ES2564083T3 - Uso de enzimas pectinolíticas para el tratamiento de pulpa de frutas y hortalizas y secuencias enzimáticas para las mismas - Google Patents

Abstract

Uso de una o más enzimas pectinolíticas para el tratamiento de pulpa de frutas u hortalizas, en el que al menos una enzima pectinolítica es un polipéptido que tiene actividad pectinolítica y que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad, preferiblemente al menos 90% de identidad, más preferiblemente al menos 95% de identidad y aún más preferiblemente al menos 98% de identidad con la secuencia del polipéptido de PGAI según la SEQ ID NO:2 y b) un fragmento de a) que tiene actividad pectinolítica.

Description

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procariótico o eucariótico a través de la integración en el genoma celular o se presentan extracromosómicamente (p. ej. plásmidos que se replican autónomamente con un origen de replicación).

La construcción de vectores que se pueden usar según la presente invención es conocida por el experto debido a la susodicha divulgación (cfr., p. ej., Sambrook y cols., Molecular Cloning: A Laboratory manual (2ª edición, Coldspring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y. (1989). El casete de expresión según la presente invención puede incluir uno o más sitios de enzimas de restricción para insertar la secuencia de nucleótidos, que codifica una enzima pectinolítica, bajo la regulación de una secuencia reguladora. El casete de expresión también puede incluir una señal de terminación funcionalmente enlazada al polinucleótido así como secuencias reguladoras, que son necesarias para la traducción apropiada del polinucleótido.

Seleccionar un vector de expresión apropiado depende de las células anfitrionas. Los vectores de expresión de levaduras u hongos pueden incluir un origen de replicación, un promotor y un mejorador apropiados así como cualquier sitio de unión ribosomal, sitio de poliadenilación, sitito donante y aceptor de empalme, secuencia de terminación de la transcripción y secuencias de flanqueo 5’ no transcritas necesarios.

Ejemplos de células anfitrionas apropiadas son: células fúngicas del género Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Hypocrea, Neurospora, Mucor, Penicillium, Chrysosporium, Myceliophthora, Fusarium etc., tales como levaduras de los géneros Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Trichosporon, Schwanniomyces, Hansenula, Pichia y otras de esta categoría. Sistemas anfitriones apropiados son, por ejemplo, hongos como Aspergilli, p. ej. Aspergillus niger (ATCC 9142) o Aspergillus ficuum (NRLL 3135) o Trichoderma (p. ej. Trichoderma reesei QM6a y derivados del mismo) y levaduras como Saccharomyces, p. ej. Saccharomyces cerevisiae, o Pichia, tal como Pichia pastoris, o Hansenula, p. ej. H. polymorpha (DSMZ 70277). Tales microorganismos se pueden obtener a partir de depositarios reconocidos, p. ej. American Type Culture Collection (ATCC), Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) o Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) o cualquier otro depositario.

Adicionalmente al uso de un promotor especial, otros tipos de elementos pueden influir en la expresión de genes clonados. En particular, se mostró que los intrones tienen el potencial de mejorar la expresión génica.

El casete de expresión también puede incluir elementos adicionales, tales como elementos que pueden ser regulados por elementos endógenos o exógenos como proteínas con dedos de cinc, incluyendo proteínas con dedos de cinc naturales o proteínas con dedos de cinc quiméricas.

El casete de expresión usado según la presente invención también puede incluir elementos mejoradores o elementos promotores aguas arriba.

Los vectores usados según la presente invención se pueden construir de tal modo que incluyan un elemento mejorador. Así, las construcciones según la presente invención incluyen el gen de interés junto con una secuencia de DNA 3', que actúa como una señal para terminar la transcripción y para permitir la poliadenilación del mRNA así obtenido. Se puede usar cualquier secuencia de señal que permita la secreción desde el posible organismo anfitrión seleccionado. Las secuencias de señal más preferidas para la secreción desde hongos filamentosos son la secuencia de señal de glucoamilasa (glaA) o fitasa procedente de Aspergillus niger, la secuencia de señal de TAKAamilasa procedente de A. oryzae y la secuencia de señal de celobiohidrolasa I procedente de T. reesei, o secuencias de señal derivadas de estas. Alternativamente, se podría usar la secuencia de señal de la proteína deseada.

También es posible usar una secuencia líder especial, puesto que la secuencia de DNA entre el sitio de comienzo de la transcripción y el comienzo de la secuencia codificante, es decir la secuencia líder no traducida, puede influir en la expresión génica. Secuencias líder preferidas incluyen secuencias que controlan la expresión óptima del gen ligado, es decir tienen una secuencia líder de consenso preferida que incrementa o conserva la estabilidad del mRNA y evita un inicio de la traducción inapropiado. La elección de tales secuencias es muy conocida para el experto en la técnica.

Tan pronto como se obtenga el casete de expresión o la secuencia de DNA según la presente invención, se puede insertar en vectores por medio de métodos conocidos para sobreexpresar el polipéptido codificado en sistemas anfitriones apropiados. Sin embargo, las propias secuencias de DNA también se pueden usar para transformar sistemas anfitriones apropiados de la presente invención para alcanzar una sobreexpresión del polipéptido codificado.

Tan pronto como una secuencia de DNA según la presente invención se exprese en una célula anfitriona apropiada en un medio adecuado, la enzima codificada se puede concentrar y/o aislar mediante métodos conocidos bien desde el medio si la enzima se secreta al medio o bien desde el organismo anfitrión si la enzima se presenta intracelularmente, o en el espacio periplasmático. Métodos conocidos para separar la biomasa y los sólidos del medio de cultivo seguidos por métodos para concentrar la enzima se pueden usar para la producción de soluciones enzimáticas concentradas o como una preparación para la deshidratación de la enzima.

La invención también se refiere a preparaciones que incluyen el polipéptido según la invención. En general, estas preparaciones son líquidas o secas. Las preparaciones líquidas incluyen preferiblemente la enzima en una forma

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Tabla 1. Secuencias génicas de pectinasas de Aspergillus usadas en la explotación de la base de datos del genoma de T. reesei.

Nombre de la enzima

Genes Nº de Registro

Endopoligalacturonasas de A. niger

pgaA CAB72125

pgaB

CAB72126

pgaC

CAA45707

pgaD

CAB72931

pgaE

CAA74744

pgaI

CAA41693

pgaII

CAA41694

Pectina liasas de A. niger

pelA CAA43130

pe/B

CAA46521

pelC

AAW03313

pelD

AAA32701

Pectato liasa de A. niger

plyA CAC33162

Exopoligalacturonasa de A. tubingensis

pgaX CAA68128

(Endo)-xilogalacturonasa de A. tubingensis

xghA CAC07733

Ramnogalacturonasas de A. niger

rhgA CAA63911

rhgB

CAA63912

Exorramnogalacturonasas de A. niger

rgxA ABD61566

rgxB

ABD61567

rgxC

ABD61568

Ramnogalacturonano liasa de A. aculeatus

rhgB 1NKG_A

Pectina metil-esterasa de A. aculeatus

pme1 AAB42153

Pectina metil-esterasa de A. oryzae

pmeA BAA75474

Pectina metil-esterasa de A. tubingensis

pmeA P17872

Ramnogalacturonano acetil-esterasa de A. aculeatus

rha1 CAA61858

Ramnogalacturonano acetil-esterasa de A. niger

rgaeA CAC41360

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Tabla 2. Pectinasa putativa que codifica genes identificados de la base de datos del genoma de T. reesei.

Gen

Modelo de gen / Id. Prot. Andamiaje : Región (pb) Identidad (%)

pga1

fgenesh5_pg.C_ scaffold_1000682 /103049 1 : 24952622496642 Poligalacturonasa de A. fumigatus EAL91052; 76% de identidad Endopoligalacturonasa de A. nidulans ABF50893; 74% de identidad

*

fgenesh5_pg.C_ scaffold_33000038 / 112140 33 : 88035-89368 Exopoligalacturonasa de F. oxysporium BAE97149; 56% de identidad Exopoligalacturonasa de A. nidulans ABF50895; 54% de identidad

pgx1

*

estExt_fgenesh5_ pg.C_150014 / 122780 15 : 45898-47405 Exorramnogalacturonasa de A. niger 42% de identidad Exopoligalacturonasa de A. fumigatus EAL86831; 40% de identidad

rgx1

*

e_gw1.33.41.1 / 70186 33 : 90062-91279 Proteína sin nombre procedente de A. oryzae BAE61127; 54% de identidad Exopoligalacturonasa de A. fumigatus XP_747488; 53% de identidad

xga1

* de referencia

El análisis de las secuencias proteínicas derivadas con InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/, Apweiler y cols., 2000 Bioinformatics 16(12):1145-50) las identificó como miembros de la familia 28 de glucósido hidrolasas (GH28; nº reg. InterPro PF00295). Las secuencias que codifican pectinasa putativa procedentes de T. reesei mostraban todas la homología más cercana a enzimas procedentes de otros hongos implicados en la degradación de pectina (búsqueda BLASTP, Altschul y cols., 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215: 403-410, Tabla 2) y por consiguiente se denominaron pga1 (endopoligalacturonasa), pgx1 (exopoligalacturonasa), xga1 (xilogalacturonasa) y rgx1 (exorramnogalacturonasa). La identificación se verificó adicionalmente mediante un enfoque filogenético (Mega 3.1, Kumar y cols., 2004 MEGA3: Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment. Briefings in Bioinformatics. 5:150-163). Tres secciones "que no son endopoligalacturonasa" del árbol filogenético formaban de ese modo cuatro ramas. La PGX1 se encuentra en una rama que también contiene las exopoligalacturonasas procedentes de A. niger, A. tubingensis y Cochliobolus carbonum ya caracterizadas. La XGA1 es la más similar a una rama pequeña, en la que una hidrolasa de xilogalacturonano de A. tubingensis es la única enzima caracterizada. La XGA1 comparte menos similitud con las otras secuencias de esa rama que la que estas muestran entre sí y, por lo tanto, es posible que la enzima de T. reesei haya desarrollado algunas características únicas. Lo mismo se aplica a RGX1, que muestra el grado más alto de identidad de secuencia con exorramnogalacturonasas putativas. En la rama correspondiente, solo se ha probado una enzima procedente de A. niger con respecto a su funcionalidad sin determinar el mecanismo de reacción exacto (Martens-Uzunova, E. S., Zandleven, J. S., Benen, J. A., Awad, H., Kools, H. J., Beldman, G., Voragen, A. G., Van den Berg, J. A. & Schaap, P. J. (2006) A new group of exoacting family 28 glycoside hydrolases of Aspergillus niger that are involved in pectin degradation, Biochem J. 400, 43-52).

Ejemplo 2: Clonación de los genes de pectinasa de T. reesei identificados

Los genes pga1, pgx1, rgx1 y xga1 se amplificaron a partir de DNA genómico de T. reesei usando el sistema GoTaq® (Promega, EE. UU. de A.) con MgCl2 2 mM y 0,4 µM de cebadores específicos de la secuencia presentados en la Tabla 3. Las condiciones para la reacción de PCR eran las siguientes: etapa de desnaturalización inicial de 2 min. a 95°C, seguido por 28 ciclos de 1 min. a 95°C, 45 s de renaturalización a la temperatura específica del cebador (Tabla 3_TP), 2 min. de extensión a 72°C y un alargamiento final a 72°C durante 5 min. Los fragmentos de DNA de los tamaños esperados se aislaron y a continuación se clonaron al vector pBlueScript II SK+ (Stratagene, EE. UU. de A.). Las inserciones se caracterizaron mediante secuenciación.

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Tabla 3. Los cebadores usados para amplificar los genes de pectinasa de T. reesei. El DNA genómico de QM9414 de T. reesei se usó como una plantilla en las reacciones de PCR. Se muestra el nombre del plásmido que contiene el fragmento de gen amplificado.

Gen

Nombre del cebador Secuencia 5' -> 3' Tm (a [°C] Plásmido

pga1

Directo: C22000155for SEQ ID NO: 9 imagen8 50 pALK1958

Inverso: C22000155rev SEQ ID NO: 10

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*

Directo: C42000032fw SEQ ID NO: 11 imagen10 49 pALK1961

pgx1

Inverso: C42000032rv SEQ ID NO: 12

imagen11

*

Directo: C42000033fw SEQ ID NO:13 imagen12 51 pALK1964

xga1

Inverso: C42000033rv SEQ ID NO: 14

GATCACCGCGGATGCTTTATG

*

Directo: C12000223fw SEQ ID NO: 15 imagen13 58 pALK1970(b /pALK1971

rgx1

Inverso: C12000223rv SEQ ID NO: 16

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* de referencia (a Temperatura de renaturalización usada para amplificar el gen de pectinasa de T. reesei. (b La región codificante del gen rgx1 de longitud completa consistía en dos plásmidos. La información pertinente sobre los genes de pectinasa y las secuencias proteínicas deducidas se resumen en la

Tabla 4 y la Tabla 5, respectivamente. Tabla 4. Resumen de los genes de pectinasa de T. reesei.

Gen de pectinasa

imagen15 Longitud con intrones (pb) (a Región codificante (pb) (b Nº de intrones Longitudes de los intrones (pb)

pga1

imagen16 1381 1137 4 64, 59, 59, 59

pgx1

* 1421 1311 2 50,57

xga1

* 1218 1215 0

rgx1

* 1374 1371 0 imagen17

* de referencia

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y cols. (1993, High frequency one-step gene replacement in Trichoderma reesei. I. Endoglucanase I overproduction. Mol. Gen. Genet. 241:515-522), bien seleccionando la acetamida como una única fuente de nitrógeno (gen marcador amdS) o bien sin suplemento de uridina (gen marcador pyr4). Los transformantes se purificaron en placas de selección a través de un solo conidio antes de esporularlos en PD.

Tabla 6. Los casetes de expresión construidos para sobreproducir proteínas de pectinasa en Trichoderma reesei. La estructura global de los casetes de expresión era como se describe en la Fig. 1. Los genes pga1, pgx1, rgx1 y xga1 clonados se fusionaron exactamente al promotor cbh1/cel7A de T. reesei.

Pectinasa de T. reesei

Plásmido de expresión Tamaño del casete de expr.(a Terminador cbh1 (b

PGAI

pALK1967 9.0 kb 627 pb (AvaII)

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(amdS(c) pALK1960 (pyr4(c) 10.0 kb imagen20

PGXI *

pALK1968 9.2 kb 627 pb (AvaII)

RGXI *

pALK1974 8.8 kb 627 pb (AvaII)

XGAI *

pALK1969 8.6 kb 627 pb (AvaII)

* de referencia

(a El casete de expresión para la transformación de T. reesei se aisló del esqueleto del vector al usar digestión con NotI.

(b El número de los nucleótidos de la región terminadora de cbh1 después del codón de PARADA. El sitio de restricción en el extremo 3', usado para escindir el fragmento génico genómico, se incluye entre paréntesis.

(c Se construyeron dos plásmidos de expresión para el gen pga1; el plásmido pALK1967 incluía el gen marcador amdS para la selección del transformante, y el pALK1960 incluía el gen marcador pyr4.

La producción de pectinasa de los transformantes se analizó a partir de los sobrenadantes de cultivo de los cultivos en matraz agitado (50 ml). Los transformantes se hicieron crecer durante 7 días en un medio complejo inductor de celulasa basado en lactosa (Joutsjoki y cols. 1993. Transformation of Trichoderma reesei with the Hormoconis resinae glucoamylase P (gamP) gene: production of a heterologous glucoamylase by Trichoderma reesei. Curr. Genet. 24:223-228) tamponado con KH2PO4 al 5%. La actividad de poligalacturonasa se ensayó mediante un método viscosimétrico usando pectina de cítrico (Copenhagen pectin X-2955, Dinamarca) como el sustrato, según se describe en la patente EP0388593. Una unidad de poligacturonasa (PGU, por sus siglas en inglés) se define como la cantidad de enzima que provocaba una reducción de 15 nPas-1 en la viscosidad bajo condiciones estándar. Los genotipos de los transformantes elegidos se confirmaron usando inmunotransferencias Southern en las que se incluyeron varios digestos genómicos y se usó el casete de expresión respectivo como una sonda. La sobreexpresión de las proteínas de PGAI, PGXI, RGXI y XGAI se analizó mediante SDS-PAGE con tinción de Coomassive posterior. La proteína de PGAI se sobreproducía notablemente en T. reesei (véase la Figura 3), mientras que no se podía detectar actividad de PGU o sobreproducción de proteína visible en SDS-PAGE para los transformantes PGXI, RGXI y XGAI que, sin embargo, demostraron contener un casete de expresión integrado. Esto sugiere que se produce una cantidad muy baja de las proteínas de PGXI, RGXI y XGAI en T. reesei.

Los transformantes de PGAI elegidos se cultivaron en biorreactores de laboratorio a 28°C en el medio indicado anteriormente durante 3-4 días con control del pH 4,4 ± 0,2 (NH3/H3PO4) para obtener material para las pruebas de aplicación. Los sobrenadantes se recuperaron mediante centrifugación y filtración a través de filtros Seitz-K 150 y EK (Pall SeitzSchenk Filter-systems GmbH, Bad Kreuznach, Alemania). Se produjeron dos preparaciones con perfiles enzimáticos idénticos (PGA1+++, CBHI-, EGII-). Se produjo F050183 con transformante derivado de RF5514 y F050200 con transformante derivado de RF5455; el primero se seleccionó con el marcador pyr4 y el último con el marcador amdS. Así, la cepa anterior solo tiene DNA homólogo.

Ejemplo 4: Caracterización de la enzima PGAI de T. reesei

La enzima PGAI de T. reesei en bruto se caracterizó en cuanto al óptimo de pH y la estabilidad térmica.

La dependencia del pH de la proteína de PGAI de T. reesei sobreproducida (muestra F 050183) se determinó dentro de un intervalo de pH de 3,0-8,0 al preparar el tampón de muestra al mezclar ácido cítrico 0,1 M y Na2HPO4 0,2 M (ambos complementados con 100 microgramos/ml de albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en inglés) (Fluka, Nº Cat. 05470) hasta el pH deseado. La actividad se ensayó al pH deseado con incubaciones de 60 min. La Fig. 2A-C muestra los resultados. Las enzimas de Aspergillus tienen un óptimo de pH alrededor de 4,5, mientras que

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Tabla 7. Resultados de prueba con preparación de zumo de frambuesas, fresas, ciruelas y zanahorias

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Rendimiento de zumo Rendimiento de zumo *Brix Turbidez Turbidez Sedimento

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[g] [%] imagen25 NTU 24h NTU [%]

Prueba testigo en frambuesas

795 79,5 9,4 58 58 1,0

Frambuesa F050183

789 78,9 9,4 50 52 1,3

Prueba testigo en fresas

803,9 80,39 6,3 170 79 12,2

Fresa F050183

906 90,6 6,3 183 56 14,5

Prueba testigo en ciruelas

543 54,3 15 157 142 20,0

Ciruelas F050183

764 76,4 17,2 143 124 9,0

Prueba testigo en zanahorias

742 74,2 9,5 161 17,8 8,3

Zanahorias F050183

723 72,3 9,5 150 72 7,7

La tabla 7 anterior muestra que el tratamiento de fresas y ciruelas con PGA1 de Trichoderma incrementó el rendimiento de zumo y °Bx (contenido de azúcar) sin pectina esterasa ni otras actividades pectinolíticas.

5 Los resultados se presentan gráficamente en la Figura 7. La Figura 7 muestra el rendimiento de un zumo obtenido del prensado de pulpas de diferentes frutas/hortalizas después del tratamiento con PGA1 de Trichoderma reesei. Los resultados se muestran en comparación con los valores testigo respectivos.

Sorprendentemente, la PGA1 de Trichoderma daba un resultado superior con frutas que contenían pectina que es poco esterificada y soluble. Basándose en los resultados presentados anteriormente, es posible llevar a cabo el

10 tratamiento de dicha pulpa de fruta solo con la enzima PGA1 de Trichoderma a 65°C en una hora sin pectinasas adicionales. Este resultado superior no se podía esperar.

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Claims (1)

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