PL181389B1 - Enzymatyczny srodek przeciwbakteryjny PL - Google Patents
Enzymatyczny srodek przeciwbakteryjny PLInfo
- Publication number
- PL181389B1 PL181389B1 PL95316571A PL31657195A PL181389B1 PL 181389 B1 PL181389 B1 PL 181389B1 PL 95316571 A PL95316571 A PL 95316571A PL 31657195 A PL31657195 A PL 31657195A PL 181389 B1 PL181389 B1 PL 181389B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- chloroperoxidase
- hypochlorite
- vanadium
- added
- hydrogen peroxide
- Prior art date
Links
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title claims description 15
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 title description 10
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 72
- 108010035722 Chloride peroxidase Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 241001537312 Curvularia inaequalis Species 0.000 claims abstract description 40
- 101710143559 Vanadium-dependent bromoperoxidase Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 47
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 46
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 37
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 23
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 12
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 claims description 9
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 claims description 9
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 claims description 9
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 claims description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 7
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 claims description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 108010073450 Lactate 2-monooxygenase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 claims 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 claims 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 12
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 abstract description 5
- WQYVRQLZKVEZGA-UHFFFAOYSA-N hypochlorite Chemical compound Cl[O-] WQYVRQLZKVEZGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 144
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 43
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 36
- 108010016350 vanadium chloroperoxidase Proteins 0.000 description 35
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 30
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 30
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 28
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 27
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 27
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 25
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 25
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 24
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 20
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 19
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 19
- LEONUFNNVUYDNQ-UHFFFAOYSA-N vanadium atom Chemical group [V] LEONUFNNVUYDNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 17
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- -1 thiocyanate ions Chemical class 0.000 description 16
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 108010073997 Bromide peroxidase Proteins 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 13
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 11
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 11
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 10
- 241000557265 Drechslera biseptata Species 0.000 description 10
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 10
- 108010079058 casein hydrolysate Proteins 0.000 description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 10
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 10
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 10
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 10
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 10
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 9
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 8
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 8
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 8
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 8
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 8
- VOBIHUAWDXUCPH-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-5,5-dimethylcyclohexane-1,3-dione Chemical compound CC1(C)CC(=O)C(Cl)C(=O)C1 VOBIHUAWDXUCPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241001474374 Blennius Species 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 6
- 241000186805 Listeria innocua Species 0.000 description 6
- 102000003896 Myeloperoxidases Human genes 0.000 description 6
- 108090000235 Myeloperoxidases Proteins 0.000 description 6
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 6
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 6
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 6
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 6
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 6
- IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M potassium bromide Chemical compound [K+].[Br-] IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- LSGOVYNHVSXFFJ-UHFFFAOYSA-N vanadate(3-) Chemical compound [O-][V]([O-])([O-])=O LSGOVYNHVSXFFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000512259 Ascophyllum nodosum Species 0.000 description 5
- 241000218746 Curvularia subpapendorfii Species 0.000 description 5
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 5
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100038609 Lactoperoxidase Human genes 0.000 description 4
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N hypochlorous acid Chemical compound ClO QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- HHYBCLNAPQRAAN-UHFFFAOYSA-N 2,2-dichloro-5,5-dimethylcyclohexane-1,3-dione Chemical compound CC1(C)CC(=O)C(Cl)(Cl)C(=O)C1 HHYBCLNAPQRAAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000266330 Alternaria chartarum Species 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 108010023244 Lactoperoxidase Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 101100112520 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) CCA1 gene Proteins 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 3
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- CUILPNURFADTPE-UHFFFAOYSA-N hypobromous acid Chemical compound BrO CUILPNURFADTPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 229940057428 lactoperoxidase Drugs 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- MWNQXXOSWHCCOZ-UHFFFAOYSA-L sodium;oxido carbonate Chemical class [Na+].[O-]OC([O-])=O MWNQXXOSWHCCOZ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dimethoxybenzidine Chemical compound C1=C(N)C(OC)=CC(C=2C=C(OC)C(N)=CC=2)=C1 JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000580491 Alternaria didymospora Species 0.000 description 2
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241001236089 Curvularia nicotiae Species 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000222118 Leptoxyphium fumago Species 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241001103617 Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 Species 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- NRFTYDWKWGJLAR-MELADBBJSA-N Tyr-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)C(=O)O NRFTYDWKWGJLAR-MELADBBJSA-N 0.000 description 2
- 108010093894 Xanthine oxidase Proteins 0.000 description 2
- 102100033220 Xanthine oxidase Human genes 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 2
- 239000007859 condensation product Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- VTIIJXUACCWYHX-UHFFFAOYSA-L disodium;carboxylatooxy carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)OOC([O-])=O VTIIJXUACCWYHX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000001362 electron spin resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 2
- 229940045872 sodium percarbonate Drugs 0.000 description 2
- 239000003760 tallow Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 229940044613 1-propanol Drugs 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000266326 Alternaria botrytis Species 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010089254 Cholesterol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000223208 Curvularia Species 0.000 description 1
- 101001124620 Curvularia inaequalis Vanadium chloroperoxidase Proteins 0.000 description 1
- PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N Cyclohexylaminopropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCNC1CCCCC1 PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465183 Drechslera Species 0.000 description 1
- 241000992402 Drechslera fugax Species 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 108700024827 HOC1 Proteins 0.000 description 1
- 101001099464 Homo sapiens Lactoperoxidase Proteins 0.000 description 1
- 101710200950 Non-heme chloroperoxidase Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical compound CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100178273 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HOC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241001221452 Staphylococcus faecalis Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- LVHHEVGYAZGXDE-KDXUFGMBSA-N Thr-Ala-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O LVHHEVGYAZGXDE-KDXUFGMBSA-N 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 241000266300 Ulocladium Species 0.000 description 1
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CFVBFMMHFBHNPZ-UHFFFAOYSA-N [Na].[V] Chemical compound [Na].[V] CFVBFMMHFBHNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000004996 alkyl benzenes Chemical class 0.000 description 1
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003868 ammonium compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N benzenesulfonic acid Chemical class OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000005660 chlorination reaction Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 239000000551 dentifrice Substances 0.000 description 1
- 239000002781 deodorant agent Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012869 germination medium Substances 0.000 description 1
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005658 halogenation reaction Methods 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSQACBWWAIBWIC-UHFFFAOYSA-N hydron;piperazine;chloride Chemical compound Cl.C1CNCCN1 MSQACBWWAIBWIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000012263 liquid product Substances 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019645 odor Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000004028 organic sulfates Chemical class 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 229960005335 propanol Drugs 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 208000033610 salivary peroxidase Diseases 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229940071089 sarcosinate Drugs 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- JVBXVOWTABLYPX-UHFFFAOYSA-L sodium dithionite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])=O JVBXVOWTABLYPX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960001922 sodium perborate Drugs 0.000 description 1
- YKLJGMBLPUQQOI-UHFFFAOYSA-M sodium;oxidooxy(oxo)borane Chemical compound [Na+].[O-]OB=O YKLJGMBLPUQQOI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003871 sulfonates Chemical class 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 1
- 125000005287 vanadyl group Chemical group 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09D—COATING COMPOSITIONS, e.g. PAINTS, VARNISHES OR LACQUERS; FILLING PASTES; CHEMICAL PAINT OR INK REMOVERS; INKS; CORRECTING FLUIDS; WOODSTAINS; PASTES OR SOLIDS FOR COLOURING OR PRINTING; USE OF MATERIALS THEREFOR
- C09D5/00—Coating compositions, e.g. paints, varnishes or lacquers, characterised by their physical nature or the effects produced; Filling pastes
- C09D5/16—Antifouling paints; Underwater paints
- C09D5/1606—Antifouling paints; Underwater paints characterised by the anti-fouling agent
- C09D5/1612—Non-macromolecular compounds
- C09D5/1625—Non-macromolecular compounds organic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
- C11D3/38654—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing oxidase or reductase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
1. Enzymatyczny srodek przeciwbakteryjny zasadniczo wolny od aktywnosci katalazy, znamienny tym, ze zawiera haloperoksydaze wanadowa, zródlo halogenku i nadtlenek wo- doru lub zródlo nadtlenku wodoru. 2. Srodek wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako haloperoksydaze wanadowa zawiera chloroperoksydaze. 3. Srodek wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako haloperoksydaze wanadowa zawiera chloroperoksydaze, która mozna otrzymac z Cumilaria inaeaualis. 4. Srodek wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako haloperoksydaze wanadowa zawiera chloroperoksydaze, która wykazuje immunologiczna reakcje krzyzowa z chlorope- roksydaza z Curvularia inaequalis CBS 102.42. 5. Srodek wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako zródlo nadtlenku wodoru zawiera enzymatyczny uklad wytwarzajacy nadtlenek wodoru. 6. Srodek wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako uklad wytwarzajacy nadtlenek wodoru zawiera uklad glukoza/oksydaza glukozowa lub mleczan/oksydaza mleczanowa. PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest enzymatyczny środek przeciwbakteryjny, zawierający haloperoksydazę, źródło nadtlenku wodoru oraz źródło halogenku.
Różne enzymatyczne środki przeciwbakteryjne są znane w technice. Przykładowo, WO-A-94/04217 ujawnia stabilizowane środki do czyszczenia zębów, które mają zdolność do wytwarzania jonów podtiocyjaninowych (OSCN) w stężeniach skutecznych przeciwbakteryjnie. Środki zawierają oksydoreduktazę dla wytwarzania nadtlenku wodoru oraz enzym peroksydazę zdolny do utleniania jonów tiocyjanianowych, które są normalnie obecne w ślinie, do przeciwbakteryjnych jonów podtiocyjaninowych (OSCN-). Odpowiednie peroksydazy obejmują laktoperoksydazę, mieloperoksydazę, peroksydazę ze śliny oraz chloropropoksydazę.
Enzymatyczne środki przeciwbakteryjne, zawierające haloperoksydazę są również ujawnione w EP-A-500 387 (Exoxemis). Opisano, że haloperoksydazy wiążą selektywnie i hamują wzrost docelowych mikroorganizmów w obecności nadtlenku i halogenku. Jako odpowiednie haloperoksydazy EP-A-500 387 wymienia mieloperoksydazę (MPO), oksydazę z eozynofili (EPO), laktoperoksydazę (LPO) oraz chloroperoksydazę (CPO). Donoszono, że stosunek halogenku do nadtlenku wodoru jest krytycznym czynnikiem w odniesieniu do stabilności i działania haloperoksydaz. Przy bardzo niskim stosunku, nadtlenek wodoru może hamować działanie haloperoksydazy, podczas, gdy przy bardzo wysokich stosunkach halogenek może blokować reakcję enzymatyczną. Stosunek może zmieniać się w szerokim zakresie, ale korzystnie jest utrzymywany powyżej 50.
Z powodu niepożądanych reakcji ubocznych nadtlenku wodoru, rzeczywiste stężenie nadtlenku wodoru w środku przeciwbakteryjnym może być niższe niż oczekiwane. A zatem autorzy wynalazku stwierdzili, że bardziej pożądane jest dysponowanie możliwością użycia wysokiego wyjściowego stężenia nadtlenku wodoru w środku przeciwbakteryjnym, w połączeniu ze zwykłą ilością halogenku.
Ponadto, istnieje zapotrzebowanie na enzymatyczne środki przeciwbakteryjne, mające spektrum aktywności przeciwbakteryjnej, różniące się od znanych enzymatycznych środków przeciwbakteryjnych. Korzystnie, środki powinny mieć zdolność do wykazywania aktywności przeciwbakteryjnej wobec mikroorganizmów, które są trudne do zwalczenia, np. Streptococcus
181 389 faecalis. W innych okolicznościach może być pożądane zwalczanie także mikroorganizmów niepatogennych, ponieważ mogą one powodować psucie się produktów żywnościowych.
A zatem, celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie enzymatycznego przeciwbakteryjnego środka, który jest pozbawiony jednej lub więcej z powyższych wad.
Ostatnio nieoczekiwanie stwierdziliśmy, że skuteczny enzymatyczny środek przeciwbakteryjny może być utworzony przy zastosowaniu haloperoksydazy wanadowej.
Wcześniejszy stan techniki wspomniany powyżej obejmuje różne haloperoksydazy dla zastosowania w środkach przeciwbakteryjnych, ale nie przywiązywano szczególnej wagi do klasy haloperoksydaz wanadowych.
Haloperoksydazy wanadowe różnią się od innych haloperoksydaz tym, że grupa prostetyczna w tych enzymach ma strukturalne właściwości podobne do wanadanu (wanad V), podczas, gdy inne haloperoksydazy są hemoperoksydazami.
Niektóre bromoperoksydazy wanadowe znajdują się w naturze na powierzchni wodorostów (Wever i wsp., 1991). W nienaruszonej roślinie w wodzie morskiej bromoperoksydaza wanadowa jest dostępna dla dodanych substratów i jest zdolna do uwalniania HOBr po dodaniu nadtlenku wodoru. Rola enzymu nie została ustalona, ale jest prawdopodobne, że powstawanie wysoce aktywnego utleniacza HOBr w wodzie morskiej jest częścią systemu obronnego rośliny, zapobiegającego wzrostowi na jej powierzchni mikroorganizmów i grzybów.
Po odkryciu nie-hemowej wanadowej bromoperoksydazy z wodorostów Ascophyllum nodosum wykazano, że duża liczba innych gatunków wodorostów również zawiera te enzymy. Bromoperoksydaza z A. nodosum była szczególnie intensywnie badana i charakteryzowana (celem dokonania przeglądu, patrz odnośniki 2-3). Grupa prostetyczna w tych enzymach ma cechy strukturalne podobne do wanadanu (wanad V). W reakcji katalitycznej ustalonej dla tego enzymu, nadtlenek wodoru reaguje z enzymem z wytworzeniem kompleksu nadtlenek wodoru-enzym, po czym bromek oraz proton reagują z- kompleksem z wytworzeniem kompleksu enzym-HOBr. Wykazano (De Boer i wsp., 1988), że kompleks ten rozpada się do enzymu i HOBr. Pokazano również, że te wanadowe bromoperoksydazy (De Boer i wsp., 1988) mają wysoką funkcjonalną stabilność w podłożu wodnym i organicznym. Przykładowo, enzymy te były stabilne przez trzy tygodnie w warunkach umożliwiających rozkład i mogą być przechowywane przez ponad miesiąc bez utraty aktywności w rozpuszczalnikach organicznych, takich jak aceton, metanol, etanol (obecne w ilości do 60% obj./obj.) i 1-propanol. Jednakże, enzymy te mają wadę, a mianowicie dla potencjalnego zastosowania, powinien być obecny lub dodawany bromek, a dalsze wysiłki klonowania genów kodujących te bromoperoksydazy z wodorostów i określenia ich sekwencji aminokwasowej nie powiodły się.
Znana istniejąca, zawierająca hem chloroperoksydaza z Caldariomyces fumago jest mniej odpowiednia do wytwarzania enzymatycznych środków przeciwbakteryjnych z powodu swojej właściwej sobie niestabilności i niskiego optimum pH wynoszącego 2,75 (J.R. Kanofsky, 1984), co poważnie ogranicza jej stosowanie. Podobne powody nie dopuszczają do zastosowania enzymu mieloperoksydazy (MPO) z krwinek białych, która jest również zdolna do wytwarzania HOCl (A.R.J. Bakkenist i wsp., 1980).
Pojawiły się już doniesienia (patrz odnośniki 8, 9), że grzyby strzępkowe wydzielają haloperoksydazę o zwiększonej stabilności. W szczególności wykazano, że glebowy grzyb Curvularia inaequalis wydziela wanadowe chloroperoksydazy (J.W.P.M. Van Schijndel i wsp., 1993), które posiadają wysokie powinowactwo do chlorków i mają optimum pH dla reakcji chlorowania około 5,5. Tak jak w przypadku bromoperoksydazy z wodorostów, grupa prostetyczna w chloroperoksydazie ma cechy strukturalne podobne do wanadanu (wanad V). W kolejnych, bardziej szczegółowych badaniach (J.W.P.M. Van Schijndel i wsp., 1994), wykazano, że kinetyka enzymatyczna utleniania chlorku przez nadtlenek wodoru przypomina bromoperoksydazę wanadową z wodorostów A. nodosum. Ponadto, trzy różne metody pokazały, że enzym wytwarza utlenione związki chloru (HOCl) jako produkt reakcji, a sam jest oporny na ten produkt. Enzym posiada wysoką termostabilność (Tm 90°C) i wykazuje dużą stabilność w rozpuszczalnikach organicznych, takich jak 40% metanol, etanol i propanol.
181 389
Enzymatyczny przeciwbakteryjny środek według wynalazku, zawiera haloperoksydazę wanadową, źródło halogenku i nadtlenek wodoru lub źródło nadtlenku wodoru.
Dokładny opis wynalazku (a) Haloperoksydaza wanadowa
Haloperoksydaza wanadowa, która stanowi składnik środka według wynalazku może w zasadzie być wybrana spośród różnych form haloperoksydaz wanadowych, które zostały dotąd ujawnione. Przykładowo, można użyć wanadową (nie-hemową) haloperoksydazę wytwarzaną z Curvularia inaequalis, takąjak opisana w USA nr 4 707 466. Alternatywnie, można wyizolować i oczyścić chloroperoksydazę z Curvularia inaequalis (CBS 102.42) według metody J.W.P.M. Van Schijndela i wsp. (1993).
Inne źródła haloperoksydaz wanadowych obejmują Drechslera biseptata (CBS 371.72), Drechslera Jugax (CBS 509.77), Drechslera nicotiae (CBS 655.74), Drechslera subpapendorfii (656.74), Embelisia hyacinthi (416.71), Embelisia didymospora (CBS 766), Ulocladium chartarum (200.67) i Ulocladium botrytis (452.72).
Alternatywnie, haloperoksydaza wanadowa może być przygotowana technikami rekombinowania DNA poprzez transformowanie odpowiedniego gospodarza wektorami ekspresyjnymi, zawierającymi początek replikacji, sekwencje kontrolujące transkrypcję i terminację i sekwencję DNA kodującą haloperoksydazę wanadową, hodowanie gospodarza w warunkach, które umożliwiają, ekspresję genu struktury i izolowanie haloperoksydazy wanadowej. Jest to opisane szczegółowo poniżej w przykładach.
(b) Źródło jonów halogenkowych
Drugim składnikiem środków higienicznych według wynalazku, jest źródło jonów halogenkowych. Mogą nimi być dowolne jony halogenkowe, ale korzystne jest źródło jonów jodku lub chlorku, ponieważ są one najbardziej skuteczne. Najbardziej korzystnym źródłem jonów halogenkowych jest chlorek sodu. Halogenek może być dodawany do enzymatycznych środków przeciwbakteryjnych według wynalazku lub, alternatywnie, może być użyty halogenek, który jest naturalnie obecny w wodzie z kranu i który jest na ogół w ilości 2-5 mM.
(c) Źródło nadtlenku wodoru
Higieniczne środki według wynalazku, zawierają ponadto źródło nadtlenku wodoru lub układ wytwarzający nadtlenek wodoru. Przykładami odpowiedniego układu wytwarzającego nadtlenek wodoru są sole nadboranowe lub nadwęglanowe, korzystnie nadwęglan sodu lub nadboran sodu.
Nadtlenek wodoru może być również dostarczony przez enzymatyczny układ wytwarzania nadtlenku wodoru, który może być w zasadzie wybrany spośród różnych enzymatycznych układów wytwarzania nadtlenku wodoru, znanych w technice. Przykładowo, można użyć oksydazy aminowej i aminy, oksydazy aminokwasowej i aminokwasu, oksydazy mleczanowej i mleczanu, oksydazy cholesterolowej i cholesterolu, oksydazy kwasu moczowego i kwasu moczowego lub oksydazy ksantynowej z ksantyną. Korzystna jest jednakże kombinacja oksydazy glukozowej i glukozy.
Ilość oksydazy glukozowej będzie zależała od jej specyficznej aktywności i aktywności jakiejkolwiek resztkowej katalazy, która może być obecna, ale jako przykład można ogólnie powiedzieć, że środek według wynalazku będzie zawierał od 10 do 1000, korzystnie od 20 do 500 jednostek oksydazy glukozowej na g lub ml środka, przy czym jednostka aktywności enzymu jest zdefiniowana jako ilość wymagana do przekształcenia 1 pmola substratu na minutę w standardowych warunkach.
(d) Inne składniki
Enzymatyczne środki przeciwbakteryjne według wynalazku, na ogół zawierają od 0,01 do 50% wag., korzystnie 0,1 do 5,0% wag. jednego lub więcej związków powierzchniowo czynnych jako środków zwilżających. Odpowiednie związki powierzchniowo lub detergentowo czynne obejmują mydła lub anionowe, niejonowe, kationowe, amfoteryczne lub dwubiegunowe związki, które nie są mydłami. Układ powierzchniowo czynny zwykle obejmuje jeden lub więcej anionowych związków powierzchniowo czynnych i jeden lub więcej niejonowych
181 389 związków powierzchniowo czynnych. Może też dodatkowo zawierać detergentowe związki amfoteryczne lub dwubiegunowe, ale zwykle nie jest to zalecane ze względu na ich stosunkowo wysoki koszt.
Na ogół niejonowe i anionowe związki powierzchniowo czynne, które tworzą taki układ, można wybrać spośród związków opisanych w „Surface Active Agents” Vol. 1, by Schwartz & 20 Perry, Interscience 1949, Vol. 2 przez Schwartz, Perry & Berch, Interscience 1958, w bieżącym wydaniu „McCutcheon's Emulsifiers i Detergents” opublikowanym przez Manufacturing Confectioners Company lub w „Tenside-Taschenbuch”, H. Stache, wydanie 2, Carl Hauser 25 Verlag, 1981.
Odpowiednie niejonowe związki detergentowe, które można stosować obejmują, zwłaszcza, produkty reakcji związków, zawierających grupę hydrofobową i reaktywny atom wodoru, np. alifatycznych alkoholi, kwasów, amidów lub alkilofenoli z tlenkami alkilenu, zwłaszcza z tlenkiem etylenu, samym lub z tlenkiem propylenu. Konkretne niejonowe związki detergentowe stanowią produkty kondensacji C6-C22 alkilofenoli z tlenkiem etylenu, zwykle zawierające od 5 do 25 EO, tzn. 5 do 25 jednostek tlenku etylenu na cząsteczkę oraz produkty kondensacji alifatycznych pierwszorzędowych lub drugorzędowych liniowych lub rozgałęzionych C8-C,8 alkoholi z tlenkiem etylenu, zwykle z 5 do 40 EO.
Odpowiednie anionowe związki detergentowe, które można stosować, zwykle stanowią rozpuszczalne w wodzie sole metali alkalicznych organicznych siarczanów i sulfonianów, zawierające rodniki o długości 8 do 22 atomów węgla, przy czym stosowany tu termin „alkilowe” obejmuje alkilową część wyższych rodników acylowych. Przykładem odpowiednich syntetycznych anionowych związków detergentowych są alkilosiarczany sodu i potasu, zwłaszcza wytworzone przez siarczanowanie wyższych C8-C18 alkoholi, otrzymywanych np. z łoju lub oleju kokosowego; C9-C20 alkilobenzenosulfoniany sodu i potasu, zwłaszcza alkilobenzenosulfoniany sodu z liniowym drugorzędowym C10-C15 alkilem oraz alkilogliceryloeterosiarczany sodu, a szczególnie etery wyższych alkoholi pochodzących z łoju lub oleju kokosowego i syntetycznych alkoholi pochodnych ropy naftowej. Korzystne anionowe związki detergentowe stanowią CH-Cj5 alkilobenzenosulfoniany sodu i C^-C^ alkilosiarczany sodu.
Odpowiednie są także środki powierzchniowo czynne, takie jak opisane w EP-A-328 177 (Unilever), które są odporne na wysalanie, środki typu alkilopoliglikozydów opisane w Ep-A-070 074 i alkilomonoglikozydy.
Korzystne układy powierzchniowo czynne stanowią mieszaniny związków amonowych z niejonowymi, zwłaszcza grupy i przykłady takich środków wskazane w EP-A-346 995 (Unilever). Szczególnie korzystny jest układ, który jest mieszaniną soli metalu alkalicznego siarczanu pierwszorzędowego alkoholu C^-C^ razem z pierwszorzędowym alkoholem C12-C15 etoksylowanym 3-7 EO.
Niejonowy detergent korzystnie stanowi więcej niż 10%, np. 25-90% wag. układu powierzchniowo czynnego. Anionowe związki powierzchniowo czynne mogą być obecne w układzie np. w ilości w zakresie od około 5% do około 40% wag.
Enzymatyczne środki detergentowe według wynalazku mogą także zawierać inne składniki zwykle stosowane w środkach przeciwbakteryjnych, takie jak środki zagęszczające. Szczególnie użyteczne pod tym względem są kombinacje związków powierzchniowo czynnych znane z EP-A-314 232 (Unilever), które tworzą żele zagęszczające po rozcieńczeniu wodą.
Te środki przeciwbakteryjne według wynalazku mogą być użyte do czyszczenia twardych powierzchni i prania tkanin, jak również higieny i czyszczenia w zastosowaniach przemysłowych/instytucjach, takich jak szpitale i do czyszczenia i dezynfekcji sprzętu medycznego. Innym zastosowaniem jest przemysł mleczarski, gdzie mogą być stosowane do dezynfekcji sprzętu mleczarskiego. Środki przeciwbakteryjne mogą być również z powodzeniem użyte w dezodorantach ze względu na ich zdolności do zwalczania bakterii, które powodują przykry zapach.
181 389
Środki przeciwbakteryjne według wynalazku mogą być użyte w postaci proszku, który ma być rozpuszczony w wodzie przed użyciem, ale mogą również wchodzić w skład produktów ciekłych lub żeli.
Przy takiej postaci produktów jest istotne, żeby wytwarzanie soli podchlorowcowej nie rozpoczynało się, dopóki środek nie zostanie użyty. Można to uzyskać poprzez fizyczne rozdzielenie enzymu i jego substratu, np. poprzez zamknięcie enzymu w kapsułkach zgodnie z dobrze znanymi technikami.
Kiedy enzymatyczny środek przeciwbakteryjny ma być użyty, rozcieńcza się go 5 do 100 razy poprzez dodanie wody, celem otrzymania środowiska mającego najbardziej skuteczną aktywność przeciwbakteryjną, następnie doprowadza się do kontaktu z powierzchnią, która ma być dezynfekowana.
Piśmiennictwo
1. R. Wever, M.G.M. Tromp. B.E. Krenn. Marjani i M. van Tol. Brominating activity of seaweed Ascophyllum nodosum. Impact on biosphere. Envir. Sc. Techn. 25 (1991), 446-449.
2. R. Wever and K. Kustin. Vanadium: a biologically relevant element. Adv. Inorg. Chem. 35 (1990), 81-115.
3. D. Rehder. The bioinorganic chemistry of vanadium. Ang. Chem. Ed. Engl. 30 (1991)148-167.
4. E. de Boer and R. Wever. The reaction mechanism of novel vanadium bromoperoxidase, steady-state kinetic analysis. J. Biol. Chem. 263 (1988), 12326-12332.
5. E. de Boer, H. Plat, M.G.M. Tromp, M.C.R. Franssen, H.C. van der Plas, E..M. Meijer and H.E. Schoemaker. Vanadium-containing bromoperoxidase: an example of an oxidoreductase with high operational stability in aqueous and organie media. Biotechn. Bioeng. 30 (1987), 607-610.
6. J.R. Kanofsky. Singlet oxygen producion by chloroperoxidase-hydrogen peroxide-halide systems. J. Biol. Chem. 259 (1984), 5596-5600.
7. A.R.J. Bakkenist, J.E.G. de Boer, H. Plat and R. Wever. The halide complexes of myeloperoxidase and the mechanism of halogenation reactions. Biochim. Biophys. Acta 613 (1980), 337-348.
8. J.C. Hunter-Cevera and L. Sotos. Screening for „new” enzyme in nature: haloperoxidase production by Death Valley dematiaceous hyphomycetes. Microb. Ecol. 12 (1986) 121-127.
9. T-N.E. Liu, T. MTimkulu, J. Geigert, B. Wolf, S.L. Neidleman, D. Silva and J.C. Hunter-Cevera. Isolation and characterization of a novel non-heme chloroperoxidase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 142 (1987), 329-333.
10. J.W.P.M. Van Schijndel, E.G.M. Vollenbroek and R. Wever. The chloroperoxidase from the fungus Curvularia inaequalis; novel vanadium enzyme. Biochim. Biophys. Acta 1161 (1993), 249-256.
11. Van Schijndel, J.W.P.M., Barnett, P., Roelse, J., Vollenbroek, E.G.M. and Wever, R. Vanadium chloroperoxidase from the fungus Curvularia inaequalis; stability and steadystate kinetics (1994) Eur. J. Biochem. 225, 151-157.
12. H. Sehagger and G. Von Jagow (1987) Anal. Biochem. 166, 368-379.
13. P. Matsudaira (1987) J. Biol. Chem. 262,10035-10038.
14. Sambrook, J., Fritch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edn„ Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.).
15. R. Wever, H. Plat and E de Boer (1985), Biochem. Biophys. Acta 830, 181-186.
Wynalazek będzie dalej zilustrowany następującymi nie ograniczającymi przykładami.
181 389
Przykład 1. Minimalne stężenie hamujące (MIC, ang. Minimal Inhibitory Concentration) podchlorynu
Materiały:
W tym przykładzie użyto następujących szczepów bakteryjnych: Escherichia coli NCTC 900, Pseudomonas aeruginosa AtCc 15442, Staphylococcus aureus ATCC 13565, Streptococcus faecalis NCTC 1092 i Listeria innocua ATCC 33090 serotyp 6B. Bakterie hodowano przez 15 do 18 godz. w 30°C w pożywce Brain Heart Infusion (BHI). Po hodowli, szczepy przemywano dwa razy buforem cytrynianowym pH 5,5 (bufor 20 mM cytrynian sodu-NaOH +10 mM NaCl). Zawiesiny bakterii odwirowywano w wirówce Eppendorfa (14000 obr./min. przez 5 min.), a następnie supernatanty były usuwane, po czym osad bakteryjny ponownie zawieszano w buforze cytrynianowym. Tę procedurę przemywania powtarzano następnie jeszcze raz dla każdej zawiesiny bakteryjnej. Dwukrotnie przemyta zawiesina bakteryjna była następnie rozcieńczana buforem cytrynianowym pH 5,5 celem uzyskania zawiesiny o około 107 bakterii na ml. W czasie etapów przemywania, komórki były trzymane w lodzie. Bufory i roztwór BSA (1% wag./obj. w buforze cytrynianowym pH 5,5) były sterylizowane poprzez filtrowanie i przechowywane w 4°C. Roztwory podchlorynu sporządzono z roztworu wyjściowego (107000 ppm) poprzez rozcieńczenie jałową demineralizowaną wodą.
Metody:
Stosując jałowe techniki, sporządzono zawiesinę o około 107 bakterii na ml w buforze cytrynianowym pH 5,5. Porcje po 1,9 ml z tej zawiesiny dodawano do jałowych probówek. Następnie do probówek dodawano 0,1 ml zimnego roztworu podchlorynu o różnych stężeniach, w taki sposób, żeby otrzymać zakres rozcieńczenia podchlorynu. Probówki były mieszane w sposób ciągły przy użyciu mieszadła magnetycznego. Dołączono również ślepe oznaczenia, gdzie dodawano jedynie jałowego buforu zamiast roztworu podchlorynu. Próbki inkubowano dokładnie 5 min. w 30°C. Po tym czasie inkubacji pobierano 1 ml mieszaniny reakcyjnej i dodawano do 9 ml zimnego roztworu BSA (1% wag./obj.) i natychmiast umieszczono w lodzie. Było to robione dla zatrzymania reakcji podchlorynu z mikroorganizmem. Określono przeżywalność jako ilość jednostek tworzących kolonie (ang. Colony Forming Units (CFU)) na ml poprzez rozcieńczenie próbki od 10- do 10'5 i wysianie 100 μΐ próbek o różnych rozcieńczeniach na oznaczone płytki z agarem-BHI. Płytki inkubowano następnie przez 15-18 godzin w 30°C. Jeżeli po tym czasie inkubacji nie było widocznych CFU, płytki inkubowano przez następne 24 godziny w 30°C.
Definicja:
Minimalne stężenie hamujące (wartość MIC) jest tu zdefiniowane jako stężenie podchlorynu, które prowadzi w zastosowanych warunkach doświadczalnych do obniżenia o co najmniej log 6 ilości jednostek, tworzących kolonie konkretnego testowanego mikroorganizmu.
Otrzymane wyniki są pokazane w tabeli I. Uzyskane wartości mieszczą się w tym samym zakresie, o którym donosi literatura.
Tabela I
Wartości MIC dla różnych mikroorganizmów.
| Mikroorganizm | Wartość MIC w ppm |
| Escherichia coli | 2-3 |
| Staphylococcus aureus | 2-3 |
| Listeria innocua | 2-3 |
| Pseudomonas aeruginosa | 2-3 |
| Streptococcus faecalis | 2-3 |
181 389
Przykład 2. Minimalne stężenie hamujące podchlorynu i podchlorynu wytworzonego enzymatycznie przez chloroperoksydazę wanadową (V-CPO) z Curvularia inaequalis
W tym przykładzie efekt zabijania przez podchloryn jest porównywany z efektem zabijania podchlorynu wytworzonego enzymatycznie przez chłoroperoksydazę wanadową (V-CPO) z Curvularia inaequalis. W celu umożliwienia porównania zastosowano mikropompę. Zrobiono to, aby profil stężenia podchlorynu w czasie doświadczenia był taki sam, jak w sytuacji, gdy podchloryn jest wytwarzany enzymatycznie. Również aktywność V-CPO w warunkach doświadczenia była oznaczana bardzo starannie, aby znać ilość podchlorynu obecnego w każdym punkcie czasowym doświadczenia.
Materiały:
Szczepami bakteryjnymi użytymi w tym przykładzie były Escherichia coli NCTC 900, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Staphylococcus aureus ATCC 13565, Streptococcus faecalis NCTC 1092 i Listeria innocua ATCC 33090 serotyp 6B. Bakterie hodowano przez 15 do 18 godz. w 30°C w pożywce Brain Heart Infusion (BHI). Po hodowli, szczepy przemywano dwa razy buforem cytrynianowym pH 5,5 (bufor 20 mM cytrynian sodu-NaOH +10 mM NaCl). Zawiesiny bakterii odwirowywano w wirówce Eppendorfa (14000 obr./min przez 5 min), a następnie supernatant był usuwany, po czym osad bakteryjny ponownie zawieszano w buforze cytrynianowym. Tę procedurę przemywania powtarzano następnie jeszcze raz dla każdej zawiesiny bakteryjnej. Dwukrotnie przemyta zawiesina bakteryjna była następnie rozcieńczana buforem cytrynianowym pH 5,5 celem uzyskania zawiesiny o około 107 bakterii na ml. W czasie etapów przemywania, komórki były trzymane w lodzie. Bufory i roztwór BSA (1% wag./obj. w buforze cytrynianowym pH 5,5) były sterylizowane poprzez filtrowanie i przechowywane w 4°C. Roztwory podchlorynu sporządzono z roztworu wyjściowego (107000 ppm) poprzez rozcieńczenie jałową demineralizowaną wodą. Roztwory H2O2 sporządzano z 30% roztworu wyjściowego poprzez rozcieńczenie jałową demineralizowaną wodą. Casitone otrzymano z Difco. Chłoroperoksydazę z Curvularia inaequalis oczyszczano według van Schijndel i wsp. (1993). Aktywność chloroperoksydazy w przekształcaniu Cl' do HOC1 oznaczano spektrofotometrycznie w 20 mM cytrynianie sodu jako buforze, pH 5,5, 10 mM NaCl, 100 μΜ H2O2, 50 pm monochlorodimedon w 30°C, śledząc przekształcenie monochlorodimedonu (e 290 nm = 20,2 mM'1 · cm'1) do dichlorodimedonu (e 290 nm = 0,2 mM'1 · cm'1). 1 jednostka chloroperoksydazy jest zdefiniowana jako ilość enzymu, która przekształca 1 pmol monochlorodimedonu (Sigma) na minutę.
Metody:
Stosując jałowe techniki, sporządzono zawiesinę o około 107 bakterii na ml w buforze cytrynianowym pH 5,5. Porcje po 1,8 ml z tej zawiesiny dodawano do jałowych naczynek reakcyjnych, które były mieszane w sposób ciągły w czasie doświadczenia przy użyciu mieszadła magnetycznego. Następnie do naczynek reakcyjnych dodawano 0,2 ml roztworu V-CPO o różnych stężeniach (sposób obliczenia patrz poniżej), w taki sposób, żeby otrzymać zakres rozcieńczenia V-CPO. Dołączono również ślepe oznaczenia, gdzie dodawano jedynie 0,2 ml jałowego buforu zamiast 0,2 ml roztworu V-CPO. Naczynka reakcyjne inkubowano w 30°C. Następnie dodawano 0,5 ml roztworu wyjściowego H2O2 dla zapoczątkowania reakcji V-CPO. Użyte stężenie wyjściowego H2O2 zależało od wytwarzanego stężenia podchlorynu i było dobierane w taki sposób, aby stężenie końcowe H2O2 (na zakończenie przepływu) było w pięciokrotnym nadmiarze molowym w porównaniu z końcowym stężeniem podchlorynu. Próbki inkubowano dokładnie 5 min. w 30°C. Po tym czasie inkubacji pobierano 1 ml mieszaniny reakcyjnej i dodawano do 9 ml zimnego roztworu BSA (1% wag./obj.) i natychmiast umieszczano w lodzie. Było to robione dla zatrzymania reakcji podchlorynu z mikroorganizmem. Określano przeżywalność jako ilość jednostek, tworzących kolonie (CFU) na ml poprzez rozcieńczenie próbki od 10- do 10'5 i wysianie 100 pl próbek o różnych rozcieńczeniach na oznaczone płytki z agarem-BHI. Płytki inkubowano następnie przez 15-18 godzin w 30°C.
181 389
Jeżeli po tym czasie inkubacji nie było widocznych CFU, płytki inkubowano przez następne 24 godziny w 30°C.
Otrzymane wartości MIC porównywano z wartościami MIC, które zostały uzyskane, gdy dodawano takie same ilości podchlorynu przy użyciu mikropompy. Wykonano to w następujący sposób:
Stosując jałowe techniki, sporządzono zawiesinę o około 107 bakterii na ml w buforze cytrynianowym pH 5,5. Porcje po 1,8 ml z tej zawiesiny dodawano do jałowych naczynek reakcyjnych, które były mieszane w sposób ciągły w czasie doświadczenia przy użyciu mieszadła magnetycznego. Naczynka reakcyjne inkubowano w 30°C. Następnie dodawano 0,2 ml roztworu wyjściowego H2O2. Stężenie użytego wyjściowego H2O2 zależało od wytwarzanego stężenia podchlorynu i było dobierane w taki sposób, aby stężenie końcowe H2O2 (na zakończenie przepływu) było w pięciokrotnym nadmiarze molowym w porównaniu z końcowym stężeniem podchlorynu. Następnie zastosowano przepływ 0,5 ml roztworu podchlorynu o znanym stężeniu w ciągu 5 min. (przepływ: 0,1 ml na min) w 30°C. Wykonano serię doświadczeń z użyciem różnych roztworów podchlorynu o odmiennych stężeniach w taki sposób, żeby otrzymać zakres rozcieńczenia podchlorynu (dla obliczeń patrz poniżej). Po 5 minutowym okresie inkubacji pobierano 1 ml mieszaniny reakcyjnej i dodawano do 9 ml zimnego roztworu BSA (1% wag./obj.) i natychmiast umieszczano w lodzie. Było to robione dla zatrzymania reakcji podchlorynu z mikroorganizmem. Określano przeżywalność jako ilość jednostek, tworzących kolonie (CFU) na ml poprzez rozcieńczenie próbki od 10'1 do 10'5 i wysianie 100 pl próbek o różnych rozcieńczeniach na oznaczone płytki z agarem-BHI. Płytki inkubowano następnie przez 15-18 godzin w 30°C. Jeżeli po tym czasie inkubacji nie było widocznych CFU, płytki inkubowano przez następne 24 godziny w 30°C.
Podobieństwo profili podchlorynu uzyskane w opisanych powyżej doświadczeniach z V-CPO w porównaniu z podchlorynem z roztworu wyjściowego potwierdzono przy zastosowaniu takiego samego systemu doświadczalnego (jak dla doświadczeń kontrolnych bez dodanych mikroorganizmów) połączonego ze spektrofotometrem, w którym stężenia podchlorynu w czasie mogły być śledzone przy 290 nm, wykorzystując przekształcenie monochlorodimedonu (e 290 nm = 20,2 mM4 · cm'1) do dichlorodimedonu (e 290 nm = 0,2 mM4 · cm4).
Obliczenia:
Stężenie końcowe podchlorynu wytworzonego przez V-CPO było obliczane jak następuje: przy użyciu 0,01 jednostki na ml of V-CPO wytwarzane jest 0,01 pmol podchlorynu na ml na min., co stanowi równoważnik 0,05 pmol podchlorynu na ińl na 5 min. Na skutek efektu rozcieńczenia strumienia 0,5 ml, który jest dodawany do 2,0 ml wyjściowej objętości, stężenie końcowe po 5 minutach wynosi (2,0/2,5) x 0,05 (mola na ml = 0,04 pmola podchlorynu na ml po 5 minutach. To stężenie może być następnie wyrażone jako 0,04 pmoli podchlorynu na ml = 0,4 x 52,5 ppm podchlorynu = 2,0 ppm podchlorynu. Inne stężenia końcowe podchlorynu uzyskano poprzez zwiększanie lub zmniejszanie stężenia V-CPO. Stężenie końcowe dodawane do podchlorynu obliczano jak następuje:
Ponieważ strumień 0,5 ml jest dodawany do objętości mieszaniny reakcyjnej 2,0 ml, objętość końcowa wynosi 2,5 ml, co odpowiada pięciokrotnemu rozcieńczeniu. W celu otrzymania końcowego stężenia podchlorynu 2,10 ppm, użyto roztworu wyjściowego 10,50 ppm. Inne stężenia podchlorynu otrzymano poprzez zwiększenie lub zmniejszenie roztworu wyjściowego podchlorynu.
Definicja:
Minimalne stężenie hamujące (wartość MIC) jest tu zdefiniowane jako stężenie podchlorynu, które prowadzi w zastosowanych warunkach doświadczalnych do obniżenia o co najmniej log 6 liczby jednostek, tworzących kolonie konkretnego testowanego mikroorganizmu.
Otrzymane wyniki są pokazane w tabeli II. Porównane są efekty zabijania dla różnych stężeń końcowych podchlorynu, bądź wytwarzanego przez V-CPO, bądź na zakończenie przepływu podchlorynu. Jak można wywnioskować z tabeli II, podchloryn wytwarzany enzymatycznie przez Y-CPO daje całkowite zahamowanie wzrostu już przy stężeniach podchlorynu
181 389 tak niskich jak 0,4 ppm dla wszystkich badanych organizmów z wyjątkiem Staphylococcus aureus, podczas, gdy dla otrzymania takiego samego zahamowania wzrostu potrzebne są 2 ppm podchlorynu. Pokazuje to, że haloperoksydaza, zawierająca wanad jest bardziej wydajnym składnikiem higienicznym niż można się było spodziewać jedynie na podstawie jej zdolności do wytwarzania podchlorynu. Widoczne jest również, że V-CPO powoduje zabicie wszystkich testowanych mikroorganizmów, patogennych lub niepatogennych, podczas gdy twierdzi się, że haloperoksydaza, zawierająca hem skutecznie zabija jedynie bakterie patogenne (patrz EP-A-500 387).
Tabela II
Wartości MIC dla różnych mikroorganizmów
| Mikroorganizm | Wartość MIC dla podchlorynu (w ppm) | Wartość MIC dla V-CPO (w ppm) |
| Escherichia coli | 2 | 0,4 |
| Staphylococcus aureus | 2-3 | 1,6 |
| Listeria innocua | 2 | 0,4 |
| Pseudomonas aerugninosa | 2 | 0,4 |
| Streptococcus faecalis | 2 | 0,4 |
Przykład 3. Wydajność zabijania dla podchlorynu i podchlorynu wytworzonego enzymatycznie przez V-CPO w obecności hydrolizatu białkowego
Wiadomo, że dla utrzymania higieny w sytuacjach mających miejsce w praktyce, konieczne jest stosowanie nadmiaru podchlorynu, ponieważ ta aktywna cząsteczka będzie reagować nie tylko z mikroorganizmem, ale również z innymi związkami, które są obecne. A zatem istotnym jest badanie zachowania haloperoksydazy zawierającej wanad w płynach zawierających na przykład hydrolizat białkowy.
Materiały: Szczepami bakteryjnymi hodowanymi w tym przykładzie były Escherichia coli NCTC 900. Bakterie hodowano przez 15 do 18 godz. w 30°C w pożywce Brain Heart Infusion (BHI). Po hodowli, szczepy przemywano dwa razy z buforem cytrynianowym pH 5,5 (bufor 20 mM cytrynian sodu-NaOH +10 mM NaCl). Zawiesiny bakterii odwirowano w wirówce Eppendorfa 14000 obr./min przez 5 min), a następnie supematanty były usuwane, po czym osad bakteryjny ponownie zawieszono w buforze cytrynianowym. Tą procedurę przemywania powtarzano następnie jeszcze raz dla każdej zawiesiny bakteryjnej. Dwukrotnie przemyta zawiesina bakteryjna była następnie rozcieńczana buforem cytrynianowym pH 5,5 celem uzyskania zawiesiny o około 108 bakterii na ml. W czasie etapów przemywania, komórki były trzymane w lodzie. Bufory i roztwór BSA (1% wag./obj. w buforze cytrynianowym pH 5,5) były sterylizowane poprzez filtrowanie i przemywanie w 4°C. Roztwór podchlorynu sporządzono z roztworu wyjściowego (107000 ppm) poprzez rozcieńczenie jałową demineralizowaną wodą. Roztwory H2O3 sporządzono z 30% roztworu wyjściowego poprzez rozcieńczenie jałową demineralizowaną wodą. Casitone otrzymano z Difco. Chloroperoksydazę z Curvularia inaequalis oczyszczano według van Schijdel i wsp. (1993).
Metody: Stosując jałowe techniki, sporządzono zawiesinę o około 108 bakterii na ml w buforze cytrynianowym pH 5,5. Porcje po 1,3 ml z tej zawiesiny dodawano do jałowych naczynek reakcyjnych, które były mieszane w sposób ciągły w trakcie doświadczenia przy użyciu mieszadła magnetycznego. Następnie dodawano 0,5 ml roztworu 0,5 mg na ml Casitone (w buforze cytrynianowym pH 5,5), odpowiednio dodawano 0,5 ml buforu cytrynianowego pH 5,5. Następnie do naczynek reakcyjnych dodawano 0,2 ml of roztworu V-CPO o różnych stężeniach (dla obliczenia patrz przykład 2) w taki sposób, aby uzyskać stężenia końcowe podchlorynu 3,2 ppm lub 6,5 ppm. Dołączono również ślepe oznaczenia, gdzie dodawano jedynie
181 389
0,2 ml jałowego buforu zamiast 0,2 ml roztworu V-CPO. Naczynka reakcyjne inkubowano w 30°C. Następnie dodawano 0,5 ml roztworu wyjściowego H2O2 (stężenie podchlorynu było dobierane tak, aby otrzymać pięciokrotny nadmiar molowy nadtlenku wodoru na zakończenie przepływu) dla zapoczątkowania reakcji V-CPO. Próbki inkubowano dokładnie 5 min w 30°C. Po tym czasie inkubacji pobierano 1 ml mieszaniny reakcyjnej i dodawano do 9 ml zimnego roztworu BSA (1% wag./obj.) i natychmiast umieszczono w lodzie. Było to zrobione dla zatrzymania reakcji podchlorynu z mikroorganizmem. Określono przeżywalność jako ilość jednostek tworzących kolonie (CFU) na ml poprzez rozcieńczenie próbki od 10'1 do 10-6 i wysianie 100 μΐ próbek o różnych rozcieńczeniach na oznaczone płytki z agarem-BHI. Płytki inkubowano następnie przez 15-18 godzin w 30°C. Jeżeli po tym czasie inkubacji nie było widocznych CFU, płytki inkubowano przez następne 24 godziny w 30°C.
Otrzymane wydajności zabijania porównywano z wydajnościami zabijania, które zostały uzyskane, gdy dodawano takie same ilości podchlorynu przy użyciu mikropompy. Wykonano to w następujący sposób:
Stosując jałowe techniki, sporządzono zawiesinę o około 108 bakterii na ml w buforze cytrynianowym pH 5,5. Porcje po 1,3 ml z tej zawiesiny dodawano do jałowych naczynek reakcyjnych, które były mieszane w sposób ciągły w trakcie doświadczenia przy użyciu mieszadła magnetycznego. Następnie dodawano 0,5 ml roztworu 0,5 mg na ml roztworu Casitone (w buforze cytrynianowym pH 5,5), odpowiednio dodawano 0,5 ml buforu cytrynianowego pH 5,5. Następnie do naczynek reakcyjnych dodawano 0,2 ml of roztworu V-CPO o różnych stężeniach (dla obliczenia patrz przykład 2) w taki sposób, aby uzyskać stężenia końcowe podchlorynu 3,2 ppm lub 6,5 ppm. Dołączono również ślepe oznaczenia, gdzie dodawano jedynie 0,2 ml jałowego buforu zamiast 0,2 ml roztworu V-CPO. Naczynka reakcyjne inkubowano w 30°C. Następnie zastosowano strumień 0,5 ml roztworu podchlorynu, uzyskując stężenie końcowe podchlorynu odpowiednio 3,2 ppm i 6,5 ppm (dla obliczeń stężenia patrz przykład 2) w ciągu 5 min (przepływ: 0,1 ml na min) w 30°C. Po 5 minutowym okresie inkubacji pobierano 1 ml mieszaniny reakcyjnej i dodawano do 9 ml zimnego roztworu BSA (1% wag./obj.) i natychmiast umieszczono w lodzie. Było to zrobione dla zatrzymania reakcji podchlorynu z mikroorganizmem. Określono przeżywalność jako ilość jednostek tworzących kolonie (CFU) na ml poprzez rozcieńczenie próbki od 101 do 106 i wysianie 100 |il próbek o różnych rozcieńczeniach na oznaczone płytki z BHI-agarem. Płytki inkubowano następnie przez 15-18 godzin w 30°C. Jeżeli po tym czasie inkubacji nie było widocznych CFU, płytki inkubowano przez następne 24 godziny w 30°C. Wyniki są pokazane w tabeli III.
Tabela III
Wpływ Casitone na wydajność zabijania HClO, wytworzonego przez V-CPO
| Stężenie Casitone (mg/ml) | Log redukcji dla 3,2 ppm podchlorynu wytworzonego przez V- CPO | Log redukcji dla 3,2 ppm podchlorynu | Log redukcji dla 6,5 ppm podchlorynu wytworzonego przez V-CPO | Log redukcji dla 6,5 ppm podchlorynu |
| 0,0 | 8,0 (= całkowite zabicie) | 8,2 (= całkowite zabicie) | 8,0 (= całkowite zabicie) | 8,2 (= całkowite zabicie) |
| 0,1 | 5,0 | 0,5 | 8,0 (= całkowite zabicie) | 1,0 |
Przykład 4.
Porównanie między wydajnością zabijania dla haloperoksydazy zawierającej wanad i haloperoksydazy zawierającej hem.
Materiały: Szczepami bakteryjnymi użytymi w tym przykładzie były Escherichia coli NCTC 900, Streptococcus faecalis NCTC 1092 i Listeria innocua ATCC 33090 serotyp 6B.
181 389
Bakterie hodowano 15 do 18 godz. w 30°C w pożywce Brain Heart Infusion (BHI). Po hodowli, szczepy przemywano dwa razy buforem cytrynianowym pH 5,5 (bufor 20 mM cytrynian sodu-NaOH + 10 mM NaCl).
Zawiesiny bakterii odwirowywano w wirówce Eppendorfa (14000 obr./min przez 5 min), a następnie supernatant był usuwany, po czym osad bakteryjny ponownie zawieszano w buforze cytrynianowym. Tę procedurę przemywania powtarzano następnie jeszcze raz dla każdej zawiesiny bakteryjnej. Dwukrotnie przemyta zawiesina bakteryjna była następnie rozcieńczana buforem cytrynianowym pH 5,5 celem uzyskania zawiesiny o około 107 bakterii na ml. W czasie etapów przemywania, komórki były trzymane w lodzie. Bufory i roztwór BSA (1% wag./obj. w buforze cytrynianowym pH 5,5) były sterylizowane poprzez filtrowanie i przechowywane w 4°C. Chloroperoksydazę z Curvularia inaeąualis oczyszczano według van Schijdel i wsp. (1993). Chloroperoksydazę zawierającą hem otrzymano z Sigmy (z Caldariomyces fumago). Aktywność chloroperoksydazy w przekształceniu Cl' do HOCl oznaczano spektrofotometrycznie w 20 mM cytrynianie sodu jako buforze, pH 5,5, 10 mM NaCl, 100 pM H2O2, 50 pM monochlorodimedon w 30°C, śledząc przekształcenie monochlorodimedonu (e 290 nm = 20,2 mM4· cm4) do dichlorodimedonu (e 290 nm = 0,2 mM4· cm4). 1 jednostka chloroperoksydazy jest zdefiniowana jako ilość enzymu, która przekształca 1 pmol monochlorodimedonu (Sigma) na minutę. Ten sam test (i definicję aktywności) zastosowano dla obu enzymów, aby mieć możliwość dawkowania tej samej aktywności obu enzymów.
Metody: Stosując jałowe techniki, sporządzono zawiesinę o około 107 bakterii na mł w 20 mM buforze cytrynianowym pH 5,5, 10 mM NaCl. Porcje po 1,9 ml z tej zawiesiny dodawano do jałowych probówek. Następnie do probówek dodawano 0,1 ml roztworu wyjściowego odpowiednio chloroperoksydazy zawierającej wanad i chloroperoksydazy zawierającej hem, w taki sposób żeby otrzymać zakres rozcieńczenia obu enzymów. Dołączono również ślepe oznaczenia, gdzie dodawano jedynie 0,2 ml jałowego buforu zamiast 0,2 ml roztworu wyjściowego enzymu. Następnie dodawano 0,5 ml 25 mM roztworu wyjściowego H2O2. Próbki inkubowano dokładnie 5 min w 30°C. Po tym czasie inkubacji pobierano 1 ml mieszaniny reakcyjnej i dodawano do 9 ml zimnego roztworu BSA (1% wag./obj.) i natychmiast umieszczano w lodzie. Określano przeżywalność jako ilość jednostek tworzących kolonie (CFU) na ml poprzez rozcieńczenie próbki od 104 do 10-5 i wysianie 100 pl próbek o różnych rozcieńczeniach na oznaczone płytki z agarem-BHI. Płytki inkubowano następnie przez 15-18 godzin w 30°C. Jeżeli po tym czasie inkubacji nie było widocznych CFU, płytki inkubowano przez następne 24 godziny w 30°C.
Wyniki są przedstawione w tabeli IV. Dane wyraźnie pokazują, że chloroperoksydaza zawierająca wanad dostarcza znacznie skuteczniejszego systemu higieny niż chloroperoksydaza zawierająca hem, nawet jeżeli są użyte takie same dawki aktywności.
181 389
Tabela IV
| 10mMNaCl | Chloroperoksydaza wanadowa (jed. na ml) | Chloroperoksydaza hemowa (jed. na ml) | Log redukcji |
| E. coli | 0,000 | 0,0 | |
| 0,00156 | 4,0 | ||
| 0,0030 | 5,0 | ||
| 0,0060 | 7,0 (=całkowite zabicie) | ||
| 0,012 | 7,0 (=całkowite zabicie) | ||
| 0,025 | 7,0 (=całkowite zabicie) | ||
| 0,050 | 7,0 (=calkowite zabicie) | ||
| 0,10 | 7,0 (=całkowite zabicie) | ||
| 0,000 | 0,0 | ||
| 0,00156 | 0,1 | ||
| 0,0030 | 0,1 | ||
| 0,0060 | 0,1 | ||
| 0,012 | 0,2 | ||
| 0,025 | 1,0 | ||
| 0,050 | 1,2 | ||
| 0,10 | 1,2 | ||
| L. innocua | 0,000 | 0,0 | |
| 0,00156 | 7,0 (całkowite zabicie) | ||
| 0,0030 | 7,0 (całkowite zabicie) | ||
| 0,0060 | 7,0 (całkowite zabicie) | ||
| 0,012 | 7,0 (całkowite zabicie) | ||
| 0,025 | 7,0 (całkowite zabicie) | ||
| 0,050 | 7,0 (całkowite zabicie) | ||
| 0,10 | 7,0 (całkowite zabicie) | ||
| 0,00 | 0,0 | ||
| 0,00156 | 0,0 | ||
| 0,0030 | 0,0 | ||
| 0,0060 | 0,0 | ||
| 0,012 | 0,0 | ||
| 0,025 | 0,0 | ||
| 0,050 | 0,0 | ||
| 0,10 | 0,0 | ||
| S. faecalis | 0,00 | 0,0 | |
| 0,00156 | 5,0 | ||
| 0,0030 | 5,0 | ||
| 0,0060 | 7,0 (całkowite zabicie) | ||
| 0,012 | 7,0 (całkowite zabicie) | ||
| 0,025 | 7,0 (całkowite zabicie) | ||
| 0,050 | 7,0 (całkowite zabicie) | ||
| 0,10 | 7,0 (całkowite zabicie) | ||
| 0,00 | 0,0 | ||
| 0,00156 | 0,0 | ||
| 0,0030 | 0,1 | ||
| 0,0060 | 0,1 | ||
| 0,012 | 0,1 | ||
| 0,025 | 0,1 | ||
| 0,050 | 0,1 | ||
| 0,10 | 0,9 |
181 389
Przykład 5.
Wpływ różnych źródeł nadtlenku wodoru na hamujące działanie V-CPO.
W poprzednich przykładach nadtlenek wodoru, który jest jednym z substratów w reakcji V-CPO, był dodawany z roztworu wyjściowego. W tym przykładzie opisany jest wpływ użycia innych źródeł nadtlenku wodoru. Oksydazy były testowane w 30°C w biologicznym monitorze tlenu Model YSI 5300 (Oxygen chamber model 5301), w którym śledzono zużycie tlenu, stosując bufor cytrynianowy pH 5,5 (20 mM cytrynian sodu-NaOH +10 mM NaCl). Bufor był nasycany powietrzem w 30°C. Jako substrat dla oksydazy glukozy użyto glukozy 15 g/l (stężenie końcowe). Szczepem bakteryjnym użytym w tym przykładzie była Escherichia coli NCTC 900. Bakterie hodowano przez 15 do 18 godz. w 30°C w pożywce Brain Heart Infusion (BHI). Po hodowli, szczepy przemywano dwa razy buforem cytrynianowym pH 5,5 (bufor 20 mM cytrynian sodu-NaOH + 10 mM NaCl). Zawiesiny bakterii odwirowywano w wirówce Eppendorfa (14000 obr./min przez 5 min), a następnie supernatant był usuwany, po czym osad bakteryjny ponownie zawieszano w buforze cytrynianowym. Tą procedurę przemywania powtarzano następnie jeszcze raz dla każdej zawiesiny bakteryjnej. Dwukrotnie przemyta zawiesina bakteryjna była następnie rozcieńczana buforem cytrynianowym pH 5,5 celem uzyskania zawiesiny o około 108 bakterii na ml. W czasie etapów przemywania, komórki były trzymane w lodzie. Bufory i roztwór BSA (1% wag./obj. w buforze cytrynianowym pH 5,5) były sterylizowane poprzez filtrowanie i przechowywane w 4°C. Roztwór podchlorynu sporządzono z roztworu wyjściowego (107000 ppm) poprzez rozcieńczenie jałową demineralizowaną wodą. Roztwory H2O2 sporządzono w 30% roztworu wyjściowego poprzez rozcieńczenie jałową demineralizowaną wodą. Casitone otrzymano z Difco. Chloroperoksydazę z Curvularia inaequalis oczyszczano według van Schijdel i wsp. (1993). Oksydazę glukozy z Aspergillus niger otrzymano z Sigmy.
Metody: Stosując jałowe techniki, sporządzono zawiesinę o około 108 bakterii na ml w buforze cytrynianowym pH 5,5. Porcje po 1,3 ml z tej zawiesiny dodawano do jałowych naczynek reakcyjnych, które były mieszane w sposób ciągły w trakcie doświadczenia przy użyciu mieszadła magnetycznego. Nastęnie dodawano 0,5 ml roztworu 0,5 mg na ml Casitone ( w buforze cytrynianowym pH 5,5). Następnie do naczynek reakcyjnych dodawano 0,2 ml of roztworu V-CPO tak, aby uzyskać stężenie końcowe podchlorynu 6,5 ppm. Dołączono również ślepe oznaczenia, gdzie dodawano jedynie 0,2 ml jałowego buforu zamiast 0,2 ml roztworu V-CPO. Naczynka reakcyjne inkubowano w 30°C. Następnie dodawano 0,5 ml jednego z trzech następujących systemów wytwarzających nadtlenek wodoru:
1. H2O2 z 3 mM roztworu wyjściowego;
2. nadwęglan sodu z 3 mM roztworu wyjściowego;
3. mieszaninę oksydazy glukozy (0,39 jednostek/ml) i glukozy 75 mg/ml.
Próbki inkubowano dokładnie 5 min w 30°C. Po tym czasie inkubacji pobierano 1 ml mieszaniny reakcyjnej i dodawano do 9 ml zimnego roztworu BSA (1% wag./obj.) i natychmiast umieszczano w lodzie. Było to robione dla zatrzymania reakcji podchlorynu z mikroorganizmem. Określano przeżywalność jako ilość jednostek tworzących kolonie (CFU) na ml poprzez rozcieńczenie próbki od 10- do 10‘6 i wysianie 100 μΐ próbek o różnych rozcieńczeniach na oznaczone płytki z agarem-BHI. Płytki inkubowano następnie przez 15-18 godzin w 30°C. Jeżeli po tym czasie inkubacji nie było widocznych CFU, płytki inkubowano przez następne 24 godziny w 30°C. Otrzymane wartości MIC porównywano z wartościami MIC, które zostały uzyskane, gdy dodawano takie same ilości podchlorynu przy użyciu mikropompy.
Wykonano to w następujący sposób: stosując jałowe techniki, sporządzono zawiesinę o około 108bakterii na ml w buforze cytrynianowym pH 5,5. Porcje po 1,3 ml z tej zawiesiny dodawano do jałowych naczynek reakcyjnych, które były mieszane w sposób ciągły w czasie doświadczenia przy użyciu mieszadła magnetycznego. Następnie dodawano 0,5 ml roztworu Casitone (0,5 mg na ml w buforze cytrynianowym pH 5,5). Następnie dodawano 0,2 ml buforu cytrynianowego pH 5,5. Naczynka reakcyjne inkubowano w 30°C. Następnie zastosowano strumień 0,5 ml roztworu podchlorynu o stężeniu 32,5 ppm w ciągu 5 min (przepływ:
0,1 ml na min) w 30°C. Po 5 minutowym okresie inkubacji pobierano 1 ml mieszaniny reakcyjnej i dodawano do 9 ml zimnego roztworu BSA (1% wag./obj.) i natychmiast umieszczano w lodzie. Było to robione dla zatrzymania reakcji podchlorynu z mikroorganizmem. Określano przeżywalność jako ilość jednostek tworzących kolonie (CFU) na ml poprzez rozcieńczenie próbki od 10'1 do 10- i wysianie 100 pl próbek o różnych rozcieńczeniach na oznaczone płytki z agarem-BHI. Płytki inkubowano następnie przez 15-18 godzin w 30°C. Jeżeli po tym czasie inkubacji nie było widocznych CFU, płytki inkubowano przez następne 24 godziny w 30°C. Wyniki są pokazane w tabeli V.
Tabela V
Reakcja V-CPO z różnymi źródłami H2O2.
| Źródło nadtlenku wodoru | Stężenie Casitone (mg/ml) | Log redukcji przy 6,5 ppm podchlorynu | Log redukcji przy 6,5 ppm podchlorynu wytworzonego enzymatycznie przez V-CPO |
| Roztwór wyjściowy H2O2 | 0,0 | 8,2 (= całkowite zabicie) | 8,0 (= całkowite zabicie) |
| Nadwęglan | 0,0 | 8,0 (= całkowite zabicie) | 8,2 (= całkowite zabicie) |
| Oksydaza glukozy | 0,0 | 6,4 (= całkowite zabicie) | 6,4 (= całkowite zabicie) |
| Roztwór wyjściowy H2O2 | 0,1 | 1,0 | 8,0 (= całkowite zabicie) |
| Nadwęglan | 0,1 | 0,8 | 8,2 (= całkowite zabicie) |
| Oksydaza glukozy | 0,1 | 1,0 | 6,4 (= całkowite zabicie) |
Przykład 6.
Sposób określenia sekwencji kodującej genu dla chloroperoksydazy (cDNA) i genu z Curvularia inaequalis (Centraal Bureau voor Schimmelcultures, 25 Natherlands, strain No 102,42) i możliwe systemy ekspresyjne.
Chloroperoksydaza była izolowana i oczyszczana z hodowli płynnych C. inaequalis jak opisano przez Van Schijndel i wsp., 1993), z tą różnicą, że po chromatografii DEAE wykonano dwa dodatkowe etapy oczyszczania stosując system FPLC (Pharmacia LKB). Najpierw użyto kolumny opartej o oddziaływania hydrofobowe z fenylo-sefarozą Cl-4B dla związania enzymu w obecności 2 M NaCl w 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), i następnie elucji zstępującym gradientem od 2M NaCl w 50 mM Tris-HCl (pH 8,3). Dla ostatecznego oczyszczenia do związania enzymu użyto anionowymiennej kolumny MonoQ HR 5/5 (z Pharmacia LKB), po czym wymywanie gradientem od 0 M do 0,5 M NaCl w 20 mM piperazynie -HCl (pH 5,4). Następujące po tym zatężenie enzymu przeprowadzono stosując rotacyjne odparowanie, a następnie dializę wobec buforu 50 mM Tris-SO4 (pH 8). Oczyszczana chloroperoksydaza była trawiona enzymatycznie odpowiednio, proteazami ze Staphylococcus V8 i trypsyną, zgodnie ze standardowymi sposobami znanymi w tej dziedzinie lub przecinana chemicznie CNBr (Gross, E.(1967), Methods Enzymology 11, 238-255). Uzyskane peptydy rozdzielano stosując SDS-PAGE według Laemmli (Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 680-685) lub w żelu z tricyną według Schagger i Van Jagow (1987), a następnie przenoszono na filtry PVDF (Immobilon-P z Millipore), stosując bufor do przenoszenia CAPS (10 mM kwas 3-[cykloheksylamino]-1-propanosulfonowy, 10% methanol, pH 11), jak opisano przez Matsudaira (1987). Po elektroforetycznym wymyciu filtr płukano przez 5 min wodą dejonizowaną, barwiono 0,1% Błękitem Coomassie R-250 w 50% metanolu przez 5 min i odbarwiano w 50% metanolu, 10% kwasie octowym przez 10 min w temperaturze pokojowej i suszono na powietrzu. Prążki białkowe były poddawane automatycznemu sekwencjonowaniu Edmana w urządzeniu do sekwencjonowania białek Porton LF 3000 (Beckman Instruments, Inc., USA).
181 389
Wyniki oznaczania sekwencji aminokwasowej są zebrane na fig. 1. W oparciu o sekwencję aminokwasową peptydów zaprojektowano całkowicie zdegenerowane oligonukleotydy (patrz tabela VII). Te zdegenerowane startery zostały użyte w łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR), w której stosowano jako matrycę pierwszą nić cDNA. Pierwszą nić cDNA przygotowano jak następuje:
Celem wyizolowania RNA, sporami C. inaeaqualis inokulowano podłoże fermentacyjne zawierające 4 g ekstraktu drożdżowego i 2 ml roztworu mikroelementów (Van Schijndel i wsp., 1993) na litr. Po kilku dniach hodowli grzybnia była zbierana poprzez filtrowanie i liofilizowana. Zliofilizowaną grzybnię C. inaequalis mielono w ciekłym azocie. RNA ekstrahowano poprzez dodanie buforu do ekstrakcji RNA (42 mM cytrynian sodu pH 7, 83% Nsarkozynian laurynowy, 50 mM beta-merkaptoetanol, 1% Triton Χ-100 i 4 M izotiocyjanian guanidyny) i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dodawano 0,1 objętości 2 M octanu sodu (pH 4) i 1 objętość fenolu : chloroformu : alkoholu izoamylowego (25:24:1) i mieszaninę umieszczono w lodzie na 15 min. Po odwirowaniu przez 10 min przy 10000 x g (4°C) zbierano fazę wodną, dodawano 1 objętość absolutnego alkoholu i mieszanina była inkubowana przez 1 godzinę w -20°C, a następnie krótko odwirowywana przy 10000 x g. Osad zawieszano w odpowiedniej objętości buforu do ekstrakcji RNA i frakcjonowano poprzez ultrawirowanie w gradiencie chlorku sodu (Sambrook i wsp., 1989). Osad starannie przemywano i przechowywano w 75% roztworze etanolu w -70°C. Celem izolowania mRNA, RNA był wytrącany i zawieszany w wodzie wolnej od RNAzy, po czym mRNA był ekstrahowany przy zastosowaniu zestawu do izolacji mRNA polyAtract (Promega Corporation, USA). Syntezę pierwszej nici cDNA przeprowadzono na mRNA wyizolowanym z C. inaequalis stosując zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA Pharmacia (Pharmacia Biotech). W oparciu o sekwencję aminokwasową peptydów chloropeptydazy zaprojektowano cztery 20-nukleotydowe oligonukleotydy (patrz również tabela VII) i użyto jak startery w reakcjach łańcuchowych polimerazy z pierwszą nicią cDNA z C. ineaqualis jako matrycą. Reakcje łańcuchowe polimerazy wykonywano stosując termocykler (Eppendorf mastercykler 5330) i polimerazę Taq (Promega Corporation). Dla optymalnej amplifikacji cDNA kodującego chloroperoksydazę przy zastosowaniu zdegenerowanych starterów reakcja łańcuchowa polimerazy była przeprowadzana w 46°C (etap przyłączania) przez 30 cykli. Dwa uzyskane specyficznie fragmenty były poddawane ligacji z wektorem pUC18, klonowane i sekwencjonowane z obu nici. W oparciu o wyniki sekwencjonowania DNA zaprojektowano następujące dwa specyficzne startery:
5'- CATAGCGATAGCGACGCGGA-3' i
5'- CTAACCCCGGCGCCAACATC-3'
Te dwa startery zostały użyte w reakcji łańcuchowej polimerazy z pierwszą nicią cDNA jako matrycą. W ten sposób otrzymano specyficzny dla genu fragment DNA, łącząc dwie znane sekwencje DNA. Fragment ten został sklonowany w wektorze pUC18, a następnie ustalono jego sekwencję. Dla uzyskania regionu 5' mRNA kodującego chloroperoksydazę użyto zestaw 5'-A.mplifinder RACE kit (Clonetech corporation). Gen dla chloroperoksydazy z genomu C. ineaqualis izolowano jak następuje:
Genomowy DNA C.ineaqualis izolowano ze zliofilizowanej grzybni, która była mielona w ciekłym azocie i ekstrahowana odpowiednią ilością buforu do ekstrakcji (200 mM Tris-HCl, pH 8,5, 25 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1% SDS i 0,2 mg na ml proteinazy K). Po całonocnej inkubacji w temperaturze pokojowej dodawano 0,7 objętości fenolu i 0,3 objętości chloroformu i energicznie mieszano. Probówki odwirowywano przy 10000 x g i warstwę wodną przenoszono do czystej probówki. Genomowy DNA wytrącano 2 objętościami absolutnego etanolu. Po odwirowaniu przez 5 min, przy 5000 x g osad zawieszano w 2 ml 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA i traktowano RNAzą (Boehringer Mannheim), tak jak zalecał producent. Roztwór zawierający genomowy DNA ekstrahowano mieszaniną fenol : chloroform: alkohol izoamylowy (25:24:1) i po wytraceniu etanolem ostatecznie rozpuszczano
181 389 w odpowiedniej objętości buforu 10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA. Do analizy metodą Southema, DNA genomowy był trawiony kilkoma kombinacjami enzymów restrykcyjnych i po elektroforezie w żelu agarozowym przeniesiony na filtr nitrocelulozowy (Sambrook i wsp., 1989).
Hybrydyzację przeprowadzono stosując wyznakowany radioaktywnie fragment genu (namnożony przy użyciu dwóch specyficznych starterów opisanych powyżej), który wytworzono poprzez losowe startery, stosując dATP wyznakowany alfa-32P (Sambrook i wsp., 1989). W oparciu o otrzymane wyniki sporządzono mini-bibliotekę, stosując genomowy DNA strawiony Pst I, który wstawiono do wektora pUC18. Bibliotekę przeszukiwano taką samą sondą, jak opisana przy technice Southema. Klon pozytywny izolowano i również częściowo sekwencjonowano z dwóch nici dla potwierdzenia wyników dotyczących sekwencji cDNA. Gen kodujący chloroperoksydazę C. inaequalis i jego postulowany produkt są przedstawione na fig. 2.
System wytwarzania chloroperoksydazy w Saccharomyces cerevisiae zastał utworzony jak następuje:
Dobrze znany indukowany promotor drożdżowy GALI otrzymano jako fragment Eco R1 Bam HI z genu GALI z dzikiego szczepu S. cerevisiae (Molecular i Cellular Biology 10, 4757-4769, 1990) i sklonowano w miejscach EcoR1 i BamH1, odpowiednio w plazmidach YCplac33 i YEplac95 (Gietz i Sugino (1988) Gene 74, 527-534). Otrzymane plazmidy nazwano odpowiednio TNT1 i TNT2, Przed początkiem 5' genu dla chloroperoksydazy C. inaeąualis utworzono miejsce restrykcyjne BamH1 poprzez przeprowadzenie reakcji PCR, stosując jako matrycę fragment 5' Pst I EcoRI genu dla chloroperoksydazy C.inaequalis subsklonowany w pUC18 i jako startery: 22 nukleotydowy starter do sekwencjonowania M13/pUC lewy (ang. revers) oraz starter:
5' GAG AGA GGA TCC ACT CAC TAC TTA CAA TCA CAC 3'
Namnożony fragment był trawiony Bam HI i Eco RI. Fragment Eco RI Pvu II genu dla chloroperoksydazy z C. inaeąualis, zawierający część 3' genu, był klonowany w pUC18 strawionym Eco Ri Sma I. Z tego klonu, po strawieniu go Eco RI i Xba I, oczyszczono fragment zawierający część 3' genu dla chloroperoksydazy C. inaequalis. Wykonano potrójną ligację, która obejmowała bądź TNT1, bądź TNT2, każdy strawiony Bam HI i Xba I i fragment 5' Bam HI Eco Ri oraz fragment 3' Eco RI Xba I. Otrzymane po ligacji i klonowaniu plazmidy sprawdzano, czy są właściwe. Otrzymane w ten sposób plazmidy zostały nazwane odpowiednio TNT3 (pochodzący z TNT1) i TNT4 (pochodzący z TNT2).
Szczep drożdży BJ1991 transformowano odpowiednio plazmidami TNT3 i TNT4, zgodnie ze znanymi w tej dziedzinie sposobami i selekcjonowano transformanty ura+. Transformanty ura+ replikowano na płytki-YP zawierające bądź glukozę (2%, bądź galaktozę 2%). Po wyrośnięciu, z płytek pobierano trochę komórek i zawieszano w 200 μΐ 20 mM Tris-HCl pH 8,1. Po 5 minutowej inkubacji pobierano 10 μΐ płynu i nakraplano na filtr nitrocelulozowy. Filtry nitrocelulozowe inkubowano w buforze: 100 mM octan sodu (pH 5,5), 1 mM ortodianizydyna, 100 mM KBr i 2 mM H2O2. Powstawanie wyraźnego zabarwienia obserwowano dla wszystkich plam pochodzących ze szczepów rosnących na galaktozie, podczas gdy brak powstawania zabarwienia obserwowano dla drożdży rosnących na glukozie. Pokazuje to, że skonstruowano indukowany galaktozą system wytwarzania produktu dla genu chloroperoksydazy z Curvularia inaequalis w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Podobny test, z wykorzystaniem buforu 100 mM fosforan potasu (pH 6,5), 100 mM KBr, 1 mM H2O2 i 40 (iM czerwień fenolowa (BDH), wyraźnie pokazuje powstawanie błękitnego/purpurowego zabarwienia z płynami z drożdży rosnących na galaktozie, podczas gdy zmiana koloru nie zachodziła dla płynów z drożdży rosnących na glukozie. Celem dalszego potwierdzenia, że stworzony został system ekspresji genu dla chloroperoksydazy C. inaequalis w drożdżach, który wywarza chloroperoksydazę o takim samym działaniu jak chloroperoksydaza C. inaequalis, zrekombinowany enzym oczyszczano z zaindukowanych galaktozą szczepów drożdży transformowanych TNT3 lub TNT4. Po hodowli w podłożu zawierającym galaktozę, komórki
181 389 drożdży były zbierane i zawieszane w 20 mM Tris-HCl (pH 8,1). Następnie dodawano jałowe kulki, po czym zawiesina była energicznie wytrząsana. Po odwirowaniu przez 15 minut przy 10000 x g zbierano supernatant i nakładano na kolumnę z DEAE i zrekombinowany enzym oczyszczano, stosując zasadniczo taki sam sposób oczyszczania jak dla enzymu z dzikiego szczepu C. inaeąualis (patrz wyżej). Po oczyszczeniu otrzymano zrekombinowaną chloroperokśydazę o aktywności specyficznej 22 jednostki na mg białka (oznaczonej w buforze 100 mM octanu sodu pH 5, 0, 1 mM H2O2, 5 mM chlorek potasu i 50 pM MCD, patrz również van Schijndel i wsp., 1993), która bardzo dobrze przypomina aktywność specyficzną około 20 jednostek na białko, otrzymaną dla oczyszczonej (patrz wyżej) chloroperoksydazy z samego C. inaeąualis. Profile aktywności przy różnych wartościach pH dla chloroperoksydazy typu dzikiego i zrekombinowanej chloroperoksydazy pochodzącej z drożdży są pokazane na fig. 3. Figura 3 dostarcza dalszych danych, że zrekombinowany enzym wytwarzany w drożdżach ma taką charakterystykę funkcjonalną, jak enzym dzikiego typu.
Przykład 7.
Poszukiwanie odpowiednich haloperoksydaz w innych mikroorganizmach. Mikroorganizmami użytymi w tym przykładzie są Curvularia inaeąualis (CBS 102.42),
Drechslera biseptata (CBS 371, 72), Drechslera fugax (CBS 509.77), Drechslera nicotiae (CBS 655.74), Drechslera subpapendorfii (656.74), Embelisia hyacinthi (416.71), Embelisia didymospora (CBS 766), Ulocladium chartarum (200.67) i Ulocladium botrytis (452.72). Różne grzyby hodowano na płytkach agarowych. Po zakończeniu wzrostu, białka zewnętrzkomórkowe przenoszono (przeniesienie metodą replik) na filtr nitrocelulozowy, który był uprzednio namoczony w buforze 50 mM Tris-HCl (pH 8,3). Po 15 minutach inkubacji na płytkach agarowych, filtr był testowany na aktywność haloperoksydazy poprzez zanurzenie filtru w 100 mM octanie sodu (pH 5,5) lub fosforanie potasu (pH 6,5 i 7,5), 1 mM ortodianizydynie, 2 mM nadtlenku wodoru w obecności i nieobecności 0,1 M bromku potasu. W ten sposób mogło być wykrywane wytwarzanie bromoperoksydazy i/lub chloroperoksydazy. Celem zbadania, czy wytwarzana haloperoksydaza jest haloperoksydazą zawierającą wanad, opisany powyżej test był powtarzany w obecności i nieobecności 10 i 100 pM wanadami sodu. W przypadku haloperoksydazy zawierającej wanad, w sytuacji, gdy dodawany jest wanadan, można obserwować zwiększenie sygnału. Celem zbadania, czy zidentyfikowana chloroperoksydaza jest rzeczywiście podobna do haloperoksydazy wanadowej z C.inaeąualis, niewielka ilość chloroperoksydazy była oczyszczana (zasadniczo jak opisano w van Schijndel i wsp., 1993) z Ulocladium chartarum, Embelisia didymospora i Drechslera subpapendorfii. Optima pH tych enzymów wahały się od pH 4,5 do 5,5. Aktywność chlorująca tych enzymów zwiększała się po dodaniu wanadanu, co wyraźnie wskazuje, że enzymy te są rzeczywiście haloperoksydazami wanadowymi. Celem dalszego zbadania podobieństwa zidentyfikowanych enzymów z chloroperoksydazą wanadową z C. inaeąualis, jedna ze zidentyfikowanych haloperoksydaz była dalej charakteryzowana. Wybrana do tego została chloroperoksydaza wytwarzana przez grzyba Drechslera biseptata (CBS 371.72). Ma ona własności podobne do chloroperoksydazy z Curvularia inaeąualis, to jest wysoką termostabilność i wysokie powinowactwo do substratu. Śledzono również spektrum EPR dla oczyszczonego enzymu. Jak w przypadku innych haloperoksydaz wanadowych (de Boer wsp., 1988; Wever wsp., 1988), utleniony enzym nie daje sygnału przy pomiarze EPR; jednakże po redukcji ditionianem sodu obserwuje się typowe spektrum wanadylowe EPR (dane nie pokazane). Izotropowe parametry EPR go wynoszące 1,969 i A0 o wartości 9.0 mT prawie takie same, jak stwierdzone dla enzymu z C. inaeąualis (Wever i wsp, 1985). Ponadto, oczyszczony enzym został rozdzielony na peptydy przy użyciu proteaz i bromocyjanu. Mapy peptydowe wykazywały te same wzory, sugerując, że te dwa enzymy mają dużą homologię sekwencji. Rzeczywiście tak jest, ustalono sekwencję dwóch rozdzielonych pochodnych z enzymów peptydów, które zostały otrzymane poprzez działanie na enzym proteioz.i które oczyszczono. Sekwencje wykazały bardzo dużą homologię, a zatem można wyciągnąć wniosek, że te dwa enzymy są bardzo podobne.
181 389
Sekwencja aminokwasowa peptydu z C. inaequalis:
(Asp)-leu-arg-gln-pro-tyr-asp-pro-thr-ala-pro-ile-glu-asp-gln-pro-gly-ile-val-arg-thrSekwencja aminokwasowa podobnego peptydu z D.biseptata:
Asp-leu-arg-gln-pro-tyr-asp-pro-dir-ala-pro-ile-glu-glu-gln-gln-pro-gly-ile-val-arg-thrOdpowiednie haloperoksydazy zawierające wanad mogą być zatem identyfikowane poprzez zastosowanie techniki replik, w której badane jest zwiększenie aktywności po dodaniu wanadami, i/lub poprzez (częściowe) oczyszczenie enzymu i szukanie zwiększenia aktywności po dodaniu wanadanu.
Przykład 8. Dalsze poszukiwanie odpowiednich haloperoksydaz w innych mikroorganizmach przy użyciu przeciwciał.
Szczepami użytymi w tym przykładzie są: Curvularia inaegualis (CBS 102.42), Drechslera biseptata (CBS 371.72), Drechslera subpapendorfii (CBS 656.74), Embellissia didymospora (CBS 30 766.79) i Ulocladium chartarum (CBS 200.67).
Mikroorganizmy hodowano w dwóch fazach. Najpierw zaszczepiano 50 ml jałowego podłoża do kiełkowania (jak opisano w Van Schijndel i wsp., 1993) dużą liczbą spor mikroorganizmu. Hodowla była wytrząsana przez 3 dni w 23°C, po czym hodowla była przenoszona do 3 litrowych kolb Erlenmeyera zawierających 1 litr podłoża fermentacyjnego (5 g hydrolizatu kazeiny (Gibco BRL), 3 g ekstraktu drożdżowego i 1 g fruktozy na litr dejonizowanej wody). Podłoże, które było wytrząsane w 23°C, zbierano po 14-17 dniach, filtrowano i oczyszczano chloroperoksydazę zasadniczo według Van Schijndel i wsp., (1994). Otrzymano poliklonalne przeciwciała (stosując kompletny adjuwant Freunda przy pierwszym wstrzyknięciu i niekompletny adjuwant Freunda przy wstrzyknięciu przypominającym) przeciw oczyszczonej (zgodnie z van Schijndel wsp., (1994) chloroperoksydazie z Curvularia inaequalis w króliku (2-miesięcznej samicy). Królik był skrwawiony po 6 dniach po ostatnim wstrzyknięciu przypominającym. Surowice były ogrzewane przez 30 min w 56°C celem zinaktywowania komplementu, a następnie odwirowywane. Zbierany był supernatant. Wykonano serię rozcieńczeń każdej z oczyszczonych chloroperoksydaz, jak również bromoperoksydazy z Ascophylum nodosum (oczyszczonej zgodnie z Wever i wsp., 1985), wychodząc od 50 μΐ każdego białka (około 0,1 mg na ml) i każda próbka była rozcieńczana kolejno dwa razy. Rozcieńczenia nakraplano przy użyciu urządzenia do techniki dot-blot (Bio-Rad) na filtr nitrocelulozowy, 2% BSA i inkubowano kolejno, z króliczą antysurowicą przeciw chloroperoksydazie, rozcieńczoną 1:800, biotynylowanymi kozimi przeciwkróliczymi przeciwciałami (rozcieńczenie 1:3000), streptawidyną skoniugowaną z alkaliczną fosfatazą (rozcieńczenie 1:2000) i odczynnikiem dającym reakcję barwną (fosforan 5-bromo-4-chloro-3-inodolilu, chlorek tetrazolu 4-NitroBlue (Boehringer Mannheim). Wszystkie etapy wykonywano według standardowych przepisów. Otrzymane wyniki są pokazane w tabeli VI.
Tabela VI
| Haloperoksydaza z: | Reakcja krzyżowa z monoklonalnymi przeciwciałami otrzymanymi przeciw chloroperoksydazie z C. inaequalis |
| C. inaequalis | tak |
| D. biseptata | tak |
| D. subpapendorfii | tak |
| E. didymospora | tak |
| U. chartarum | tak |
| Bromoperoksydaza z: A. nodosum | nie |
W oparciu o wyniki przedstawione w tabeli VI można wywnioskować, że testy immunologiczne z przeciwciałami otrzymanymi przeciw chloroperoksydazie C. inaeąualis nadają się do identyfikacji innych odpowiednich haloperoksydaz zawierających wanad.
181 389
Te haloperoksydazy mogą występować bądź w postaci nieoczyszczonej, bądź częściowo lub całkowicie oczyszczonej. Sposoby oczyszczania mogąbyć dowolnymi sposobami znanymi w tej dziedzinie, takimijak sączenie molekularne, chromatografiajonowymienna, chromatografia poprzez oddziaływania hydrofobowe, techniki wytrącania, techniki (ultra)filtrowania, chromatografia powinowactwa, elektroforeza w żelu i temu podobne.
Przykład 9.
Dalsze poszukiwanie odpowiednich haloperoksydaz w innych mikroorganizmach.
W tym przykładzie opisano, w jaki sposób sonda radioaktywna pochodząca z genu dla chloroperoksydazy z Cumularia inaeąualis może być użyta do wykrywania homologicznych genów w innych mikroorganizmach. Wykonano to jak następuje:
Chromosomalny DNA z C. inaequalis (CBS 102.42), Embelissia didymospora (CBS 766.79) i Drechlera biseptata (CBS 371.72) oczyszczano zasadniczo jak opisano dla chromosomalnego DNA C. inaequalis (jak opisano w przykładzie 6). Do analizy genomowego DNA metodą Southema, DNA był trawiony kilkoma kombinacjami enzymów restrykcyjnych i po elektroforezie w żelu agarozowym przeniesiony na filtr nitrocelulozowy (Sambrook i wsp., 1989). Hybrydyzację przeprowadzono stosując wyznakowany radioaktywnie fragment genu, który wytworzono przy użyciu losowych starterów, stosując dATP wyznakowany alfa-32P (Sambrook i wsp., 1989). Użyty specyficzny dla genu fragment był namnażany (przed znakowaniem radioaktywnym) w reakcji łańcuchowej polimerazy, stosując pierwszą nić cDNA (patrz przykład 6) jako sondę i wykorzystując startery:
5' -CACGATGGGGTCCGTTACAC i '-GTACCGCTATCGCTGCGCCTG
Warunki hybrydyzacji były następujące:
Do prehybrydyzacji i hybrydyzacji używano jako buforu 6 x SSPE, 5 x roztwór Denhardta, 0,5% SdS i 10 mg DnA ze spermy łososia. Prehybrydyzację prowadzono przez 1 godzinę w 55°C, a następnie sonda radioaktywna była gotowana przez 1 min, po czym bezpośrednio dodawana. Następnie hybrydyzację kontynuowano przez noc. Autoradiogram, który otrzymano dla DNA z Cunmlaria inaequalis i Drechlera biseptata jest przedstawiony na fig. 4. Na figurze, ścieżka 1: DNA lambda; ścieżka 2: nie trawiony genomowy DNA z C. inaequalis; ścieżka 3: to samo, trawienie Eco RI; ścieżka 4: trawienie Bam HI; ścieżka 5: Eco RI i Bam HI; ścieżka 6 trawienie Xba I; ścieżka 7 Pst I; ścieżka 8 Xba I i Pst I; ścieżki 9- 14: to samo, stosując D. biseptata:. Jak widać na figurze, pozytywny sygnał otrzymano dla chromosomalnego DNA z Drechslera biseptata, co wskazuje na wysoki stopień podobieństwa obu genów. Podobne wyniki otrzymano dla DNA z Embellisia didymospora.. Wnioskujemy zatem, że gen dla chloroperoksydazy, lub części pochodzące z tego genu, lub sondy oparte o sekwencję genu dla chloroperoksydazy z C. inaequalis, mogą być użyte do wykrywania odpowiedniej haloperoksydazy wanadowej z innych mikroorganizmów.
181 389
Tabela VII
Startery oligonukleotydowe (20-mery), oparte o sekwencje aminokwasowe z chloroperoksydazy wanadowej z Curvularia inaequalis _I: inozyna_
A/G: w tej pozycji użyta jest w równych ilościach mieszanina A i G C/T: w tej pozycji użyta jest w równych ilościach mieszanina C i T.
G/A/T/C: w tych pozycjach użyta jest w równych ilościach mieszanina G, A, C i T.
Oligo 1:
5' - T A C/T A T G A A A/G C C IG TIG A A/G C A -3'
Oligo 2:
5' -A G/A T/C T G I G CG/A T A IG C G/A T T G/A T C-3'
Oligo 3:
5' - G A C/T G A A/G A C IG C IG A A/G T A C/T G A-3'
Oligo 4:
5' - A G/A I G C T/C T GI G C IC C G/A/T/C C C C A T-3'
181 389
Abs./min
Fig.4.
rc c in o ώ
Γ
UJ CD UJ O. X £L
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
181 389
| CCTCGCTTTT | ACAACCAGAT | CGTACGTCGC | ATCGCAGTTA | CGTACAAGAA | GGAAGAGGAC | 960 | |
| CTTGCCAACA | GCGAAGTCAA | CAATGCGGAT | TTCGCCCGCC | TCTTCGCCCT | CGTCGACGTC | 1020 | |
| GCTTGCACAG | ACGCTGGTAT | CTTTTCCTGG | AAGGAGAAAT | GGGAGTTCGA | ATTCTGGCGC | 1080 | |
| CCACTATCTG | GTGTGCGAGA | CGACGGCCGT | CCAGACCATG | GAGATCCTTT | CTGGCTCACT | 1140 | |
| CTCGGTGCCC | CAGCTACTAA | CACCAACGAC | ATTCCATTCA | AGCCTCCTTT | CCCAGCTTAC | 1200 | |
| CCATCTGGTC | ACGCGACCTT | TGGCGGTGCT | GTGTTCCAAA | TGGTGCGTCG | ATACTACAAC | 1260 | |
| GGCCGCGTAG | GTACATGGAA | GGACGACGAA | CCCGACAACA | TTGCCATCGA | TATGATGATC | 1320 | |
| TCGGAGGAGC | TCAACGGCGT | GAACCGCGAC | CTACGCCAGC | CTTATGACCC | CACGGCCCCA | 1380 | |
| ATCGAAGACC | AACCCGGTAT | CGTGCGCACC | CGCATTGTTC | GCCACTTCGA | CTCGGCCTGG | 1440 | |
| GAACTCATGT | TCGAAAACGC | CATTTCGCGC | ATCTTCCTCG | GTGTCCACTG | GCGTTTCGAT | 1500 | |
| GCCGCCGCCG | CCCGCGACAT | TCTCATTCCC | ACGACGACAA | AGGACGTCTA | CGCTGTCGAC | 1560 | |
| AACAATGGCG | CCACCGTGTT | CCAGAACGTA | GAGGACATTA | GGTACACAAC | CAGGGGTACG | 1620 | |
| CGTGAGGACC | CCGAGGGCCT | CTTCCCTATC | GGTGGTGTGC | CACTGGGTAT | CGAGATTGCG | 1680 | |
| GATGAGATTT | TTAATAATGG | ACTTAAGCCT | ACGCCCCCGG | AGATCCAGCC | TATGCCGCAG | 1740 | |
| GAGACACCGG | TGCAGAAGCC | GGTGGGACAG | CAGCCGGTTA | AGGGCATGTG | GGAGGAAGAG | 1800 | Fig.2. |
| CAGGCGCCGG | TAGTCAAGGA | GGCGCCGTAG | 1830 | (Cont.) |
(c.d.)
181 389
| ATGGGGTCCG | Fig.2 TTACACCCAT | CCCACTCCCT | AAGATCGATG | AACCCGAAGA | GTACAACACC | 60 |
| AACTACATAC | TATTCTGGAA | CCATGTCGGT | TTGGAACTCA | ACCGCGTAAC | TCACACTGTT | 120 |
| GGAGGCCCCC | TGACGGGACC | ACCTCTCTCT | GCCAGGGCTC | TGGGTATGCT | GCACTTGGCT | 180 |
| ATTCACGACG | CCTACTTTTC | TATCTGCCCT | CCGACCGACT | TCACCACCTT | CCTCTCACCT | 240 |
| GATACTGAGA | ATGCCGCGTA | CCGTCTACCT | AGCCCTAATG | GTGCAAATGA | TGCTCGCCAA | 300 |
| GCAGTCGCTG | GAGCTGCCCT | CAAGATGCTG | TCTTCACTGT | ACATGAAGCC | CGTCGAGCAG | 360 |
| CCTAACCCTA | ACCCCGGCGC | CAACATCTCC | GACAACGCTT | ATGCTCAGCT | TGGCTTGGTT | 420 |
| CTCGACCGAT | CAGTTCTGGA | GGCACCTGGT | GGCGTGGACC | GAGAGTCAGC | CAGTTTCATG | 480 |
| TTTGGTGAGG | ATGTAGCCGA | TGTCTTCTTC | GCACTCCTCA | ACGATCCTCG | AGGTGCTTCG | 540 |
| CAGGAGGGCT | ACCACCCTAC | ACCCGGCCGC | TATAAATTTG | ACGATGAACC | TACTCACCCT | 600 |
| GTCGTCCTCA | TTCCAGTAGA | CCCCAACAAC | CCTAATGGTC | CCAAGATGCC | TTTCCGTCAG | 660 |
| TACCACGCCC | CATTCTACGG | CAAGACCACG | AAGCGTTTTG | CTACGCAGAG | CGAGCACTTC | 720 |
| CTGGCCGACC | CACCGGGCCT | GCGTTCTAAT | GCGGACGAGA | CCGCGGAGTA | TGACGACGCC | 780 |
| GTCCGCGTCG | CTATCGCCAT | GGGTGGTGCT | CAGGCTCTCA | ACTCCACCAA | GCGTAGCCCA | 840 |
| TGGCAGACAG | CACAGGGCCT | ATACTGGGCC | TACGATGGGT | CAAACCTCAT | TGGCACACCA | 900 |
181 389
Fig.1.
Sekwencje peptydowe pochodzące z chloroperoksydazy wanadowej sekwencja sposób cięcia
C. inaegualis
1ML—LYMK PVEOPNPNPGANISDNAYAOLGLVLDRSVT ,F.A a (S)
CNBr
Trypsyna
Trypsyna
Trypsyna
Trypsyna
3(G)YHPTPGRYKFDDEP
4IDEPEEYN (D) LRQPYDPTAPIEDQPGXVRTb
D. biseptata
6LNGLNRDLRQPYUPTAPIEEQPGXVb v8 prot.
asekwencje podkreślone są użyte do zaprojektowania zdegenerowanych starterów DNA.
bhomologiczne sekwencje pomiędzy C.inaequalis i D.biseptata są wytłuszczone.
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.
Cena 4,00 zł.
Claims (6)
- Zastrzeżenia patentowe1. Enzymatyczny środek przeciwbakteryjny zasadniczo wolny od aktywności katalazy, znamienny tym, że zawiera haloperoksydazę wanadową, źródło halogenku i nadtlenek wodoru lub źródło nadtlenku wodoru.
- 2. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że jako haloperoksydazę wanadową zawiera chloroperoksydazę.
- 3. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że jako haloperoksydazę wanadową zawiera chloroperoksydazę, którą można otrzymać z Curvularia inaequalis.
- 4. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że jako haloperoksydazę wanadową zawiera chloroperoksydazę, która wykazuje immunologiczną reakcję krzyżową z chloroperoksydazą z Curvularia inaequalis CBS 102.42.
- 5. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że jako źródło nadtlenku wodoru zawiera enzymatyczny układ wytwarzający nadtlenek wodoru.
- 6. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że jako układ wytwarzający nadtlenek wodoru zawiera układ glukoza/oksydaza glukozowa lub mleczan/oksydaza mleczanowa.* * *
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP94200893 | 1994-03-31 | ||
| PCT/EP1995/001229 WO1995027046A2 (en) | 1994-03-31 | 1995-03-31 | Enzymatic antimicrobial compositions containing haloperoxidases |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL316571A1 PL316571A1 (en) | 1997-01-20 |
| PL181389B1 true PL181389B1 (pl) | 2001-07-31 |
Family
ID=8216755
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL95341279A PL181397B1 (pl) | 1994-03-31 | 1995-03-31 | Sekwencja DNA kodujaca chloroperoksydaze wanadowa, wektor ekspresyjny i sposób wytwarzania haloperoksydazy wanadowej PL |
| PL95316571A PL181389B1 (pl) | 1994-03-31 | 1995-03-31 | Enzymatyczny srodek przeciwbakteryjny PL |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL95341279A PL181397B1 (pl) | 1994-03-31 | 1995-03-31 | Sekwencja DNA kodujaca chloroperoksydaze wanadowa, wektor ekspresyjny i sposób wytwarzania haloperoksydazy wanadowej PL |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0753055A1 (pl) |
| JP (1) | JPH09511396A (pl) |
| CN (1) | CN1146782A (pl) |
| AU (1) | AU2215495A (pl) |
| BR (1) | BR9507226A (pl) |
| CA (1) | CA2182966A1 (pl) |
| CZ (1) | CZ288041B6 (pl) |
| HU (1) | HUT74967A (pl) |
| NL (1) | NL9401048A (pl) |
| PL (2) | PL181397B1 (pl) |
| SK (1) | SK123096A3 (pl) |
| WO (1) | WO1995027046A2 (pl) |
Families Citing this family (128)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2635097A (en) * | 1996-04-29 | 1997-11-19 | Novo Nordisk A/S | Non-aqueous, liquid, enzyme-containing compositions |
| JP2000512267A (ja) * | 1996-05-09 | 2000-09-19 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 抗微生物ペルオキシダーゼ組成物 |
| EP1005362A4 (en) * | 1997-03-24 | 2002-10-09 | Clorox Co | CHLOROPEROXYDASE ENZYME SYSTEM FOR PRODUCING HYPOCHLOROUS ACID AND HYPOCHLORITE $ i (IN SITU) |
| DE69719568T2 (de) * | 1997-07-09 | 2003-12-24 | The Procter & Gamble Company, Cincinnati | Oxidoreductase enthaltende reinigungszusammensetzungen |
| ID23661A (id) * | 1997-08-14 | 2000-05-11 | Novo Nordisk As | Komposisi antimixroba yang mengandung haloperoksidase sumber halida dan sumber amonium |
| US6074631A (en) * | 1997-08-14 | 2000-06-13 | Novo Nordisk A/S | Reduction of malodour |
| US6025186A (en) * | 1997-08-14 | 2000-02-15 | Novo Nordisk A/S | Reduction of malodor |
| US6080391A (en) * | 1997-08-14 | 2000-06-27 | Novo Nordisk A/S | Reduction of malodour |
| US6228128B1 (en) | 1997-11-10 | 2001-05-08 | Charlotte Johansen | Antimicrobial activity of laccases |
| US6232457B1 (en) | 1998-09-10 | 2001-05-15 | The Regents Of The University Of California | Recombinant vanadium haloperoxidases and their uses |
| US6656715B1 (en) | 1998-09-10 | 2003-12-02 | The Regents Of The University Of California | Recombinant minimal catalytic vanadium haloperoxidases and their uses |
| US6592867B2 (en) * | 1998-11-09 | 2003-07-15 | Novozymes A/S | Antimicrobial composition containing an oxidoreductase and an enhancer of the N-hydroxyanilide-type |
| ATE417899T1 (de) * | 1999-05-06 | 2009-01-15 | Novozymes As | Enzymatische konservierung von wässrigen lacken |
| US7063970B1 (en) | 1999-05-06 | 2006-06-20 | Norozymes A/S | Enzymatic preservation of water based paints |
| JP2003506053A (ja) * | 1999-08-10 | 2003-02-18 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 汚れた動物用床材の悪臭の軽減 |
| WO2001011969A1 (en) * | 1999-08-13 | 2001-02-22 | Novozymes A/S | ENZYMATIC METHOD FOR KILLING OR INHIBITING MICROBIAL CELLS AT HIGH pH |
| US6410292B1 (en) | 2000-04-14 | 2002-06-25 | Novozymes A/S | Nucleic acids encoding polypeptides having haloperoxidase activity |
| WO2001079462A2 (en) * | 2000-04-14 | 2001-10-25 | Novozymes A/S | Nucleic acids encoding polypeptides having haloperoxidase activity |
| AU2001246407A1 (en) | 2000-04-14 | 2001-10-30 | Maxygen, Inc. | Nucleic acids encoding polypeptides having haloperoxidase activity |
| WO2001079458A2 (en) * | 2000-04-14 | 2001-10-25 | Novozymes A/S | Polypeptides having haloperoxidase activity |
| US6509181B1 (en) | 2000-04-14 | 2003-01-21 | Novozymes, A/S | Polypeptides having haloperoxide activity |
| US6511835B1 (en) | 2000-04-14 | 2003-01-28 | Novozymes, A/S | Nucleic acids encoding polypeptides having haloperoxidase activity |
| US6410291B1 (en) | 2000-04-14 | 2002-06-25 | Novozymes A/S | Polypeptides having haloperoxidase activity |
| WO2001079463A2 (en) * | 2000-04-14 | 2001-10-25 | Novozymes A/S | Nucleic acids encoding polypeptides having haloperoxidase activity |
| AU2002220541A1 (en) * | 2000-12-15 | 2002-06-24 | Novozymes A/S | Use of haloperoxidase, peroxide and carboxylic acid |
| US7267818B2 (en) | 2001-12-04 | 2007-09-11 | Novozymes A/S | Method for killing spores |
| EP1497382A1 (en) * | 2002-04-12 | 2005-01-19 | Biolocus Aps | Antifouling composition comprising an enzyme in the absence of its substrate |
| DK3219804T3 (da) | 2007-04-24 | 2019-09-30 | Novozymes North America Inc | Afgiftning af forbehandlede lignocelluloseholdige materialer |
| CN101827527A (zh) * | 2007-10-23 | 2010-09-08 | 诺维信公司 | 用于杀死孢子和装置消毒或灭菌的方法 |
| WO2010046142A2 (en) * | 2008-10-23 | 2010-04-29 | Getinge Disinfection Ab | A method of obtaining high level disinfection in a washer disinfector, and a washer disinfector |
| JP2012522743A (ja) | 2009-04-03 | 2012-09-27 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | ウイルスを不活性化するための方法 |
| CN102421456A (zh) | 2009-04-22 | 2012-04-18 | 诺维信公司 | 用于杀伤或抑制分枝杆菌属生长的方法 |
| EP2510944A1 (en) * | 2011-04-15 | 2012-10-17 | National University of Ireland, Galway | Treatment of bacterial infections |
| WO2013164429A1 (en) | 2012-05-02 | 2013-11-07 | Novozymes A/S | Enzymatic solubilization of metals |
| US9902946B2 (en) | 2013-01-03 | 2018-02-27 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same |
| CN105189724A (zh) | 2013-03-14 | 2015-12-23 | 诺维信公司 | 含有酶和抑制剂的水溶性膜 |
| WO2014173980A2 (en) | 2013-04-23 | 2014-10-30 | Novozymes A/S | Liquid automatic dish washing detergent compositions |
| JP7020778B2 (ja) | 2013-05-03 | 2022-02-16 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 洗剤酵素のマイクロカプセル化 |
| CN105120681A (zh) * | 2013-05-08 | 2015-12-02 | 诺维信公司 | 动物饲料酶 |
| WO2014183921A1 (en) | 2013-05-17 | 2014-11-20 | Novozymes A/S | Polypeptides having alpha amylase activity |
| WO2015014803A1 (en) | 2013-07-29 | 2015-02-05 | Novozymes A/S | Protease variants and polynucleotides encoding same |
| EP3126479A1 (en) | 2014-04-01 | 2017-02-08 | Novozymes A/S | Polypeptides having alpha amylase activity |
| CN112899086A (zh) | 2014-04-11 | 2021-06-04 | 诺维信公司 | 洗涤剂组合物 |
| CN106459937B (zh) | 2014-05-27 | 2024-09-10 | 诺维信公司 | 用于产生脂肪酶的方法 |
| EP3760713A3 (en) | 2014-05-27 | 2021-03-31 | Novozymes A/S | Lipase variants and polynucleotides encoding same |
| WO2016001319A1 (en) | 2014-07-03 | 2016-01-07 | Novozymes A/S | Improved stabilization of non-protease enzyme |
| WO2016079110A2 (en) | 2014-11-19 | 2016-05-26 | Novozymes A/S | Use of enzyme for cleaning |
| CN107567489A (zh) | 2015-04-10 | 2018-01-09 | 诺维信公司 | 衣物洗涤方法，dna酶和洗涤剂组合物的用途 |
| CN107636134A (zh) | 2015-04-10 | 2018-01-26 | 诺维信公司 | 洗涤剂组合物 |
| WO2016184944A1 (en) | 2015-05-19 | 2016-11-24 | Novozymes A/S | Odor reduction |
| EP3310688A1 (en) | 2015-06-17 | 2018-04-25 | Novozymes A/S | Container |
| WO2016135351A1 (en) | 2015-06-30 | 2016-09-01 | Novozymes A/S | Laundry detergent composition, method for washing and use of composition |
| EP3950939A3 (en) | 2015-07-06 | 2022-06-08 | Novozymes A/S | Lipase variants and polynucleotides encoding same |
| EP3350303B1 (en) | 2015-09-17 | 2020-04-08 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent compositions comprising polypeptides having xanthan degrading activity |
| CA2991114A1 (en) | 2015-09-17 | 2017-03-23 | Novozymes A/S | Polypeptides having xanthan degrading activity and polynucleotides encoding same |
| CA2994356A1 (en) | 2015-10-07 | 2017-04-13 | Novozymes A/S | Compositions comprising dnase polypeptides |
| US10479981B2 (en) | 2015-10-14 | 2019-11-19 | Novozymes A/S | DNase variants |
| US10675589B2 (en) | 2015-10-14 | 2020-06-09 | Novozymes A/S | Cleaning of water filtration membranes |
| WO2017093318A1 (en) | 2015-12-01 | 2017-06-08 | Novozymes A/S | Methods for producing lipases |
| US20190002819A1 (en) | 2015-12-28 | 2019-01-03 | Novozymes Bioag A/S | Heat priming of bacterial spores |
| BR112018069220A2 (pt) | 2016-03-23 | 2019-01-22 | Novozymes As | uso de polipeptídeo que tem atividade de dnase para tratamento de tecidos |
| EP3464538A1 (en) | 2016-05-31 | 2019-04-10 | Novozymes A/S | Stabilized liquid peroxide compositions |
| WO2017220422A1 (en) | 2016-06-23 | 2017-12-28 | Novozymes A/S | Use of enzymes, composition and method for removing soil |
| WO2018002261A1 (en) | 2016-07-01 | 2018-01-04 | Novozymes A/S | Detergent compositions |
| WO2018007573A1 (en) | 2016-07-08 | 2018-01-11 | Novozymes A/S | Detergent compositions with galactanase |
| WO2018011276A1 (en) | 2016-07-13 | 2018-01-18 | The Procter & Gamble Company | Bacillus cibi dnase variants and uses thereof |
| WO2018060475A1 (en) | 2016-09-29 | 2018-04-05 | Novozymes A/S | Spore containing granule |
| EP3519548A1 (en) | 2016-09-29 | 2019-08-07 | Novozymes A/S | Use of enzyme for washing, method for washing and warewashing composition |
| WO2018077938A1 (en) | 2016-10-25 | 2018-05-03 | Novozymes A/S | Detergent compositions |
| EP3535377B1 (en) | 2016-11-01 | 2022-02-09 | Novozymes A/S | Multi-core granules |
| KR20190086540A (ko) | 2016-12-01 | 2019-07-22 | 바스프 에스이 | 조성물 중 효소의 안정화 |
| WO2018108865A1 (en) | 2016-12-12 | 2018-06-21 | Novozymes A/S | Use of polypeptides |
| WO2018184818A1 (en) | 2017-04-06 | 2018-10-11 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
| CN111108183A (zh) | 2017-06-30 | 2020-05-05 | 诺维信公司 | 酶浆液组合物 |
| EP3684897A1 (en) | 2017-09-20 | 2020-07-29 | Novozymes A/S | Use of enzymes for improving water absorption and/or whiteness |
| US11414814B2 (en) | 2017-09-22 | 2022-08-16 | Novozymes A/S | Polypeptides |
| US11332725B2 (en) | 2017-09-27 | 2022-05-17 | Novozymes A/S | Lipase variants and microcapsule compositions comprising such lipase variants |
| CN111542589A (zh) | 2017-10-16 | 2020-08-14 | 诺维信公司 | 低粉化颗粒 |
| EP3697881A1 (en) | 2017-10-16 | 2020-08-26 | Novozymes A/S | Low dusting granules |
| EP3701017A1 (en) | 2017-10-27 | 2020-09-02 | Novozymes A/S | Dnase variants |
| EP3476936B1 (en) | 2017-10-27 | 2022-02-09 | The Procter & Gamble Company | Detergent compositions comprising polypeptide variants |
| WO2019154954A1 (en) | 2018-02-08 | 2019-08-15 | Novozymes A/S | Lipase variants and compositions thereof |
| WO2019154951A1 (en) | 2018-02-08 | 2019-08-15 | Novozymes A/S | Lipases, lipase variants and compositions thereof |
| CN111770788B (zh) | 2018-03-13 | 2023-07-25 | 诺维信公司 | 使用氨基糖低聚物进行微囊化 |
| WO2019201793A1 (en) | 2018-04-17 | 2019-10-24 | Novozymes A/S | Polypeptides comprising carbohydrate binding activity in detergent compositions and their use in reducing wrinkles in textile or fabric. |
| US11661592B2 (en) | 2018-04-19 | 2023-05-30 | Novozymes A/S | Stabilized endoglucanase variants |
| WO2019201785A1 (en) | 2018-04-19 | 2019-10-24 | Novozymes A/S | Stabilized cellulase variants |
| WO2019238761A1 (en) | 2018-06-15 | 2019-12-19 | Basf Se | Water soluble multilayer films containing wash active chemicals and enzymes |
| WO2020070199A1 (en) | 2018-10-03 | 2020-04-09 | Novozymes A/S | Polypeptides having alpha-mannan degrading activity and polynucleotides encoding same |
| EP3891264A1 (en) | 2018-12-03 | 2021-10-13 | Novozymes A/S | LOW pH POWDER DETERGENT COMPOSITION |
| EP3898962A2 (en) | 2018-12-21 | 2021-10-27 | Novozymes A/S | Polypeptides having peptidoglycan degrading activity and polynucleotides encoding same |
| BR112021018731A2 (pt) | 2019-03-21 | 2021-12-21 | Novozymes As | Variantes de alfa-amilase e polinucleotídeos codificando as mesmas |
| WO2020207944A1 (en) | 2019-04-10 | 2020-10-15 | Novozymes A/S | Polypeptide variants |
| US20220186151A1 (en) | 2019-04-12 | 2022-06-16 | Novozymes A/S | Stabilized glycoside hydrolase variants |
| EP3994255A1 (en) | 2019-07-02 | 2022-05-11 | Novozymes A/S | Lipase variants and compositions thereof |
| WO2021037895A1 (en) | 2019-08-27 | 2021-03-04 | Novozymes A/S | Detergent composition |
| WO2021053127A1 (en) | 2019-09-19 | 2021-03-25 | Novozymes A/S | Detergent composition |
| EP4038170A1 (en) | 2019-10-03 | 2022-08-10 | Novozymes A/S | Polypeptides comprising at least two carbohydrate binding domains |
| BR112021021050A2 (pt) | 2019-11-29 | 2022-09-13 | Basf Se | Composição, uso de uma composição, polímero, processo para preparar polímeros, e, método para melhorar o desempenho de limpeza de uma composição líquida de detergente |
| US20220411773A1 (en) | 2019-12-20 | 2022-12-29 | Novozymes A/S | Polypeptides having proteolytic activity and use thereof |
| EP3892708A1 (en) | 2020-04-06 | 2021-10-13 | Henkel AG & Co. KGaA | Cleaning compositions comprising dispersin variants |
| MX2022011948A (es) | 2020-04-08 | 2022-10-21 | Novozymes As | Variantes de modulos de union a carbohidratos. |
| WO2021214059A1 (en) | 2020-04-21 | 2021-10-28 | Novozymes A/S | Cleaning compositions comprising polypeptides having fructan degrading activity |
| EP3907271A1 (en) | 2020-05-07 | 2021-11-10 | Novozymes A/S | Cleaning composition, use and method of cleaning |
| WO2021259099A1 (en) | 2020-06-24 | 2021-12-30 | Novozymes A/S | Use of cellulases for removing dust mite from textile |
| EP3936593A1 (en) | 2020-07-08 | 2022-01-12 | Henkel AG & Co. KGaA | Cleaning compositions and uses thereof |
| CN116323889A (zh) | 2020-08-25 | 2023-06-23 | 诺维信公司 | 家族44木葡聚糖酶变体 |
| US20240240114A1 (en) | 2020-09-22 | 2024-07-18 | Basf Se | Improved Combination of Protease and Protease Inhibitor with Secondary Enzyme |
| EP4225905A2 (en) | 2020-10-07 | 2023-08-16 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants |
| EP4232539A2 (en) | 2020-10-20 | 2023-08-30 | Novozymes A/S | Use of polypeptides having dnase activity |
| US20230399588A1 (en) | 2020-10-28 | 2023-12-14 | Novozymes A/S | Use of lipoxygenase |
| WO2022106400A1 (en) | 2020-11-18 | 2022-05-27 | Novozymes A/S | Combination of immunochemically different proteases |
| WO2022106404A1 (en) | 2020-11-18 | 2022-05-27 | Novozymes A/S | Combination of proteases |
| EP4284905A1 (en) | 2021-01-28 | 2023-12-06 | Novozymes A/S | Lipase with low malodor generation |
| EP4291646A2 (en) | 2021-02-12 | 2023-12-20 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants |
| WO2022189521A1 (en) | 2021-03-12 | 2022-09-15 | Novozymes A/S | Polypeptide variants |
| EP4060036A1 (en) | 2021-03-15 | 2022-09-21 | Novozymes A/S | Polypeptide variants |
| US20240060061A1 (en) | 2021-03-15 | 2024-02-22 | Novozymes A/S | Dnase variants |
| WO2022268885A1 (en) | 2021-06-23 | 2022-12-29 | Novozymes A/S | Alpha-amylase polypeptides |
| CN118660951A (zh) | 2022-03-02 | 2024-09-17 | 诺维信公司 | 木葡聚糖酶用于改善洗涤剂的可持续性的用途 |
| AU2023228020A1 (en) | 2022-03-04 | 2024-07-11 | Novozymes A/S | Dnase variants and compositions |
| AU2023250091A1 (en) | 2022-04-08 | 2024-10-03 | Novozymes A/S | Hexosaminidase variants and compositions |
| EP4309500A1 (en) * | 2022-07-18 | 2024-01-24 | Acies Bio d.o.o. | Peroxidase based biocontrol agents |
| WO2024017883A1 (en) * | 2022-07-18 | 2024-01-25 | Acies Bio D.O.O. | Peroxidase based biocontrol agents |
| WO2024126483A1 (en) | 2022-12-14 | 2024-06-20 | Novozymes A/S | Improved lipase (gcl1) variants |
| WO2024131880A2 (en) | 2022-12-23 | 2024-06-27 | Novozymes A/S | Detergent composition comprising catalase and amylase |
| WO2024156628A1 (en) | 2023-01-23 | 2024-08-02 | Novozymes A/S | Cleaning compositions and uses thereof |
| WO2024194245A1 (en) | 2023-03-21 | 2024-09-26 | Novozymes A/S | Detergent compositions based on biosurfactants |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4707446A (en) * | 1983-05-24 | 1987-11-17 | Cetus Corporation | Stable haloperoxidase method |
| AU642980B2 (en) * | 1990-03-21 | 1993-11-04 | Quest International B.V. | Ultilization of enzymes |
| GB9015910D0 (en) * | 1990-07-19 | 1990-09-05 | Univ Bruxelles | Novel use |
| JP3399549B2 (ja) * | 1990-11-16 | 2003-04-21 | サントリー株式会社 | 微生物由来ペルオキシダーゼ遺伝子 |
| JP4063317B2 (ja) * | 1991-02-21 | 2008-03-19 | エクソゼミス，インコーポレイテッド | 感染治療および叢制御の方法および組成物 |
| US5262151A (en) * | 1991-11-25 | 1993-11-16 | Montgomery Robert E | Stabilized enzymatic antimicrobial compositions |
-
1994
- 1994-06-24 NL NL9401048A patent/NL9401048A/nl not_active Application Discontinuation
-
1995
- 1995-03-31 BR BR9507226A patent/BR9507226A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-03-31 PL PL95341279A patent/PL181397B1/pl unknown
- 1995-03-31 CN CN95192407A patent/CN1146782A/zh active Pending
- 1995-03-31 EP EP95915183A patent/EP0753055A1/en not_active Withdrawn
- 1995-03-31 CZ CZ19962850A patent/CZ288041B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-03-31 AU AU22154/95A patent/AU2215495A/en not_active Abandoned
- 1995-03-31 WO PCT/EP1995/001229 patent/WO1995027046A2/en active IP Right Grant
- 1995-03-31 CA CA002182966A patent/CA2182966A1/en not_active Abandoned
- 1995-03-31 SK SK1230-96A patent/SK123096A3/sk unknown
- 1995-03-31 JP JP7525418A patent/JPH09511396A/ja active Pending
- 1995-03-31 PL PL95316571A patent/PL181389B1/pl unknown
- 1995-03-31 HU HU9602673A patent/HUT74967A/hu unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUT74967A (en) | 1997-03-28 |
| AU2215495A (en) | 1995-10-23 |
| NL9401048A (nl) | 1995-11-01 |
| JPH09511396A (ja) | 1997-11-18 |
| SK123096A3 (en) | 1997-06-04 |
| PL316571A1 (en) | 1997-01-20 |
| WO1995027046A3 (en) | 1995-11-30 |
| EP0753055A1 (en) | 1997-01-15 |
| WO1995027046A2 (en) | 1995-10-12 |
| BR9507226A (pt) | 1997-09-09 |
| PL181397B1 (pl) | 2001-07-31 |
| HU9602673D0 (en) | 1996-11-28 |
| CA2182966A1 (en) | 1995-10-12 |
| CN1146782A (zh) | 1997-04-02 |
| CZ288041B6 (cs) | 2001-04-11 |
| CZ285096A3 (en) | 1997-10-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL181389B1 (pl) | Enzymatyczny srodek przeciwbakteryjny PL | |
| JP2716233B2 (ja) | 布帛の漂白用洗剤添加剤 | |
| CN1046775C (zh) | 染料转移抑制剂 | |
| US5866393A (en) | Haloperoxidases from curvularia verruculosa and nucleic acids encoding same | |
| Simons et al. | Primary structure and characterization of the vanadium chloroperoxidase from the fungus Curvularia inaequails | |
| MXPA98000419A (en) | Haloperoxidasas of vervulular curvular and nucleic acids that codify for the mis | |
| US6426410B1 (en) | Phenol oxidizing enzymes | |
| US7160709B2 (en) | Phenol oxidizing enzymes | |
| MXPA01006388A (es) | Enzimas oxidantes de fenol. | |
| CA2384954C (en) | Novel phenol oxidizing enzymes | |
| US6372465B2 (en) | Haloperoxidases with altered pH profiles | |
| JP2002506638A (ja) | ｐＨ特性を変更したハロペルオキシダーゼ | |
| US20020165113A1 (en) | Detergent compositions comprising novel phenol oxidizing enzymes | |
| EP1315802A2 (en) | Phenol oxidizing enzyme variants | |
| WO2000005349A1 (en) | Phenol oxidizing enzymes | |
| WO1999049010A2 (en) | Phenol oxidizing enzymes and their use | |
| JP4866169B2 (ja) | メラニン分解酵素 | |
| MXPA00008969A (en) | HALOPEROXIDASES WITH ALTERED pH PROFILES | |
| DK164818B (da) | Detergentadditiv, detergentkomposition og fremgangsmaade til blegning af pletter paa tekstil | |
| NZ235671A (en) | Bleaching agent and process for inhibiting dye transfer during washing and |