MX2010012666A - Uso de enzimas pectinoliticas para el tratamiento de pure de vegetales y frutas y secuencias de enzima para esto. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere al uso de una o más enzimas pectinolíticas para el tratamiento de puré de frutas o vegetales así como un proceso para tratamiento enzimático de puré de frutas o vegetales que comprende la etapa de agregar una o más enzimas pectinolíticas, en donde al menos una enzima pectinolítica se obtiene de Trichoderma reesei, así como a un proceso para la preparación de un jugo de frutas o vegetales que comprende el proceso para tratamiento enzimático de puré de frutas o vegetales. Por otro lado, la invención describe moléculas de ADN recombinantes que codifican un polipéptido que tiene actividad endopoligalacturonasa, un polipéptido que tiene actividad exopoligalacturonasa, un polipéptido que tiene actividad exoramnogalacturonasa y un polipéptido que tiene actividad xilogalacturonasa.

Description

USO DE ENZIMAS PECTINOLITICAS PARA EL TRATAMIENTO DE PURE DE VEGETALES Y FRUTAS Y SECUENCIAS DE ENZIMA PARA ESTO CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere al uso de enzimas pjectinoliticas o polipéptidos que tienen actividad pectinolitica para el tratamiento de puré de frutas o vegetales. La invención se refiere además al uso de enzimas jectinolíticas para la preparación de jugo de frutas o /egetales. Al menos una de las enzimas se obtiene de Trichoderma reesei. Por otro lado, la invención se refiere a secuencias de polipéptido que tienen actividad peptinolitica japropiada en el tratamiento de puré de frutas o vegetales asi como para polinucleótidos que codifican las secuencias de polipéptido. Particularmente, la invención se refiere al uso de una poligalacturonasa de Trichoderma reesei en el tratamiento de puré de frutas o vegetales, particularmente puré de manzana, asi como al uso de la enzima para la preparación de jugo de frutas o vegetales, en particular jugo de manzana.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los polímeros de pectina son constituyentes importante de las · paredes de célula de planta. La pectina es el polisacárido estructural principal de las láminas y paredes cplulares de frutas o vegetales. La textura de la fruta o vLgetal depende de la cantidad y propiedades de la pectina. Generalmente, la fruta que no está madura contiene protopectina insoluble, mientras que la fruta madura contiene más pectina soluble. La pectina es un heteropolisacárido con una columna compuesto de homogalacturonanos alternos (regiones suaves) y ramnogalacturonanos (regiones vellosas) . Las. regiones suaves son polímeros lineales de ácido -D-galacturónico ligados a 1,4. Los residuos de ácido alacturónico pueden metilesterificarse en el grupo ¡carboxilo.

La fruta contiene enzimas pectinolíticas, que participan en el proceso de maceración natural durante y después de la maduración. Las pectinasas industriales se usan en el procesamiento de frutas y vegetales en alimentos y bebidas. En los procesos industriales las enzimas se usan, por ejemplo, en el procesamiento de frutas o vegetales, con objeto de hidrolizar la pectina y para incrementar el jugo cuando se presiona la fruta o vegetal, para reducir la viscosidad hasta ser capaz de concentrar jugos turbios o para degradar la pectina completamente con objeto de clarificar jugos y concentrarlos.

Los jugos de frutas y vegetales, especialmente jugos En el arte previo los jugos de frutas/purés de frutas ya sé han preparado al usar enzimas pectinolíticas, que contienen pectinasas suaves y de región vellosa. Pectinasas de "región suave" comprenden esterasas de pectina (o metil-esterasas de pectina) , poligalacturonasas y pectina liasas (o trans-eliminasas de pectina) . Las pectinasas de "región vellosa" comprenden principalmente endo-arabanasas , arabinofuranosidasas , ramnogalacturonasas, arabino-galactanasas , entre otras. Ambas categorías de enzima se presentan en preparaciones de pectinasa estándar derivadas de Aspergillus niger. En el proceso del arte previo la pectinasa se agrega durante el aplastado de las manzanas con . objeto de alcanzar la distribución apropiada de la enzima en el puré ya que el batido no se recomienda. Después de un tiempo de espera de 30 - 120 minutos, el puré se prensa por sistema de prensado en horizontal o de cinturón. El jugo obtenido se cuela con objeto · de separar partículas gruesas. Posteriormente, el jugo se pasteuriza o se despoja de esencia en un evaporador al vacío. Después de volver a enfriar hasta alrededor de 48 - 52°C, toma lugar el tratamiento del jugo con objeto de despectinizar y degradar el almidón. Este tratamiento toma alrededor de 1 - 2 horas seguido por el proceso de filtración, es decir, ultrafiltración .

Las preparaciones de pectinasa (composiciones de pectinasa) del arte previo que consisten de pectinasas de "región suave" y "región vellosa" no son apropiadas para tales procesos de prensado descritos, ya que licúan el puré y cusan altas cantidades de sólidos en el jugo. La aplicación exclusiva de una poligalacturonasa especifica en combinación con una pectina esterasa alta suministra resultados de prensado mucho mejores, es decir, ciclos de prensado más cortos, rendimientos más altos de prensado y sólidos más bajos en el jugo. Adicionalmente el juego contiene menos o nada de pectina residual, que mejora la despectinisación y filtrado posterior.

En el procesamiento de jugos transparentes, se requiere una 2a etapa de procesamiento llamada "despectinización", en la cual usualmente se usan pectinasas tanto de "región suave" como "región vellosa". En principio, es necesario degradar todas las sustancias moleculares superiores presentes (¡principalmente pectinas, almidón, etc.) con objeto de alcanzar un proceso de ultrafiltración optimizado. Las pectinasas usadas en los procesos del arte previo no son satisfactorias con respecto a su desempeño a temperaturas más altas o la calidad del jugo obtenido.

Actualmente las pectinasas que son activas a temperaturas más altas (> 60 °C) no están disponibles. Por otro lado, las pectinasas usadas para el tratamiento del puré que proporcionan jugo directamente transparente después del prensado sin pectina residual no están satisfactoriamente disponibles actualmente. Las enzimas pectinoliticas se conocen del arte previo. Las pectinasas de Aspergillus, por ejemplo, se describen en · WO 94/14952 y WO 94/14966. cjrbohydrate Research 338 (2003), 515-524, describe el aislado y caracterización de dos ísoformas de poligalacturonasa de Tríchoderma reesei (ATCC 26920) que pertenecen a la familia de glicosil hidrolasa 28. La enzima sé caracteriza en términos de sus propiedades de pH y temperatura. No se describe un uso particular de las ppligalacturonasas .¦ En consecuencia, hay una necesidad en el arte previo para enzimas pectinoliticas que sea apropiadas para el tratamiento de puré de frutas o vegetales en términos de Janejo más fácil y con respecto a las propiedades de tjemperatura y la conducción del proceso.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN I En consecuencia, es un objetivo de la presente invención proporcionar un proceso mejorado para la preparación de jugo de frutas o vegetales. En particular, es un objetivo de la presente invención proporcionar un proceso mejorado para la preparación de puré de frutas o vegetales. El método de la invención es para llevar a un mejor rendimiento y calidad en términos del jugo finalmente obtenido. Por otro lado, el proceso de la invención seria practicable sobre un amplio rango de temperaturas y debería también llevar a buenos resultados cuando el proceso se lleva a cabo a altas temperaturas. El proceso de la invención es para mejorar la capacidad de extracción o degradación y, de esta manera, la capacidad de prensado del puré. Esto lleva a jugos con un bajo contenido de pectinas residuales después del prensado, es decir la claridad de los jugos obtenidos es para mejorarse y, de esta manera, evitar filtraciones laboriosas. El proceso de la invención debería ser apropiado para frutas diferentes.

Un objetivo adicional de la invención es proporcionar genes que codifican ' enzimas pectinolíticas así como proporcionar las secuencias de polipéptidos que tienen actividad pectinolítica que es apropiada en el proceso antes mencionado. En particular, las secuencias de la invención son para codificar enzimas pectinolíticas que tienen un amplio intervalo de aplicación y que lleva a mejoras en él proceso del tratamiento del puré y la preparación de jugo de frutas o vegetales .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras adjuntas son para ilustrar la invención en bandas de proteína se visualizaron por tinción con azul Coomassie Brilli.ant. El tamaño del Trichoderma PGAl es alrededor de 38 kDa.

Figura 4A. Jugo proporcionado después de prensar las preparaciones de puré de manzana tratadas con enzima. La dosificación de 100 ppm de una mezcla que contiene 50 000 PG unidades/mg de ya sea el Trichoderma PGAIs (F050183 y F050200) o el Aspergillus PG1 del estado del arte (REFERENCIA) , todas suministradas con 2000 PE unidades/g de Jetil esterasa de pectina A. niger, se usó en el experimento. En una de las pruebas de puré no se agregó enzima (BLANCO) . El tiempo de incubación de la enzima fue 60 min a 25°C.

Fig. 4B. Diagrama de prensa que muestra el jugo proporcionado después de cada. etapa de presión.

Figura 5. Turbidez (medida como NTU) del jugo después del tratamiento y prensado de la enzima. Dosificación de 100 ppm de una mezcla que contiene 50 000 PG unidades/mg de ya Sea los Trichoderma PGAl ( F050183 y F050200 ) o el Aspergillus jPGl del estado del arte (REFERENCIA) , todos suministrados con j2000 PE unidades/g de metil es.terasa de pectina A. niger, se usó en el experimento. En una de las pruebas de puré no se agregó enzima (BLANCO) . El tiempo de incubación de la. enzima fue 60 min a 25°C.

Figura 6. Una foto de los jugos de muestra después del tratamiento y prensado de la enzima. Muestras de izquierda a derecha: Blanco (sin enzima), F050183, F050200 y Aspergillus PG1 del estado del arte como una referencia.

Figura 7. Rendimiento (%) del jugo . obtenido de los prensados de purés de frutas/vegetales diferentes después del tratamiento con Trichoderma reesei PGAl .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se ha encontrado ahora sorprendentemente que las pectinasas de Trichoderma reesei muestran un excelente desempeño en el tratamiento de puré de frutas o vegetales y específicamente en el tratamiento de un puré de frutas que contiene pectina soluble o esterificada inferior. En pjarticular, se ha encontrado que la poligalacturonasá de Trichoderma reesei (PGAl) muestra un excelente desempeño en tratamiento de puré de manzana. Se ha encontrado sorprendentemente que la poligalacturonasá de Trichoderma reesei (PGAl) puede usarse como la única enzima para el iratamiento de un puré de frutas que contiene pectina esterificada soluble o inferior y el proceso puede conducirse favorablemente a temperaturas elevadas. Se ha encontrado además que la poligalacturonasá de Trichoderma reesei PGAl Duede usarse favorablemente en combinación con enzimas ectinolíticas adicionales, tipo pectina metilesterasas, pojligalacturonasas , pectina liasas, pectato liasas, arabinofuranosidasas, endo-arabanasas o ramnogalacturonasas para mejorar el tratamiento de puré de frutas aún a partir de frutas que tienen pectina insoluble o esterificada superior, por ello el proceso se ha conducido a una temperatura que es compatible' con las enzimas usadas.

La invención se refiere al uso de una o más enzimas pectinoliticas para el tratamiento de puré de frutas o vegetales, en donde al menos una enzima pectinolitica se obtiene de Trichoderma reesei. En- particular, la invención se refiere al uso de una poligalacturonasa de Trichoderma reesei en el tratamiento de puré de manzana. Por otro lado, la invención se refiere al proceso para tratamiento enzimático de puré de frutas o vegetales que comprende la etapa de agregar una o más enzimas pectinoliticas asi como a un proceso para la preparación de un jugo de frutas o vegetales que comprende el proceso para tratamiento enzimático de puré de frutas o vegetales, en donde al menos una enzima pectinolitica se obtiene de Trichoderma reesei. En particular, la invención se refiere a un proceso para iratamiento enzimático de puré de manzana, por ello una oligalacturonasa de Trichoderma reesei que tienen SEQ ID NO: 2 se usa.

La invención, por otro lado, se refiere a una molécula de ADN recombinante que durante la expresión en una célula hospedera eucariótica o procariótica codifica un polipéptido que tienen actividad endo-poligalacturonasa , la molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN seleccionada de a) secuencias de ADN que tienen o que comprenden la SEQ ID NO: 1 (pgal) , b) secuencias de ADN que hibridan con las secuencias de ADN de a) bajo condiciones severas, c) secuencias de ADN que tienen un grado de identidad del 70%. hasta 98% a las secuencias de a) o d) secuencias de ADN que se relacionan a las secuencias de a) , b) o c) debido a la degeneración del código genético.

La invención, por otro lado, se refiere a una molécula de ADN recombinante que durante la expresión en una célula hospedera eucariótica o procariótica codifica un polipéptido que. tienen actividad exo-poligalacturonasa . La molécula de ADN recombinante ¦ comprende una secuencia de ADN seleccionada dje a) secuencias de ADN que tienen o que comprenden la SEQ ID NO: 3 (pgxl), b) secuencias de ADN que hibridan con las secuencias de ÁDN de a) bajo condiciones severas, c) secuencias de ADN que tienen un grado de identidad del 60% hasta 98% a las secuencias de a) o d) secuencias de ADN que s(e relacionan ' a las secuencias de a), b) o c) debido a la degeneración del código genético.

Adicionalmente, la invención se refiere a una molécula de ADN recombinante que durante la expresión en una célula hospedera eucariótica o procariótica codifica un polipéptido que tienen actividad exo-ramnogalacturonasa , la molécula de ADN recombinante comprende una secuencia .de ADN seleccionada de a) secuencias de ADN que tienen o que comprenden la SEQ ID N®: 5 (rgxl), b) secuencias de ADN que hibridan con las secuencias de ADN de a) bajo condiciones severas, c) secuencias de ADN que tienen un grado de identidad del 60% hasta 98% a las secuencias de a) o d) secuencias de ADN que se relacionan a las secuencias de a), b) o c) debido a la degeneración del código genético.

La invención también se refiere a una molécula de ADN rjecombinante que durante la expresión en una célula hospedera eucariótica o procariótica codifica un polipéptido que tiene actividad xilogalacturonasa , la molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN selecionada de a) Jecuencias de ADN que tienen o que comprenden la SEQ ID NO: 7 (ixgal) , b) secuencias de ADN que hibridan con las secuencias de ADN de a) bajo condiciones severas, c) secuencias de ADN que tienen un grado de identidad del 60% hasta 98% a las ¡ secuencias de a) o d) secuencias de ADN que se relacionan a las secuencias de a), b) o c) debido a la degeneración del código genético.

La invención también se refiere a un polipéptido que tienen actividad pectinolitica y que comprende una secuencia de1 aminoácidos .seleccionada de: a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tienen al menos 77% de identidad, preferiblemente al menos 80% de identidad, más preferido al menos 85% de identidad, todavía más preferido al menos 90% de identidad, todavía más preferido al menos 95% de identidad y todavía, más preferido al menos 98% de identidad a la secuencia del polipéptido PGAI (SEQ ID NO: 2); (b) una .variante de a) que comprende un fragmento que tienen actividad pectinolitica; y e) un fragmento de a) o b) que tienen actividad pectinolitica.

La invención se refiere además a un polipéptido que tienen actividad exo-poligalacturonasa, exo-ramnogalacturonasa o xilogalacturonasa y que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tienen al menos 60% de identidad, preferiblemente al menos 70% de identidad, más preferido al menos 80% de identidad, todavía más preferido al menos 90% de identidad y todavía más preferido al menos 95% de identidad a la secuencia de los polipéptidos SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8, y b) una variante de a) .

Para el propósito de la presente invención el término enzima pectinolitica" comprende pectinasas, esterasas de pectina (o metil-esterasas de pectina), poligalacturonasas, pectina liasas (o trans-eliminasas de pectina) , pectato liasas (o trans-eliminasas de pectato) , arabinofuranosidasas , endo-arabanasas o ramnogalacturonasas.

Cuando se prepara un puré de frutas o vegetales de acuerdo a la presente invención, la fruta o vegetal en cuestión se machaca primero, luego el puré se trata con la enzima pectinolitica de la presente invención, luego el puré se prensa y el jugo de esta manera obtenido se pasteuriza opcionalmente y se trata además opcionalmente con (las) enzimas pectinoliticas y/o con otras enzimas apropiadas para la conducción del proceso. En esta conexión las características de temperatura de las enzimas adicionales a usarse deberían tomarse' en cuenta con respecto a la conducción general' del proceso a temperaturas más altas.

La enzima pectinolitica se agrega directamente durante o después del machacado y en cantidades usuales en la técnica.

La aplicación preferible es para usar una preparación de péctinasa que consiste de 50.000 - 100.000 PGU/mg en una solución al 1 - 5 %. La dosificación recomendada de la enzima es 50 - 100 g/t de frutas. La temperatura de reacción recomendada es 10 - 30 °C, el tiempo de reacción es 30 - 120 minutos. El pH promedio del puré es 3.2 - 3.6.

La enzima pectinolitica puede agregarse en cualquier forma que sea conveniente y compatible con la conducción del ¦proceso.

La enzima pectinolitica se agrega preferiblemente como solución liquida concentrada o diluida.

Preferiblemente, la enzima pectinolitica es una enzima pe'ctinolitica que tienen una de las secuencias SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8. De forma más preferible es la poligalacturonasa de Trichoderma reesei que tiene la SEQ ID NO: 2.

El proceso descrito arriba es apropiado para el tratamiento .de cualquier puré de frutas o vegetales. Las frutas apropiadas se seleccionan de manzanas, peras, uvas, uvas blancas, uvas rojas, moras y ciruelas. El proceso es apropiado tanto para frutas que se procesan a temperaturas fjias (por ejemplo 10-30°C) como para frutas que se procesan altas temperaturas (por ejemplo 50°C) . Los vegetables adecuados se seleccionan de zanahorias y tomates. Otro i · I material procesable puede incluir granos de café o cacao y pimienta .

Se obtienen resultados más favorables cuando el puré de frutas es un puré de manzana y la enzima usada es poligalacturonasa de Trichoderma ¦ reesei. Se obtienen resultados particularmente favorables cuando el puré de frutas es un puré de frutas que contiene pectina soluble y esterificada baja tipo fresas o ciruelas. Se ha encontrado que en este caso un jugo en alto rendimiento y alta calidad puede obtenerse por el uso de Trichoderma PGA1 como enzima sencilla. En el caso de frutas que contiene pectina insóluble y/o altamente esterificada el uso de enzimas pectinoliticas adicionales en el proceso de preparar un jugo correspondiente La invención también, se refiere al ADN y secuencias de proteína de enzimas pectinolíticas novedosas de Trichoderma reesei. Aquellas, secuencias son una endo-poligalacturonasa (pgal), una exo-poligalacturonasa (pgxl), una exo-ramnogalacturonasa (rgxl) y una xilogalacturonasa (xgal). Las secuencias se dan en el listado de secuencias adjunto como SEQ, ID NO: 1 hasta SEQ ID NO: 8.

La invención también comprende variantes y derivados de las secuencias de ADN en tanto codifiquen un polipéptido que tiene la actividad .reivindicada . Específicamente comprendidas por la invención son secuencias de ADN que hibridan a la secuencia respectiva bajo condiciones severas. Los ejemplos de condiciones severas son hibridación a 65°C, 18 h en solución de dextransulfato (GenescreenPlus , Dupont) , lavado de los filtros durante 30 min, primero con 6 x SSC, dos veces cln 2 x SSC1 tres veces con 3 x SSC, con SDS al 0.1% y después de que 0.2 x SSC a 65°C (método de detección y a.cuerdo a la presente invención, el programa versión "Clone Manager 7 Align Plus 5" incluyendo las funciones "Comparar Dos Secuencias/Global/Comparar secuencias de ADN" se usó especialmente para determinar el grado de identidad. En este caso los algoritmos disponibles de las siguientes fuentes se usaron: Hirschberg,. D. S. (1975) A linear space algorithm for computing longest common subsequences , Commun . Assoc. Comput . MaLh. 18:341-343; Myers, E.W. and W. Miller. (1988) Optimal alignments in linear space, CABIOS 4:1, 11-17; Chao, K-M, W.R. Perason and W. Miller. (1992) Aligning two sequences within a specified diagonal band, CA-BIOS 8:5, 481-4B7.

La expresión de las secuencias del gen clonado resulta ei¾ la producción de la proteina deseada, o en la producción de un fragmento de esta proteina. Esta expresión puede tomar lugar en una manera continua en las células transformadas, o en una manera controlada.

Los fragmentos se entienden que son partes de las moléculas de polipéptido o ácido nucleico suficientemente largas para tener las propiedades enzimáticas deseadas o para codificar los polipéptidos pectinoliticos descritos o un fragmento biológicamente activo de los mismos. Preferiblemente, las secuencias del fragmento son las secuencias de polipéptido maduras respectivas sin una secuencia de señal.

La invención también se refiere a polipéptidos que tienen secuencias con un grado de identidad de al menos 60%, preferiblemente al menos 70%, más preferido al menos 80%, todavía más preferido al menos 90% y más preferido al menos 95% con las secuencias de polipéptido de arriba SEQ ID NOs : 2, 4, 6 u 8 o fragmentos de los mismos o partes de estos en la medida en que el polipéptido mantiene la actividad pectinolítica respectiva. Preferiblemente, la invención se refiere a un polipéptido que tiene un grado de identidad del al menos 77%, preferiblemente al menos 80%, más preferido al menos 85%, todavía más preferido al menos 90%, todavía más preferido al menos 95% y todavía, más preferido al menos 98% para la secuencia del polipéptido PGAl (SEQ ID NO: 2) .

Como se usa en el contexto presente el término "identidad" de polipéptidos se refiere a la identidad global entre dos secuencias de aminoácido comparadas una con la otra del primer aminoácido codificado por el gen correspondiente para el último aminoácido. La identidad de las secuencias de longitud completa se mide al usar el programa de alineación global Needleman-Wunsch en el paquete de programa EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite; Rice et al., 2000), versión 3.0.0, con . los siguientes parámetros: EMBLOSUM62, penalización de espacio 10.0, penalización extendida 0.5. El algoritmo se describe en Needleman and Wunsch (1970) Journal of Molecular Biology 48, 443-453.

Los términos "proteina", "péptido" y "polipéptido" son para volverse intercambiables. Un polipéptido o enzima con actividad de endo-poligatacturonasa, exo-poligalacturonasa, exo-ramnogalacturonasa o xilogalacturonasa significa una •enzima que tiene la actividad de acuerdo a los ensayos establecidos en la técnica. La invención también incluye variantes de las enzimas reivindicadas en la medida en que mantienen su actividad original. Una variante de acuerdo a la presente invención incluye variantes de polipéptidos que se derivan por eliminación o adición de uno o más aminoácidos al extremo de terminal N y/o terminal C de la proteína nativa; .iminación o adición de uno o más aminoácidos para uno o más sitios en la proteína nativa; o sustitución de uno o más aminoácidos para uno o más sitios en la enzima. La producción de tales variantes se conoce generalmente bien para personas experimentadas en la técnica. Las variantes de las secuencias de aminoácido de polipéptidos pueden, por ejemplo, producirse por mutaciones en el AD . Los métodos de mutagénesis y cambios en la secuencia de nucleótido son bien conocidos para personas experimentadas en la técnica (cf., por ejemplo, Kunkel, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82:488 (1985), Kunkel et , Methods in Enzymol., 154:367 (1987), Patente de E.U.A. No. 4,873,192, Walker and Gaastra, eds . , Techniques in Molecular Biology, Mac Millan. Publishing Company, New York (1*983)). Las referencias en sustituciones apropiadas de aminoácidos, que no influyen negativamente la actividad biológica de la proteina de nota, pueden encontrarse en el modelo de Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, Nati. Biomed. Res. Found., Washington, D. C. (1978) . Se prefieren las sustituciones conservadoras, tales como intercambiar un aminoácido por otro con propiedades similares.

Este tipo de aminoácidos, que son intercambiables dentro dé un grupo, se enlistan en la siguiente Tabla pero no se limita a estos.

La invención también se refiere a preparaciones (composiciones) de ácido nucleico esencialmente purificadas o aisladas o preparaciones (composiciones) de proteina. En este sentido un polinucleótido/polipéptido aislado y purificado o si segmento se refiere a un polinucleótido o polipéptido o su segmento que se presenta aislado de su ambiente natural. Un ségmento aislado de un ácido polinucleico o polipéptido puede ocurrir en una forma purificada o puede ocurrir en un ambiente no nativo, tal como en una célula hospedera transgénica.

La presente invención también se refiere a casetes de expresión, que pueden usarse para introducir una estructura de lectura abierta, que codifica una enzima pectinolitica de acuerdo a la invención, en una célula hospedera. Preferiblemente incluyen un promotor con una región de inicio de transcripción, que se liga a la estructura de lectura abierta de la secuencia de ADN deseada. Tal cásete de expresión puede incluir una variedad de sitios de desdoblamiento de restricción para la inserción de la estructura de lectura abierta y/u otros ADN, por ejemplo una región reguladora de transcripción y/o genes marcadores seleccionables . En la dirección 5'? 3' de la transcripción, el cásete de expresión incluye un promotor con una región de inicio de transcripción y traducción, la secuencia deseada de ADN y las regiones de terminación de traducción y transcripción. El cásete de expresión de tal es funcional en una célula microbiana. La región de terminación puede ser nativa al promotor o el ADN en cuestión o puede derivarse de cualquier fuente diferente.

El término "estructura de lectura abierta" (ORF) se refiere a la secuencia de aminoácido que se codifica entre lis codones de inicio y paro de traducción de una secuencia de codificación. Los términos "codón de inicio" y "codón de paro" se refieren a una unidad de' tres nucleótidos contiguos (codones) en una secuencia de codificación, que especifica la cadena de inicio y la cadena de paro de la síntesis de la proteína (traducción de mARN) .

En conexión con una "ligadura funcional" de ácido nucleico se refiere a un compuesto como una parte de la misma molécula de ácido nucleico en una posición apropiada y con una orientación apropiada para el inicio de la transcripción de la molécula. El ADN funcionalmente ligado a un promotor está bajo la regulación de inicio de transcripción del oromotor. Las secuencias de codificación pueden ligarse funcionalmente a una secuencia reguladora en la orientación del sentido u orientación del antisentido. Con referencia a .'.a "ligadura funcional" de polipéptidos se refiere a la conexión como una parte del mismo polipéptido, es decir por medio de enlaces de peptidilo.

De acuerdo a la presente invención cualquier promotor puede usarse. Usualmente, el promotor se refiere a la cadena arriba .de la secuencia de nucleótido con respecto a- la secuencia de codificación y controla la expresión de la secuencia de codificación por el reconocimiento de la ARN polimerasa y otros factores que son necesarios para una transcripción correcta. El promotor usado de acuerdo a la presente invención puede incluir un promotor mínimo, es decir una secuencia de ADN corta de un cuadro TATA y otras secuencias que especifican el sitio de inicio de transcripción a las cuales los elementos reguladores se enlazan para la expresión.

- El promotor de acuerdo a la presente invención también puede incluir una secuencia de nucleótido que comprende un promotor mínimo y elementos reguladores; este promotor mínimo p'uede verificar la expresión de una secuencia de codificación JARN funcional.

La invención también se refiere a vectores incluyendo el ÁDN de acuerdo a la presente invención. Estos vectores comprenden cualquier plásmido, cósmido, fago y otro vector en una forma de hebra doble o hebra sencilla, lineal o circular; éstos vectores por sí mismos pueden transmitirse o movilizarse y pueden . transformar un hospedero procariótico o eucariótico por medio de integración en el genoma celular o pueden ocurrir extracromosomalmente (por ejemplo autónomamente reemplazando plásmidos con un origen de replicación) .

La construcción de vectores que pueden usarse de acuerdo a la presente invención se conoce para la persona experimentada debido a la descripción antes mencionada (ref., por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory manual (2a edición, Coldspring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y. (1989) . El cásete de e presión de acuerdo a la presente invención puede incluir uno o más sitios de desdoblamiento de la enzima de restricción para insertar la secuencia de nucleótido, que codifica una enzima pectinolítica, bajo la regulación de uíia secuencia reguladora. El cásete de expresión también puede incluir una señal de terminación funcionalmente ligada al polinucleót ido así como secuencias reguladoras, que son necesarias para .la traducción apropiada del polinucleót ido .

Seleccionar un vector de expresión apropiado depende de las células hospederas. Los vectores de expresión de levadura u hongos pueden incluir un origen de replicación, un promotor y potenciador apropiado así como cualquier sitio enlazado a ribosoma necesario, sitio de poliadenilacion, sitio aceptor y donador de empalme, secuencia de terminación de transcripción secuencia flanqueada 5' no transcrita.

Los ejemplos de células hospederas apropiadas son: células del género Aspergillus , Rhizopus, Trichoderma , Hypocrea, Neurospora, Mucor, Penicillium, . Chrysosporium, Myceliophthora , Fusarium etc., tal como levaduras del género Kluyveromyces , Saccharomyces, Schi zosaccharomyces , Trichosporon, Schwanniomyces , Hansenula, Pichia y otros de esta categoría. Los. sistemas hospederos apropiados son, por ejemplo, hongos tipos Aspergilli, por ejemplo Aspergillus niger (ATCC 9142) o Aspergillus ficuum (NRLL . 3135) o Trichoderma (por ejemplo Trichoder a reesei QM6a y derivados de los mismos) y levaduras tipo Saccharomyces, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae o Pichia, tal como Pichia pastoris . o Hansenula, por ejemplo H. polymorpha ( DSMZ 70277). Tales microorganismos pueden obtenerse de d!epositantes reconocidos, por ejemplo Colección de Cultivo Tipo Americana (ATCC, por sus siglas en inglés) , Gentraalbureau voor Schimmelcultures [CBS) [Oficina Central para Cultivos de Moho] · o Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH [DSMZ) [Colección de Alemania de Micro-Organismos y Cultivos Celulares] o cualquier otro depositante.

Adicionalmente para el uso de un promotor especial, otros tipos de elementos pueden incluir en la expresión de genes clonados. Se mostró en' particular que los intrones tienen el potencial para potenciar la expresión del gen.

El cásete dé expresión también puede incluir elementos 'adicionales, tales como elementos que pueden regularse por elementos endógenos o exógenos tipo proteínas de dedo de la secuencia íider no traducida, puede influir la sión del gen. Las secuencias líderes preferidas incluyen secuencias que controlan la expresión óptima del gen unido, es decir que tienen una secuencia líder de consenso preferida que incrementa o conserva la estabilidad de mARN y evita un inicio de traducción inapropiado. La elección de tales secuencias es bien conocida para la persona experimentada en la técnica.

Tan pronto como el cásete de expresión o secuencia de ADN de acuerdo a la presente invención se obtiene, puede insertarse en vectores por medio de métodos conocidos, para sobre expresar el. polipéptido codificado en sistemas hospederos apr.opiados. Sin embargo, las secuencias de ADN por sí mismas también pueden usarse para transformar los sistemas hospederos apropiados de la presente invención p'ara alcanzar una sobreexpresión del polipéptido codificado.

Tan pronto como una secuencia de ADN de acuerdo a la presente invención .· se expresa en una célula hospedera apropiada en un medio adecuado, la enzima codificada puede concentrarse y/o aislarse por métodos conocidos ya sea del ledio si la enzima se secreta en el medio o del organismo hospedero si la enzima ocurre intracelularmente , o en espacio periplasmático. Los métodos conocidos para separar la biomasa y I los sólidos del medio de cultivo seguido por métodos para concentrar la enzima pueden usarse para la producción de soluciones enzimáticas concentradas o como preparación para la deshidratación de la enzima.

La invención también se refiere a preparaciones que incluyen el polipéptido de acuerdo a la invención. En general estas preparaciones son liquidas o secas. Las preparaciones liquidas preferiblemente incluyen la enzima en una forma purificada o enriquecida. Sin embargo, los adyuvantes tal como un estabilizador con glicerol, sorbitol o propilen glicol, borato, aditivos tales como sales, azúcar, conservadores, medios para ajustar el valor del pH, etc. pueden agregarse. Las preparaciones liquidas típicas son suspensiones acuosas o de aceite. Como se usa en el contexto presente, la "preparación de e'nzima" se refiere a cualquier producto de enzima que contiene a'l menos una enzima pectinolítica de la invención. De esta manera, tal preparación de enzima puede ser un medio de cultivo gastado o filtrado. El medio de cultivo gastado significa el medio de cultivo del hospedador que comprende las enzimas producidas. Preferiblemente, las células hospederas se separan del medio después de la producción. Si se desea, tales preparaciones pueden secarse por rocío, granularse o ;.iofilizarse ' o las preparaciones pueden de otra manera concentrarse y/o estabilizarse para almacenamiento. Si se requiere, una enzima deseada puede purificarse además de acuerdo con métodos convencionales, tal como extracción, precipitación, cromatografía, electroforesis , o los similares.

Sin embargo, es una ventaja de la invención que el medio dé cultivo con o sin células hospederas pueda utilizarse como una preparación . de enzima como tal sin purificación adicional, debido a que la enzima pectinolítica de la invención puede secretarse en el medio de cultivo y muestra la actividad en las condiciones de ambiente del medio de cultivo gastado. Tales preparaciones de enzima son muy económicas para proporcionarse y usarse, debido a que el aislamiento de una enzima especifica del medio de cultivo es innecesario .

Además de la enzima pectinolitica, las preparaciones de enzima pueden comprende una o más de otras enzimas, que pueden ser, por ejemplo, otras celulasas, amilasas, lipasas, proteasas, hemicelulasas , xilanasas, pectinasas y/u oxidasas tal como lacasas y peroxidasas.

Además de la enzima pectinolitica, la preparación de enzima puede contener aditivos tales como estabilizadores, soluciones amortiguadoras, conservadores, tensoactivos y/o componentes del medio de cultivo. Los aditivos preferidos son tales que se usan comúnmente en las preparaciones de enzima pretendidas para la aplicación donde la preparación de enzima (plásmidos , fragmentos de ADN) , en transformaciones E. coli, etc. Los métodos básicos usados se describen en los manuales de biología molecular estándares, por ejemplo Sambrook et al. (1989). Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, EUA y Sambrook and Russell (2001). Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, EUA.

La base de datos del genoma Trichoderma reesei (el ahamorfo de Hypocrea jecorina) (http://gsphere.lanl.gov/trirel/trirel.home.html) se buscó con las secuencias de varias Aspergillus pectinasas (Tabla 1) al ujsar el programa TBLASTN (Altschul et al., 1990. Basic local a¡lignment search tool . J. Mol. Biol. 215:403-410).

Sólo en búsqueda con endo-poligalacturonasas A. niger, éxo-poligalacturonasas A. tubingensis, exo-lamnogalacturonasas supuestas de A. niger, y endo-lilogalacturonasa de A. tubingensis producen impactos con similitud importante (menor que e-20 sobre al menos 80% de su longitud) , resultando en la identificación de cuatro r diferentes estructuras de lectura abierta (Tabla 2) . Las regiones de codificación completas de estas secuencias se obtuvieron de http: //gsphere . lanl . gov/trirel/trirel . home . html .

Tabla 1. Secuencias del Gen de Pectinasa Asperglllus Usadas eJ la Minería de la Base de Datos del Genoma de T. reesei.

Nombre de la enzima Genes No. de Acceso 1 pgaA CAB72125 pgaB CAB72126 pgaC CAA45707 A. /i/grer endo-poligalacturonasas pgaD CAB72931 pgaE CAA74744 pgal CAA41693 pgall CAA41694 pelA CAA43130 pelB CAA46521 A. niger pectina Masas pe/C AAW03313 peID AAA32701 A. niger pectato liasa plyA CAC33162 A. tubingensis exo-poligalacturonasa pgaX CAA68128 A. tubingensis (endo)-xilogalacturonasa xghA CAC07733 rhgA CAA63911 A. niger ramnogalacturonasas rhgB CAA63912 rgxA ABD61566 A. n/'ger exo-ramnogalacturonasas rgxB ABD61567 - rgxC ABD61568 A. aculeatus ramnogalacturonan liasa rhgB 1NKG_A A. aculeatus pectin metil-esterasa pme1 AAB42153 A. oryzae pectin metil-estérasa pmeA BAA75474 A. tubingensis pectin metil-esterasa pmeA P 17872 A. aculeatus rha1 CAA61858 ramnogalacturonan acetil-esterasa A. niger rgaeA CAC41360 ramnogalacturonan acetil-esterasa poligalacturonasa) , pgxl (exo-poligalacturonasa) , " xgal (xilogalacturonasa) y rgxl (exo-ramnogalacturonasa ) . La identificación se verificó además por enfoque filogenético (Mega 3.1, Kumar et al, 2004 MEGA3 : Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment. Briefings in Bioinfórmatics . 5:150-163). Tres secciones "no endo-poligalacturonasa" del árbol filogenético forman por ello cuatro ramificaciones. PGX1 se encuentra en un ramificación que también contiene la exo- poligalacturonasas ya caracterizadas de A niger, A. tubingensis y Cochliobolus carbonum . El XGA1 es el más similar a una ramificación pequeña, en la cual una xilogalacturonan hidrolasa de A. tubingensis es la única enzima caracterizada. El XGA1 comparte menos similitud con las otras secuencias en tal ramificación que estas mostradas hacia las otras, y por lo tanto es posible que la enzima de T. reesei ha desarrollado algunas características únicas. Lo mismo aplica para RGXl, que muestra el grado más alto de ¡ identidad de secuencia para exo-ramnogalacturonasas i supuestas. En la ramificación correspondiente solo una enzima cié A. niger se ha probado con respecto a su funcionalidad sin determinar el mecanismo de reacción exacto (Martens-Uzunova,.

E. S., Zandleven, J. S., Benen, J. A., Awad, H., Kools, H.

J., Beldman, G. , Voragen, A. G . , Van den Berg, J. A. & Schaap, . P. J. (2006) A new group of exo-acting family 28 glycoside hydrolases of Aspergillus niger that are involved ira pectin degradation, Biochem J. 400, 43-52).

EJEMPLO 2 : Clonación de los genes de pectinasa T. reesei identificados Los genes pgal, pgxl, rgxl y xgal se amplificaron de ADN génómico T. reesei usando el sistema GoTaq® (Promega, EUA) con 2 mM de MgCfe y 0.4 µ? de cebadores específicos de secuencia presentados en la Tabla 3. Las condiciones para la reacción PCR fueron las siguientes: 2 min de etapa de desnaturalización inicial a 95°C, seguido por 28 ciclos de 1 min a 95°C, 45 s combinación en sus pares base a la temperatura específica del cebador (Tabla 3_TP) , 2 min de extensión a 72°C y un alargamiento final a 72°C durante 5 min. Los fragmentos de ADN de los tamaños esperados se Jislaron, y luego se clonaron al vector pBlueScript II SK+ (Stratagene, EUA) . Los insertos se caracterizaron por procesamiento de secuencia; Tabla 3. Los cebadores Usados para Amplificar los Genes de Pectinasa T. reesei. El ADN genómico de QM9414 G. reesei se isó como una plantilla . en las reacciones PCR. El nombre del plásmido que contiene el fragmento del gen amplificado se La información relevante en los genes de pectinasa y las secuencias de proteina deducidas se resumen en la Tabla 4 y Tabla 5, respectivamente.

Tabla 4. Resumen de los Genes de Pectinasa T. reesel. j El codón de PARO se incluye.

† El codón de PARO no se incluye.

Tabla 5 . Resumen de las secuencias de pectinasa T. reesel deducidas . a La predicción en la secuencia de señal (ss) se hizo usando el! programa SignalP V3.0 (Nielsen et al., 1997. Identification of prokaryotic y eukaryotic signal peptides arld prediction of their cleavage sites. Protein Engineering 10:1-6; Bendtsen et al., 2004. Improved prediction of signal piptides: SignalP 3.0. J.. Mol. Biol. 340:783-795); el valor NN se obtuvo usando redes neurales y valor HMM usando modelos Markov ocultos. (kj La secuencia de señal predicha no se incluyó. La predicción se hizo usando la herramienta Compute pl/MW en el servidor ExPASy (Gasteiger et al., 2003. ExPASy: the proteiomics sjerver for in-depth proteina knowledge and analysis. Nucleic cids Res. 31:3784-3788). (|c El número de secuencias N-X-S/T. j'd Los valores marcados para RGXI se calculan después de la eliminación de dos secuencias de señal posibles.

Los residuos de aminoácido reportados para ser cruciales Dará acción catalítica de la endo-poligalacturonasa II de ?. niger (van Santen et al., 1999. 1.68-A crystal structure of jendopolygalacturonase II from Aspergillus niger and Identification of active site residues by site-directed mutagenesis. J. Biol. 'Chem. 274:30474-30480; Armand et al., 2000. The active site topology of Aspergillus niger endopolygalacturonase II as studied by site-directed mutagenesis. J Biol Chem. 275:691-696) se identifican también eri PGAI, PGXI y XGAI de T. reesei. Esto indica propiedades catalíticas similares de las enzimas de pectinasa de T. j reesei para aquellos de A. niger. Además de la firma del sitio activo típica para glicósido hidrolasas GH28, PGAI, PGXI y XGAI que contienen diversos dominios PbHl (repeticiones beta-hélice paralelas), que también se encuentran en varios tipos de enzimas pectinoliticas (Jenkins Pickersgill, 2001. The architecture of parallel beta- helices and related folds. Prog Biophys Mol Biol. 77:111- 175.). Los hallazgos confirman además las características pectinoliticas de los genes T. reesei indicados aquí.

EJEMPLO 3 : Sobréexpresión de los Genes de Pectinasa en Trichoderma. reesei Los plásmidos de expresión se construyeron para la sobréexpresión de los genes de pectinasa T. reesei. Los plásmidos de expresión construidos se enlistan en la Tabla 6. i Los genes pgal, pgxl, rgxl y xgal, incluyendo sus secuencias de señal propias, se fusionaron exactamente al promotor T. r•' eesei cbhl (cel7A) . La terminación de transcripción sé aseguró por el terminador T. reesei cel7A y el gen marcador A. nidulans amdS se usó para selección de los transformantes jeorno se describe en Paloheimo et al. (2003) La producción de ¡rendimiento alto de una xilanasa bacteriana en el hongo genómico, se incluye en el paréntesis. íc Dos plásmidos de expresión se construyeron para el gen pgal el plásmido pALK1967 incluye el gen marcador amdS para lá selección del transformante, y el pALK1960 incluye el gen marcador pyrA.

La producción de ' pectinasa de los transformantes se analizó de los sobrenadantes de cultivo de los cultivos del matraz de agitación (50 mi). Los transformantes se hicieron crecer durante 7 días en un medio inducido por celulasa con base en lactosa (Joutsjoki et al. 1993. Transíormation of Trichoderma reesei with the Hormoconis resinae glucoamylase P (gamP) gene: production of a heterologous glucoamylase by Trichoderma reesei. Curr. Genet . 24:223-228) amortiguada con H2PO4 al 5%. La actividad de poligalacturonasa se procesó por ensayo por un método viscosimétrico usando pectina cítrica (C.openhagen pectin X-29'55, Dinamarca) como el sustrato, como se describe en la Patente EP0388593. Una unidad de oligacturonasa (PGU) se define como la cantidad de enzima que provoca reducción 15 nPas-1 en viscosidad bajo condiciones estándares. Los genotipos de los transformantes elegidos se confirman al usar Southern blots en los cuales diversas (digestiones genómicas se incluyeron y el cásete de expresión respectivo se usó como una sonda. La sobre expresión de las proteínas PGAI, PGXI, RGXI y XGAI se analizó por SDS-PAGE con tinción Coomassive posterior. La proteina PGAI se sobre produjo notablemente en T. reesei (ver Figura 3), mientras que sin actividad PGU o sobre producción de proteina visible en SDS-PAGE puede detectarse para los transformantes PGXI, RGXI y XGAI que, sin embargo, se mostraron para contener cásete de expresión integrado. Esto sugiere que la cantidad muy baja de las proteínas PGXI, RGXI y XGAI se producen en G. reesei .

Los transformantes PGAI elegidos se cultivaron en bioreactores de laboratorio a 28 °C en el medio indicado arriba durante 3-4 días con pH de control 4.4 + 0.2 (NH3/H3PO4) para obtener material para las pruebas de aplicación. Los sobrenadantes se recuperaron por centrifugación y filtración a través de filtros Seitz-K 150 y EK (Pall SeitzSchenk Filter-systems GmbH, Bad Kreuznach, Alemania) . Dos preparaciones se produjeron con perfiles de enzima idénticos (PGA1+++, CBHI-, EGII-). El F050183 se produjo con RF5514 derivado del transformante y F050200 con F5455 derivado del transformante; el formador se seleccionó con el marcador pyrA y la última con el marcador amdS . De esta manera el formador de cepa porta solamente el ADN homólogo .

EJEMPLO 4: Caracterización de la Enzima T. reesei P6AI La enzima T. reesei PGAI cruda se caracterizó en términos de pH óptimo y estabilidad térmica.

La dependencia del pH de la proteina G. reesei PGAI sobreprqducida (muestra F 050183) se determinó dentro de un rango de pH de 3.0-8.0 al preparar la solución amortiguadora muestra al mezclar ácido cítrico 0.1 M y Na2HP04 0.2 M (ambos complementados con albúmina de suero de bovino (BSA) 100 microgramo/ml (Fluka, Cat . # 05470) al pH deseado. La actividad se ensayó en ' el pH deseado con incubaciones de 60 min. La Fig. 2A-C muestra los resultados. Las enzimas Áspergillus tienen un pH óptimo alrededor de 4.5, mientras que la Trichoderma PGAI tiene un pH óptimo ligeramente más neutro en pH 5.0. La Trichoderma PGAI todavía conserva alrededor de 70% de actividad en pH 5.5, en la cual la Aspergillus PG1 tiene solamente 30% de la máxima actividad izquierda. La Aspergillus PG2 pierde su actividad en pH 5.5.

La dependencia de temperatura de la proteína Trichoderma PGAI sobreproducida (muestra F050183) se determinó en pH 5.0 dentro del intervalo de 40°C - 75°C, ' y comparó con la Aspergillus PG1 y PG2 del estado de la técnica evaluadas en su pH óptimo 4.5. Sorprendentemente, la Trichoderma PGAI tiene una alta temperatura óptima de alrededor de 65°C, y todavía alrededor de 60% de actividad máxima de 70°C, clorhídrico 0.5 M Solución de trabajo: 0.233 g Titriplex III se disolvió en 30 mi de hidróxido de sodio 0.5 M. 5 mi de solución madre se agregó y llenó hasta.50 mi con NaOH 0.5 M.

Volúmenes de ensayo Sustrato : Enzima : 0.1 mi PAHBAH : 0.65 mi Temperatura de incubación del color; 80°C Duración de incubación del color: 15 min Valor muestra: El sustrato se. midió con una pipeta en un tubo de prueba.- La reacción se inició al agregar la solución de enzima. El lote se mezcló e incubó a 40°C durante 60 min. Después de la incubación la reacción se detuvo al agregar el reactivo PAHBAH. Para el desarrollo del color las muestras se Incubaron durante 15 min a 80°C. Posteriormente las muestras se enfriaron en un baño de hielo durante alrededor de 5 min y centrifugó (2 min, 13000 rpm) . Los sobrenadantes se midieron fotométricamente contra' la muestra en blanco a 412 nm. muestra en blanco se encontraron cantidades considerables i péctina residual.' Ejemplo 6: Prueba de Txlchoderma. PGA1 en la preparación de jugo de diferentes frutas y vegetales.

La preparación F050183 de Trichoderma PGA1 producida como se describe en el Ejemplo 3 se probó en la preparación de jugo de frutas y vegetales sin agregar pectina metil esterasa.

Las fresas y frambuesas se trituraron manualmente con un dispositivo de metal. Las ciruelas y zanahorias se machacaron mecánicamente con una picadora. Las zanahorias se blanquearon por calentamiento en microondas a 95°C. 1000 g de puré se colocó en una botella de 2000 mi y la temperatura se ajustó durante 20 min antes de agregar la solución de enzima. La temperatura de reacción fue 65°C y el tiempo de reacción de 60 min. Se realizó la molienda después de la reacción de enzima al presionar en una prensa de laboratorio Hafico usando ropa de prensa textil. El jugo recibido se colectó en un matraz Imhoff para asentar.

Enzima y Dosificación: La dosificación se hizo con base en la recomendación ¡general en la técnica.: 200 ppm a 30.000 PGU/mg corresponde con ciruelas con Tricho-derma PGA1 que incrementa el rendimiento del jugo y °Bx (contenido de azúcar) sin pectina esterasa y oirás actividades pectinoliticas .

Los resultados se presentan gráficamente en la Figura 7. La Figura 7 muestra el rendimiento de un jugo obtenido del prensado de diferentes purés de frutas/vegetales después del tratamiento con Trichoderma reesei PGA1. Los resultados se muestran en comparación con los valores en blanco respectivos.

Sorprendentemente, la Trichoderma PGA1 da un resultado superior con frutas que contienen' pectina que es esterificada baja y soluble. Con base en los resultados presentados Jrriba, es posible llevar a cabo el tratamiento del puré de frutas solo con la enzima Trichoderma PGA1 a 65 °C en una hora sin ninguna de las pectinasas adicionales. No se esperaba ? este resultado superior.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. El uso de una o más enzimas pectinoliticas para el tratamiento de puré de frutas o vegetales, en donde al menos una enzima pectinolitica se obtiene de Trichoderma reesei. 2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde la enzima pectinolitica es seleccionada de pectinasas, Jectina metilesterasas , poligalacturonasas, pectina liasas, pectato liasas, arabinofuranosidasas , endo-arabanasas o rramnogalacturonasas . 3. El uso de conformidad con la reivindicación 2, en donde la enzima pectinolitica es una poligalacturonasa de Trichoderma reesei. 4. El uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde la poligalacturonasa tiene la secuencia de aminoácidos de 22-379 de SEQ ID NO: 2. 5. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 4, en donde la fruta o vegetal es seleccionada de manzanas, peras, uvas, moras, zanahorias o tomates. 6.. El uso de conformidad con la reivindicación 5, en dónde la fruta es manzana. 7. El uso de' conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 5, en donde la enzima pectinolitica es una poligalacturonasa de Trichoderma reesei que tienen la secuencia de aminoácidos de 22-379 de SEQ ID NO: 2 y la fruta es manzana. 8. Un proceso para tratamiento enzimático de puré de frutas o vegetales, caracterizado porque comprende la etapa de agregar una o más enzimas pectinoliticas , en donde al menos una enzima pect'inolitica se obtiene de Trichoderma r,eesei . 9. El proceso de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la enzima pectinolitica es seleccionada de pectinasas, pectina metilesterasas , poligalacturonasas, pectina liasas, pectato liasas, arabinofuranosidasas , endo-arabanasas o ramnogalacturonasas . 10. El proceso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la enzima . pectinolitica es una poligalacturonasa de Trichoderma reesei. 11. El proceso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la poligalacturonasa tiene la secuencia de aminoácidos de 22-379 de SEQ ID NO: 2. b) secuencias de ADN que hibridan con las secuencias de ADN de a) bajo condiciones severas, c) secuencias de ADN que tienen un grado de identidad del 70% hasta 98% hasta las secuencias de a), o d) secuencias de ADN que se relacionan a las secuencias de a), b o c) debido a la degeneración del código genético. 17. Un polipéptido, caracterizado porque tiene actividad endo-poligalacturonasa y se codifica por una molécula de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 16. 18. Un polipéptido, caracterizado porque tiene actividad pectinolítica y comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tienen al menos 77% de identidad, preferiblemente al menos 80% de identidad, más preferido al menos 85% de identidad, todavía más preferido al menos 90% de identidad, todavía más preferido al menos 95% de identidad y todavía más preferido al menos 98% de identidad a la secuencia de el polipéptido PGAI (SEQ ID NO: 2) . b) una variante de a) que comprende un fragmento que tienen actividad pectinolítica ; y c) un fragmento de a) o b) que tienen actividad pectinolítica. 19. Una molécula de ADN recombinante, que durante la expresión en una célula hospedera procariótica o eucariótica codifica un polipéptido que tiene actividad exo-poligalacturonasa , exo-ramnogalacturonasa o xilogalacturonasa, la molécula. de ADN recombinante caracterizada porque comprende una secuencia de ADN seleccionada de: a) secuencias de ADN que tienen o que comprende SEQ ID NO: 3 (pgx 1), SEQ ID NO: 5 (rgx 1) o SEQ ID NO: 7 (xga 1) , b) secuencias de ADN que hibridan con una de las secuencias de ADN de a) bajo condiciones severas, c) secuencias de ADN que tienen un grado de identidad d¡el 60% hasta 98% hasta las secuencias de a), d) secuencias de ADN que se relacionan a las secuencias de a), b) o c) debido a la degeneración del código genético. 20. Un polipéptido, caracterizado porque tiene actividad exo-poligalacturonasa, exo-ramnogalacturonasa o xilogalacturonasa y se codifica por una molécula de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 19. 21. Un polipéptido, caracterizado porque tiene actividad éxo-poligalacturonasa , exo-ramnogalacturonasa o xilogalacturonasa y comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de j a . un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tienen al menos 60% de identidad, Pe'nicillium , Saccharomyces o Fusarium. 26. Una preparación, caracterizada porque comprende uno más polipéptidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17, 18, 20 y 21, opcionalmente junto con enzimas y/o excipientes adicionales.