CN1327772C - 杀死孢子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过使孢子与卤过氧化物酶、过氧化氢源和碘化物离子源接触而杀死或灭活孢子的方法。此外可以使该孢子与卤过氧化物酶增强剂接触。

Description

杀死孢子的方法
发明领域
本发明涉及杀死或灭活孢子的酶促方法。
背景
已知可从需氧的芽孢杆菌(Bacilli)、厌氧的梭状芽孢杆菌(Clostridia)、选择的八叠球菌(sarcinae)和少数放线菌(actinomycetes)形成孢子。孢子在不带有任何代谢反应的方面类似于某些植物种子。在这点上，它们尤其适合忍受严峻的环境压力，且已知在长时间暴露于热、干燥、辐射和毒性化学药品之后可存活。这些性质使得尤其难以在会受到极端条件不利影响的环境如活组织或与活组织接触的物体等中杀死孢子。
在70摄氏度中数分钟内可对真菌、病毒和病原细菌的营养细胞进行消毒；在100摄氏度可对许多孢子进行消毒。然而，一些腐生生物的孢子在煮沸数小时后仍可存活。加热是目前最常用的确保对孢子进行消毒的方法。
孢子的外壳由包含多达孢子总蛋白质的80％的角蛋白样蛋白质组成。正是该蛋白质外壳负责孢子对化学消毒剂的抗性。微生物生活史的孢子阶段特征在于代谢休眠和对可破坏营养阶段的微生物的环境因素的抗性。
细菌内生孢子和真菌孢子的萌发伴随着增加的代谢和对热与化学反应物降低的抗性。为发生萌发，孢子必须感知环境足以支持生长和繁殖。简单的α氨基酸可刺激孢子萌发。
本发明提供了杀死或灭活孢子的改善的酶促方法。
发明概述
本发明提供了杀死或灭活孢子的方法，该方法包括使孢子与卤过氧化物酶(haloperoxidase)、过氧化氢源和碘化物离子源接触。
在一个实施方案中，该卤过氧化物酶是氯过氧化物酶或溴过氧化物酶。在另一个实施方案中，该卤过氧化物酶是含有钒的卤过氧化物酶。
在另外一个实施方案中，本发明的方法也包括使孢子与在下文中进一步进行表征的增强剂接触。
发明详述
卤过氧化物酶和展示卤过氧化物酶活性的化合物
适合于整合入本发明方法中的卤过氧化物酶包括氯过氧化物酶、溴过氧化物酶和展示氯过氧化物酶或溴过氧化物酶活性的化合物。卤过氧化物酶形成一类酶，该酶能够根据如下反应式在过氧化氢或生成过氧化氢的系统中将卤化物(Cl-、Br-、I-)氧化为相应的次卤酸：
H2O2+X-+H+H2O+HOX
其中X-是卤化物而HOX是次卤酸。
卤过氧化物酶根据其对卤化物离子的特异性进行分类：催化从氯化物离子形成次氯酸盐、从溴化物离子形成次溴酸盐和从碘化物离子形成次碘酸盐的氯过氧化物酶(E.C.1.11.1.10)；和催化从溴化物离子形成次溴酸盐和从碘化物离子形成次碘酸盐的溴过氧化物酶。然而，次碘酸盐自发地歧化为碘，因而碘是观察到的产物。这些次卤酸盐化合物随后可以与其他化合物进行反应而形成卤化化合物。
已从各种生物中分离卤过氧化物酶：哺乳动物、海洋动物、植物、藻类、地衣、真菌和细菌。普遍接受的是卤过氧化物酶是自然界中负责形成卤化化合物的酶，尽管可能涉及其他的酶。
卤过氧化物酶已从许多不同的真菌中分离，特别是从真菌暗色丝孢菌(dematiaceous hyphomycetes)类中分离，该类例如卡尔黑霉属(Caldariomyces)如C.fumago、链格孢属(Alternaria)、弯孢霉属(Curvularia)如C.verruculosa和不等弯孢(C.inaequalis )、Drechslera、Ulocladium和葡萄孢属(Botrytis)。
也已从细菌中分离了卤过氧化物酶，例如假单胞菌属(Pseudomonas)如吡咯菌素假单胞菌(P.pyrrocinia)和链霉菌属(Streptomyces)如金霉素链霉菌(S.aureofaciens)。
在一个优选的实施方案中，卤过氧化物酶是源自弯孢霉属物种的钒卤过氧化物酶(即含有钒或矾酸盐的卤过氧化物酶)，所述物种特别是C.verruculosa和不等弯孢，如描述于WO 95/27046中的不等弯孢CBS102.42，如由WO 95/27046图2中的DNA序列编码的钒卤过氧化物酶(全文引入作为参考)；或者如描述于WO 97/04102中的C.verruculosa CBS147.63或C.verruculosa CBS 444.70。
在另一个优选的实施方案中，卤过氧化物酶是含有矾的卤过氧化物酶，如钒氯过氧化物酶。钒氯过氧化物酶可源自WO 01/79459中的Drechslerahartlebii、描述于WO 01/79458中的Dendryphiella salina、描述于WO01/79461中的Phaeotrichoconis crotalarie或描述于WO 01/79460中的棉丝菌属(Geniculosporium sp.)。钒卤过氧化物酶更优选地源自Drechslerahartlebii(DSM 13444)、Dendryphiella salina(DSM 13443)、Phaeotrichoconis crotalarie(DSM 13441)或棉丝菌属物种(DSM 13442)。
卤过氧化物酶的浓度一般在0.01-100ppm酶蛋白质的范围内，优选地为0.05-50ppm酶蛋白质，更优选地为0.1-20ppm酶蛋白质且最优选地为0.5-10ppm酶蛋白质。
卤过氧化物酶活性的确定
通过如下步骤进行微量滴定测定，即，将100μl卤过氧化物酶样品(约0.2μg/ml)与100μl 0.3M pH7的磷酸钠缓冲液-0.5M溴化钾-0.008％苯酚红混合，将溶液加入到10μl 0.3％的H2O2中，并测量作为时间的函数的595nm的吸收。
应用一氯双甲酮(Sigma M4632，290nm时ε＝20000M-1cm-1)作为底物的测定进行如下。作为时间的函数对290nm吸收的降低进行测量。应用浓度为约1μg/ml的卤过氧化物酶在0.1M磷酸钠或0.1M乙酸钠、50μM一氯双甲酮、10mM KBr/KCl和1mM H2O2中进行该测定。将HU定义为每分钟在pH5和30℃氯化或溴化的1微摩尔一氯双甲酮。
过氧化氢源
卤过氧化物酶需要的过氧化氢源可为过氧化氢或原位产生过氧化氢的过氧化氢前体。任何溶解时可释放卤过氧化物酶能应用的过氧化物的固体实体均可充当过氧化氢源。在溶解于水或适当的基于水的介质时可产生过氧化氢的化合物包括但不局限于金属过氧化物、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过氧酸、烷基过氧化物、酰基过氧化物、过氧化酯、过氧化脲、过硼酸盐和过氧羧酸或其盐。生成可被卤过氧化物酶应用以氧化碘化物的过氧化物的任何化合物均是本发明可接受的过氧化氢源；这包括大量本领域技术人员可意识到的化合物。也可应用这些物质之两种或多种的混合物。
另一个过氧化氢源是生成过氧化氢的酶系统，如氧化酶及该氧化酶的底物。氧化酶和底物的组合的例子包括但不局限于氨基酸氧化酶(参见如US 6,248,575)和适当的氨基酸、葡萄糖氧化酶(参见如WO 95/29996)和葡萄糖、乳酸氧化酶和乳酸、半乳糖氧化酶(参见如WO 00/50606)和半乳糖，以及醛糖氧化酶(参见如WO 99/31990)和适当的醛糖。
通过研究EC 1.1.3._、EC 1.2.3._、EC 1.4.3._和EC 1.5.3._或类似的种类(按国际生物化学协会(International Union of Biochemistry))，本领域的技术人员易于识别这种氧化酶和底物的组合的其他例子。
过氧化氢源可在过程开始时或过程中添加，如一般添加的量相应于0.001mM～25 mM的水平，优选地为0.005mM～5mM的水平，且特别地为0.01～1mM的水平。
碘化物离子源
根据本发明，与卤过氧化物酶反应所需的碘化物离子源可以以许多不同方式得到，如通过添加碘化物盐。在一个优选的实施方案中，碘化物盐是碘化钠或碘化钾或其混合物。
碘化物离子源的浓度一般相应于0.01mM～1000mM碘化物离子的浓度，优选地为0.05mM～500mM。
增强剂
我们已观察到可通过在本发明的组合物中包括增强剂以获得改善的抗微生物活性。该增强剂优选地为胺化合物，该胺化合物可为具有下面分子式的化合物：
其中 取代基团R1和R2可以相同或不同，为任何一个下面的基团：氧、苯基和C1-6-烷基；
其中苯基和C1-6-烷基基团可未取代或由一个或多个独立的取代基团R3取代；
该 取代基团R3为任何一个下面的基团：羟基、卤素、甲酰基、羧基及其酯和盐、氨甲酰基、磺基及其酯和盐、氨磺酰基、硝基、氨基、苯基、酰基、C1-6-烷基和C1-6-烷氧基；
其中氨甲酰基、氨磺酰基、氨基、苯基、C1-6-烷基、C1-6-烷氧基和酰基基团可以进一步是未取代的或由一个或多个独立的取代基团R4取代；
该 取代基团R4为任何一个下面的基团：卤素、羟基、甲酰基、羧基及其酯和盐、氨甲酰基、磺基及其酯和盐、氨磺酰基、硝基、氨基、苯基、酰基、C1-6-烷基和C1-6-烷氧基；
其中氨甲酰基、氨磺酰基和氨基基团可以进一步为未取代的或由羟基、C1-4-烷基和C1-4-烷氧基独立地取代一次或两次；
且其中苯基、C1-6-烷基、C1-6-烷氧基和酰基基团可以进一步为未取代的或由一个或多个下面的基团独立地取代：卤素、羟基、氨基、甲酰基、羧基及其酯和盐、氨甲酰基、磺基及其酯和盐和氨磺酰基。
在一个实施方案中，当取代基团R3是羧基及其酯时，R3不能直接与如下碳原子连接，该碳原子在上式中与氮原子直接连接。
如在此处所用的，其中n可为2～6的术语“C1-n-烷基”代表具有一个到指定数目的碳原子(n)的饱和或不饱和的分支或直链烷基基团。一般的C1-6-烷基包括但不局限于甲基、乙基、乙烯基、正丙基、异丙基、丙烯基、异丙烯基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、巴豆基、甲代烯丙基、戊基、异戊基、丙烯基、异戊二烯基、己基、异己基等。
如在此处所用的，其中n可为2～6的术语“C1-n-烷氧基”代表通过醚基团连接的C1-n-烷基基团；如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基等。
如在此处所用的术语“酰基”指包含通过羰基连接的C1-6-烷基基团的单价取代基；如乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、新戊酰基、戊酰基等。
如在此处所用的，胺化合物可为其阳离子形式。
在一个实施方案中，增强剂不是α氨基酸。
在一个优选的实施方案中，R1是氢。
在另一个优选的实施方案中，R1是氢，且R2是醇(氨基醇)，如乙醇胺。
在进一步优选的实施方案中，胺化合物是铵盐，即本领域中已知的任何铵盐：如硫酸二胺、氯化铵、溴化铵或碘化铵。
增强剂可以以0.01mM～1000mM的浓度范围存在于组合物中，优选地为0.05mM～500mM，更优选地为0.1mM～100mM，且最优选地为0.1mM～50mM。
孢子
在本发明的方法中与卤过氧化物酶、过氧化氢源和碘化物离子源接触的孢子包括所有种类的孢子。
在一个实施方案中，该孢子为内生孢子，如所有梭菌属物种(Clostridium sp.)孢子、Brevibacillus sp.孢子和芽孢杆菌属物种(Bacillussp.)孢子，如来自炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、恶臭杆菌(Bacillusputida)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumila)的孢子。
在另一个实施方案中，该孢子为外生孢子，如放线菌目(Actinomycetales)孢子，如来自放线菌属物种(Actinomyces sp.)、链霉菌属物种、高温放线菌属物种(Thermoactinomyces sp.)、糖单孢菌属物种(Saccharomonospora sp.)和Saccharopylospora sp.。
在另外一个实施方案中，该孢子为细菌孢子。细菌孢子的例子包括但不局限于如上所述的所有梭菌属物种(Clostridium sp.)孢子和芽孢杆菌属物种孢子。
在另外一个实施方案中，该孢子为真菌孢子。真菌孢子的例子包括但不局限于分生孢子，如来自曲霉属(Aspergillus)物种和青霉属(Penicillium)物种的孢子。
方法和用途
本发明提供了一种组合物，该组合物包含卤过氧化物酶、过氧化氢源和碘化物离子源。
本发明也提供了杀死或灭活孢子的酶促方法，该方法包括使孢子与卤过氧化物酶、过氧化氢源和碘化物离子源接触。
卤过氧化物酶、过氧化氢源和碘化物离子源可配制为液体(如含水的)或干燥的产物制剂。该干燥的产物制剂随后可再次水合以形成可用于本发明方法中的活性液体或半液体制剂。
当将卤过氧化物酶、过氧化氢源和碘化物离子源配制为干燥的制剂时，可将这些成分混合、安排在不连续的层中或独立包装。
在一个实施方案中，本发明的方法不包括使孢子与α氨基酸接触。
本发明的方法可用于净化已暴露于孢子如生物学战争试剂，如能够导致炭疽的炭疽芽孢杆菌孢子的场所。
在本发明的上下文中，术语“杀死或灭活孢子”意思指至少99％的孢子不能转化(萌发)为营养细胞。优选99.9％(更优选99.99％且最优选99.999％)的孢子不能转化为营养细胞。
可以在0和90摄氏度之间的温度使孢子与本发明的组合物接触，且温度优选地在5和80摄氏度之间，更优选地在10和70摄氏度之间，更加优选地在15和60摄氏度之间，最优选地在18和50摄氏度之间，且特别是在20和40摄氏度之间。
本发明的组合物适于在各种环境中杀死或灭活孢子。本发明的组合物可以期望用于任何环境中以减少孢子污染，如健康护理工业(如动物医院、人类医院、动物诊所、人类诊所、疗养院、儿童和老人日托设施(day-carefacilities)等)、食品工业(如餐馆、食品加工工厂、食品贮存工厂、食品杂货店等)、服务工业(hospitality industry)(如旅馆、汽车旅馆、度假胜地、旅游船等)、教育工业(如学校和大学)等。
本发明的组合物可以期望用于任何环境中以减少孢子污染，如普通的房屋表面(如地面、墙壁、天花板、家具的外表面等)、特定设备的表面(如硬表面、制造设备、工艺设备等)、纺织品(如棉织品，毛织品，丝织品，合成的织品如聚酯、聚烯烃和聚丙烯酸酯，混合纤维如棉聚酯(cottonpolyester)等)、基于木材和纤维素的系统(如纸)、土壤、动物畜体(如皮、肉、毛发、羽毛等)、食品(如水果、蔬菜、坚果、肉类等)和水。
在一个实施方案中，本发明的方法涉及对纺织品的杀孢子处理。蜡状芽孢杆菌的孢子已被鉴定为主要的纺织品洗涤后污染物。因而，用本发明的组合物处理纺织品对于抗纺织品污染物的杀孢子活性是特别有用的。
可用本发明的组合物处理的纺织品的例子包括但不局限于个人物品(如衬衫、裤子、长袜、内衣等)、机构物品(institutional items)(如毛巾、实验室外套、长袍、围裙等)、客户服务物品(如毛巾、餐巾、桌布等)。
用本发明的组合物对纺织品进行的杀孢子处理可以包括使纺织品与本发明的组合物接触。该接触可发生于洗涤纺织品之前。可选择地，该接触可发生于纺织品洗涤过程中以提供杀孢子活性和任选地提供清洁活性以从纺织品中去除或减少污迹、污渍等。
由本发明的组合物接触的孢子可位于任何表面，该表面包括但不局限于用于如乳品厂、化学或药物加工工厂的工艺设备，实验室设备，水卫生系统，原油处理设备，纸浆加工设备，水处理设备或冷却塔的表面。本发明的组合物应该以有效杀死或灭活讨论中的表面上的孢子的量应用。
可以通过如下方法使孢子与本发明的组合物接触，即通过将孢子浸没在组合物的含水制剂中(如洗涤过程)、通过将组合物喷到孢子上、通过布的方式将组合物应用于孢子或者通过本领域技术人员认识到的任何其他方法。任何将本发明的组合物应用于孢子导致杀死或灭活孢子的方法均是可接受的应用方法。
本发明的方法也可用于净化已暴露于孢子(如病原性孢子)，如生物学战争试剂，如能够导致炭疽的炭疽芽孢杆菌孢子的场所。这种场所包括但不局限于衣物(如军衣)、车辆的内外部分、建筑物的内外部分、任何类型的军事设施和任何类型的上述环境。
本发明进一步通过下面的实施例进行描述，该实施例不应理解为限制本发明的范围。
实施例
用作缓冲液和底物的化学药品是至少试剂等级的商业产品。
实施例1
孢子产生
从Bacillus globigii或苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)(苏云金芽孢杆菌株ATCC10792)的新鲜培养物对Tryptose Blod Agar Base(TBAB)平板进行划线。将培养物于30摄氏度温育过夜。
从TBAB平板悬浮菌环量的纯芽孢杆菌并将细胞悬浮于2ml无菌水中。各自用100μl细胞悬浮液对2×SG平板进行接种。2×SG的组成如下：16g/L Difco细菌用营养肉汤、0.5g/L MgSO4×7H2O、2.0g/L KCl、1.0ml/100ml 10％的葡萄糖、0.1ml/100ml 1M的Ca(NO3)2、0.1ml/100ml0.1M的MnSO4、10μl/100ml 0.01M的FeSO4和1％Difco细菌用琼脂。
将平板于30摄氏度温育48-72小时。用相差显微镜检查孢子形成。孢子是明亮相。
当孢子形成效率接近100％时，用水收获细胞菌苔并通过强烈的涡旋而悬浮细胞。通过在4摄氏度于6000G离心5-10分钟收集细胞。用冰冷的水将细胞洗涤3次(×)。沉淀含有营养细胞和孢子。
应用分级密度梯度从营养细胞中分离孢子。为每一个洗涤的沉淀准备一个含有30ml 43％的Urographin的离心管。在Urographin中配制3ml细胞孢子的混合物，从而Urographin终浓度为20％。轻轻将20％的Urographin细胞/孢子混合物加载于43％的Urographin的顶层。
在室温于10000G离心30分钟。轻轻去除上清液。将纯的孢子沉淀悬浮于1ml冰冷的水中并转移到微量离心管中。在4摄氏度于最大速度离心1-2分钟，并将沉淀在冰冷的水中再洗涤2次。
通过相差显微镜和血细胞计数器检查孢子纯度和每ml的孢子数目。于-20摄氏度贮存悬浮于水中的孢子。
实施例2
液体制品中芽孢杆菌属孢子的杀死
将106个Bacillus globigii孢子接种于微量滴定板的A1-A6孔中，并将106个苏云金芽孢杆菌孢子接种于A7-A12孔中。
在孔A1-A3和A7-A9中加入卤过氧化物酶杀死系统，以达到DMG缓冲液(50mM DMG，pH 6.0)中1mM H2O2、1mM KI、1mg/L Curvulariaverruculosa卤过氧化物酶(称为HPO)的终浓度。孔中总体积为250μL。在孔A4-A6和A10-A12中加入DMG缓冲液(50mM DMG，pH 6.0)以达到250μL的总体积。
将微量滴定板于30摄氏度温育60分钟，以列的方式10-倍系列稀释内含物至TBB培养基(不合琼脂的Tryptose Blod Agar Base)中。然后将平板在潮湿的室中于30摄氏度温育过夜。18-24小时后通过用平板读出器读出OD620或通过在加入5μL 3mM的MTT/孔之后目测检查平板而记录稀释系列中的生长。MTT是当存在活细胞时形成紫色不溶性甲(formazan)染料的四氮唑染料。对孔比较活/死细胞从而直接给出以对数单位表示的杀死作用。对于Bacillus globigii，杀死作用被确定为5个对数单位，而对于苏云金芽孢杆菌，杀死作用被确定为6个对数单位。
实施例3
使用增加量的卤过氧化物酶和KI对于悬浮于液体HPO-KI中的孢子 的杀死率
应用描述于实施例1和2中的系统，用50mM pH 6.0的DMG缓冲液中的卤过氧化物酶(HPO)+KI(均以增加的浓度)+1mM H2O2对Bacillusglobigii孢子进行处理。在室温温育60分钟后，添加无菌过滤的Na2S2O3(可使I2猝灭)达到1％的终浓度。随后在TBB生长培养基中的系列稀释物揭示了杀死的孢子的数目。
表1.HPO-KI液体中Bacillus globigii孢子的剂量反应性杀死实验的结果。
 HPO，浓度   1mg/L  5mg/L
 KI，浓度   1mM   5mM  1mM  10mM  50mM  100mM
 杀死作用   ～5log U   ～3log U  2log U  0-1log U  0-1log U  0-1log U
实施例4
温度依赖性孢子杀死作用
使Bacillus globigii和苏云金芽孢杆菌孢子于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃接受卤过氧化物酶+KI+H2O2的作用。
向Bacillus globigii孢子(107/微量离心管)和苏云金芽孢杆菌孢子(105/微量离心管)中加入描述于实施例2中的1ml杀菌混合物。使该管在水浴中于相关温度温育60分钟。将悬浮于1ml pH 6.0的50mM DMG缓冲液中的孢子用作对照。在热处理结束时，在无菌水中制备稀释系列(10-倍的稀释物)，并将来自稀释物的等份试样铺在Tryptose Blod Agar Base平板上。将平板于30℃温育过夜。通过记录CFU，对各种温度时杀菌系统的杀死作用进行了计算。结果以对数单位给出。
表2.以对数单位记录的杀死作用。
   10℃   15℃   20℃   25℃   30℃   35℃   40℃   45℃ 50℃   55℃   60℃
  Bacillusglobigii 0.5 1 2 3 4 5 6 7 7 6 7
  苏云金芽孢杆菌 2 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5
实施例5
向表面应用卤过氧化物酶-KI系统
剂量反应性实验证明酶和KI的浓度增加及由此自由I2的浓度增加可增加陶瓷表面的杀死作用。
用水中的Bacillus globigii孢子悬浮液(约106个孢子/ml)对瓷砖进行喷雾，使其完全干燥，然后用下面的混合物进行喷雾：50mM pH 6.0的DMG缓冲液中的卤过氧化物酶+KI+1mM H2O2。在潮湿的室中温育60分钟后，使过量的流体于室温蒸发，并以0.5％琼脂糖固化的TBB营养培养基将瓷砖覆盖。在潮湿的室中于30℃温育过夜，通过应用1mM MTT显示生长的小菌落，该MTT当与呼吸的生物接触时可形成紫色的甲。通过对HPO/I2处理的瓷砖和未处理的对照瓷砖上的小菌落进行计数计算了杀死的程度。
表3.不同HPO-KI浓度对陶瓷砖上芽孢杆菌孢子的杀死率。
HPO，浓度  1mg/L  5mg/L   10mg/l  10mg/l   10mg/L
KI，浓度  1mM  1mM   1mM  5mM   10mM
杀死作用  1-2log U  1-2log U   1-2log U  ～2log U   ～3log U
实施例6
应用实施例5的方法，将HPO的作用与葡萄糖氧化酶(GOX)的作用进行了组合，该葡萄糖氧化酶在葡萄糖和氧存在时形成过氧化氢。将接种了约3×10E6/块砖的Bacillus globigii孢子的瓷砖(反面)用净化流体覆盖，该净化流体由5mg/l Curvularia verrucullosa卤过氧化物酶(rCvP)、2mg/L葡萄糖氧化酶(GOX)、1％(w/v)葡萄糖、5mM KI、1mM H2O2、0.2％(w/v)Quillaja皂苷、0.3％甲基纤维素、100mM pH6.5的Tris缓冲液组成，或者单独用rCvP-KI系统覆盖，或者单独用GOX-葡萄糖系统覆盖。将缓冲液+甲基纤维素+皂苷用作对照。在净化程序后，使瓷砖于室温干燥24小时。然后用营养琼脂糖包被瓷砖并于34℃温育20小时。随后通过向琼脂糖的表面应用探测活细胞的1mM MTT染料来显示小菌落。通过确定瓷砖上小菌落的面积密度估计了净化作用。
表4.以对数单位表示的HPO、HPO+GOX和GOX酶制品对陶瓷表面孢子的杀死率。
HPO  HPO+GOX  GOX
Bacillus globigii 2  5  3-4
苏云金芽孢杆菌 2  5-6  3-4
实施例7
卤过氧化物酶-KI系统向毛巾布(terry cloth)块的应用
将布块(5cm×5cm)用Bacillus globigii孢子接种，使其干燥，浸泡于50mM pH 6.0的DMG缓冲液中的5mg/L卤过氧化物酶、5mM KI、1mM H2O2中，并温育60分钟。然后将猝灭I2反应的Na2S2O3添加到1％(w/v)的终浓度并使其反应30分钟。用无菌水处理未猝灭的样品。在猝灭后，将布块置于25ml的离心管中，用无菌水覆盖，并于4℃在环形摇床(circular shaker)(300rpm)中温育约20小时。将稀释的样品铺于TBAB板上并对出现的细菌菌落进行计数，从而确定洗涤水中的活孢子。大约1/3在布上接种的孢子被释放且随后可在“洗涤液体”中探测到。
表5.卤过氧化物酶-KI系统在毛巾布块上的杀死作用。
    无猝灭的HPO-KI     有猝灭的HPO-KI
    20℃     30℃     20℃     30℃
杀死作用，log U     1     1     0     0.5
实施例8
法兰绒布块的净化
将1.2cm×1.2cm的法兰绒布块用约10E8的溶于水中的苏云金芽孢杆菌孢子接种。使该布于室温干燥过夜。将2ml净化流体与1％葡萄糖和2mg/L葡萄糖氧化酶(GOX)结合应用于布块，该净化流体由含有0.2％Quillaja皂苷、0.3％甲基纤维素、1mM H2O2、5mM KI、卤过氧化物酶(HPO)(参见表6中的浓度)的100mM pH 6.0的DMG缓冲液组成，之后布块于室温(在直径4.5cm的敞开的培养皿中)温育约18-20小时。在那时将布块(现已干燥)置于宽的30ml离心管中并用10ml无菌的0.1％Tween覆盖。将管置于超声清洗浴(Branson)中并处理60分钟。然后将100μL现已富含孢子的流体转移到微量滴定板上A行的孔中，并如实施例2所描述的以列的方式进行10-倍的稀释。将微量滴定板在潮湿的室中于30摄氏度温育过夜，并如实施例2所描述的对生长进行记录。结果表示于表6中。
表6.法兰绒布块的净化。
未处理的 1mg/LHPO   1mg/LHPO+GOX 5mg/LHPO   5mg/LHPO+GOX 10 mg/LHPO   10mg/LHPO+GOX
  杀死作用，log U 0 0.5 2.5 4.5 5 6 6

Claims (12)

1.一种杀死或灭活孢子的酶促方法，该方法包括使孢子与含有钒的卤过氧化物酶、过氧化氢源和碘化物离子源接触，其中不使孢子与α氨基酸接触。
2.权利要求1的方法，其中卤过氧化物酶是氯过氧化物酶或溴过氧化物酶。
3.权利要求1的方法，其中碘化物离子源是碘化物盐。
4.权利要求1的方法，该方法还包括使孢子与增强剂接触。
5.权利要求1的方法，该方法还包括使孢子与表面活性剂接触。
6.权利要求1-5中任何一项的方法，其中孢子位于表面。
7.权利要求6的方法，其中表面是纺织品表面。
8.权利要求6的方法，其中表面是实验室设备或工艺设备的表面。
9.一种净化暴露于孢子的场所的方法，该方法包括使孢子与含有钒的卤过氧化物酶、过氧化氢源、碘化物离子源和增强剂接触，其中不使孢子与α氨基酸接触。
10.权利要求9的方法，其中碘化物离子源是一种或多种碘化物盐。
11.权利要求9的方法，该方法还包括使孢子与表面活性剂接触。
12.含有钒的卤过氧化物酶在杀死孢子中的用途。
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