MXPA01006388A - Enzimas oxidantes de fenol. - Google Patents

Abstract

Se describen en la presente novedosas oxidantes del fenol codificadas por acidos capaces de hibridizar para el acido nucleico que tiene secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 1 y en particular aquellas que se obtienen de hongos. La presente invencion proporciona secuencias de acidos nucleicos de aminoacidos para Bipolaris spicifera, Curvularia pallescens y Amerosporium atrum. La presente invencion proporciona vectores de expresion y celulas hospederas que comprenden enzimas oxidantes del fenol que codifican para acidos nucleicos, metodos para producir las enzimas oxidantes del fenol, asi como metodos para estructurar los hospederos de expresion.

Description

ENZIMAS OXIDANTES DE FENOL Campo de la Invención La presente invención se relaciona a enzimas novedosas oxidantes del fenol, en particular, a en ima novedosas oxidantes del fenol que se obtienen a partir d>_ hongos. La presente invención proporciona métodos ; células hospederas para expresar las enzimas oxidante; del fenol asi como métodos para producir los sistemas d¿ expresión que comprenden a las enzimas oxidantes dei fenol .

Antecedentes de la Invención Las oxidantes del fenol funcionan al catalizai reacciones rédox, es decir, la transferencia d-electrones a partir de un donador de electrones (normalmente un compuesto fenólico) a oxigeno molecul i (que actúa como un aceptor de electrones) que se reduce n H20. Mientras que son capaces de utilizar una amplia variedad de diferentes compuestos fenólicos a manera :k donadores de electrones, las enzimas oxidantes del fenol REF: 130026 ^^^^ ^^^j^^. son muy especificas para el oxigeno molecular como el aceptor de electrones. Las enzimas oxidantes del fenol pueden utilizáis-para una amplia variedad de aplicaciones, que incluyen is industria de detergentes, la industria del papel y i-pasta papelera, la industria textil y la industii-alimenticia. En la industria de detergentes, las enzima oxidantes del fenol se han utilizado para prevenir 1_-, transferencia de tintes en solución a partir de un textil a otro durante el lavado con detergente, una que comúnmente se le refiere como inhibición de 1-transferencia del colorante. La mayoria de las enzimas oxidantes del fenol exhiben un pH óptimo en la gama de ph ácido mientras que son inactivas en pH neutros alcalinos. Las enzimas oxidantes del fenol se conocen porque s -producen mediante una amplia variedad de hong = , incluyendo especies de los géneros Aspergillus , Neurospora, Podospora, Botytis, Pleurotus, Formes, Phlebia, Tramates, Polyporus, Rhizoctonia y Lentinus. _:i? embargo, aún existe una necesidad para identificar aislar a las enzimas oxidantes del fenol, y a organismos capaces de producir naturalmente a las enzimas oxidantes del fenol para usarse en las composiciones y métodos par--, la industria textil, limpieza y lavado con detergentes.

Breve Descripción de la Invención La presente invención se relaciona a enzimas novedosas oxidantes del fenol codificadas por un cid'-nucleico capaz de hibridizarse al ácido nucleico que codifica para la enzima oxidante del fenol de Stachybotrys chartarum (que se muestra en la Figura 1, y que tiene la secuencia del polinucleótido que se muestii en SEQ ID N0:1), o un fragmento de esta, baj condiciones de alta hasta intermedia rigurosidad, siempre y cuando la enzima oxidante del fenol sea capaz ele modificar el color asociado con los colorantes e compuestos coloreados. En las modalidades ilustrat ivas-descritas en la presente, las enzimas oxidantes del fenol se obtienen a partir de hongos. Las enzimas oxidantes elel fenol de la presente invención se pueden utilizar, e ejemplo, para el blanqueo de papel y pasta papelera, parr, el blanqueo de color de manchas sobre telas para evit i la transferencia de colorantes en las aplicaciones detergentes y textiles. Las enzimas oxidantes del fenol de la presente invención pueden ser capaces de modific : el color en ausencia de un agente intensificador o er. presencia de un agente intensificador. Por consiguiente, la presente invención proporción.-. enzimas oxidantes del fenol codificadas por los ácidos nucleicos capaces de hibridizarse al ácido nucleico que tiene la secuencia como se muestra en SEQ ID N0:1 o a ur. fragmento de esta, bajo condiciones de intermedia hast-, alta rigurosidad. Estas enzimas comprenden por lo menos un 601 de identidad, por lo menos un 65% de identidad, por lo menos un 70% de identidad, por lo menos un 751 el-identidad, por lo menos un 80% de identidad, por lo menos un 85% de identidad, por lo menos un 90% de identidad y por lo menos un 951 de identidad a la enzima oxidante elel fenol de Stachybotrys chartarum que tiene la secuencia el-aminoácidos descrita en SEQ ID- NO: 2, y excluye especificamente a la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 2 , mientras que la enzima sea capaz de modificar el color asociado con los colorantes e compuestos coloreados. En una modalidad, la enzima oxidante del fenol puede obtenerse a partir de bacterias, levaduras o especies de hongos que no sean ei- Stachybotrys . En una modalidad preferida, la enzini-- oxidante del fenol se obtiene a partir de hongos que incluyen las especies de Myrothecium, especies de 5 Curvularia, especies de Chaetomium, especies ele Bipolaris, especies de Humicola, especies de Pleurotus, especies de Trichoderma, especies de Mycellophtora especies de Amerosporium. En una modalidad preferida, el hongo incluye Myrothecium verrucaria, Curvulaii 10 pallescens, Chaetomium sp, Bipolaris spciífera, Humicola insolens, Pleurotus abalonus, Trichoderma reesei, Mycellophtora thermophila y Amerosporium a trum. En una modalidad ilustrativa descrita en ln presente, la enzima oxidante del fenol se obtiene 15 partir de Bipolaris spícífera y tiene la secuencia de ácidos nucleicos genómicos como se muestra en la Figura 1 (SEQ ID NO: 3) y la secuencia deducida de aminoácidos come se muestra en la Figura 3 (SEQ ID NO:4). En otra modalidad ilustrativa descrita en la presente, la enzima 20 oxidante del fenol se obtiene a partir de Curvularia pallescens y tiene la secuencia genómica de ácidos nucleicos como se muestra en la Figura 9 (SEQ ID NO: 6) *-**A**'M>! • - la secuencia deducida de aminoácidos como se muestra ei. la Figura 10 (SEQ ID NO:7). En otra modalidad ilustrativa descrita en la presente, la enzima oxidante del fenol se obtiene a partir de Amerosporium a trum y comprende las secuencias de ácidos nucleicos como se muestra en la Figura 13 (SEQ ID NO: 8) y la secuencia deducida de aminoácidos como se muestra en la Figura 13 (SEQ IE NO:9) . En consecuencia, la presente invención abarca a las enzimas oxidantes del fenol codificadas por las secuencias de polinucleótidos que se hibridan baje condiciones de rigurosidad intermedia a alta a los cidos nucleicos que tienen la secuencia como se muestra en SEC ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 ó SEQ ID NO: 8, o fragmentos ele estas, y que son capaces de modificar el color asociade con un colorante o un compuesto coloreado. La presente invención también abarca a polinucleótidos que codificar, para la secuencia de aminoácidos como se muestran en SEQ ID NO: asi como a los polinucleótidos que codifican pai a la secuencia de aminoácidos como se muestran en SEQ IE1 NO: 7 y a polinucleótidos que codifican para la secuencia de aminoácidos como se muestran en SEQ ID NO: 9. L.-? presente invención proporciona vectores de expresión células hospederas que comprenden polinucleótidos que codifican para las enzimas oxidantes del fenol de 1.-, presente invención asi como a métodos para producir las enzimas. La presente invención proporciona un método par _-, producir una enzima oxidante del fenol que comprende los pasos de obtener una célula hospedera que comprende un polinucleótido capaz de hibridizarse a SEQ ID N0:1, e fragmentos de esta, bajo condiciones de rigurosidad intermedia a alta en donde el polinucleótido codific-para una enzima oxidante del fenol capaz de modificar el color asociado con colorantes y compuestos coloreados; cultivar la célula hospedera bajo condiciones adecuadas para la producción de la enzima oxidante del fenol; y opcionalmente recuperar la enzima oxidante del fenol qu-se produce. En una modalidad, el polinucleótido comprendía secuencia como se muestra en SEQ ID NO: 3; en otra modalidad, el polinicleótido comprende la secuencia come se muestra en SEQ ID NO: 6; y en otra modalidad, el polinucleótido comprende la secuencia como se muestra en SEQ ID NO: 8. En otra modalidad, la enzima oxidante del fenol comprende la secuencia de aminoácidos como s-muestra en SEQ ID NO: 4; en otra modalidad, la enzima oxidante del fenol comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 7; e incluso en ot i a modalidad, la enzima oxidante del fenol comprende i: secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: .

La presente invención también proporciona un mete i: para producir una célula hospedera que comprende ui polinucleótido que codifica para una enzima oxidante del fenol que comprende los pasos de obtener ui polinucleótido capaz de hibridizarse a SEQ ID NO:l, o _? fragmentos de esta, bajo condiciones de rigurosielau intermedia a alta en donde el polinucleótido codifie.-, para una enzima oxidante del fenol capaz de modificar el color asociado con colorantes o compuestos coloreados ; introducir el polinucleótido a la célula hospedera; cultivar la célula hospedera bajo condiciones adecuadas para la producción de la enzima oxidante del fenol. En una modalidad, el polinucleótido comprende la secuencia como se muestra en SEQ ID NO: 3. En otra modalidad, el polinucleótido comprende la secuencia como se muestra en SEQ ID NO: 6. En otra modalidad, el polinucleotide comprende la secuencia como se muestra en SEQ ID NO: 8. En la presente invención, la célula hospedera comprende un polinucleótido que codifica para una enzim_-oxidante del fenol que incluye honqos filamentosos, levaduras y bacterias. En una modalidad, la celul-hospedera es un hongo filamentoso que incluye lac especies de Aspergillus, especies de Trichoderma, y especies de Mucor. En otra modalidad, la célula hospeder de hongo filamentoso incluye Aspergillus niger var , awomari o Trichoderma reesei. Incluso en otra modalidad de la presente invención, la célula hospedera es una levadura que incluye especies de Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces y Yarrowia. En otra modalidad más, lac especies de Saccharomyces es Saccharomyces cerevisiae. Incluso en otra modalidad adicional,- la célula hospedera es una bacteria gram positiva, tal como las especies el-Bacillus, o una bacteria gram negativa, tal como las especies de Escherichia. También se proporciona en la presente composiciones detergentes que comprenden una enzima oxidante del feno -**- -*»— codificada por los ácidos nucleicos capaces de hibridizarse al ácido nucleico que codifica para la enzima oxidante del fenol de Stachybotrys chartarum ] -se muestra en la Figura 1 y que tiene SEQ ID N0:1) baje condiciones de rigurosidad intermedia a alta. Estas enzimas tienen por lo menos un 60% de identidad, por le menos un 65% de identidad, por lo menos un 70% ele identidad, por lo menos un 75% de identidad, por lo meno; un 801 de identidad, por lo menos un 85% de identidael, por lo menos un 90% de identidad y por lo menos un 95% ele identidad a la enzima oxidante del fenol que tiene ln secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: , y excluyen especificamente los aminoácidos que tienen la secuencia como se muestra en SEQ ID NO: 2, mientras que la enzima sea capaz de modificar el color asociado con los colorantes o compuestos coloreados. En una modalidad ele la composición detergente, el aminoácido comprende la secuencia como se muestra en SEQ ID NO: 4. En otra modalidad de la composición detergente, el aminoaciol" comprende la secuencia como se muestra en SEQ ID NO: 7. En otra modalidad más de la composición detergente, el aminoácido comprende la secuencia como se muestra en SE; ID NO: 9. La presente invención también abarca métodos par a modificar el color asociado con colorantes o compuesto'.? coloreados que ocurren en las manchas de una muestra, que comprende los pasos de poner en contacto la muestra cor. la composición que comprende a la enzima oxidante del fenol codificado por el ácido nucleico capaz el-hibridizarse al ácido nucleico que codifica para la enzima oxidante del fenol de Stachybotrys chartarum (que se muestra en la Figura 1 y que tiene SEQ ID NO:l) bajo' condiciones de rigurosidad intermedia a alta. Estas enzimas oxidantes del fenol tienen por lo menos un 60% de identidad, por lo menos un 65% de identidad, por lo menos un 70% de identidad, por lo menos un 75% de identidad, por lo menos un 80% de identidad, por lo menos un 85% ele identidad, por lo menos un 901 de- identidad y por le menos un 951 de identidad a la enzima oxidante del fenol que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ IE1 NO: 2, y excluye especificamente el aminoácido que tiene la secuencia como se muestra en SEQ ID NO: 2, mientras que la enzima sea capaz de modificar el color asociaele con los colorantes y compuestos coloreados. En una modalidad del método, el aminoácido comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 4. En otra modalidad, el aminoácido comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 7. En otra modalidad más, el aminoácido comprende al aminoácido que tiene la secuencia como se muestra en SEQ ID NO: 9.

Breve Descripción de las Figuras Las Figuras ÍA y IB proporcionan la secuencia genómica de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 1) que codifica para una enzima oxidante del fenol que puede obtenerse a partir de Stachybotrys chartarum. La Figura 2 proporciona la secuencia genómica (SEQ ID NO: 3) que codifica para una enzima oxidante del fenol que puede obtenerse Bipolarius spicifera . La Figura 3 proporciona la secuencia deducida de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) para una enzima oxidante del fenol que puede obtenerse de Bipolarius spicifera . La Figura 4 es una alineación de aminoácidos de la enzima oxidante del fenol que puede obtenerse a partir de ...*. . . . ._ .. . . r- -—- . 1.1W&Í Stachybotrys chartarum SEQ ID NO: 2 (linea superior y Bipolarius spicífera (SEQ ID N0:4). La Figura 5 es un ADNc (SEQ ID NO: 5) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) que se obtiene :l-Stachybotrys chartarum. La Figura 6 es una representación que se obtiene ele la técnica de hibridación Southern descrita en el Ejemplo IV. El ADN genómico se aisla a partir de las siguientes cepas: Stachybotrys chartarum (sendas 1 y 2), Myrotheciuii verrucaria (lineas 7 y 8), Curvularia pallescens (lineas 5 y 6) , Myrothecium cinctum (sendas 7 y 8), Pleurotus eryngii (lsends 9 y 10), Humicola Ínsulas (sendas 11 y 12). El ADN genómico se digiere con enzimas de restricción EcoRI (sendas 1, 3, 5, 7, 9, 11) ó Hindlll (sendas 2, 4, 6, 8, 10 y 12). La sonda ADN que se utiliza para el análisis Southern se aisla a partir del fragmente genómico de Stachybotrys chartarum generado mediante E F que cubre la parte interna de los genes de más de 1 kb en tamaño. La misma sonda ADN se utiliza en las técnicas de hibridación Southern que se ilustran en las Figuras 7, í y 9.

La Figura 7 es una representación de la técnica :1-hibridación Southern descrita en el Ejemplo IV. El APL genómico se aisla a partir de las siguientes cepas: Stachybotrys chartarum (sendasl y 2), Aspergillus nieier (sendas 3 y 4), Corpinus ciñeras (sedas 5 y ?>, Mycellophthora thermophila (sendas 7 y 8), Pleurotus abalonus (sendas 9 y 10), Trichoderma reesei (sendas 11 y 12) . ) . El ADN genómico se digiere con enzimas d-restricción EcoRI (sendas 1, 3, 5, 7, 9, 11) ó Hindlll (sendas 2, 4, 6, 8, 10 y 12). La Figura 8 es una representación de la técnica ele hibridación Southern descrita en el Ejemplo IV. El APN genómico se aisla a partir de las siguientes cepas: Stachybotrys chartarum (senda 1), Trametes vesicolor (sendas 2 y 3); Amerosporium a trum (sendas 6 y "i; Bipolaris spícifera (sendas 8 y 9); Chaetomium sp (sendas 10 y 11). El ADN genómico se digiere con enzimas ele restricción EcoRI (sendas 1, 2, 8 y 10) ó Hindlll (sendas 3, 9 y 11) . La Figura 9 proporciona la secuencia genómica ol-. ácidos nucleicos de una enzima oxidante del fenol que se puede obtener de Curvularia pallescens a partir del sitie del inicio de la traducción hasta el sitio finalizador de la traducción. La Figura 10 proporciona la secuencia deducida ole aminoácidos de la enzima oxidante del fenol que se puede 5 obtener a partir de Curvularia pallescens . La Figura 11 proporciona una alineación de aminoácidos entre la secuencia de aminoácidos que se puede obtener de Bipolaris spicifera que se muestra en SEQ ID NO: 4 (línea inferior) y Curvularia pallescens que 10 se muestra en SEQ ID NO:7 (línea superior). La Figura 12 muestra el perfil del pH de Bipolaris spicifera como se cuantifica a 470nm al utilizar Guaicol como sustrato. La Figura 13 muestra el ácido nucleico ele 15 Amerosporium a trum (SEQ ID NO: 8) y la secuencia deducida de aminoácidos (SEQ ID NO: 9). La Figura 14 proporciona -una alineación de aminoácidos entre la secuencia de aminoácidos que se obtiene de Amerosporium a trum (SEQ ID NO: 9) (línea 20 inferior) y la secuencia de aminoácidos que se obtiene ele Stachybotrys chartarum (SEQ ID NO:2) (línea superior). a£riiaÉ?a iái^l¡a-3 Descripción Detallada de la Invención Definisiones Como se utiliza en la presente, el término "enzim-oxidante del fenol" se refiere a aquellas enzimas que catalizan las reacciones rédox y que son específicas par.-, el oxígeno molecular y/o el peróxido de hidrógeno como el aceptor de electrones. Las enzimas oxidantes del fenol descritas en la presente se codifican por el acid nucleico capaz de hibridizase a SEQ ID N0:1 (que codifico. para una enzima oxidante del fenol que se obtiene partir de Stachybotrys chartarum número ATCC 38898) , o un fragmento de esta, bajo condiciones de rigurosidad intermedia a alta y que sean capaces de modificar el color asociado con el colorante o compuesto coloraelo. Estas enzimas oxidantes del fenol tienen por lo menos ui 60% de identidad, por lo menos un 65% de identidad, e lo menos un 70% de identidad, por - lo menos un 75% de identidad, por lo menos un 801 de identidad, por lo mene'S un 85% de identidad, por lo menos un 90% de identidael '__ por lo menos un 95% de identidad para la enzima oxidant-del fenol que tiene la secuencia de aminoácidos descrit en SEQ ID NO: 2 como se determina por el Programa MegAlign de DNAstar (DNASTAR; Inc. Madison, Wl 53715) por Jotun Hein Method (1990, Method in Enzymology, 183: 626-645^. Como se utiliza en la presente, Stachybctrys se refiere a cualquier especie de Stachybotrys que produo-una enzima oxidante del fenol capaz de modificar el color asociado con colorante o compuestos coloreados. Ln presente invención abarca derivados de aislamientoc naturales de Stachybotrys, que incluyen la descendencia } mutantes, siempre y cuando el derivado sea capaz d-producir una enzima oxidante del fenol capaz de modificar el color asociado con el colorante o los compuestos coloreados . Como se utiliza en la presente al referirse a las enzimas oxidantes del f^nol, el término "que se obtiene a partir de" significa las enzimas oxidantes del fenol equivalentes a aquellas que se originan a partir de o qu-se producen naturalmente por la - cepa microbiana en particular a la que se menciona. Para ejemplificar, l s enzimas oxidantes del fenol que se obtienen de Bipolar i = se refieren a aquellas enzimas oxidantes del fenol que s-producen naturalmente por Bipolaros . La presente invención abarca las enzimas oxidantes del fenol que s- producen de manera recombinante en organismos hospederos mediante las técnicas de manipulación genética. Eor ejemplo, una enzima oxidantes del fenol que se obtiene de Bipolaris puede producirse en especies de Aspergillus 5 mediante técnicas de manipulación genética. Como se utiliza en la presente, el termine "compuesto coloreado" se refiere a una sustancia qu- agrega color a los textiles y a sustancias que resultar. en una apariencia visual del tinte. Como se define en 10 Dictionary of Fiber and Textile Technology (Hoechst Celanese Corporation (1990) PO Box 32414, Charlotte Né 28232), un colrante es un compuesto coloreado que se incorpora en la fibra mediante una reacción química, aspersión, o dispersión. Los ejemplos de colorantes 15 incluyen colorantes directos de Azul, colorantes aciolos de Azul, colorantes directos de Rojo, colorantes reactivos de Azul y colorantes reactivos de Negro. Un catálogo de los colorantes textiles comúnmente utilizados se puede hallar en Colour Index, 3a edición. Vol. 1-8. 20 Los ejemplos de sustancias que resultan en la apariencia visual de tintes son los polifenoles, carotenoides, ••*ff-?r-f¡f#¿«'^-*" antocianinas, taninas, y productos de reacción d- Maillard, etc. Como se utiliza en la presente, la frase "modificar el color asociado con un colorante o un compuesto 5 coloreado" o "modificación del compuesto coloreado" significa que el colorante o compuesto se cambia mediant- la oxidación de manera tal que ya sea que el color aparezca modificado, es decir, que el color aparezca visualmente disminuido, decolorado, blanqueado, retirado 10 o deslavado, o que el color no se afecte pero que el compuesto se modifique de manera tal que se pueda inhibir la re-deposición del colorante. La presente invención abarca la modificación del color por cualquier medio qu- incluya, por ejemplo, la remoción completa del compuesto' 15 coloreado de la tinción en una muestra, tal como en un textil, mediante cualquier medio así como la reducci n de la intensidad de color o un cambio en el color olel compuesto. Por ejemplo, en las aplicaciones de papel \ pasta papelera, la la desliqnificación en la pasta 20 papelera resulta en un mayor brillo en el papel que se hace a partir de esta pasta papelera.

Como se utiliza en la presente, el término "mutantes y variantes", cuando se refiere a las enzimas oxidantes del fenol, se refiere a enzimas oxidantes del fenol que se obtienen mediante la alteración de la secuencia el-aminoácidos que ocurre naturalmente y/o la estructura el-esta, tal como mediante la alteración de la secuencia de ácidos nucleicos del gen estructural y/o mediante una sustitución directa y/o la alteración de la secuencia ele aminoácidos y/o la estructura de la enzima oxidante del fenol. El término "derivado" de enzima oxidante del fenol como se utiliza en la presente, se refiere a una porci n o fragmento de la cadena completa de la secuencia ole aminoácidos que ocurre naturalmente o variante de la enzima oxidante del fenol que retiene por lo menos algo' de la actividad de la enzima oxidante del fenol que ocurre naturalmente. Como se utiliza en la presente, el término "mutantes y variantes", cuando se refiere a cepas microbianas, se refiere a células que se cambian en alguna forma a partir de un aislamiento natural, por ejemplo, que tengan una secuencia alterada de nucleótielO'S del ADN de, por ejemplo, el gen estructural que codifica para la enzima oxidante del fenol; alteraciones a uri aislamiento natural a fin de intensificar la producción de la enzima oxidante del fenol; u otros cambios que afectan a la expresión de las enzimas oxidantes del fenol. El término "agente intensificador" o "mediador" se refiere a cualquier compuesto que sea capaz de modificar el color asociado con un colorante o un compuesto coloreado en asociación con la enzima oxidante del fenol o un compuesto que incrementa la actividad oxidativa 'd la enzima oxidante del fenol. El agente intensificador es típicamente un compuesto orgánico.

Enzimas Oxidantes del Fenol Las enzimas oxidantes del fenol de la presente invención funcionan al catalizar reacciones rédox, es decir, la transferencia de electrones a partir de un donador de electrones (usualmente un compuesto fenólico1 a oxígen molecular y/o peróxido de hidrógeno (que actúa como un aceptor de electrones) que se reduce hasta agua. Los ejemplos de estas enzimas son las lacasas (Er 1.10.3.2), bilirrubina oxidasa (EC 1.3.3.5), fenol oxidasas (EC 1.14.18.1), catecol oxidasas (EC 1.10.3.1).

La presente invención abarca las enzimas oxidantes del fenol que se obtienen a partir de bacterias, levaduras o especies de hongos que no sean de Stachybotrys, estas enzimas se codifican por un acido 5 nucleico capaz de hibridizarse al ácido nucleico como s- muestra en SEQ ID NO: 1 bajo condiciones de rigurosidad intermedia a alta, siempre y cuando la enzima sea capaz de modificar el color asociado con un colorante o un compuesto coloreado. 10 Las enzimas oxidantes del fenol que codificadas para el ácido nucleico capaz de hibridizarse a SEQ ID NO: 1, .- a un fragmento de este, se obtienen a partir d- bacterias, levaduras y especies de hongos que no sean Stachybotrys, pero no se limitan a Myrotheciuru 15 verrucaria, Curvalaria pallescens , Chaetomium sp, Bipolaris spicifera , Humicola insolens, Pleurotus abalonus, Trichoderma reesei, Mycellophthora thermophila y Amerosporium a trum. Los ejemplos ilustrativos de las enzimas oxidantes del fenol aisladas y caracterizaelas 20 codificadas por los ácidos nucleicos capaces ole hibridizarse a SEQ ID NO: 1 se proporcionan en la presente e incluyen las enzimas oxidantes del fenol que -*&^^ *l se obtienen a partir de cepas de Bipolaris spicifeí a , Curvularia pallescens , y Amerosporium a trum e incluyer las enzimas oxidantes del fenol que comprenden las secuencias de aminoácidos como se muestran en SEQ ID No : 4, SEQ ID NO: 7, y SEQ ID NO: 9, respectivamente. La secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: : representa una secuencia parcial de aminoácidos. Las cepas de Bipolaris spicifera se encuentran disponibles a partir de Centraalbureau Voor Schimmelcultures Baam (CBS) -Delft (The Netherlands' Institute of the Royal Netherlands Academy of Arts anol Sciences con número de acceso CBS: CBS 197.31; CB¿ 198.31; CBS 199.31; CBS 211.34; CBS 274.52; CBS 246.62; CBS 314.64; CBS 315.64; CBS 418.67; CBS 364.70 y CBS 586.80. Las cepas de Curvularia pallescens se encuentran disponibles a partir de la Colección Americana de Tipos de Cultivo (ATCC) e incluyen los números de acceso ATCC: ATCC 12018; ATCC 22920; ATCC 32910; ATCC 34307; ATCC 38779; ATCC 44765; ATCC 60938; ATCC 60939; y ATCC 60941.

Las cepas de Amerosporium a trum se encuentran disponibles de CBS e incluyen los números de acceso CBS, CBS 142.59; CBS 166.65; CBS 151.69; CBS 548.86. Como se entiende por el técnico diestro, pueden haber leves variaciones de aminoácidos de la enzima oxidante del fenol halladas entre la variedad de cepas depositadas de un organismo en particular. Por ejemplo', entre la variedad de cepas de Bipolaris splcíf i ? depositadas con el CBS, pueden haber secuencias ele aminoácidos que tengan un 95% o más de identidad a la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 4 y similarmente, entre la variedad de cepas de Curvulaiia pallescens que se depositan con el ATCC, pueden haber secuencias de aminoácidos que tengan un 951 o mas ole identidad a la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 7. Además, entre la variedad de cepas de Amerosporium a tri u depositadas con CBS, pueden haber secuencias de aminoácidos que tengan un 95% o mas ole identidad a la secuencia de aminoácidos que se muestra er. SEQ ID NO: 9. Por lo tanto, la presente invención abarca las enzimas oxidantes del fenol que pueden obtenerse a partir de cepas de Bipolaris spícifera que tengan por lo menos un 95% de identidad a la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 4. La presente invención también abarca a las enzimas oxidantes del fenol que ^ pueden obtener a partir de cepas de Curvularia pallescens que tengan por lo menos un 95% de identidad a la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: ". La presente invención también abarca las enzimas oxidantes del fenol que se pueden obtener a partir de cepas de Amerosporium atrium que abarcan por lo menos un 95% de identidad a la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 9. Ácidos Nucleicos que codifican para las enzimas oxidantes del fenol La presente invención abarca polinucleótidos que codifican para las enzimas oxidantes del fenol que se pueden obtener a partir de bacterias, levaduras o especies de hongos que no sean Stachybotrys cuyos polinucleótidos comprenden por lo menos un 601 de identidad, por lo menos un 65% de identidad, por lo menos un 70% de identidad, por lo menos un 75% de identidaol, por lo menos un 80% de identidad, por lo menos un 85% ole identidad, por lo menos un 90% de identidad y por 1 menos un 95% de identidad a la secuencia de polinucleótidos descrita en SEQ ID NO: 1 (como s-determina por el Programa MegAlign de DNAstar (DNASTAP, Ine Maidson, Wl 53715) por Jotun Hein Method (19':'' , Method in Enzymology, 183: 626-645) con una penalidad d-intervalo = 11, una penalidad por longitud de interval" = 3 y Alineación en Pareja de los Parámetros Ktuple = 1 siempre que la enzima codificada por el polinucleotido sea capaz de modificar el color asociado con los colorantes o los compuestos coloreados. En una modalidaei preferida, la enzima oxidante del fenol que codifica ur. polinucleótido que comprende las secuencias como se muestran en SEQ ID NO: 3. En otra modalidad preferida, la enzima oxidante del fenol se codifica por un polinucleótido que comprende la secuencia como se muestra en SEQ ID NO: 6. Incluso en otra modalidad preferida, la enzima oxidante del fenol se codifica por un polinucleótido que comprende la secuencia como se muestra en SEQ ID NO: 8. Como se entiende por el técnico diestro, debido a la redundancia del código genético, una diversidad de polinucleótidos puede codificar para la enzima oxidante del fenol descrita en SEQ ID NO: 4, SEC ID NO: 7, y SEQ ID NO: 9. La presente invención abare-, todos estos polinucleótidos. El ácido nucleico que codifica para la enzim.-oxidante del fenol pude obtenerse mediante procedimientos convencionales que se conocen en la técnica a partir ole, por ejemplo, ADN clonado (por ejemplo, una "genoteca" de ADN) , mediante síntesis química, mediante clonación ole ADNc, mediante PCR, o mediante la clonación del ADN genómico, o fragmentos de este, purificados a partir ol-una célula deseada, tal como las especies de Biopolari= , especies de Curvularia o especies de Amerosporium iVer, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, .-Laboratory Manual 2a Edición., Cold Spring Harb">? Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D. M. (de.), 1985, DNA Cloning; A Practical Approach, MPL Press, Ltd., Oxford, U. K. Vol. I, -II.). las secuencias de ácidos nucleicos derivadas del ADN genómico pueden contener regiones reguladoras además de las regiones codificadoras. Cualquiera que sea la fuente, el acido nucleico aislado que codifica para la enzima oxidante del fenol de la presente invención deberá ser molecularment clonado en un vector adecuado para la propagación del gen. En la clonación molecular del gen del ADN genomic o, los fragmentos de ADN se generan, algunos de los cuales 5 codifican para el gen deseado. El ADN puede desdoblarse en secuencias específicas al utilizar diversas enzimas de restricción. Alternativamente, uno puede usar el ADNasa en presencia de manganeso para fragmentar el ADN, o el ADN puede escindirse físicamente mediante por ejemplo-, 10 tratamiento por sonido. Los fragmentos de ADN lineales luego se pueden separar según su tamaño mediante tecnie as convencionales, que incluyen pero no se limitan a, electroforesis en agarosa o gel de poliacrilamida, PCR y cromatografía en columna. 15 Una vez que se generan los fragmentos de áciclo= nucleicos, la identificación del fragmento especifico de ADN que codifica para la enzima oxidante del fenol pueele lograrse mediante una variedad de formas. Por ejemplo, un gen que codifica para la enzima oxidante del fenol de la 20 presente invención o su ARN específico, o un fragmento de este, tal como un cebador o una sonda, puede aislarse y marcarse y luego utilizarse en las valoraciones ole "•^-»-- • hibridación para detectar un gen que se genera. (Benton, W y Davis, R. , 1977, Science 196: 180; Grunstein, M y Hogness, D. , 1975, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 72: 39 ? 1 '< . Aquellos fragmentos de ADN que comparten una similituo sustancial de secuencias para la sonda se hibridan bajo-condiciones rigurosas. La presente invención abarca las enzimas oxidantes del fenol codificadas por el ácido nucleico identificad: a través de la técnica de hibridación de ácidos nucleicos al utilizar SEQ ID NO: 1 a manera de una sonda o cebador y detectar los ácidos nucleicos ya sea de origen genómico' o de ADNc. El ácido nucleico que codifica para las enzimas oxidantes del fenol que se obtiene de bacterias, levaduras o especies de hongos que no sean de Stachybotrys y que tienen por lo menos un 60% de identidad a SEQ ID NO: 1 pueden detectarse mediante hibridación o amplificación de ADN-ADN ó ADN-ARN al utilizar sondas, porciones o fragmentos de SEQ ID NO: 1. En consecuencia, la presente invención proporciona un método para la detección del ácido nucleico que codifica para una enzima oxidante del fenol incluidos por la presente invención que comprende hibridizar parte o la „..«_,..j¡Lnc totalidad de la seucuncia de ácidos nucleicos de SEQ IE NO: 1 con los ácidos nucleicos de Stachybotrys ya sea de origen genómico o de ADNc. También se incluyen dentro del alcance de la presente invención las secuencias de polinucleótidos que son capaces de hibridizarse a la secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID NO: 1 bajo condiciones de rigurosidaoi intermedia a máxima. Las condiciones de hibridación est n basadas en la temperatura de fusión (Tm) del complejo ole aglutinación de ácidos nucleicos, como se muestra en Berger y Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academio Press, San Diego CA) incoprorado en la presente para ? referencia, y confieren una "rigurosidad" definida como se explica a continuación. La "rigurosidad máxima" ocurre típicamente en aproximadamente Tm-5°C (5°C por debajo de Tm de i a sonda); la "alta rigurosidad" en aproximadamente 5"C hasta de 10 °C por debajo de Tm; la "rigurosidad intermedia" en aproximadamente 10 °C hasta 20 °C por debajo de Tm; y una "baja rigurosidad" en aproximadamente 20 JC hasta 25 °C por debajo de Tm. Por ejemplo en la presente ««^aM—Málit invención las siguientes son las condiciones para una alta rigurosidad: la hibridación se lleva a cabo a 37oC en un amortiguador que contiene 50% formamida, 5x SSEE, 0.51 SDS y 50 ug/ml de ADN fragmentado con Herring. El lavado se lleva a cabo a 65oC durante 30 minutos en presencia de 1 x SSC y 0.1% de SDS una sola vez, a 65oC durante 30 minutos en presencia de 0.5 x SSC y 0.1% de ?DS una sola vez y a 65oC durante 30 minutos en presencia de 0.1 x SSC y 0.1% de SDS una sola vez; las siguientes son condiciones de una* rigurosidad intermedia: la hibridación se lleva a cabo a 37oC en un amortiguador que contiene25% de formamida, 5x SSPE, 0.5% SDS y 50 ug/ml d-ADN fragmentado con Herring. El lavado se lleva a cabo a 50oC durante 30 minutos en presencia de 1 x SSC y 0.1% de SDS una sola vez, a 50oC durante 30 minutos en presencia de 0.5 x SSC y 0.1% de SDS una sola vez; las siguientes son condiciones de una ba*a riguros-idad: la hibridación se lleva a cabo a 37oC en un amortiguador que contiene 25% de formamida, 5x SSPE, 0.51 SDS y 50 ug/ml de AD1J fragmentado con Herring. El lavado se lleva a cabo a 37oC durante 30 minutos en presencia de 1 x SSC y 0.11 SDS una sola vez, a 37oC durante 30 minutos en presencia de 0.5 :- SSC y 0.11 de SDS una sola vez. Un ácido nucleico capaz de hibridarse a una sonda de ácido nucleicobaj e condiciones de una alta rigurosidad tiene aproximadamente un 801 hasta un 100% de identidad a la sonda; un aciel: 5 nucleico capaz de hibridarse a una sonda de aciol: nucleico bajo condiciones de una rigurosidad intermeoli que tiene aproximadamente un 50% hasta aproximadamente 801 de identidad a la sonda. El término " hibridación" como se utiliza en la presente 10 debe incluir "el proceso mediante el cual una cadena ole ácidos nucleicos se une a una cadena complementaria a través de un pareo de bases" (Coombs J (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York NY) . El proceso de amplificación se lleva a cabo mediante la 15 tecnología de reacción en cadena de la polimerasa (PCF'.' como se describe en Dieffenbach CW y GS Dvekster (1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, - Cold Spring Harboi Press, Plainview NY) . Una secuencia de ácidos nucleicos de por lo menos aproximadamente 10 nucleótidos y hasta 20 aproximadamente 60 nucleótidos de SEQ ID NO: 1 preferiblemente desde aproximadamente 12 hasta j? nucleótidos, y más preferiblemente de aproximadamente 2 * jí g^ggfojfea^a^gí^fea nucleótidos se pueden utilizar como una sonda o u: cebador PCR. Un método preferido para aislar la estructura de ácidos nucleicos de la invención de un ADNc o una genoteca mediante el uso de la reacción en cadena de la polímera .-. (PCR) al utilizar sondas de oligonucleótidos que s-preparan en base a una secuencia de polinucleótidos cc>n?>_ se muestra en SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, el PCR puede llevarse a cabo utilizando técnicas descritas en el No. de Patente de E. U. A. 4,683,202.

Sistemas de Expresión La presente invención proporciona células hospederas, métodos de expresión y sistemas para la producción de las enzimas oxidantes del fenol que se obtienen de bacterias, levaduras o de especies de hongos que no sean de Stachybotrys en microorganismo'.? hospederos. Estos microorganismos hospederos incluyen hongos, levaduras y especies bacterianas. Una vez que se obtiene un ácido nucleico que codifica para una enzima oxidante del fenol de la presente invención, las células hospederas recombinantes que contienen el ácido nucleic <_ pueden estructurarse al utilizar metodologías que se conocen bien en la técnica. Las técnicas de biología molecular se describen en Sambrook et al., Molecular Biology Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Sprimg Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989). El ácido nucleico que codifica para la enzima oxidante del fenol de la presente invención se obtiene y se transforma en una célula hospedera al utilizar vectores apropiados. Se conocen por aquellos diestros en la técnica una diversidad de vectores y cassettes de transformación y expresión para clonación, para la transformación y expresión en hongos, levaduras y bacterias . De manera típica, el vector o cassette contiene secuencias que dirigen la transcripción y traducción del ácido nucleico, un marcador seleccionable, y secuencias gue permiten una replicación autónoma o una integración cromosómica. Los vectores adecuados comprenden la región 5' del gen que alberga los controles del inicio de la transcripción y una región 3' del fragmento de ADN que controla la terminación de la transcripción. Estas regiones de control pueden derivarse de genes homólogos o heterólogos al hospedero siempre que la reacción de control que se seleccione sea capaz de funcionar en la célula hospedera. Los promotores o las regiones del control de la iniciación, que son útiles para promover la expresión de las enzimas oxidantes del fenol en una célula hospedera se conocen por aquellos diestros en la técnica. Virtualmente cualquier promotor capaz de controlar esta enzima oxidante del fenol es adecuado para la presente invención, los ácidos nucleicos que codifican para la enzima oxidante del fenol están ligados de manera operable mediante los codones de inicio hacia regiones seleccionadas para el control de la expresión para una expresión efectiva de estas enzimas. Una vez que se estructuran los cassettes adecuados, se utilizan para transformar la célula hospedera. Los procedimientos generales de transformación se muestran en Current Protocols in Molecular Biology (vol. 1, editado por Ausubel et al., John Wiley & Sons, Ine. 1987, Capítulo 9) e incluyen los métodos de fosfato de calcio, la transformación al utilizar PEG y electroporación. Para Aspergillus y Trichoderma, se ¡?g^^ pueden utilizar el PEG y la transformación de protoplastos mediada por calcio (Finkelstein, DB 1991 Transformation. In Biotechnology of Filamentous Fungi. Technology and Products (editados por Finkelstein & Bill 113-156. La electroporación del protoplasto se describe en Finkelestein, DB 1992 Transformation. In Biotechnolog of Filamentous Fungi. Technology and Products (editados por Finkelstein & Bill) 113-156. El bombardeo por microproyectiles en conidia se describe en Fungaro et al. (1995) Transformation of Aspergillus nidulans by microprojection bombardment on intact conidia. FEMS Microbiology Letters 125 293-298. La transformación mediada por Agrobacterium se describe en Groot et al. (1998) Agrobacterium tumefaciens-mediated trans format ion of filamentous fungi. Nature Biotechnology 16 839-841. Para la transformación de Saccharomyces, la transformación mediada por acetato de litio y PEG y i a transformación del protoplasto mediada por calcio asi como las técnicas de electroporación se conocen por aquellos de destreza en la técnica. Las células hospederas pueden contener la secuencia codificadora para la enzima oxidante del fenol de la presente invención y la expresión de la proteína puede identificarse mediante una diversidad de procedimientos conocidos por aquellos diestros en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN y técnicas de bioensaye proteico o inmunoensayo que incluyen las tecnologías basadas en membranas, basadas en soluciones, o basadas en microcircuitos para la detección y/o cuantificación del ácido nucleico o proteína.

Actividades de la enzima oxidante del fenol Las enzimas oxidantes del fenol de la presente invención son capaces de utilizar una amplia variedad de diferentes compuestos fenólicos como donantes de electrones, mientras que son muy específicas para el oxígeno molecular como el aceptor de electrones y/o el peróxido de hidrógeno como el aceptor de electrones . Dependiendo del sustrato específico y las condiciones de reacción, por ejemplo, temperatura, presencia o ausencia de agentes intensificadores, etc., cada reacción de oxidación para la enzima oxidante del fenol tiene un pH óptimo.

Las enzimas oxidantes del fenol de la presente invención son capaces de oxidar una amplia variedad ele colorantes o compuestos coloreados que tengan diferentes estructuras químicas, al utilizar oxígeno y/o peróxido d-hidrógeno como el aceptor de electrones. En consecuencia las enzimas oxidantes del fenol de la presente invención se utilizan en aplicaciones en donde es deseable modificar el color asociado con los colorantes o los compuestos coloreados, tal como la limpieza, para retir r las manchas de comida sobre el textil y una redeposición anti-colorante; textiles; y aplicaciones de papel y pasta papelera.

Compuestos Coloreados En la presente invención, una amplia variedad de compuestos coloreados pueden ser objetivos para la oxidación de las enzimas oxidantes del fenol de la presente invención. Por ejemplo, en las aplicaciones ele detergentes, las sustancias coloreadas que pueden ocurrir como manchas sobre la tela pueden ser un objetivo. Diversos tipos o clases de sustancias coloreadas pueden aparecer como manchas, tales como las estructuras derivadas de la porfirina, tales como la hemoglobina en las manchas de sangre o la clorofila en plantas; taninos y polifenoles (ver P. Ribéreau-Gayon, Plant Phenolics, Editor. Oliver Boyd, Edinburgh, 1972, pp. 169-198> que 5 ocurren en las manchas por té, manchas por vino, manxhas por plátano, manchas por durazno; carotenoides, la.0 sustancias coloreadas que ocurren en el tomate (licopeno, rojo), mango (caroteno, amarillo-naranja) (G. E. Bartley et al., The Plant Cell (1995), Vol. 7, 1027-1038); 10 antocianinas , las moléculas muy coloreadas que ocurren en varias frutas y flores (P. Ribéreau-Gayon, Plant Phenolics, Ed. Oliver & Boyd, Edinburgh, 1972, pp.135- 169); y los productos de la reacción de Maillard, las sustancias coloreadas con amarillo/café que aparecen al 15 calentar mezclas de moléculas de carbohidratos en presencia de estructuras de proteína/péptidos, tales como las que se hayan en el aceite para cocinar. Los pigmentos se describen en Kirk - Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, Tercera edición Vol. 17; página 788-889, una 20 publicación de Wiley-Interscience. John Wiley & Sons y los colorantes se describen en Kirk - Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, Tercera edición Vol. , - -*--. *- ±, - - • -—'~—¿-8, una publicación de Wiley-Interscience. John Wiley s Sons .

Agentes Intensificadores Una enzima oxidante del fenol de la presente invención puede actuar para modificar el color asociado con los colorantes o los compuestos coloreados er. presencia o ausencia de aentes intensificadores dependiendo de las características del compuesto. Si ur. compuesto es capaz de actuar como un sustrato directo para la enzima oxidante del fenol, la enzima oxidante olel fenol puede modificar el color asociado con un colorante o un compuesto coloreado en ausencia de un agente intensificador, aunque el agente intensificador aun se prefiere para una actividad óptima de la enzima oxidante del fenol. Para otros compuestos coloreados- incapaces de actuar como un sustrato directo para la enzima oxidante elel fenol o que no son directamente accesibles para la enzima oxidante del fenol, se requiere un agente intensificador para la actividad óptima de la enzima oxidante del fenol y una modificación del color.

. - .. .*..**. Los agentes intensificadores se describen por ejemplo en WO 95/01426 publicado el 12 de Enero de 1995; WO 96/06930, publicado el 7 de marzo de 1996; y . 97/11217 publicado el 27 de marzo de 1997. Los agentes intensificadores incluyen pero no se limitan al acido fenotiazin-10-propiónico (PPT) , 10-metilfenotiazinaa (MPT) , ácido fenoxazin-10-propiónico (PPO) , 10-metilfenoxazina (MPO), acetosiringona de ácido 10-etilfenotiazin-4-carboxílico (EPC) , siringaldehido, metilsiringato, 2, 2' -azino-bis (3-etilbenzotiazolin-ó-sulfonato (ABTS) y ácido 4-hidroxi-4-bifenil-carboxilico.

Cultivos La presente invención abarca las enzimas oxidantes del fenol que se obtienen a partir de hongos incluyendo pero no limitándose a especies de Myrothecium, especies de Curvalaria, especies de Chaetomium, especies de Bipolaris, especies de Humicola, especies de Pleurotus, especies de Trichoderma, especies de Mycellophthora y especies de Amerosporium. En particular, los hongos-incluyen pero no se limitan a Myrothecium verrucaria, Curvalaria pallescens, Chaetomium sp, Bipolar is spicifera, Humicola insolens, Pleurotus abalonus, Trichoderma reesei, Mycellophthora thermophila ;_ Amerosporium a trum. Además de los ejemplos ilustrativos proporcionados en la presente, otros ejemplos de las especies anteriores incluyen Myrothecium verrucaria que tiene un número de acceso ATCC 36315; Pleurotus abalonus que tiene un número ATCC de acceso 96053; Hu icola insolens que tiene un número ATCC de acceso 22061; Mycellophthora thermophila que tiene un número de acceso ATCC 48104; y Trichoderma reesei que tiene un número ole acceso ATCC 56765.

Purificación Las enzimas oxidantes del fenol de la present -invención pueden producirse mediante el cultivo de las cepas productoras de la enzima oxidante del fenol bajo condiciones aeróbicas en un medio nutritivo que contiene carbono asimilable y nitrógeno junto con otros nutrientes esenciales. El medio puede componerse en conformidad con los principios que se conocen bien en la técnica. Durante el cultivo, las cepas productoras de la enzima oxidante del fenol secretan la enzima oxidante del fenol de manera extracelular. Esto permite el aislamien : y purificación (recuperación) de la enzima oxidante del fenol para lograrse, mediante por ejemplo, la separación de la masa celular a partir del caldo de cultivo (r-r ejemplo mediante filtración o centrifugación) . El calcl: de cultivo libre de células se puede utilizar como tal o, si se desea, primero se puede concentrar (por ejemplo mediante la evaporación o ultrafiltración) . Si se desea, la enzima oxidante del fenol luego puede separarse del caldo libre de cultivo y purificarse hasta el graol'-deseado mediante métodos convencionales, por ejemplo mediante una cromatografía en columna, o inclus: cristalizarse. Las enzimas oxidantes del fenol de la presente invención pueden aislarse y purificarse a partir del caldo de cultivo en el cual se secreta extracelularmente mediante la concentración del sobrenadante del cultivo hospedero, luego de una fraccionación por sulfato de amonio y una cromatografía de permeabilidad en gel. Como se describe en la presente en el Ejemplo I para la enzima oxidante del fenol de Stachybotrys chartarum, las enzimas oxidantes del fenol de la presente invención se pueden purificar y someterse a técnicas convencionales para la secuenciación proteica. Los cebadores de oligonucleotidos pueden designarse basándose en la secuencia proteica y utilizarse en el PCR para aislar al ácido nucleico' que codifica para la enzima oxidante del fenol. La enzima oxidante del fenol puede caracterizarse e introducirse en las células hospederas para su expresión. En consecuencia, la presente invención abarca los vectores de expresión y las células hospederas recombinantes que comprenden una enzima oxidante del fenol de la presente invención y una purificación subsecuente de la enzima oxidante del fenol a partir de la célula hospede a recombinante . Las enzimas oxidantes del fenol de la presente invención se pueden formular y utilizar según su aplicación pretendida. En este respecto, si se utilizan en una composición de detergente, una enzima oxidante elel fenol se puede formular, directamente a partir del caldo de fermentación, a manera de un sólido recubierto al utilizar el procedimiento descrito en la Patente de Cartas de los Estados Unidos de Norteamérica No. 4,689,297. Más aún, si se desea, la enzima oxidante olel fenol puede formularse en forma líquida con un vehículo adecuado. La enzima oxidante del fenol puede también inmovilizarse, si es que se desea.

Valoraciones para la Actividad de la Oxidación del Fenol Las enzimas oxidantes del fenol pueden valorarse ?o? ejemplo mediante su actividad ABTS como se describe en el Ejemplo II o mediante el método de deslignificación como se describe en el Ejemplo III o el método de detergentes conocidos por aquellos de destreza en la técnica.

Composiciones de Detergentes Una enzima oxidante del fenol de la presente invención se puede utilizar en las composiciones ole detergentes o de limpieza. Estas composiciones pueden comprender, además de la enzima oxidante del fenol, ingredientes convencionales de detergentes tales como agentes surfactantes, agentes estructuradores y otras enzimas tales como, por ejemplo, proteasas, amilasas, lipasas, cutinasas, celulasas o peroxidasas. Otros ingredientes incluyen agentes intensificadores, agentes estabilizadores, bactericidas, abrillantadores ópticos y perfumes. Las composiciones de detergentes pueden tener cualquier forma física adecuada, tal como polvo, un liquido acuoso o no acuoso, una pasta o gel. Los ejemplos de composiciones de detergentes se dan en WO 95/01429, publicado el 12 de enero de 1995 y WO 96/06930 publicado el 7 de marzo de 1996. Habiendo así descrito las enzimas oxidantes del fenol de la presente invención, los siguientes ejemplos ahora se presentan para el propósito de ilustración y no deben de leerse ni quieren dar a entender o ser restrictivos. Las diluciones, cantidades, etc., que se expresan en la presente en términos de porcentaje son, a menos de que se especifique de otra forma, porcentajes que se dan en términos de peso porcentual por volumen (p/v). Como se utiliza en la presente, las diluciones, cantidades, etc., se expresan en términos de % (v/v), se refieren al porcentaje en términos de volumen por volumen. Las temperaturas a las que se refiere en la presente se dan en grados centígrados ( C) . Todas las patentes y publicaciones a las que se hace referencia en la presente se incorporan en la presente para su referencia.

Ejemplo 1 Producción de la enzima oxidante del fenol de Stachybotrys chartarum Se cultiva Stachybotrys chartarum con número de acceso ATCC 38898 en placas PDA (Difvo) durante aproximadamente 5-10 días. Una porción de la placa de cultivo (aproximadamente de 1.9 cm x 1.9 cm) se utiliza para inocular 100 ml de PDB (caldo de dextrosa de pap>a^ en un matraz de agitación de 500 ml. El matraz se incuba a 26-28°C, 150 rpm, durante 3-5 días hasta que se obtiene un buen cultivo. El caldo de cultivo luego se inocula en 1 L de PDE en un matraz de agitación de 2.8 L. el matraz se incuba a 26-28°C, 150 rpm, durante 2-4 días hasta que se obtiene un buen cultivo. Un fermentador de 10 L que contiene un medio de producción se prepara (que contiene en gramos/litros los siguientes componentes: glucosa 15; lecitina 1.51; acido t-aconítico 1.73; KH2P04 3; MgS04 . 7H20 0.8; CaCl2 . 2Hy 0.1; tartrato de amonio 1.2; peptona de soya 5; Staley 7359; alcohol bencílico 1; tween 20 1; acido' nitrilotriacético 0.15; MnS04 . 7H20 0.05; NaCl 0.1; FeS0 . 7H0 0.01; C0SO4 0.01; CaCl2 . 2H20 0.01; ZnS04 . 7H; 0.01; CuS04 0.001; ALK(S04)2 - 12H20 0.001; H3BO3 0.ÚU1; NaMo04 . 2H20 0.001). Luego el termentador se inocula cc>n 1 L del caldo de cultivo, y la fermentación se lleva a cabo a 28 °C durante 60 hora, bajo un flujo de aire constante de 5.0 litros/min y una agitación constante de 120 RPM. El pH se mantiene a 6.0. La presencia de la actividad de la enzima oxidante del fenol en el sobrenadante se cuantifica utilizando el siguiente procedimiento de valoración, basándose en la oxidación de ABTS (2, 2' -azino-bis (3-etilbenzotiazolin-ó-sulfonato) ) mediante el oxígeno. ABTS (SIGMA, 0.2 ml, 4.c mM H0) y NaOAc (1.5 ml, 120 mM en H20, pH 5.0 ) se mezcl i en un contenedor. La reacción comienza mediante la adición de una cantidad apropiada de la preparación a ser cuantificada (que en este es la dilución del sobrenadante) para formar una solución final de 1.8 ml . El color que se produce mediante la oxidación de ABTC luego se cuantifica cada 2 segundos durante un period: total de 14 segundos al registrar la densidad óptica (OP' a 420 nm, utilizando un espectrofotómetro. Una unidad ABTS (una unidad enzimática o EACU) en este ejemplo c-define como el cambio en el OD cuantificado a 420 por minuto/2 (dando ninguna dilución a la muestra) . De esta forma una actividad de la enzima oxidante del fenol de 3.5 EACU/ml de un sobrenadante del cultivo se pued-cuantificar . El sobrenadante resultante luego se retira olel sedimento y se concentra hasta 0.6 litros mediante ultrafiltración al utilizar una unidad de ultrafiltracion Amicon equipada con una membrana YM10 que tenga un cierre de 10 kD. Un volumen de 1.4 litros de acetona se agrega al concentrado y se mezcla con este. La mezcla resultante luego se incuba durante dos horas a 20-25°C. Después de la incubación, la mezcla se centrifuga durante 30 minutos a 10,000 g y el sedimento resultante se retira del sobrenadante. El sedimento luego se vuelv-a suspender en un volumen final de 800 ml de agua.

La suspensión resultante luego se somete a una fraccionación de sulfato de amonio como sigue: el sulfato de amonio cristalino se agrega a la suspensión a una saturación del 401 y la mezcla se incuba a 4°C durante 1» 5 horas con una agitación magnética suave. La mezcla luego se centrifuga a 10,000 g durante 30 minutos y el sobrenadante se retira del sedimento de centrifugación para un uso posterior. Luego se agrega el sulfato de amonio al sobrenadante para alcanzar un 80% de 10 saturación, y la mezcla se incuba a 4°C durante 16 horas con una agitación magnética suave. Luego la suspensión se centrifuga durante 30 minutos a 10,000 g y el sedimento resultante se retira del sobrenadante. Luego el sedimento se vuelve a suspender enl5 ml de agua y se concentra 15 hasta 6 ml mediante ultrafiltración al utilizar ur. CENTRIPREP 3000 (AMICON) . La actividad de la enzima oxidante del fenol de la suspensión luego se cuantifica al utilizar el procedimiento convencional de valoración, basándose en la 20 oxidación del ABTS por el oxígeno, como se describe anteriormente (pero con la excepción de que la preparación que se valora es la concentración —»"-— -——-t— - '*" resuspendida y no las diluciones del sobrenadante). La actividad de la enzima oxidante del fenol que se cuantifica es de 5200 EU/ml. Luego la enzima se purifica aún más mediante una cromatografía por impregnación en gel. A este respecto, una columna que contiene 850 ml de SEPHACRYL S400 ALTA RESOLUCIÓN (PHARMACIA) se equilibra con un amortiguador que contiene 50 mM KH2P04/KH2P04 (pH = 7.0) y luego se carga con el resto de la suspensión de 6 ml descrita anteriormente, y se eluye con el amortiguador que contiene 50mM KH2PO4/K2HPO4 (pH = 7.0), a una velocidad de flujo de lml/minuto. Luego se obtienen las fracciones respectivas . Las fracciones respectivas que contienen las mayores actividades de la enzima oxidante del fenol se agrupan juntas, proporcionando una suspensión de 60 ml que contiene la enzima oxidante del- fenol en estado-purificado. La actividad de la enzima oxidante del fenol de la suspensión luego se cuantifica basándose en la oxidación del ABTS por el oxígeno. La actividad enzimática que se cuantifica es de 390EU/ml. La enzima oxidante del fenol de Stachybotrys chartarum que se prepara como se describe anteriormente se somete a una electroforesis SDS en gel de poliaxrilamida y se aisla. La fracción aislada se somete a tratamiento con urea y yodoacetamida y se 5 digiere por la enzima endoLysC. Los fragmentos resultantes de la digestión por endoLysC se separan mediante HPLC (columna de fase inversa monobore C16, gradiente CH3CN) y se recolecta en una placa de multi- titulación. Las fracciones se analizan mediante MALPI 10 para la determinación de masa y se secuencian por medio de la degradación de Edman. Las siguientes secuencias ole aminoácidos se determinan y se muestran en una orientación de amino-término a carboxi-término: 15 N' DYYFPNYQSARLLXYHDHA C N' RGQVMPYESAGLK C Dos cebadores degenerados se designan basándose en 20 la secuencia de péptidos. El cebador 1 contiene la siguiente secuencia: TATTACTTTCCNAAYTAYCA en donde N representa una mezcla de todos los cuatro nucleótidos (A, - *^^ Am)^h^. & , T, C y G) e Y representa una mezcla de T y C solamente. El cebador 2 contiene la siguiente secuencia: TCGTATGGCATNACCTGNCC. Para el aislamiento del ADN genómico que codifica para la enzima oxidante del fenol, el ADN aislado a partir de (MUCL # 38898) se utiliza como un molde para PCR. El ADN se diluye 100 veces con amortiguador Tris-EDTA a una concentración final de 88ng/ul. Se agregan l'1 microlitros de ADN diluido a la mezcla de reacción que contiene 0.2mM de cada nucleótido (A, G, C y T) , lx de amortiguador de la reacción, 0.296 microgramos del cebador 1 y 0.311 microgramos del cebador 2 en un total de 10 microlitros de reacción. Después de calentar la mezcla a lOOoC durante 5 minutos, se agregan 2.5 unidades de ADN polimerasa Taq a la mezcla de reacción. La reacción PCR se lleva a cabo a 95oC durante 1 minuto, los cebadores se fijan en el molde a 45ÓC durante 1 minuto y la extensión se lleva a cabo a 68oC durante 1 minuto. Este ciclo se repite 30 veces para lograr un fragmento PCR visible en gel. El fragmento PCR que se detecta mediante el gel de agarosa contiene un fragmento de aproximadamente 1 kílobase que luego se clona en e-l -Mrr-i-irr»' vector plásmido pCR-II (Invitrogen). El inserto de 1 kr luego se somete a una secuenciación de ácidos nucleicos. Los datos de secuenciación revelan que es el gen que codifica para Stachybotrys chartarum debido a que la secuencia deducida de péptidos iguala a las secuencia de péptidos descritas anteriormente que se secuencian poi medio de la degradación de Edman. Los fragmentos PCR que contienen el gen 5' y el gen 3' luego se aislan y se secuencian. La Figura 1 proporciona la secuencia genomica de cadena completa (SEQ ID NO: 1) de Stachybotrys oxidasa que incluyen las secuencias promotoras y terminadoras .

Ejemplo II El siguiente ejemplo describe la valoración ABTS utilizada para la determinación de la actividad oxidante del fenol. La valoración ABTS es una valoración de la actividad espectrofotométrica que utiliza los siguientes reactivos: amortiguador de valoración = 50 acetato sódico, pH 5.0; 50 mM de fosfato sódico, pH 7.0; 50 mil carbonato sódico, pH 9.0. el ABTS (ácido 2, 2' -azinobis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) es una solución de 4.5 mM en agua destilada.

Se combinan 0.75 ml del amortiguador de valoración y 0.1 ml ABTS de la solución en sustrato, se mezcla y se agregan a un contenedor. El contenedor que contiene la solución de amortiguador ABTS se utilizan como un testigo en blanco. Se agregan 0.05 ml de las muestras de enzima, se mezcla rápidamente y se colocan en el contenedor que contiene la solución de a ortiguador-ABTS . La velocidad del cambio en la absorbancia a 420 nm se cuantifica, DOE' 420/minuto, durante 15 segundos (o más para muestras que tienen velocidades de actividad < 0.1) a 30 °C. Las muestras de enzimas que tienen una alta velocidad ole actividad se diluyen con el amortiguador de valoración a un nivel entre 0.1 y 1.

Ejemplo III En este ejemplo se utiliza un protocolo para el blanqueo de pasta papelera en un matraz de agitación para determinar la actividad de las enzimas oxidantes del fenol . El amortiguador que se usa es acetato de Na 50 mM, pH 5 ó 50 mM de Tris pH 8.5, madera blanda, y se utiliza también pasta papelera deslignificada con oxígeno con a de kappa de 17.3. La enzima se dosifica a 10 ABTS unidades por gramo de pasta papelera. La valoración puede llevarse a cabo con o sin mediadores, tales como aquellos descritos infra. Se colocan 250 ml del amortiguador pre-calentado en un cilindro graduado. 10 g de la pasta aguada papelera una humedad del 72% = 2.8 g de pasta papelera seca) se colocan en una licuadora convencional de cocina con ur. amortiguador de 120 ml . La pasta papelera se licúa a la mayor velocidad durante aproximadamente 30 segundos. La pasta aguada resultante se coloca en un matraz ele agitación de boca grande (la pasta papelera residual se enjuaga de la licuadora con el resto del amortiguador y una espátula) lo que resulta en aproximadamente una consistencia de 1% en el matraz (2.8 g/250 ml) . El mediador +/- de la enzima se agrega y los testigos sin enzima se incluyen en la valoración. La abertura del matraz se cubre con una gasa de grosor 2 y se asegura con una banda elástica. Los matraces se colocan a un agitador y se incuban durante 2 horas a ~55°C y 350 rpm.

Al final del tiempo de incubación, 500 mis de ic NaOH se agregan directamente sobre los matraces y la temperatura del agitador se regula a 70 °C y se le permite incubar durante .5 horas a 250 rpm. Los contenidos del matraz se filtran a través de embudos buchner. Las pastas aguadas papeleras se vierten lentamente en los embudos, sin vacío y se les permite gotear lentamente lo cual establece una capa de filtración dentro del embudo. Una vez que la mayor parte de los contenidos del matraz están dentro del embudo, se aplica un leve vacio para jalar el material en una masa aglutinada dentro del embudo. El producto futrado (líquido) se vierte de nuevo en el matraz de agitación original y se arremolina para lavar la pasta papelera residual de los lados. El producto filtrado se vierte de nuevo encima de la torta de filtración. El resultado final es -un filtrado bastante claro con un color ligeramente dorado con la mayor paite de la pasta papelera atrapada en el embudo. La torta ele filtración se lava sin un vacío, al verter suavemente un litro de agua DI sobre la torta de filtración y dejar que gotee por sí misma. Se aplica un vacío solamente al final para aspirarla y que quede la torta seca. Las tortas de filtración se secan en los embudos durante la noche en un horno a lOOrC. La pasta papelera seca se raspa manualmente de los embudos enfriados al día siguiente. Las determinaciones Microkappa basadas en el método de Scandinavian Pulp, Paper and Board Testing committe Scan-c 1: 77 (The Scandinavian Pulp, Paper and Board Testing committee Box 5604, S-114, 86 Estocolmo, Suecia) se llevan a cabo para determinar el % de deslignificacion.

Ejemplo IV El Ejemplo IV describe la técnica de hibridación Southern que se utiliza para identificar los genes homólogos de otros organismos. El ADN genómico de diversas cepas de hongos que incluye Stachybotrys chartarum, Myrothecium verruvaria, Myrothecium cinctum, Curvalaria pallescens , Humicola ínsulas, Pleurotus eryngii, Pleurotus abalonus, Aspergillus niger, Corpinus ciñeras, Mycellophthoa'a thermophila, Trichoderma reesei, Trametes versicolor, Chaetomium sp, y Bipolaris spicífera se aisla. Las especies de hongos se cultivan ya sea en medio CSL (descrito en Dunn-Coleman et al., 1991, Bio/Technology 9: 976-981) o medio MB (glucosa 40 g/1; soytone 10 g 1; elementos traza MB 1 ml/L a pH 5.0) durante 2 a 4 días. Los micelios se cultivan al filtrarse a través de Mirocloth (Calciochem) . El ADN genómico se extrae a partir de las células mediante una extracción repetida con fenol/cloroformo según el protocolo de purificación de ADN genómico (Hynes MJ, Corrick CM, King JA 1983, Mol Cell Biol 3: 1430-1439). Se digieren 5 microgramos de APN genómico con enzimas de restricción EcoRI ó HindIII durante la noche a 37oC y los fragmentos de ADN se separan en gel de agarosa al 1% mediante electroforesis en un amortiguador TBE. Los fragmentos de ADN luego se transfieren del gel de agarosa a una membrana de Nitrocelulosa en un amortiguador 20XSSC. La sonda que se utiliza para el análisis Southern se aisla a partir de plásmidos de Stachybotrys (SEQ ID NO: 1) o un fragmento de ADN generado mediante una reacción PCR que cubre la parte interna de los genes de más de 1 kb en tamaño. Los cebadores que se utilizan para generar el fragmento E CP son el Cebador 1 que contiene la siguiente secuencia: TATTACTTTCCNAAYTAYCA -en donde N representa la mezcla de los cuatro nucleótidos (A, T, C, y G) e Y representa una mezcla de T y C solamente y el Cebador 2 contiene la siguiente secuencia: TCGTATGGCATNACCTGNCC. Las hibridaciones Southern se llevan a cabo durante 18 a 2¡ 5 horas a 37 °C en un amortiguador de hibridación de rigurosidad intermedia que contiene 25% de formamida, 5:-. SSPE, 0.5% SDS y 50 ug/ml de ADN fragmentado de Herring. Las transferencias se lavan una sola vez a 50 °C durante 30 minutos en presencia de 1 x SSC y 0.1% SDS y se lavan 10 otra vez a 50 °C durante 30 minutos en 0.5 x SSC y 0.1° SDS. Las transferencias Southern se exponen a una película de rayos-X durante más de 20 horas y hasta 1 días. Las Figuras 6, 7 y 8 muestran los ADN genómicos de diversas especies de hongos que contienen secuencias que 15 son capaces de hibridizarse bajo condiciones descrit s anteriormente para los ácidos nucleicos que codifican para la enzima oxidante del fenol de" Stachybotrys que se muestra en SEQ ID NO: 1. Estas especies de hongos dan la señal más fuerte (que puede indicar una mayor identidad a 20 la sonda de ácidos nucleicos que aquellas que tienen una señal más débil) y son Myrothecium verrucaria, Curvalapa pallescens , Chaetomium sp, Bipolaris spicifera , y MfáiliáiÜÜilißiriláMÍi-Amerosporium a trum. Las especies de hongos también se hibridizan al ácido nucleico que codifica para la enzima oxidante del fenol de Stachybotrys se detectan de su APN genómico de Humicola insulens, Pleurotus abalonus, Trichoderma reesei y Mycellophthora thermophila.

Ejemplo V El Ejemplo V describe la clonación de genes que codifica para las enzimas fúngales capaces de hibridizar para la enzima oxidante del fenol de Stachybotrys de SEC1 ID NO: 1.

A. Bipolaris spícífera Basándose en la comparación de las secuencias de proteína y de ADN de la enzima oxidante del fenol de SEQ1 ID NO: 1 (a partir de Stachybotrys chartarum) y la bilirrubina oxidasa de Myrothecium - verruvaria (GenBank número 14081), un juego de cebadores de oligonucleótidos se designa para aislar las secuencias relacionadas a partir de una variedad de organismos diferentes por medio de la técnica de hibridación. Los siguientes cebadores ole oligonucleótidos (cebador 1: 5' TGGTACCAYGAYCAYGCT 3' y cebador 2: 5' RGACTCGTAKGGCATGAC 3' (en donde Y es una mezcla igual de nucleótidos T y C, R es una mezcla igual de nucleótidos A y G y K representa una mezcla igual de nucleótidos T y G) se utilizan para clonar una enzima oxidante del fenol a partir de Bipolaris spicífera . El ADN genómico aislado a partir de Bipolaris spícífera se diluye 10 veces con un amortiguador Tris-EDTA a una concentración final de 6 ng/ul. Diez microlitros de ADN diluidos se agregan a la mezcla de reacción que contiene 0.2 mM de cada nucleótido (A, G, C y T) , lx de amortiguador de reacción (10 mM Tris, 1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl a pH 8.3) para un total de 100 microlitros de reacción en presencia de los cebadores 1 y 2. Después ole calentar la mezcla a 100°C durante 5 minutos, 2.5 unidades de ADN polimerasa Taq se agregan a la mezcla ele reacción. La reacción PCR se lleva a cabo a 95°C durante 1 minuto, el cebador se fija al molde a 50°C durante 1 minuto y la extensión se lleva a cabo a 72 °C durante 1 minuto. El ciclo se repite 30 veces para lograr un fragmento PCR visible en gel y una extensión a 71 r durante 7 minutos se agrega después de 30 ciclos. El fragmento PCR que se detecta mediante gel de agarcsa contiene un fragmento de aproximadamente 1 kilobase que luego se clona en el vector plásmido pCR-II ( Invitrogen ' . El inserto de 1 kb luego se somete a una secuenciacion de ácidos nucleicos. El extremo 3' del gen se aisla mediante el método RS-PCR (Sarkar et al., 1993, PCR Methods ana Applications 2: 318-322) a partir del ADN genómico ole Bipolaris spicifera . El fragmento PCR se clona en el vector plásmido pCR-II (Invitrogen) y se secuencia. El extremo 5' del gen se aisla mediante el mismo método RS-PCR (Sarkar et al., 1993, PCR Methods and Applications 2: 318-322) a partir del ADN genómico de Bipolaris spicífera . El fragmento PCR también se clona en el vector plásmido pCR-II (Invitrogen) y se secuencia. El ADN genómico de cadena completa (SEQ ID NO: 3) incluyendo la secuencia reguladora de las regiones promotoras y terminadoras se muestran en la Figura 2 y la secuencia de aminoácidos traducida a partir del ADN genómico se muestra en la Figura 3 (SEQ ID NO: 4). La comparación de los datos de la secuencia, que se muestra en la Figura 4 , revelan que codifica para una enzima oxidante del fenol que tiene aproximadamente un 60.81 de identidad para la enzima oxidante del fenol de Stachybotrys chartarum que se muestra en SEQ ID NO: 1 (como se determina por el Programa MegAlign de DNAstar (DNASTAR, Ine Maidson, Wl 53715) por Jotun Hein Method (1990, Method in Enzymology, 183: 626-645) con una penalidad de intervalo = 11, una penalidad por longitud de intervalo = 3 y Alineación por Pares de los Parámetros Ktuple = 2.

B. Curvularia pallescens Basándose en la comparación de las secuencias de proteínas y de ácidos nucleicos de la enzima oxidante del fenol de SEQ ID NO: 1 (que se obtiene de Stachyboti ys chartarum) y la bilirrubina oxidasa que se obtiene d-Myrothecium verruvaria (número de acceso GenBank 14081 i, un juego de cebadores de oligonucleótidos se designa ?a? a aislar secuencias relacionadas a partir de una varieolaol de diferentes organismos por medio de las técnicas de hibridación. Los siguientes cebadores" de oligonucleotiolos (cebador 1: 5' TGGTACCAYGAYCAYGCT 3' y cebador 2: c>' RGACTCGTAKGGCATGAC 3' (en donde Y es una mezcla igual de nucleótidos T y C, R es una mezcla igual de nucleótidos ,-y G y K representa una mezcla igual de nucleótidos T y G> se utilizan para clonar una enzima oxidante del fenol a •MttaMaÉBÜÉl partir de Curvularia pallescens . El ADN genómico aislado a partir de Curvularia pallescens se diluye con un amortiguador Tris-EDTA a una concentración final de lü?< ng/ul. Diez microlitros de ADN diluidos se agregan a la mezcla de reacción que contiene 0.2 mM de cada nucleotido (A, G, C y T) , lx de amortiguador de reacción (10 mil Tris, 1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl a pH 8.3) para un total de 100 microlitros de reacción en presencia de los cebadores 1 y 2. Después de calentar la mezcla a 100°C durante 5 minutos, 2.5 unidades de ADN polimerasa Taq se agregan a la mezcla de reacción. La reacción PCR se lleva a cabo a 95 °C durante 1 minuto, el cebador se fija al molde a 5 °C durante 1 minuto y la extensión se lleva a cabo a 72 °C durante 1 minuto. El ciclo se repite 30 veces y una extensión a 72 °C durante 7 minutos se agrega después ole 30 ciclos. El fragmento PCR que se detecta mediante gel de agarosa contiene un fragmento de- aproximadamente 90? pares de bases. El fragmento PCR de 900 pb luego se somete a una secuenciación de ácidos nucleicos. El extremo 5' y parte del extremo 3' del ADN genómico se aislan mediante una secuenciación inversa PCR (Triglia T et al, Nucleic Acid Res. 16: 8186) a partir del AD1I uliflfliMlí ' l- í I T I i > - . - ¿i*. -. -***^*.* genómico de Curvularia pallescens utilizando dos pares de oligonucleótidos basadas en los datos de la secuencia a partir del fragmento PCR de 900 pb. El ADN genomico de cadena completa (SEQ ID NO: 6) desde la secuencia inicial de traducción hasta la secuencia final de la traducción se muestra en la Figura 10 (SEQ ID NO: 7). Los datos de comparación de la secuencia, que se muestran en la Figura 11, ilustran que la enzima oxidante del fenol que se obtiene a partir de Curvularia pallescens y tiene SEQ IE' NO: 7 presenta un 92.81 de identidad a la enzima oxidante del fenol que se clona a partir de Bipolaris spici fera y se muestra en SEQ ID NO: 4 (como se determina por el Programa MegAlign de DNAstar (DNASTAR, Ine Maidson, Wl 53715) por Jotun Hein Method (1990, Method in Enzymology, 183: 626-645) ) con una penalidad de intervalo = 11, una penalidad por longitud de intervalo = 3 y Alineación ?o? Pares de los Parámetros Ktuple - 2 . La SEQ ID NO: 7 tiene 60.8% de identidad para la enzima A oxidante del fenol de Stachybotrys chartarum que se muestra en SEQ ID NO: 1.

C. Amerosporium a trum Basándose en la comparación de las secuencias de proteínas y de ácidos nucleicos de la enzima oxidante del fenol de SEQ ID NO: 1 (que se obtiene de Stachyboti ys chartarum) y la bilirrubina oxidasa que se obtiene de Myrothecium verruvaria (número de acceso GenBank 14081', un juego de cebadores de oligonucleótidos se designa para aislar secuencias relacionadas a partir de una variedad de diferentes organismos por medio de las técnicas de hibridación. Los siguientes cebadores de oligonucleotidos (cebador 1: 5' TGGTACCAYGAYCAYGCT 3' y cebador 2: 5' RGACTCGTAKGGCATGAC 3' (en donde Y es una mezcla igual de nucleótidos T y C, R es una mezcla igual de nucleótidos .-y G y K representa una mezcla igual de nucleótidos T y G> se utilizan para clonar una enzima oxidante del fenol a partir de Amerosporium a trum. Una mezcla de reacción que contiene 0.2 mM de cada nucleótido (A, G, C y T) , lx ole amortiguador de reacción (10 mM Tris, 1.5 mM MgCl2, 50 mil KCl a pH 8.3), 1 ul de 50 pmol/ul de los cebadores 1 y 1 en un total de 50 microlitros de reacción se agregan a un tubo de calentamiento inicial (Molecular Bio-Product ; . La mezcla de reacción se calienta a 95 °C durante '1 segundos, y los tubos se enfrían en hielo durante 5 minutos. El ADN genómico aislado a partir de Amerosporiun a trum se diluye 10 veces con un amortiguador Tris-EDTA a una concentración final de 41 ng/ul. Aproximadamente 1 ul de ADN diluido se agrega al tubo de calentamiento inicial 5 con lx de amortiguador de reacción (10 mM Tris, 1.5 mío MgCl2, 50 mM KCl a pH 8.3), 2.5 unidades de APN polimerasa Taq en un volumen total de 50 microlitros. La mezcla de reacción se calienta a 95°C durante 5 minutos. La reacción PCR se lleva a cabo a 95 °C durante 1 minuto, 10 el cebador se fija al molde a 50 °C durante 1 minuto y la extensión se lleva a cabo a 72°C durante 1 minuto. El ciclo se repite 29 veces para obtener un fragmento ECF visible en gel y una extensión a 72 °C durante 7 minutos se agrega después de 29 ciclos. El fragmento PCR que 15 contiene un fragmento de aproximadamente 1 kilobase se detecta por medio de un gel de agarosa. El inserto de 1 kb luego se somete a una secuenciación de ácidos nucleicos. La secuencia genómica para Amerosporium a ti um se muestra en la Figura 13. Una alineación de aminoácidos 20 de los aminoácidos obtenidos a partir de Amerosporiup, a trum y SEQ ID NO: 2 se muestra en la Figura 14.

Ejemplo VI El Ejemplo VI ilustra el perfil de pH de Bipolaris spicifera como se determina al utilizar Guaicol como sustrato a 470 nm. La enzima oxidante del fenol que se obtiene a partir de Bipolaris spicifera se diluye en agua y se agrega a placas de 96 pocilios que contienen el sistema amortiguador de Briton y Robinson a una concentración final de 20 mM. El Guaicol (número de catálogo Sigma 6-5502) se agrega a las paredes a una concentración final de 1 mM. A la reacción se le permite seguir durante 15 minutos a una temperatura de 25 °C y una lectura se toma cada 11 minutos al utilizar un espectrofotómetro a una longitud de onda de 470 nm. Los resultados se muestran en la Figura 12. El sistema amortiguador de Briton y Robinson se muestra en la Tabla 1 a continuación.

TABLA 1 X mL de NaOH 0. 2M que se agregan a 100 mL de una Solución en Existencia (Ácido Acético 0.04 , H3P04 0.04M, y Ácido Bórico 0.04W) PH NaOH, PH NaOH, PH NaOH, PH NaOH, mL mL mL mL 1.81 0.0 4.10 25.0 6.80 50.0 9.62 7500 1.89 2.5 4.35 2.75 7.00 52.5 9.91 77.5 1.98 5.0 4.56 30.0 7.24 55.0 10.38 80.0 2.09 7.5 4.78 32.5 7.54 57.5 10.88 82.5 2.21 10.0 5.02 35.0 7.96 60.0 11.20 85.0 2.36 12.5 5.33 37.5 8.36 62.5 11.40 87.5 2.56 15.0 5.72 40.0 8.69 65.0 11.58 90.0 2.87 17.5 6.09 42.5 8.95 67.5 11.70 92.5 3.29 20.0 6.37 45.0 9.15 70.0 11.82 95.0 3.78 22.5 6.59 47.5 9.37 72.5 11.92 97.5 Ejemplo VII- El Ejemplo VI ilustra la decoloración de las cepas del tomate mediante la enzima oxidante del fenol que se obtiene a partir de Bipolaris spicifera y comprende la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 4. El potencial para blanquear las cepas se analiza al lavar una muestra de algodón con cepas sucias de tomate. Los experimentos se llevan a cabo en contenedores pequeños de 250 ml, a los cuales se agregan 15 ml de la solución de lavado (que se indica en tablas). El pH de la solución de lavado se mantiene a un pH 9. La enzima oxidante del fenol purificada que se obtiene a partir de Bipolaris spicifera tiene una secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 4 se agrega a la solución de lavado a una concentración de 100 mg/l. Se utiliza fenotiazin-10-propionato (PTP) como un intensificador, que se dosifica a 250 µM. La siguiente formulación se utiliza como una solución de lavado (2 g/litro) : Composición Detergente: LAS 241 STP 14.51 Ceniza fresca 17.51 Silicato 8.01 SCMC 0.37% pigmento Blue 0.021 Mezcla/sales 34.61 Las muestras se lavan durante 30 minutos, a 30°C. Después del lavado, las muestras se secan y el espectro de reflexión se cuantifica al utilizar un espectrómetro Minolta. Los registros de las diferencias de color entre las muestras antes y después del lavado se expresan en el espacio de color CIELAB L^a^b-. en este espacio de color, L^ indica brillo y a* y b* son las coordenadas de color. Las diferencias de color entre dos muestras se expresan como DE, gue se calculan mediante la ecuación: ?E = V?L2 + ?a2 + ?b2 ^sfcfc.

Los resultados, dados como valores ?E, se muestran en la Tabla 2 a continuación: 5 Como puede observarse a partir de los valores DE, la decoloración de la cepa del tomate se mejora en presencia del sistema enzimático/ intensificador .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el 10 mejor método conocido para la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere. 15 "-J-,- JB?->AMft

Claims (34)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 5 1. Una enzima oxidante del fenol que codifica mediante un ácido nucleico capaz de hibridizar el ácido nucleico que tiene la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 1 o un fragmento de este, bajo condiciones de rigurosidad alta a intermedia. 10 2. La enzima oxidante del fenol de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque. tiene por lo menos 601 de identidad a la enzima oxidante del fenol que contiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en 15 SEQ ID NO:
2. 2.
3. 3. La enzima oxidante del fenol de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque se obtiene a partir de una bacteria, una levadura o un hongo que no 20 sea Stachybotrys .
4. 4. La enzima oxidante del fenol de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el hongo incluye especies de Myrothecium, especies de Curvularia, especies de Chaetomium, especies de Bipolaris, especies de Humicola, especies de Pleurotus, especies de Trichoderma, especies de Mycellophthora y especies de Amerosporium.
5. 5. La enzima oxidante del fenol de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porgue el hongo incluye Myrothecium verrucaria, Curvalaria pallescens, Chaetomiun, sp, Bipolaris spicifera , Humicola insolens, Pleurotus abalonus, Trichoderma reesei, Mycellophthora thermophila y Amerosporium a trum.
6. 6. La enzima oxidante del fenol de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el hongo es una especie de Biopolarius, una especie de Curvularia o una especie de de Amerosporium.
7. 7. La enzima oxidante del fenol de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porgue el hongo es Biopolarus spicifera , Curvularia pallescens o Amerosporium atrum.
8. 8. La enzima oxidante del fenol de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9.
9. 9. Un polinucleótido aislado que codifica para el aminoácido que comprende la secuencia como se muestra er, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 ó SEQ ID NO: 9.
10. 10. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque tiene por lo menos 60% de identidad hacia la secuencia de ácidos nucleicos que se muestra en SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO: 3.
11. 11. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque comprende la secuencia de ácidos nucleicos que se muestra en SEQ IE' NO: 7 ó SEQ ID NO: 9.
12. 12. Un polinucleótido aislado capaz de hibridizar al polinucleótido que comprende la secuencia como se muestra en SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 6 ó SEQ ID NO: 8 o un fragmento de esta, bajo condiciones de rigurosidad intermedia.
13. 13. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 10.
14. 14. Una célula hospedero que comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 13.
15. 15. La célula hospedero de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque es un hongo filamentoso.
16. 16. La célula hospedero de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el hongo filanentoso incluye especies de Aspergillus, especies de Trichoderma y especies de Mucor.
17. 17. La célula hospedero de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque es una levadura.
18. 18. La célula hospedero de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la levadura incluye especies de Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kluyveromyces, y especies de Yarrowia.
19. 19. La célula hospedero de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque es una bacteria.
20. 20. La célula hospedero de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la bacteria incluye especies de Bacillus y Escherichia.
21. 21. Un método para producir una enzima oxidante del fenol en una célula hospedero que comprende los pasos de: a) obtener una célula hospedero que comprende un polinucleótido capaz de hibridizar hacia el acido' nucleico que tiene la secuencia como se muestra en b) cultivar la célula hospedero bajo condiciones adecuadas para la producción de la enzima oxidante del fenol; y c) recubrir opcionalmente la enzima oxidante del fenol 5 producida.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la enzima oxidante del fenol se obtiene a partir de especies de Myrothecium, especies de 10 Curvularia, especies de Chaetomium, especies de Bipolaris, especies de Humicola, especies de Pleurotus, especies de Trichoderma, especies de Mycellophthora y especies de Amerosporium. 15
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el hongo incluye Myrothecium verrucaria, Curvalaria pallescens , Chaetomium sp>, Bipolaris spicifera , Humicola insolens, Pleurotus abalonus, Trichoderma reesei, Mycellophthora thermophila 20 ó Amerosporium a trum.
24. ^^^^^^ 24. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la secuencia de la enzima oxidante del fenol comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 ó SEQ ID NO: 9.
25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el polinucleótido comprende la secuencia como se muestra en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8.
26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la célula hospedero incluye un hongo filamentoso, levaduras y bacterias.
27. 27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la levadura incluye especies ole Saccharomyces, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kluyveromyces, y especies de Yarrowia.
28. 28. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el hongo filamentoso incluye especies de Aspergillus, especies de Trichoderma y especies de Mucor.
29. 29. Un método para producir una célula hospedero que 5 comprende una enzima oxidante del fenol que comprende l.s pasos de: a) obtener un polinucleótido capaz de hibridizar al aci e nucleico que tiene la secuencia como se muestra en SEQ ID NO: 1, o un fragmento de este, bajo condiciones de 10 rigurosidad elevada a intermedia; b) introducir el polinucleótido en la célula hospedero; y c) cultivar la célula hospedero bajo condiciones adecuadas para la producción de una enzima oxidante olel fenol . 15
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la célula hospedero incluye hongos filamentosos, levaduras y bacterias. 20
31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el hongo filamentoso incluye »~ -"£ >* "- - •-,*--*••&*& ;*& especies de Aspergillus, especies de Trichoderma y especies de Mucor.
32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque son las especies de Aspergillus es Aspergíllus niger var. Awamon .
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el polinucleótido tiene por lo menos 60 de identidad al ácido nucleico que se muestra en SEC1 ID NO: 1 ó SEQ ID NO: 3.
34. 34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el polinucleótido comprende la secuencia de ácidos nucleicos como se muestra en SEQ IE' NO: 3, SEQ ID NO: 6 ó SEQ ID NO: 8. ENZIMAS OXIDANTES DE FENOL RESUMEN DE LA INVENCIÓN Se describen en la presente novedosas enzimas oxidantes del fenol codificadas por ácidos nucleic :s capaces de hibridizar para el ácido nucleico que tiene la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 1 y en particular aquellas que se obtienen de hongos. La presente invención proporciona secuencias de ácidos nucleicos y secuencias de aminoácidos para Bipolaris spicifera , Curvularia pallescens y Amerosporium a trum. La presente invenci n proporciona vectores de expresión y células hospeder s que comprenden enzimas oxidantes del fenol que codifican para ácidos nucleicos, métodos para producir las enzimas oxidantes del fenol, así como métodos para estrucurar los hospederos de expresión.