0
tf to 0 0 0 0 tf 0 0 tf 0 tf 0 tf
tf to 0 0 d to 0 0 0 to 0 2 0 0 H
to to to to to 0 0 to 0 0 0 0 to to 0
O 0 0 0 0 to 0 0 to 0 2 0 tf 0 0
0 0 to 0 0 0 to 0 to 0 2 tf tf 0 0
0 0 0 0 fi 0 0 to 0 0 0 0 to to 0
to to to 0 to to to 0 to 0 tf 0 0 0 0
O 0 0 to 0 d d 0 to 0 tf tf to 0
tf to to 0 to 0 0 tf 0 0 0 0 to to 0
0 tf 0 to 0 tf 2 0 to 0 0 tf 0 0
o 0 0 d 0 2 2 0 0 0 0 tf 0 0
• o 0 tf to 0 0 0 0 to tf 0 0 0 0
C\l to tf 0 0 tf to 0 tf tf 0 tf 0 to to E-i
d 2 0 to to 0 0 0 0 tf 0 0 0 tf 0
Ó) O 0 d to 0 0 0 0 0 to tf 0 0 0 0
o o 0 to 0 0 0 to 0 0 to tf 0 0 O
• mu 0 to o to 0 0 0 0 0 0 0 to 0 0 0
LL tf 0 0 0 0 to 0 to tf 0 tf 0 0 0 O
0 to 0 tf 0 0 0 to to tf 0 to 0 to
tf to d to 0 0 0 0 0 0 0 to 0 tf 0
to d 0 0 to d 0 tf to 0 to tf tf to
to to to 0 tf 0 tf 0 tf tf to 0 0 0 u
0 0 0 0 d 0 tf to 0 to tf 0 0 0 0
0 d 0 0 0 to to tf 0 0 0 0 0 0
0 to 0 tf d 0 0 0 tf 0 to 0 tf to 0
to d 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 to 0 0 0 to 0 0 0 0 0 0
0 d 0 tf 0 to tf tf 0 tf to tf 0 0
0 to 0 0 tf 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 tf to to d to 0 to 0 0 0 0 0 0
to 2 0 to tf 0 0 to to tf to tf to to 0
tf 2 0 tf 0 0 0 0 to 0 0 to 0 0
181 397 (Cont.) (c.d.)
o o O O o o O O o O o O O O o o
uo CM 00 o uo CM 00 T o uo CM CD o n
CK o o rH CM CM m m m uo UO UO r- co co
rH rH r-4 i—I rK «—< r-1 r4 i—ł rH rH t-4 r-1 ł-H
0 0 0 Eh 0 0 0 (tf 0 Eh 0 0 0 0 0
(tf H 0 0 (tf 2 Eh 0 0 (tf (tf 0 o (tf (tf
0 0 0 »tf Eh 2 tZ 0 Eh 0 0 (tf 0 0 0
u 0 0 0 Eh 0 0 0 0 U U H Eh 0 (tf
(tf (tf 0 Eh 0 (tf Eh 0 0 Eh Eh 0 Eh U 2
o 0 Eh 0 0 Eh (tf 0 0 Eh 0 0 (tf 0 0
O 0 0 (tf 0 0 0 0 Eh Eh 0 0 0 0
2 Eh Eh 0 0 (tf Eh U 0 0 0 0 (tf Eh (tf
o 0 H Eh 0 Eh (tf (tf Eh 0 0 (tf 0 tZ 0
u 0 (tf 0 0 (tf Eh 0 0 0 0 0 0 Eh 0
Eh < Eh Eh 0 (tf 0 (tf 0 (tf 0 Eh 0 0
0 0 Eh Eh 0 0 0 0 Eh Eh 2 (tf 0 Eh
o 0 0 Eh Eh Eh 0 0 0 O 0 2 Eh 0 0
0 Eh 0 0 0 Eh (tf H (tf Eh 0 0 (tf Eh
0 Eh 0 0 0 (tf 0 Eh O 0 < 0 0 (tf
o 0 0 Eh Eh 0 0 Eh 0 0 0 0 0 0 0
H (tf (Z 0 Eh 0 (tf itf Eh (tf Eh Eh 0
H Eh 0 0 0 0 0 Eh 0 0 0 Eh 0 (tf O
0 0 0 (tf 0 0 Eh Eh 0 H 0 0 (tf 0 U
0 Eh 0 0 (tf Eh Eh 0 0 0 (tf 0 0 (tf (tf
(tf 0 H 0 (tf (£ (tf O 0 0 (tf 0 0 (tf
0 <tf Eh 0 (tf 0 0 Eh 0 Eh 0 0 Eh
H 0 (tf Eh (tf (tf (tf Eh Eh 0 H H 0 Eh
0 U (tf 0 Eh 0 2 0 0 0 (tf 0 0 0
(tf 0 0 0 (tf 0 0 0 Eh 0 0 0 Eh 0 0
0 0 < (tf 0 Eh 0 Eh Eh 0 (tf 0 0 0
0 0 0 0 0 Eh 0 U (tf Eh (tf 0 0 0 0
0 0 0 (tf Eh 0 0 (tf 0 U 0 0 H 0 O
H Eh (tf 0 Eh Eh 0 Eh 0 Eh 0 (tf 0 0 (tf
< Eh (tf 0 (tf 0 0 0 0 (tf (tf 0 0 (tf 0
0 Eh 0 Eh 0 Eh 0 0 0 0 (tf 0 Eh 0 O
0 < 0 0 (tf 0 2 (tf 0 0 0 Eh Eh 0 (tf (tf
0 0 Eh 0 0 0 0 0 (tf U 0 0 -tf 0 0 Eh
H 0 0 0 0 Eh o U 0 0 Eh 0 0 (tf 0
0 0 0 0 (tf 0 0 0 O Eh (tf 0 2 0 0
O 0 Eh 0 2 0 0 U U Eh (tf (tf 0 2 0 0
(tf Eh Eh 0 0 0 0 0 0 Eh 0 0 0 Eh 0 0
H Eh (tf 0 0 (tf (tf EH Eh Eh (tf Eh Eh Eh 0
0 2 Eh 0 0 0 2 0 (tf 0 0 Eh 0 0 0
0 0 0 0 0 Eh 0 0 0 0 Eh 0 0 (tf 0 0
< EH < Eh (tf Eh Eh 0 Eh H Eh 0 0 (tf
(tf 2 < 0 2 Eh 2 0 (tf 0 (tf Eh 0 0 0 0
0 0 H (tf Eh 0 0 0 Eh 0 0 0 0 Eh 0 0
(tf Eh 0 0 0 0 0 0 0 (£ (tf Eh 0 (tf (tf (tf
0 0 0 0 (tf (Z Eh 0 0 (i 0 0 0 2 (tf 2
O Eh 0 Eh 0 (tf U 0 2 0 0 0 Eh 0 0
2 0 Eh 0 0 0 (tf 0 rij 0 0 (tf 2 (tf Eh
0 0' 0 0 0 (tf 2 0 0 0 (tf 0 2 0 0
u 0 0 Eh (tf 0 Eh 0 0 0 0 0 Eh 0 (tf
< 0 (tf 0 0 (tf 0 EH 2 Eh 0 0 0 Eh Eh Eh
Eh < 0 0 U 0 0 0 o Eh 0 0 0 0 0
H 0 (tf Eh 0 Eh (tf 0 o 0 0 0 0 Eh 0 0
H (tf 0 0 0 0 Eh (tf Eh 0 0 (tf Eh 0 0
Eh 2 (tf Eh 0 0 0 0 0 (tf 0 0 0 (tf 0 0
0 0 0 (tf Eh Eh 0 0 < 0 0 Eh 0 0 (tf 0
0 0 0 Eh 0 0 0 (tf 2 Eh 0 (tf (tf (tf 0 0
0 0 Eh 0 0 Eh 0 0 0 0 0 (tf 0 0 (tf 0
Eh Eh Eh (tf 0 < 0 0 o (tf 0 0 H Eh 0 U
0 Eh 0 U Eh 0 0 0 Eh (tf 0 2 0 (tf (tf (tf
0 0 0 0 0 0 0 Eh (tf 0 0 2 0 0 0 0
Abs./min
181 397
Fig.4.
nt c
ó
-q-—''
CD X u m ι1α.χί
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.
Cena 4,00 zł.

Claims (6)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sekwencja DNA zawierająca gen struktury kodujący chloroperoksydazę wanadowąz Cuwularia inaeąualis CBS 102.42.
  2. 2. Sekwencja DNA zawierająca gen struktury dla chloroperoksydazy wanadowej Curvularia inaeąualis CBS 102.42, jak pokazano na fig. 2.
  3. 3. Wektor ekspresyjny zawierający początek replikacji, sekwencje kontrolujące transkrypcję' i terminację oraz co najmniej część sekwencji DNA zawierającej gen struktury kodujący chloroperoksydazę wanadowąz Curvularia inaeąualis CBS 102.42.
  4. 4. Wektor ekspresyjny zawierający początek replikacji, sekwencje kontrolujące transkrypcję i terminację oraz co najmniej część sekwencji DNA gen struktury dla chloroperoksydazy wanadowej z Curvularia inaeąualis CBS 102.42, jak pokazano na fig. 2
  5. 5. Sposób wytwarzania haloperoksydazy wanadowej, znamienny tym, że transformuje się odpowiedniego gospodarza wektorem ekspresyjnym zawierającym początek replikacji, sekwencje kontrolujące transkrypcję i terminację oraz co najmniej część sekwencji DNA zawierającej gen struktury kodujący chloroperoksydazę wanadową z Curvularia inaeąualis CBS 102.42, hoduje się gospodarza w warunkach, które pozwalająna ekspresję genu struktury i izoluje się haloperoksydazę wanadową.
  6. 6. Sposób wytwarzania haloperoksydazy wanadowej, znamienny tym, że transformuje się odpowiedniego gospodarza wektorem ekspresyjnym zawierającym początek replikacji, sekwencje kontrolujące transkrypcję i terminację oraz co najmniej część sekwencji DNA zawierającej początek replikacji, sekwencje kontrolujące transkrypcję i terminację oraz co najmniej część sekwencji DNA gen struktury dla chloroperoksydazy wanadowej z Curvularia inaeąualis CBS 102.42, jak pokazano na fig. 2, hoduje się gospodarza w warunkach, które pozwalają na ekspresję genu struktury i izoluje się haloperoksydazę wanadową.
PL95341279A 1994-03-31 1995-03-31 Sekwencja DNA kodujaca chloroperoksydaze wanadowa, wektor ekspresyjny i sposób wytwarzania haloperoksydazy wanadowej PL PL181397B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP94200893 1994-03-31
PCT/EP1995/001229 WO1995027046A2 (en) 1994-03-31 1995-03-31 Enzymatic antimicrobial compositions containing haloperoxidases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL181397B1 true PL181397B1 (pl) 2001-07-31

Family

ID=8216755

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL95316571A PL181389B1 (pl) 1994-03-31 1995-03-31 Enzymatyczny srodek przeciwbakteryjny PL
PL95341279A PL181397B1 (pl) 1994-03-31 1995-03-31 Sekwencja DNA kodujaca chloroperoksydaze wanadowa, wektor ekspresyjny i sposób wytwarzania haloperoksydazy wanadowej PL

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL95316571A PL181389B1 (pl) 1994-03-31 1995-03-31 Enzymatyczny srodek przeciwbakteryjny PL

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP0753055A1 (pl)
JP (1) JPH09511396A (pl)
CN (1) CN1146782A (pl)
AU (1) AU2215495A (pl)
BR (1) BR9507226A (pl)
CA (1) CA2182966A1 (pl)
CZ (1) CZ288041B6 (pl)
HU (1) HUT74967A (pl)
NL (1) NL9401048A (pl)
PL (2) PL181389B1 (pl)
SK (1) SK123096A3 (pl)
WO (1) WO1995027046A2 (pl)

Families Citing this family (124)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2635097A (en) * 1996-04-29 1997-11-19 Novo Nordisk A/S Non-aqueous, liquid, enzyme-containing compositions
JP2000512267A (ja) * 1996-05-09 2000-09-19 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 抗微生物ペルオキシダーゼ組成物
AU6469698A (en) * 1997-03-24 1998-10-20 Clorox Company, The A chloroperoxidase enzyme system for generating hypochlorous acid and hypochlorite (in situ)
DE69719568T2 (de) * 1997-07-09 2003-12-24 Procter & Gamble Oxidoreductase enthaltende reinigungszusammensetzungen
US6025186A (en) * 1997-08-14 2000-02-15 Novo Nordisk A/S Reduction of malodor
WO1999008531A1 (en) * 1997-08-14 1999-02-25 Novo Nordisk A/S Antimicrobial composition containing a haloperoxidase, a hydrogen peroxide source, a halide source and an ammonium source
US6080391A (en) * 1997-08-14 2000-06-27 Novo Nordisk A/S Reduction of malodour
US6074631A (en) * 1997-08-14 2000-06-13 Novo Nordisk A/S Reduction of malodour
US6492110B1 (en) 1998-11-02 2002-12-10 Uab Research Foundation Reference clones and sequences for non-subtype B isolates of human immunodeficiency virus type 1
US6656715B1 (en) 1998-09-10 2003-12-02 The Regents Of The University Of California Recombinant minimal catalytic vanadium haloperoxidases and their uses
US6232457B1 (en) 1998-09-10 2001-05-15 The Regents Of The University Of California Recombinant vanadium haloperoxidases and their uses
US6592867B2 (en) * 1998-11-09 2003-07-15 Novozymes A/S Antimicrobial composition containing an oxidoreductase and an enhancer of the N-hydroxyanilide-type
US7063970B1 (en) 1999-05-06 2006-06-20 Norozymes A/S Enzymatic preservation of water based paints
JP2002544315A (ja) * 1999-05-06 2002-12-24 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 酵素による水性塗料の保存処理
EP1207747A1 (en) * 1999-08-10 2002-05-29 Novozymes A/S Reduction of malodour in soiled animal litter
AU6558100A (en) * 1999-08-13 2001-03-13 Novozymes A/S Enzymatic method for killing or inhibiting microbial cells at high ph
US6509181B1 (en) 2000-04-14 2003-01-21 Novozymes, A/S Polypeptides having haloperoxide activity
US6410291B1 (en) 2000-04-14 2002-06-25 Novozymes A/S Polypeptides having haloperoxidase activity
AU2001246402A1 (en) 2000-04-14 2001-10-30 Novozymes A/S Polypeptides having haloperoxidase activity
US6511835B1 (en) 2000-04-14 2003-01-28 Novozymes, A/S Nucleic acids encoding polypeptides having haloperoxidase activity
US6410292B1 (en) 2000-04-14 2002-06-25 Novozymes A/S Nucleic acids encoding polypeptides having haloperoxidase activity
WO2001079462A2 (en) * 2000-04-14 2001-10-25 Novozymes A/S Nucleic acids encoding polypeptides having haloperoxidase activity
AU2001246403A1 (en) * 2000-04-14 2001-10-30 Novozymes A/S Polypeptides having haloperoxidase activity
AU2001246401A1 (en) * 2000-04-14 2001-10-30 Novozymes A/S Polypeptides having haloperoxidase activity
WO2002047483A1 (en) * 2000-12-15 2002-06-20 Novozymes A/S Use of haloperoxidase, peroxide and carboxylic acid
CN1327772C (zh) * 2001-12-04 2007-07-25 诺和酶股份有限公司 杀死孢子的方法
AU2003226941A1 (en) * 2002-04-12 2003-10-27 Biolocus Aps Antifouling composition comprising an enzyme in the absence of its substrate
US10023881B2 (en) 2007-04-24 2018-07-17 Novozymes A/S Detoxifying pre-treated lignocellulose-containing materials
JP2011500761A (ja) * 2007-10-23 2011-01-06 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 胞子を死滅させるための、及び機器を消毒又は滅菌するための方法
WO2010046142A2 (en) * 2008-10-23 2010-04-29 Getinge Disinfection Ab A method of obtaining high level disinfection in a washer disinfector, and a washer disinfector
US20120020946A1 (en) 2009-04-03 2012-01-26 Novozymes A/S Methods for Inactivating Viruses
EP2421564A1 (en) 2009-04-22 2012-02-29 Novozymes A/S Methods for killing or inhibiting growth of mycobacteria
EP2510944A1 (en) * 2011-04-15 2012-10-17 National University of Ireland, Galway Treatment of bacterial infections
WO2013164429A1 (en) 2012-05-02 2013-11-07 Novozymes A/S Enzymatic solubilization of metals
WO2014106593A1 (en) 2013-01-03 2014-07-10 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
US20160024440A1 (en) 2013-03-14 2016-01-28 Novozymes A/S Enzyme and Inhibitor Containing Water-Soluble Films
EP3569611A1 (en) 2013-04-23 2019-11-20 Novozymes A/S Liquid automatic dish washing detergent compositions with stabilised subtilisin
WO2014177709A1 (en) 2013-05-03 2014-11-06 Novozymes A/S Microencapsulation of detergent enzymes
MX2015015127A (es) * 2013-05-08 2016-02-18 Novozymes As Enzimas para alimentacion animal.
US20160083703A1 (en) 2013-05-17 2016-03-24 Novozymes A/S Polypeptides having alpha amylase activity
WO2015014803A1 (en) 2013-07-29 2015-02-05 Novozymes A/S Protease variants and polynucleotides encoding same
WO2015150457A1 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Novozymes A/S Polypeptides having alpha amylase activity
CN112899086A (zh) 2014-04-11 2021-06-04 诺维信公司 洗涤剂组合物
WO2015181118A1 (en) 2014-05-27 2015-12-03 Novozymes A/S Methods for producing lipases
EP3149178B1 (en) 2014-05-27 2020-07-15 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
US20170121646A1 (en) 2014-07-03 2017-05-04 Novozymes A/S Improved Stabilization of Non-Protease Enzyme
WO2016079110A2 (en) 2014-11-19 2016-05-26 Novozymes A/S Use of enzyme for cleaning
CN107567489A (zh) 2015-04-10 2018-01-09 诺维信公司 衣物洗涤方法，dna酶和洗涤剂组合物的用途
CN107636134A (zh) 2015-04-10 2018-01-26 诺维信公司 洗涤剂组合物
CN107835853B (zh) 2015-05-19 2021-04-20 诺维信公司 气味减少
CN107922095A (zh) 2015-06-17 2018-04-17 诺维信公司 容器
WO2016135351A1 (en) 2015-06-30 2016-09-01 Novozymes A/S Laundry detergent composition, method for washing and use of composition
US10822598B2 (en) 2015-07-06 2020-11-03 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
WO2017046232A1 (en) 2015-09-17 2017-03-23 Henkel Ag & Co. Kgaa Detergent compositions comprising polypeptides having xanthan degrading activity
CA2991114A1 (en) 2015-09-17 2017-03-23 Novozymes A/S Polypeptides having xanthan degrading activity and polynucleotides encoding same
CN108350441B (zh) 2015-10-07 2022-09-27 诺维信公司 多肽
US10479981B2 (en) 2015-10-14 2019-11-19 Novozymes A/S DNase variants
JP2018531783A (ja) 2015-10-14 2018-11-01 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 水濾過膜の洗浄
EP3384019B1 (en) 2015-12-01 2020-06-24 Novozymes A/S Methods for producing lipases
US20190002819A1 (en) 2015-12-28 2019-01-03 Novozymes Bioag A/S Heat priming of bacterial spores
BR112018069220A2 (pt) 2016-03-23 2019-01-22 Novozymes As uso de polipeptídeo que tem atividade de dnase para tratamento de tecidos
US20190218479A1 (en) 2016-05-31 2019-07-18 Novozymes A/S Stabilized Liquid Peroxide Compositions
CN114381342A (zh) 2016-06-23 2022-04-22 诺维信公司 酶的用途、组合物以及用于去除污垢的方法
WO2018002261A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Novozymes A/S Detergent compositions
WO2018007573A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 Novozymes A/S Detergent compositions with galactanase
WO2018011276A1 (en) 2016-07-13 2018-01-18 The Procter & Gamble Company Bacillus cibi dnase variants and uses thereof
WO2018060216A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Novozymes A/S Use of enzyme for washing, method for washing and warewashing composition
US20190284647A1 (en) 2016-09-29 2019-09-19 Novozymes A/S Spore Containing Granule
WO2018077938A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Novozymes A/S Detergent compositions
CN110072986B (zh) 2016-11-01 2023-04-04 诺维信公司 多核心颗粒
US20190292494A1 (en) 2016-12-01 2019-09-26 Basf Se Stabilization of enzymes in compositions
EP3551740B1 (en) 2016-12-12 2021-08-11 Novozymes A/S Use of polypeptides
WO2018184818A1 (en) 2017-04-06 2018-10-11 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
CN111108183A (zh) 2017-06-30 2020-05-05 诺维信公司 酶浆液组合物
BR112020005558A2 (pt) 2017-09-20 2020-10-27 Novozymes A/S uso de enzimas para melhorar a absorção de água e/ou o grau de brancura
US11414814B2 (en) 2017-09-22 2022-08-16 Novozymes A/S Polypeptides
JP7317811B2 (ja) 2017-09-27 2023-07-31 ノボザイムス アクティーゼルスカブ リパーゼ変異体及びかかるリパーゼ変異体を含むマイクロカプセル組成物
US20200318037A1 (en) 2017-10-16 2020-10-08 Novozymes A/S Low dusting granules
EP3697881A1 (en) 2017-10-16 2020-08-26 Novozymes A/S Low dusting granules
CN111247245A (zh) 2017-10-27 2020-06-05 宝洁公司 包含多肽变体的洗涤剂组合物
US20230416706A1 (en) 2017-10-27 2023-12-28 Novozymes A/S Dnase Variants
EP3749761A1 (en) 2018-02-08 2020-12-16 Novozymes A/S Lipases, lipase variants and compositions thereof
WO2019154954A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Novozymes A/S Lipase variants and compositions thereof
WO2019175240A1 (en) 2018-03-13 2019-09-19 Novozymes A/S Microencapsulation using amino sugar oligomers
WO2019201793A1 (en) 2018-04-17 2019-10-24 Novozymes A/S Polypeptides comprising carbohydrate binding activity in detergent compositions and their use in reducing wrinkles in textile or fabric.
CN112204137B (zh) 2018-04-19 2024-05-14 诺维信公司 稳定化的纤维素酶变体
US11661592B2 (en) 2018-04-19 2023-05-30 Novozymes A/S Stabilized endoglucanase variants
WO2019238761A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Basf Se Water soluble multilayer films containing wash active chemicals and enzymes
EP3861008A1 (en) 2018-10-03 2021-08-11 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-mannan degrading activity and polynucleotides encoding same
CN113302270A (zh) 2018-12-03 2021-08-24 诺维信公司 低pH粉末洗涤剂组合物
US11959111B2 (en) 2018-12-21 2024-04-16 Novozymes A/S Polypeptides having peptidoglycan degrading activity and polynucleotides encoding same
AU2020242303A1 (en) 2019-03-21 2021-06-24 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
WO2020207944A1 (en) 2019-04-10 2020-10-15 Novozymes A/S Polypeptide variants
BR112021020439A2 (pt) 2019-04-12 2022-05-24 Novozymes As Variantes estabilizadas de glicosídeo hidrolase
EP3994255A1 (en) 2019-07-02 2022-05-11 Novozymes A/S Lipase variants and compositions thereof
US20220325204A1 (en) 2019-08-27 2022-10-13 Novozymes A/S Detergent composition
WO2021053127A1 (en) 2019-09-19 2021-03-25 Novozymes A/S Detergent composition
WO2021064068A1 (en) 2019-10-03 2021-04-08 Novozymes A/S Polypeptides comprising at least two carbohydrate binding domains
WO2021105330A1 (en) 2019-11-29 2021-06-03 Basf Se Compositions and polymers useful for such compositions
EP4077656A2 (en) 2019-12-20 2022-10-26 Novozymes A/S Polypeptides having proteolytic activity and use thereof
EP3892708A1 (en) 2020-04-06 2021-10-13 Henkel AG & Co. KGaA Cleaning compositions comprising dispersin variants
CN115210371A (zh) 2020-04-08 2022-10-18 诺维信公司 碳水化合物结合模块变体
WO2021214059A1 (en) 2020-04-21 2021-10-28 Novozymes A/S Cleaning compositions comprising polypeptides having fructan degrading activity
EP3907271A1 (en) 2020-05-07 2021-11-10 Novozymes A/S Cleaning composition, use and method of cleaning
EP4172298A1 (en) 2020-06-24 2023-05-03 Novozymes A/S Use of cellulases for removing dust mite from textile
EP3936593A1 (en) 2020-07-08 2022-01-12 Henkel AG & Co. KGaA Cleaning compositions and uses thereof
CN116323889A (zh) 2020-08-25 2023-06-23 诺维信公司 家族44木葡聚糖酶变体
JP2023544111A (ja) 2020-09-22 2023-10-20 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 第二の酵素を含む、プロテアーゼとプロテアーゼ阻害薬との改善された組合せ
WO2022074037A2 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Novozymes A/S Alpha-amylase variants
EP4232539A2 (en) 2020-10-20 2023-08-30 Novozymes A/S Use of polypeptides having dnase activity
US20230399588A1 (en) 2020-10-28 2023-12-14 Novozymes A/S Use of lipoxygenase
WO2022106404A1 (en) 2020-11-18 2022-05-27 Novozymes A/S Combination of proteases
WO2022106400A1 (en) 2020-11-18 2022-05-27 Novozymes A/S Combination of immunochemically different proteases
EP4284905A1 (en) 2021-01-28 2023-12-06 Novozymes A/S Lipase with low malodor generation
WO2022171780A2 (en) 2021-02-12 2022-08-18 Novozymes A/S Alpha-amylase variants
WO2022189521A1 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Novozymes A/S Polypeptide variants
WO2022194673A1 (en) 2021-03-15 2022-09-22 Novozymes A/S Dnase variants
EP4060036A1 (en) 2021-03-15 2022-09-21 Novozymes A/S Polypeptide variants
EP4359518A1 (en) 2021-06-23 2024-05-01 Novozymes A/S Alpha-amylase polypeptides
WO2023165507A1 (en) 2022-03-02 2023-09-07 Novozymes A/S Use of xyloglucanase for improvement of sustainability of detergents
WO2023165950A1 (en) 2022-03-04 2023-09-07 Novozymes A/S Dnase variants and compositions
WO2023194204A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Novozymes A/S Hexosaminidase variants and compositions
EP4309500A1 (en) * 2022-07-18 2024-01-24 Acies Bio d.o.o. Peroxidase based biocontrol agents
WO2024017883A1 (en) * 2022-07-18 2024-01-25 Acies Bio D.O.O. Peroxidase based biocontrol agents

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4707446A (en) * 1983-05-24 1987-11-17 Cetus Corporation Stable haloperoxidase method
AU642980B2 (en) * 1990-03-21 1993-11-04 Quest International B.V. Ultilization of enzymes
GB9015910D0 (en) * 1990-07-19 1990-09-05 Univ Bruxelles Novel use
JP3399549B2 (ja) * 1990-11-16 2003-04-21 サントリー株式会社 微生物由来ペルオキシダーゼ遺伝子
AU663869B2 (en) * 1991-02-21 1995-10-26 Exoxemis, Inc. Methods and compositions for the treatment of infection and control of flora
US5262151A (en) * 1991-11-25 1993-11-16 Montgomery Robert E Stabilized enzymatic antimicrobial compositions

Also Published As

Publication number Publication date
NL9401048A (nl) 1995-11-01
AU2215495A (en) 1995-10-23
BR9507226A (pt) 1997-09-09
WO1995027046A2 (en) 1995-10-12
CZ285096A3 (en) 1997-10-15
HU9602673D0 (en) 1996-11-28
WO1995027046A3 (en) 1995-11-30
SK123096A3 (en) 1997-06-04
PL316571A1 (en) 1997-01-20
CZ288041B6 (cs) 2001-04-11
PL181389B1 (pl) 2001-07-31
JPH09511396A (ja) 1997-11-18
EP0753055A1 (en) 1997-01-15
CA2182966A1 (en) 1995-10-12
CN1146782A (zh) 1997-04-02
HUT74967A (en) 1997-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL181397B1 (pl) Sekwencja DNA kodujaca chloroperoksydaze wanadowa, wektor ekspresyjny i sposób wytwarzania haloperoksydazy wanadowej PL
CA1341130C (en) Use of oxidoreductases in bleaching and/or detergent compositions and their preparation by microorganisms engineered by recombinant dna technology
Roy et al. Applications of a high maltose forming, thermo-stable α-amylase from an extremely alkalophilic Bacillus licheniformis strain AS08E in food and laundry detergent industries
Simons et al. Primary structure and characterization of the vanadium chloroperoxidase from the fungus Curvularia inaequails
Banks et al. The isolation and properties of a DNA-unwinding protein from Ustilago maydis
EP0635053B1 (en) Rhamnogalacturonan acetylesterase (RGAE) from Aspergillus aculeatus
JP5230889B2 (ja) リポキシゲナーゼ
Irie et al. Homologous expression of recombinant manganese peroxidase genes in ligninolytic fungus Pleurotus ostreatus
CN1891820B (zh) 在表面活性剂存在下稳定的胆固醇氧化酶
Hillmer et al. Solubilization and partial characterization of particulate dehydrogenases from Clostridium kluyveri
Chambers et al. Identification of a putative active site residue in the exo‐β‐(1, 3)‐glucanase of Candida albicans
JP2002506638A (ja) ｐＨ特性を変更したハロペルオキシダーゼ
JP4133326B2 (ja) 新規なフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
US20010041666A1 (en) Haloperoxidases with altered pH profiles
EP0558024B1 (en) Novel vector having promoter that is inducible by methanol and/or glycerol
Belmouden et al. Molecular cloning and nucleotide sequence of cDNA encoding rat kidney long‐chain l‐2‐hydroxy acid oxidase: Expression of the catalytically active recombinant protein as a chimaera
PL175670B1 (pl) Oczyszczona i wyizolowana sekwencja DNA kodująca polipeptyd wykazujący aktywność enzymu poligalakturonazy (PGX) z Aspergillus tubigensis
Narise Esterase isozymes of Drosophila virilis: Purification and properties of α-and β-esterase isozymes
JPH1033180A (ja) 組換えフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
AU677296B2 (en) An enzyme with pectin lyase activity
JP3732868B2 (ja) 新規なアスコルビン酸酸化酵素、該酵素をコードする遺伝子及び該酵素の製造法並びにその用途
Sasangka et al. Structural features of the glycogen branching enzyme encoding genes from Aspergilli
JP6619152B2 (ja) フラビンアデニンジヌクレオチド依存型グルコース脱水素酵素活性を有するキメラタンパク質
Mbassi et al. Purification and partial characterization of a thermostable peroxidase isoenzyme from Vigna sp seedlings
Stewart Genomic organization and expression of the lignin peroxidase genes of Phanerochaete chrysosporium