KR20010032381A - 바실루스 리케니포르미스로부터 얻어지는 펙틴 분해 효소 - Google Patents

Abstract

본 발명에서는 8 보다 높은 pH 에서 최적 활성을 가지고 있는, 바실루스 리케니포르미스 또는 바람직하게는 배열된 16S rDNA 서열을 토대로 바실루스 리케니포르미스에 대하여 최소한 99 % 상동하는 다른 바실루스 종으로부터 유도되거나 또는 그것에 내인성인 펙틴 분해 효소가 제공된다. 펙틴 분해 효소는 효소 부류 펙테이트 리아제 (EC 4.2.2.2), 펙틴 리아제 (EC 4.2.2.10) 및 폴리갈락투로나제 (EC 3.2.1.15)에 속하며, 알칼리성 조건하에서 예를 들면 직물의 가공처리와 같은 산업용 처리공정에서 및 예컨대 세탁용 세제 및 경질 표면 클리닝 제품의 활성 성분으로서 유용하다.

Description

바실루스 리케니포르미스로부터 얻어지는 펙틴 분해 효소{PECTIN DEGRADING ENZYMES FROM BACILLUS LICHENIFORMIS}

펙틴 중합체는 식물 세포벽의 중요한 구성성분이다. 펙틴은 그것의 골격을 호모갈락투로난 (매끄러운 영역)과 람노갈락투로난 (털이 난 영역)이 교대로 구성하고 있는 헤테로-다당이다. 매끄러운 영역은 1,4-결합된 알파-D-갈락투론산의 선형 중합체이다. 갈락투론산 잔기는 변화하는 정도로 카르복실기상에서 메틸-에스테르화될 수 있으며, 통상적으로 비-무작위적인 방식으로 폴리갈락투론산의 블록은 완전하게 메틸-에스테르화된다.

펙티나제는 그것들의 선호하는 기질, 고도로 메틸-에스테르화된 펙틴 또는 적게 메틸-에스테르화된 펙틴 및 폴리갈락투론산 (펙테이트), 및 그것들의 반응 메카니즘, 베타-제거 또는 가수분해에 따라 분류될 수 있다. 펙티나제는 주로 중합체의 사슬내의 무작위 부위에서 내부적으로 작용하여 중합체를 절단함으로써 올리고머의 혼합물이 형성되거나, 또는 그것들은 외부적으로 작용하여 중합체의 한 단부부터 공격하여 단량체 또는 이량체가 생성되기도 한다. 펙틴의 매끄러운 영역에 대해 작용하는 여러 가지 펙티나제 활성은 펙테이트 리아제 (EC 4.2.2.2), 펙틴 리아제 (EC 4.2.2.10), 폴리갈락투로나제 (EC 3.2.1.15), 엑소-폴리갈락투로나제 (EC 3.2.1.67), 엑소-폴리갈락투로네이트 리아제 (EC 4.2.2.9) 및 엑소-폴리-알파-갈락투로노시다제 (EC 3.2.1.82)와 같은 효소 명명법 (1992)에 의해 제공되는 효소의 분류에 포함된다.

펙테이트 리아제는 에르위니아, 슈도모나스, 클레브시엘라 및 크산토모나스와 같은 상이한 박테리아 속으로부터 클론되었다. 또한 바실루스 서브틸리스로부터 (Nasser et al., (1993) FEBS 335:319-326) 및 바실루스 종 YA-14 로부터 (Kim et al., (1994) Biosci. Biotech. Biochem. 58:947-949) 이루어지는 펙테이트 리아제의 클로닝이 설명되었다. 바실루스 푸밀루스에 의해 (Dave and Vaughn (1971) J. Bacteriol. 108:166-174), 바실루스 폴리믹사에 의해 (Nagel and Vaughn (1961) Arch. Biochem. Biophys. 93:344-352), 바실루스 스테아로써모필루스에 의해 (Karbassi and Vaughn (1980) Can. J. Microbiol. 26:377-384), 바실루스 종에 의해 (Hasegawa and Nagel (1966) J. Food Sci. 31:838-845) 및 바실루스 종 RK9 에 의해 (Kelly and Fogarty (1978) Can. J. Microbiol. 24:1164-1172) 생성된, 8 내지 10 의 pH 범위에서 최대 활성을 가지고 있는 펙테이트 리아제의 정제에 대해서는 보고되었지만, 그러나 이들 유기체로부터 얻어지는 펙테이트 리아제를 코드화하는 유전자의 클로닝에 대해서는 언급이 되지 않았다. 기재된 모든 펙테이트 리아제는 최대 활성을 위해 2 가 양이온을 필요로 하며, 그 중에서 칼슘 이온이 가장 자극적이다.

WO 98/45393 에는 끈적한 얼룩에 대해 현저한 세척성을 나타내는 프로토펙티나제를 함유하고 있는 세제 조성물이 개시되어 있다.

일반적으로, 펙티나제를 생성하는 미생물은 광범위한 펙틴 분해 또는 변형 효소들을 나타낸다. 때로 미생물은 또한 셀룰라제 및/또는 헤미셀룰라제를 생성하고, 그러한 미생물로부터 생성된 복합 다중-성분 효소 제제는 다양한 적용에 대하여 최적화되는 것이 어려울 것이며, 심지어는 그것들은 바람직하지 못한 효과를 나타내는 효소들을 함유할 수도 있다. 그러므로, 본 발명의 목적은 예컨대 세제 또는 상이한 산업 가공 처리과정에서 단지 원하는 효과만을 나타내는 펙틴 분해 효소를 제공하는 것이다.

(발명의 개요)

본 발명자들은 바실루스 속에 속하는 바실루스 스트레인, 보다 구체적으로는 바실루스 리케니포르미스 스트레인에 대해 내인성인 여러 가지 펙틴 분해 효소, 특히 알칼리성 펙틴 분해 효소를 발견하였고, 그러한 효소를 코드화하는 DNA 서열을 확인하는데 성공하였다.

따라서, 본 발명은 첫 번째 측면으로, 바실루스 리케니포르미스의 스트레인 또는 그것과 매우 관련된 바실루스 종으로부터 유도된 또는 그것에 대해 내인성인 펙틴 분해 효소로 본질적으로 구성되는 효소 제제에 관한 것으로, 효소는 바람직하게는 펙테이트 리아제 (EC 4.2.2.2), 펙틴 리아제 (EC 4.2.2.10) 또는 폴리갈락투로나제 (EC 3.2.1.15)이다.

본 발명의 두 개의 펙테이트 리아제의 DNA 서열은 각각 SEQ ID NO. 3 및 7 로서 서열 목록에 열거되며, 추론되는 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO. 4 와 8 로서 서열 목록에 열거된다. 이들 신규한 효소는 효소 명명법에 따라 효소 부류 EC 4.2.2.2 로 분류될 것으로 여겨진다. 그러나, 본 발명의 효소는 또한 EC 4.2.2.2 에 속하는 효소들에 대하여 종래부터 부여되어 오던 펙테이트 및 폴리갈락투로니드에대한 활성 외에도 펙틴 (에스테르화될 수 있음)에 대해서도 촉매적 활성을 나타낸다는 것이 주지되어야 한다.

본 발명의 펙틴 리아제의 DNA 서열은 SEQ ID NO. 1 로서 서열 목록에 열거되고, 추론되는 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 2 로서 서열 목록에 열거된다. 이 신규한 효소는 효소 명명법에 따라 효소 부류 EC 4.2.2.10 으로 분류될 것으로 여겨진다.

본 발명의 폴리갈락투로나제의 DNA 서열은 SEQ ID NO. 5 로서 서열 목록에 열거되고, 추론되는 아미노산 서열은 SEQ ID NO.6 으로서 서열 목록에 열거되어 있다. 이 신규한 효소는 효소 명명법에 따라 효소 부류 EC 3.2.1.15 로 분류될 것으로 여겨진다.

따라서, 본 발명은 두 번째 측면으로, i) 바실루스 리케니포르미스 ATCC 14580 에 의해 생성되는 폴리펩티드이거나, 또는 ii) SEQ ID NO: 8 의 위치 28 에서 341 사이에 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드이거나; 또는 iii) 상기 폴리펩티드와 최소한 45 % 상동하는 상기 i) 또는 ii) 에서 규정된 폴리펩티드의 유사체이거나, 또는 iv) 위치 233 및 238 에 있는 아르기닌이 보존되고 유도된 폴리펩티드가 상기 폴리펩티드와 최소한 42 % 상동한다면 하나 또는 여러 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의하여 상기 폴리펩티드로부터 유도되거나, 또는 v) 정제된 형태의 상기 폴리펩티드에 대하여 발생된 다클론성 항체와 면역학적으로 반응하는 펙테이트 리아제에 관한 것이다.

한 측면으로, 본 발명은 (a) 펙테이트 리아제 활성을 가지고 있고, SEQ ID NO: 7 의 뉴클레오티드 82 부터 뉴클레오티드 1026 까지에 도시되어 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자; (b) (a) 의 종 상동체; (c) SEQ ID NO: 8 의 아미노산 잔기 28 부터 아미노산 잔기 341 까지의 아미노산 서열에 대해 최소한 70 % 동일하고 펙테이트 리아제 활성을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자; (d) (a), (b) 또는 (c) 에 상보하는 분자; 및 (e) (a), (b), (c) 또는 (d) 의 축퇴성 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다.

SEQ ID NO: 8 의 아미노산 서열에 의해 표시되는 본 발명의 펙테이트 리아제를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자 (DNA 서열)를 포함하고 있는 플라스미드 pSJ1678 은 대장균 스트레인에 형질전환되었고, 그것은 특허 절차상의 목적을 위한 미생물 기탁의 국제 승인에 대한 부다페스트 조약에 따라 본 발명자들에 의해 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germany)에 1997 년 9 월 25 일에 기탁 번호 DSM 11789 하에 기탁되었다.

세 번째 측면으로, 본 발명은 i) 바실루스 리케니포르미스 ATCC 14580 에 의해 생성된 폴리펩티드이거나, 또는 ii) SEQ ID NO: 4 의 위치 28 부터 221 까지에 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드이거나, 또는 iii) 상기 폴리펩티드와 최소한 60 % 상동하는 상기 i) 또는 ii) 에서 규정된 폴리펩티드의 유사체이거나, 또는 iv) 위치 133 및 155 에 있는 라이신 및 위치 158 에 있는 아르기닌이 보존되고 유도된 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 4 의 위치 60 에서 158 까지와 최소한 66 % 상동한다면, 하나 또는 여러 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의하여 상기 폴리펩티드로부터 유도되거나, 또는 v) 정제된 형태의 상기 폴리펩티드에 대하여 발생된 다클론성 항체와 면역학적으로 반응하는 펙테이트 리아제에 관한 것이다.

한 측면으로, 본 발명은 (a) 펙테이트 리아제 활성을 가지고 있고, SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 82 부터 뉴클레오티드 666 까지에 도시되어 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자; (b) (a) 의 종 상동체; (c) SEQ ID NO: 4 의 아미노산 잔기 28 부터 아미노산 잔기 221 까지의 아미노산 서열에 대해 최소한 70 % 동일한 펙테이트 리아제 활성을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자; (d) (a), (b) 또는 (c) 에 상보하는 분자; 및 (e) (a), (b), (c) 또는 (d) 의 축퇴성 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다.

네 번째 측면으로, 본 발명은 i) 바실루스 리케니포르미스 ATCC 14580 에 의해 생성된 폴리펩티드이거나, 또는 ii) SEQ ID NO: 2 의 위치 31 부터 494 까지에 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드이거나, 또는 iii) 상기 폴리펩티드와 최소한 60 % 상동하는 i) 또는 ii) 에서 규정된 폴리펩티드의 유사체이거나, 또는 iv) SEQ ID NO: 2 와 관련하여 위치 377 및 383 에 있는 아르기닌이 보존되고 유도된 폴리펩티드가 상기 폴리펩티드와 최소한 60 % 상동한다면, 하나 또는 여러개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의하여 상기 폴리펩티드로부터 유도되거나, 또는 v) 정제된 형태의 상기 폴리펩티드에 대하여 발생된 다클론성 항체와 면역학적으로 반응하는 펙틴 리아제에 관한 것이다.

한 측면으로, 본 발명은 (a) 펙틴 리아제 활성을 가지고 있고, SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 91 부터 뉴클레오티드 1485 까지에 도시되어 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자; (b) (a) 의 종 상동체; (c) SEQ ID NO: 2 의 아미노산 잔기 31 부터 아미노산 잔기 494 까지의 아미노산 서열에 대해 최소한 70 % 동일한, 펙틴 리아제 활성을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자; (d) (a), (b) 또는 (c) 에 상보하는 분자; 및 (e) (a), (b), (c) 또는 (d) 의 축퇴성 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다.

SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열에 의해 표시되는 본 발명의 펙틴 리아제를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자 (DNA 서열)를 포함하고 있는 플라스미드 pSJ1678 은 대장균 스트레인에 형질전환되었고, 그것은 특허 절차상의 목적을 위한 미생물 기탁의 국제 승인에 대한 부다페스트 조약에 따라 본 발명자들에 의해 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germany)에 1998 년 2 월 23 일에 기탁 번호 DSM 12031 하에 기탁되었다.

다섯 번째 측면으로, 본 발명은 i) 바실루스 리케니포르미스 ATCC 14580 에 의해 생성된 폴리펩티드이거나, 또는 ii) SEQ ID NO: 6 의 위치 1 부터 415 까지에 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드이거나, 또는 iii) 상기 폴리펩티드와 최소한 70 % 상동하고, 하나 또는 여러 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의하여 상기 폴리펩티드로부터 유도되거나, 또는 정제된 형태의 상기 폴리펩티드에 대하여 발생된 다클론성 항체와 면역학적으로 반응하는 i) 또는 ii) 에서 규정된 폴리펩티드의 유사체인 폴리갈락투로나제에 관한 것이다.

한 측면으로, 본 발명은 (a) 폴리갈락투로나제 활성을 가지고 있고, SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 1 부터 뉴클레오티드 1248 까지에 도시되어 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자; (b) (a) 의 종 상동체; (c) SEQ ID NO: 6 의 아미노산 잔기 1 부터 아미노산 잔기 415 까지의 아미노산 서열에 대해 최소한 70 % 동일한 폴리갈락투로나제 활성을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자; (d) (a), (b) 또는 (c) 에 상보하는 분자; 및 (e) (a), (b), (c) 또는 (d) 의 축퇴성 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다.

SEQ ID NO: 6 의 아미노산 서열에 의해 표시되는 본 발명의 폴리갈락투로나제를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자 (DNA 서열)를 포함하고 있는 플라스미드 pSJ1678 은 대장균 스트레인에 형질전환되었고, 그것은 특허 절차상의 목적을 위한 미생물 기탁의 국제 승인에 대한 부다페스트 조약에 따라 본 발명자들에 의해 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germany)에 1998 년 2 월 23 일에 기탁 번호 DSM 12030 하에 기탁되었다.

다른 측면으로 본 발명은 다음의 작동가능하게 연결되어 있는 엘레먼트들을 포함하고 있는 발현 벡터를 제공한다: 전사 프로모터; (a) 펙테이트 리아제 활성을 가지고 있고 SEQ ID NO: 7 의 뉴클레오티드 82 에서 뉴클레오티드 1026 까지의 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 82 에서 뉴클레오티드 666 까지의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드를 코드화하는; 또는 펙틴 리아제 활성을 가지고 있고 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 91 에서 뉴클레오티드 1485 까지의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드를 코드화하는; 또는 폴리갈락투로나제 활성을 가지고 있고 SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 1 에서 뉴클레오티드 1248 까지의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자; (b) (a) 의 종 상동체; (c) SEQ ID NO: 8 의 아미노산 잔기 28 에서 아미노산 잔기 341 까지의 아미노산 서열에 대해 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 잔기 28 에서 아미노산 잔기 221 까지의 아미노산 서열에 대해 최소한 70 % 동일한 펙테이트 리아제 활성을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는; 또는 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 잔기 31 에서 아미노산 잔기 494 까지의 아미노산 서열에 대해 최소한 70 % 동일한 펙틴 리아제 활성을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는; 또는 SEQ ID NO: 6 의 아미노산 잔기 1 에서 아미노산 잔기 415 까지의 아미노산 서열에 대해 최소한 70 % 동일한 폴리갈락투로나제 활성을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자; (d) (a), (b) 또는 (c) 의 축퇴성 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된 DNA 절편; 및 전사 터미네이터.

또 다른 측면으로, 본 발명은 그 안에 상술된 바와 같은 발현 벡터가 도입되어 있는 배양된 세포를 제공하는데, 이 세포는 DNA 절편에 의하여 코드화된 폴리펩티드를 발현한다.

본 발명의 추가의 측면으로, (a) SEQ ID NO: 8 의 아미노산 잔기 28 에서 아미노산 잔기 341 까지의 아미노산 잔기 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드 분자; (b) SEQ ID NO: 4 의 아미노산 잔기 28 에서 아미노산 잔기 221 까지의 아미노산 잔기 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드 분자; 및 (c) (a) 또는 (b) 의 종 상동체로 이루어지는 군으로부터 선택된, 펙테이트 리아제 활성을 가지고 있는 단리된 폴리펩티드가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면으로는, (a) SEQ ID NO: 2 의 아미노산 잔기 31 에서 아미노산 잔기 494 까지의 아미노산 잔기 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드 분자; 및 (b) (a) 의 종 상동체로 이루어지는 군으로부터 선택된, 펙틴 리아제 활성을 가지고 있는 단리된 폴리펩티드가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면으로, (a) SEQ ID NO: 6 의 아미노산 잔기 1 에서 아미노산 잔기 415 까지의 아미노산 잔기 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드 분자; 및 (b) (a) 의 종 상동체로 이루어지는 군으로부터 선택된, 폴리갈락투로나제 활성을 가지고 있는 단리된 폴리펩티드가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면으로, 다른 폴리펩티드와 결합된 본 발명에 따르는 정제된 폴리펩티드를 포함하고 있는 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면으로, 상술된 바와 같은 발현 벡터가 그 안에 도입되어 있는 세포를 배양하고, 그로써 상기 세포가 DNA 절편에 의하여 코드화된 폴리펩티드를 발현하고, 그 폴리펩티드를 회수하는 것으로 이루어지는, 본 발명에 따르는 폴리펩티드의 제조 방법이 제공된다.

본 발명의 신규한 효소는 셀룰로스 물질, 특히 셀룰로스-함유 섬유, 실, 직조된 또는 부직조 직물의 처리, 기계식 종이-제조 펄프 또는 재순환된 폐종이의 처리, 및 섬유의 레팅(retting)에 유용하다. 처리는 셀룰로스성 물질의 의류 제조 또는 직물 제조용으로 준비된 물질로의 가공처리중에, 예컨대 디사이징 또는 연마 단계에서; 또는 그러한 직물 또는 의류의 공업용 또는 가정용 세탁중에 수행될 수 있다.

따라서, 추가의 측면으로 본 발명은 실질적인 펙틴 분해 활성을 가지고 있는 효소를 포함하고 있는 세제 조성물; 및 셀룰로스-함유 섬유, 실, 직조된 또는 부직 직물의 처리를 위한 본 발명의 효소의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 효소는 셀룰로스성 물질의 제조에서 효소적 연마 공정에, 예컨대 계속되는 염색 조작에서의 적절한 반응을 위해 사용되기에 매우 효과적이다. 나아가, 신규한 효소를 포함하고 있는 세제 조성물은 세탁물에 존재하는 특정한 얼룩 또는 오염물, 특히 갈락탄 또는 아라비노갈락탄 함유 식품, 식물 등으로부터 유발된 얼룩 및 반점을 제거 또는 표백할 수 있는 것으로 예상된다. 또한 신규한 효소를 포함하고 있는 세제 조성물을 사용한 처리는 특정 얼룩이 셀룰로스성 물질에 결합하는 것을 방지할 수 있을 것으로 예상된다. 본 발명의 효소는 또한 클리닝이 필요한 경질 표면으로부터 어떤 얼룩 또는 오염물을 제거하거나 또는 제거하는 것을 보조하는 효과를 가지고 있는 경질 표면 클리닝 조성물의 성분으로서 유용하다.

정의

본 발명을 보다 상세하게 논하기 전에 다음의 용어들을 먼저 정의하기로 한다.

용어 ″오르토로그 (또는 종 상동체)″ 는 상이한 종으로부터 얻어지는 유사한 폴리펩티드 또는 단백질에 대하여 상동성을 가지고 있는 한 종으로부터 얻어지는 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다.

용어 ″파라로그″ 는 동일한 종으로부터 얻어지는 구별되는 폴리펩티드 또는 단백질에 대해 상동성을 가지고 있는 주어진 종으로부터 얻어지는 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다.

용어 ″발현 벡터″ 는 그것의 전사를 제공하는 추가의 절편에 작동가능하게 연결되어 있는 관심의 폴리펩티드를 코드화하는 절편을 포함하고 있는 선형 또는 원형의 DNA 분자를 나타낸다. 그러한 추가의 절편으로는 프로모터 및 터미네이터 서열이 있으며, 임의로 하나 또는 둘 이상의 복제 기원, 하나 또는 둘 이상의 선택가능한 마아커, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA 로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 엘레먼트를 함유할 수 있다. 본 발명의 발현 벡터는 재조합 DNA 과정을 편리하게 수행받을 수 있는 것이면 어떠한 발현 벡터도 될 수 있으며, 선택된 벡터는 때로 그 안에 벡터가 도입될 숙주 세포에 따라 좌우될 것이다. 그러므로, 벡터는 자동적으로 복제하는 벡터, 즉 염색체외에 존재하는 벡터일 수 있고, 그것의 복제는 염색체와는 무관한 것, 예컨대 플라스미드이다. 또는 달리, 벡터는 숙주 세포에 도입되었을 때, 숙주 세포 게놈안에 통합되어 그것이 통합된 염색체(들)과 함께 복제되는 것일 수 있다.

용어 ″재조합 발현된″ 또는 ″재조합적으로 발현된″ 은 폴리펩티드 또는 단백질의 발현과 관련하여 당해 기술분야에 공지된 표준 정의에 따라 규정된다. 단백질의 재조합적인 발현은 일반적으로 상술된 바와 같은 발현 벡터를 사용함으로써 수행된다.

용어 ″단리된″ 은 폴리뉴클레오티드 분자에 적용되었을 때에는, 폴리뉴클레오티드가 그것의 천연적인 환경으로부터 제거되었고, 따라서 다른 외래성 또는 원하지 않는 코딩 서열이 없으며, 유전학적으로 공학처리된 단백질 제조 시스템내에서 사용하기에 적당한 형태인 것을 말한다. 그러한 단리된 분자들은 그것들의 천연 환경으로부터 분리되는 것들이며 cDNA 및 게놈 클론이 포함된다. 본 발명의 단리된 DNA 분자는 그것들이 원래 결합되었던 다른 유전자들이 없지만, 자연적으로 발생하는 5' 및 3' 미번역 영역, 예컨대 프로모터 및 터미네이터를 포함할 수 있다. 결합된 영역의 확인은 당업자에게는 명백할 것이다 (Dynan and Tijan, Nature 316:774-778, 1985). 용어 ″단리된 폴리뉴클레오티드″ 는 다르게는 ″클론된 폴리뉴클레오티드″ 로 사용될 수도 있다.

단백질/폴리펩티드에 적용되었을 때 용어 ″단리된″ 은 그것의 천연 환경 이외의 조건에서 단백질이 발견되는 것을 가리킨다. 바람직한 형태에서, 단리된 단백질은 실질적으로는 다른 단백질, 특히 다른 상동하는 단백질 (즉 ″동종성 불순물″)이 없다. 단백질은 40 % 이상 순수한 형태로, 보다 바람직하게는 60 % 이상 순수한 형태로 제공되는 것이 바람직하다.

보다 바람직하게는, 단백질은 고도로 정제된 형태로, 즉 SDS-PAGE 에 의해 측정되는 바, 80 % 이상 순수한 형태로, 보다 바람직하게는 95 % 이상 순수한 형태로, 가장 바람직하게는 99 % 이상 순수한 형태로 제공되는 것이 바람직하다.

용어 ″단리된 단백질/폴리펩티드″ 는 용어 ″정제된 단백질/폴리펩티드″ 로도 교체 사용될 수 있다.

용어 ″동종성 불순물″ 은 본 발명의 폴리펩티드가 원래 기원하는 동종성 세포로부터 기원하는 어떠한 불순물 (예컨대 본 발명의 폴리펩티드 이외의 다른 폴리펩티드)을 의미한다.

용어 ″으로부터 얻어진″ 은 특정 미생물 공급원과 관련하여 사용되는 바, 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드가 특정 공급원에 의해, 또는 공급원으로부터의 유전자가 삽입되어 있는 세포에 의해 생성되는 것을 의미한다.

용어 ″에 대해 내인성″ 은 특정 미생물 공급원과 관련하여 사용되는 바, 폴리펩티드가 천연 유전자, 즉 공급원의 세포에 재조합적으로 삽입되지 않은 유전자의 공급원에서의 존재에 기인하여 특정 공급원에 의하여 생성되는 것을 의미한다.

용어 ″작동가능하게 연결된″ 은 DNA 절편을 언급할 때, 절편들이 그것들의 의도된 목적을 위해 조화롭게 기능하도록, 예컨대 전사가 프로모터에서 개시되고, 코딩 서열을 통하여 터미네이터까지 진행되도록 배열되는 것을 나타낸다.

용어 ″푤리뉴클레오티드″ 는 5' 단부에서 3' 단부쪽으로 판독되는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일- 또는 이중-가닥 중합체를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 및 DNA 를 포함하며, 천연 공급원으로부터 단리될 수 있고, 시험관내에서 합성될 수도 있으며, 천연 및 합성 분자의 조합으로부터 제조될 수도 있다.

용어 ″폴리뉴클레오티드 분자의 상보물″ 은 상보하는 염기 서열 및 참조 서열과 비교하여 역 배향을 가지고 있는 폴리뉴클레오티드 분자를 나타낸다. 예를 들어, 서열 5' ATGCACGGG 3' 은 5' CCCGTGCAT 3' 에 상보한다.

용어 ″축퇴성 뉴클레오티드 서열″ 은 (폴리펩티드를 코드화하는 참조용 폴리뉴클레오티드 분자와 비교하여) 하나 또는 둘 이상의 축퇴성 코돈을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 축퇴성 코돈은 뉴클레오티드의 상이한 트리플렛을 함유하지만, 동일한 아미노산 잔기를 코드화한다 (즉 GAU 와 GAC 트리플렛은 각각 Asp 를 코드화한다).

용어 ″프로모터″ 는 RNA 중합효소의 결합 및 전사의 개시를 제공하는 DNA 서열을 함유하고 있는 유전자 부분을 나타낸다. 프로모터 서열은 반드시 그런 것은 아니지만 통상적으로 유전자의 5' 비-코딩 영역에서 발견된다.

용어 ″분비 신호 서열″ 은 보다 큰 폴리펩티드의 성분으로서, 그것이 합성되는 세포의 분비 경로를 통하여 보다 큰 폴리펩티드를 지정하는 폴리펩티드 (″분비 펩티드″)를 코드화하는 DNA 서열을 의미한다. 보다 큰 펩티드는 통상 일시적으로 분비 경로를 통과하는 중에 분비 펩티드가 제거되도록 절단된다.

용어 ″펙틴″ 은 고등급으로 또는 저등급으로 에스테르화될 수 있는 펙테이트, 폴리갈락투론산, 및 펙틴을 나타낸다.

용어 ″펙틴 분해 효소″ 또는 ″펙티나제″ 는 펙티나제가 주로 폴리(1,4-알파-D-갈락투로니드) 와 그것의 유도체인 펙틴성 물질의 글리코시드 결합을 절단하는 효소군에 속하는 경우에 당해 기술분야에 따라 규정된 펙티나제 효소를 의미한다 (Sakai et al., 1993).

바람직하게는 본 발명의 펙티나제는 폴리갈락투론산으로도 불리는 펙트산의 알파-1,4-글리코시드 결합의 무작위 절단을 트란스엘러미네이션 (transelimination)에 의하여 촉매하는, 폴리(1,4-알파-D-갈락투로니드) 리아제 또는 펙테이트 리아제로도 불리우는 효소 부류 폴리갈락투로네이트 리아제 (EC 4.2.2.2) (PGL)과 같은 펙티나제 효소이다. 또한 바람직한 것은 엔도-PG 로서도 알려져 있는 효소 부류 폴리갈락투로나제 (EC 3.2.1.15)(PG)와 같은 펙트산의 알파-1,4-글리코시드 결합의 무작위 가수분해를 촉매하는 펙티나제 효소이다. 또한 펙틴의 알파-1,4-글리코시드 결합의 무작위 절단을 촉매하는 펙틴 리아제로서도 알려져 있는 폴리(메톡시갈락투로니드)리아제로서 공지되어 있고, 또한 엔도-PMGL 로서도 알려져 있는 폴리메틸갈락투로네이트 리아제 (EC 4.2.2.10)와 같은 펙티나제 효소가 바람직하다.

본 발명은 펙틴 분해 효소 제제; 바람직하게는 미생물 펙틴 분해 효소에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 중성 및 알칼리성 pH 범위에서 그것들의 주요 효소 활성으로서 펙틴 분해 활성을 나타내는 미생물 효소, 특히 바실루스 리케니포르미스로부터 유도된 클론된 펙틴 분해 효소; 그러한 효소의 제조 방법; 및 그러한 효소를 직물, 세제 및 셀룰로스 섬유 가공처리 산업에 사용하기 위한 방법에 관한 것이다.

다른 관련된 서열을 얻기 위하여 본 발명의 서열을 사용하는 방법: 본 발명의 펙테이트 리아제를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 서열과 관련하여 본원에 개시된 서열 정보는 다른 상동하는 펙테이트 리아제를 확인하기 위한 도구로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)은 다양한 미생물 공급원, 특히 상이한 바실루스 종으로부터 얻어지는 다른 상동하는 펙테이트 리아제를 코드화하는 서열을 증폭시키기 위하여 사용될 수 있다.

폴리뉴클레오티드: 본 발명의 바람직한 구체예내에서, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 최소한 중간 정도의 엄격한 조건하에서 각각 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7 의 유사한 크기의 영역, 또는 그것에 상보하는 서열에 혼성화할 것이다.

특히 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 1 의 위치 91 부터 1485, SEQ ID NO: 3 의 위치 82 부터 666, SEQ ID NO: 5 의 위치 1 부터 1248, 또는 SEQ ID NO: 7 의 위치 82 부터 1026 에 도시되어 있는 전체 서열 (폴리펩티드의 성숙한 부분을 코드화함), 또는 최소한 중간 정도의 엄격한 조건하에서, 그러나 바람직하게는 하기에서 상세하게 설명되는 바와 같은 매우 엄격한 조건하에서 최소한 약 100 염기쌍의 길이를 가지고 있는, 각각 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7 의 하위서열을 포함하고 있는 어떠한 프로브중 어느 하나를 포함하고 있는 변성된 이중-가닥의 DNA 프로브에 혼성화할 것이다. 중간의, 또는 매우 엄격한 조건에서 뉴클레오티드 프로브와 상동하는 DNA 또는 RNA 서열 사이의 혼성화를 측정하기 위한 적당한 실험 조건은, 혼성화시키고자 하는 DNA 단편 또는 RNA 를 함유하고 있는 필터를 5×SSC (염화 나트륨/시트르산 나트륨, Sambrook 등, 1989)에서 10 분동안 예비침지시키고, 필터를 5×SSC, 5×덴하르드트 용액 (Sambrook 등, 1989), 0.5 % 의 SDS 및 100 ㎍/ml 의 변성된 초음파처리된 연어 정자 DNA (Sambrook 등, 1989)의 용액중에서 예비혼성화시킨 후, 10 ng/ml 농도의 무작위-프라임된 (Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132:6-13)³²P-dCTP-표지된 (1×10⁹cpm/㎍ 보다 큰 비활성) 프로브를 함유하고 있는 동일한 용액중에서 12 시간동안 45 ℃ 에서 혼성화시키는 것을 포함한다. 그런 다음 필터는 30 분동안 2×SSC, 0.5 % 의 SDS 에서 최소한 60 ℃ 에서 (중간 정도의 엄격도), 보다 바람직하게는 최소한 65 ℃ 에서 (중간/높은 엄격도), 보다 더 바람직하게는 최소한 70 ℃ 에서(높은 엄격도), 더욱 바람직하게는 최소한 75 ℃ 에서 (매우 높은 엄격도) 2 회 세척된다.

이들 조건하에서 올리고뉴클레오티드 프로브가 혼성화하는 분자들은 X-선 필름을 사용하여 검출된다.

앞에서 주지된 바와 같이, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 DNA 및 RNA 를 포함한다. DNA 및 RNA 를 단리하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 관심의 유전자를 코드화하는 DNA 및 RNA 는 당해 기술분야에 공지되어 있는 방법에 의해 Gene Bank 또는 DNA 라이브러리에 클론될 수 있다.

본 발명의 펙테이트 리아제 활성을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 그런 다음, 예컨대 혼성화 또는 PCR 에 의하여 확인되고 단리된다.

본 발명은 또한 추가로 상이한 박테리아 스트레인으로부터 얻어지는 대응 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 (오르토로그 또는 파라로그)를 제공한다. 특히 관심을 끄는 것은 바실루스종을 포함하여 그람-포지티브 친알칼리성 스트레인으로부터 얻어지는 펙틴 분해 폴리펩티드이다.

본 발명의 펙틴 분해 활성을 나타내는 폴리펩티드의 종 상동체는 본 발명에 의해 제공되는 정보 및 조성을 종래의 클로닝 기법과 함께 사용하여 클론될 수 있다. 예를 들어, DNA 는 단백질을 발현하는 세포 유형으로부터 얻어지는 염색체성 DNA 를 사용하여 클론될 수 있다. DNA 의 적당한 공급원은 노던 블롯을 본원에 개시된 서열로부터 디자인된 프로브로 프로빙함으로써 확인될 수 있다. 그런 다음 라이브러리가 포지티브 셀라인의 염색체성 DNA 로부터 제조된다. 그런 다음 본 발명의 펙틴 분해 활성을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 가 다양한 방법, 예컨대 완전한 또는 부분적인 DNA 로 프로빙함에 의해, 또는 개시된 서열을 토대로 한 축퇴성 프로브의 하나 또는 둘 이상의 세트로 프로빙함에 의해 단리될 수 있다. DNA 는 또한 중합효소 연쇄 반응을 사용하여, 또는 본원에 개시된 서열로부터 디자인된 프라이머를 사용하는 PCR (Mullis, 미국 특허 4,683,202 호)을 사용하여 클론될 수 있다. 추가의 방법으로, DNA 라이브러리는 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있고, 관심의 DNA 의 발현은 바실루스 리케니포르미스 ATCC 14580 으로부터 클론되고, 하기의 재료 및 방법과 실시예에서 설명되는 바와 같이 발현되고 정제된 펙테이트 리아제, 펙틴 리아제 또는 폴리갈락투로나제에 대하여 발생된 항체 (단클론성 또는 다클론성)를 사용하여, 또는 펙틴 분해 활성을 가지고 있는 폴리펩티드에 관련된 활성 시험에 의하여 검출될 수 있다. 유사한 기법들이 또한 게놈 클론의 단리에 적용될 수 있다.

본 발명의 대장균 DSM 11789 및 대장균 DSM 12030 및 대장균 DSM 12031 에 존재하는 플라스미드 pSJ1678 안에 클론된 DNA 서열의 폴리펩티드 코드화 부분 및/또는 유사한 DNA 서열은 펙틴 분해 활성을 가지는 효소를 생성하는 박테리아 종 바실루스 리케니포르미스의 스트레인, 바람직하게는 스트레인 ATCC 14580, 또는 본원에 개시된 다른 또는 관련된 유기체로부터 클론될 수 있다.

또는 달리, 유사한 서열은 대장균 DSM 11789, 대장균 DSM 12030 또는 대장균 DSM 12301 에 존재하는 플라스미드로부터 얻을 수 있는 DNA 서열, 예컨대 그것의 하위서열을 토대로, 및/또는 DNA 서열에 의하여 코드화된 펙틴 분해 효소의 다른 아미노산 서열에 대해서는 발생하지 않지만, 효소의 생성을 위해 의도된 숙주 유기체의 코돈 관례에 상응하는 뉴클레오티드 치환의 도입에 의해, 또는 상이한 아미노산 서열 (즉 본 발명의 펙틴 분해 효소의 변이체)에 대해 발생할 수 있는 뉴클레오티드 치환의 도입에 의해 제조될 수 있다.

본원에 개시된 서열 정보를 토대로, 본 발명의 펙티나제를 코드화하고 각각 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7 에 도시된 DNA 서열을 포함하는 전체 길이의 DNA 서열이 클론될 수 있다.

클로닝은 당해기술분야에 공지되어 있는 표준 과정들에 의해, 예컨대

바실루스 스트레인으로부터 게놈성 라이브러리를 준비하고;

그러한 라이브러리를 적당한 기질 플레이트위에 플레이팅하고;

본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고 있는 클론을 각각 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7 을 토대로 한 프로브를 사용하여 표준 혼성화 기법에 의하여 확인하는 방법에 의해; 또는 상기 바실루스 리케니포르미스 ATCC 14580 게놈 라이브러리로부터의 클론을 각각 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7 로부터 얻어지는 서열 정보를 토대로 한 프라이머를 사용하는 역 PCR 전략에 의하여 확인하는 방법에 의해 수행될 수 있다. 역 PCR 에 대한 보다 상세한 설명은 문헌을 참조한다 (M.J. MCPherson et al., ″PCR A practical approach″ Information Press Ltd, Oxford England).

본원에 개시되는 서열 정보 (SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8)를 토대로 하여, 당업자에게는 관련된 미생물 유기체로부터, 특히 바실루스 서브틸리스와 같은 바실루스 속의 다른 스트레인으로부터 얻어지는 게놈 라이브러리로부터 얻어지는 게놈 라이브러리를 사용하여 유사한 전략에 의하여 본 발명의 동종성 펙티나제를 코드화하는 상동성 폴리뉴클레오티드 서열을 단리하는 것은 기본적인 일이다.

또는 달리, 본 발명의 펙틴 분해 효소를 코드화하는 DNA 는 잘 알려져 있는 과정에 따라, 적당한 공급원, 예를 들면 하기에서 언급되는 유기체중 어느 것으로부터, 대장균 DSM 11789, 대장균 DSM 12030 또는 대장균 DSM 12301 에 존재하는 플라스미드로부터 얻을 수 있는 DNA 서열을 토대로 하여 제조된 합성 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써 편리하게 클론될 수 있다.

따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자는, 상술된 바와 같이 클로닝에 의하여 얻어진 플라스미드가 기탁되어 있는 대장균 DSM 11789, 대장균 DSM 12030 또는 대장균 DSM 12301 로부터 단리될 수 있다. 또한, 본 발명은 대장균 DSM 11789, 대장균 DSM 12030 또는 대장균 DSM 12301 스트레인의 각각의 단리된 실질적으로 순수한 생물학적 배양물에도 관련된다.

폴리펩티드: SEQ ID NO: 4 의 아미노산 28 부터 221 의 서열은 성숙한 펙테이트 리아제 서열이다; 위치 1 부터 27 은 전서열 (prosequence)이다. SEQ ID NO: 8 의 아미노산 28 부터 341 의 서열은 성숙한 펙테이트 리아제 서열이다; 위치 1 부터 27 은 전서열이다. SEQ ID NO: 2 의 아미노산 31 부터 494 의 서열은 성숙한 펙틴 리아제 서열이다; 위치 1 부터 30 은 전서열이다. SEQ ID NO: 6 의 아미노산 1 부터 415 의 서열은 성숙한 폴리갈락투로나제 서열이다.

본 발명은 또한 각각 SEQ ID NO: 2, 4, 6 및 8 의 폴리펩티드에 실질적으로 상동하는 펙틴 분해 폴리펩티드, 및 그것들의 종 상동체 (파라로그 또는 오르토로그)를 제공한다. 용어 ″실질적으로 상동하는″ 은 본원에서 각각 SEQ ID NO: 2, 4, 6 및 8 에 도시된 서열, 또는 그것들의 오르토로그 또는 파라로그에 대하여 최소한 60 %, 바람직하게는 최소한 70 %, 보다 바람직하게는 최소한 80 %, 더욱 더 바람직하게는 최소한 90 % 의 서열 동일성을 가지고 있는 폴리펩티드를 의미하는 것으로 사용된다. 그러한 폴리펩티드들은 각각 SEQ ID NO: 2, 4, 6 및 8 에 도시된 서열, 또는 그것들의 오르토로그 또는 파라로그에 대하여 최소한 95 % 동일한 것이 보다 바람직할 것이며, 가장 바람직한 것은 98 % 이상 동일한 것이다. % 서열 동일성은 종래 방법에 의해, 당해 기술분야에 공지되어 있는 컴퓨터 프로그램, 예컨대 GCG 프로그램 팩키지에 제공된 GAP 에 의해 측정된다 (Program manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S. B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453). GAP 는 폴리펩티드 서열 비교를 위한 다음의 세팅으로 사용된다: 3.0 의 GAP 크리에이션 페널티 및 0.1 의 GAP 연장 페널티.

폴리뉴클레오티드 분자의 서열 동일성은 DNA 서열 비교를 위한 다음의 세팅을 사용하는 GAP 을 사용하여 유사한 방법에 의하여 측정된다: 5.0 의 GAP 크리에이션 페널티 및 0.3 의 GAP 연장 페널티.

본 발명은 부분적으로는 다른 미생물의 아미노산 펙티나제 서열에 대해 상동성을 가지고 있는 폴리펩티드 서열을 코드화하는 바실루스 리케니포르미스 스트레인으로부터 얻어진 여러개의 신규한 폴리뉴클레오티드 서열의 발견을 토대로 한다.

신규한 바실루스 리케니포르미스 펙티나제는 다음과 같이 표시되었다:

I: 펙테이트 리아제 (EC 4.2.2.2)

II: 펙테이트 리아제 (EC 4.2.2.2)

III: 펙틴 리아제 (EC 4.2.2.10)

IV: 폴리갈락투로나제 (EC 3.2.1.15)

본 발명의 신규한 펙티나제 폴리펩티드 서열은 처음에는 펙티나제에 대해 상동하는 서열을 확인하기 위하여 바실루스 리케니포르미스 서열 데이터베이스에 대해, 대표되는 연구 서열, 구체적으로 공지의 펙티나제의 아미노산 서열에 대해 의문을 가짐으로써 확인되었다.

추가로 하기에서 보다 상세하게 설명되는 바와 같은 종래의 % 서열 동일성 프로그램을 사용하여, 바로 앞의 선행 기술의 공지된 펙티나제에 대한 첨부된 SEQ ID NO: 2(III), 4(I), 6(IV), 8(II)의 아미노산 서열의 아미노산 서열 동일성을 하기의 표 1, 2 및 3 에 나타낸다.

표 1

펙테이트 리아제 (I) 에 대한 아미노산 서열 사이의 상동성

본 발명의 펙테이트 리아제에 대하여 가장 상동하는 펙틴 분해 단백질은 국제 특허 출원 공보 WO 98/45393 에서 성숙한 단백질 서열 SEQ ID NO: 4 에 58.8 % 상동하는 SEQ ID NO: 1 로서 발견되는 바실루스 종 스트레인 KSM-P15 이다.

표 2

펙테이트 리아제 (II) 에 대한 아미노산 서열 사이의 상동성

유사성에 대해 사용된 서열은 개략도에 열거된 유전자좌를 가지고 있는 TREMBLREL 로부터 얻어지는 단백질 서열이다.

II: 본 발명의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 8)

B: o08454.sp_박테리아 아미코라타 sp. 펙테이트 리아제

C: q00893.sp_진균 글로메렐라 신굴라타

II B C

II 100 %

40.8 % 40.5 %

B 100 %

40.8 %

C 100 %

40.5 %

표 3

펙틴 리아제 (III) 에 대한 아미노산 서열 사이의 상동성

본 발명의 펙틴 리아제에 대하여 가장 상동하는 펙틴 리아제 단백질은 바실루스 서브틸리스 펙틴 리아제 034819 및 바실루스 서브틸리스 펙틴 리아제 P94449 이며, 이 두가지 단백질은 TREMBL 데이터 베이스에서 발견된다 (EMBL/GENBANK/DDBJ DATA BANKS).

표 4

폴리갈락투로나제에 대한 아미노산 서열 사이의 상동성

유사성에 대해 사용된 서열들은 개략도에 열거된 유전자좌를 가지고 있는 SWISSPROT 로부터 얻어지는 단백질 서열들이다.

IV: 본 발명의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 6)

B: p27644.swissprot_박테리아 아그로박테리움 튜메파시엔스

C: p20041.swissprot_박테리아 부르콜다리아 솔라나케아룸

IV B C

IV 100 %

36.6 % 30.2 %

B 100 %

36.6 %

C 100 %

30.2 %

본 발명의 효소 제제는 바람직하게는 미생물로부터, 바람직하게는 박테리아, 아르키아 또는 진균, 특히 바실루스에 속하는, 바람직하게는 바실루스 리케니포르미스 종 및 모든 종이 바람직하게는 배열된 16S rDNA 서열을 토대로 바실루스 리케니포르미스와 최소한 99 % 상동하는 밀접하게 관련된 바실루스 종으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있는 친알칼리성 바실루스 스트레인에 속하는 박테리아와 같은 박테리아로부터 유도된다.

실질적으로 상동하는 단백질 및 폴리펩티드들은 하나 또는 둘 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 가지는 것을 특징으로 한다. 이들 변화는 바람직하게는 무시할만한 성질의 것, 즉 보존성 아미노산 치환 (표 5 참조) 및 단백질 또는 폴리펩티드의 접힘 또는 활성에 유의할만한 정도로 영향을 미치지 않는 다른 치환; 작은 결실, 전형적으로 1 내지 약 30 개의 아미노산의 결실; 및 작은 아미노- 또는 카르복시-말단 연장, 예컨대 아미노-말단 메티오닌 잔기, 약 20 내지 25 잔기의 작은 링커 펩티드, 또는 정제를 용이하게 하는 작은 연장 (친화성 꼬리), 예컨대 폴리-히스티딘 트랙, 단백질 A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991; Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95-107, 1991)이다. 친화성 꼬리를 코드화하는 DNA 들은 상업적인 공급자들 (예컨대 Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; New England Biolabs, Beverly, MA)로부터 활용가능하다.

표 5

보존성 아미노산 치환

염기성	아르기닌라이신히스티딘
산성	글루탐산아스파르트산
극성	글루타민아스파라긴
소수성	로이신이소로이신발린
방향성	페닐알라닌트립토판티로신
작은 크기	글리신알라닌세린트레오닌메티오닌

20 개의 표준 아미노산 외에, 비-표준 아미노산 (예컨대 4-히드록시프롤린, 6-N-메틸 라이신, 2-아미노이소부티르산, 이소발린 및 a-메틸 세린)이 본 발명에 따르는 폴리펩티드의 아미노산 잔기 대신 치환될 수 있다. 제한된 수의 비-보존성 아미노산, 유전자 코드에 의해 코드화되지 않은 아미노산, 및 비천연 아미노산들이 아미노산 잔기 대신 치환될 수 있다. ″비천연 아미노산″ 은 단백질 합성후에 변형되었고, 및/또는 그것들의 측쇄(들)에 표준 아미노산의 화학적 구조와는 상이한 화학적 구조를 갖는다. 비천연 아미노산들은 화학적으로 합성될 수 있거나, 또는 바람직하게는 상업적으로 활용가능하고, 피페콜산, 티아졸리딘 카르복실산, 데히드로프롤린, 3- 및 4-메틸프롤린, 및 3,3-디메틸프롤린을 들 수 있다.

본 발명의 펙테이트 리아제 폴리펩티드의 필수 아미노산들은 당해 기술분야에 공지되어 있는 과정, 예컨대 부위-특정 돌연변이생성 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이생성 (Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085, 1989)에 따라 확인될 수 있다. 후자의 기법에서, 단일 알라닌 돌연변이가 분자내의 매 잔기마다 도입되고, 그 결과의 돌연변이 분자는 분자의 활성에 중요한 아미노산 잔기를 확인하기 위하여 생물학적 활성 (즉 펙틴 분해 활성)에 대해 시험된다 (Hilton et al., J. Biol. Chem. 271:4699-4708, 1996). 효소의 활성 부위 또는 다른 생물학적 상호반응은 또한 잠정적인 접촉 부위 아미노산의 돌연변이와 함께 사용되는 구조의 물리적 분석에 의해, 예컨대 핵자기 공명, 결정학, 전자 회절 또는 광친화성 표지화와 같은 기법에 의해 측정될 수 있다 (de Vos et al., Science 255:306-312, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992). 필수 아미노산의 정체는 또한 본 발명에 따르는 폴리펩티드와 관련된 폴리펩티드의 상동성에 대한 분석으로부터 추론될 수 있다.

다중 아미노산 치환은 돌연변이생성, 재조합 및/또는 셔플링과, 이어서 관련된 스크리닝 과정, 예컨대 라이드하르-올슨 및 사우어에 의해 개시된 방법 (Reidhaar-Olson, Science 241:53-57, 1988), 보위와 사우어에 의해 개시된 방법 (Bowie and Sauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156, 1989), WO 95/17413 또는 WO 95/22625 에 개시된 방법을 사용하여 만들어지고 시험될 수 있다. 간단하게 설명하면, 상기 저자들은 폴리펩티드의 둘 또는 그 이상의 위치에서 동시에 무작위화하는 방법, 또는 상이한 돌연변이의 재조합/셔플링법 (WO 95/17413, WO 95/22625), 이어서 기능적인 폴리펩티드의 선택법과, 그런 다음 각각의 위치에서 허용되는 치환의 스펙트럼을 측정하기 위하여 돌연변이된 폴리펩티드를 서열화하는 방법을 개시한다. 사용될 수 있는 다른 방법으로는 파지 디스플레이법 (예컨대 Lowman et al., Biochem. 30:10832-10837, 1991; Lander et al., 미국 특허 5,223,409 호; Huse, WIPO 공보 WO 92/06204) 및 영역-특정된 돌연변이생성법 (Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988)이 있다.

상술된 바와 같은 돌연변이생성법/셔플링 방법은 숙주 세포에서 클론되고 돌연변이된 폴리펩티드의 활성을 검출하기 위하여 고-출력의 자동화된 스크리닝 방법과 함께 사용될 수 있다. 활성 폴리펩티드를 코드화하는 돌연변이된 DNA 분자들은 숙주 세포로부터 회수될 수 있고, 현대적인 장비를 사용하여 신속하게 서열화될 수 있다. 다른 방법은 관심의 폴리펩티드에 있는 개별적인 중요한 아미노산 잔기를 신속하게 측정하는 것을 가능하게 하고, 미지의 구조를 가지고 있는 폴리펩티드에도 적용될 수 있다.

상기 논의된 방법들을 사용하여, 당업자는 SEQ ID NO: 2 (성숙한 단백질)의 잔기 31 부터 494 까지, SEQ ID NO: 4 의 잔기 28 부터 221 까지, SEQ ID NO: 6 의 잔기 1 부터 415 까지 및 SEQ ID N0: 8 의 잔기 28 부터 341 까지에 실질적으로 상동하고 야생형 단백질의 펙틴 분해 활성을 보유하고 있는 다양한 폴리펩티드를 확인 및/또는 제조할 수 있다.

본 발명은 한 측면으로, SEQ ID NO: 2 의 위치 31 부터 494 까지의 아미노산 서열, 또는 펙틴 리아제가 탈활성화되지 않고 돌연변이가 SEQ ID NO: 2 의 위치 377 에 있는 아르기닌과 위치 383 에 있는 아르기닌을 보존한다면 하나 또는 둘 이상의 아미노산 잔기의 결실, 대체 또는 첨가 (이하 돌연변이라 언급함)에 의하여 그것으로부터 유도되는 아미노산 서열을 가지고 있는 펙틴 리아제 효소에 관한 것이다. 또한, 돌연변이 정도는 상기 설명된 377 번째 위치와 383 번째 위치에 있는 아르기닌이 보존되기만 한다면 특별하게 제한되지는 않는다. 바람직하게도, 천연 또는 모 펙틴 리아제 효소의 그러한 돌연변이 변이체들 사이에는, SEQ ID NO: 2 의 아미노산 위치 31 부터 375 까지에 상응하는 부분적인 서열에 대하여 계산되는 바, 56 % 또는 그 이상의 상동성이 존재한다. 보다 바람직한 것은, 상동성이 70 % 이상, 특히 80 % 이상인 경우이다.

나아가, 본 발명은 한 측면으로, SEQ ID NO: 4 의 위치 28 내지 221 의 아미노산 서열, 또는 펙틴 리아제가 탈활성화되지 않고 돌연변이가 SEQ ID NO: 4 의 위치 133 및 155 에 있는 라이신과 158 에 있는 아르기닌을 보존한다면 하나 또는 둘 이상의 아미노산 잔기의 결실, 대체 또는 첨가 (이하 돌연변이라 언급함)에 의하여 그것으로부터 유도되는 아미노산 서열을 가지고 있는 펙테이트 리아제 효소에 관한 것이다. 또한, 돌연변이 정도는 상기 설명된 K133, K155 및 R158 이 보존되기만 한다면 특별하게 제한되지는 않는다. 바람직하게도, 천연 또는 모 펙틴 리아제 효소의 그러한 돌연변이 변이체들 사이에는, SEQ ID NO: 4 의 아미노산 위치 60 부터 158 까지에 상응하는 부분적인 서열에 대하여 계산되는 바, 66 % 또는 그 이상의 상동성이 존재한다. 보다 바람직한 것은, 상동성이 70 % 이상, 특히 80 % 이상인 경우이다.

나아가, 본 발명은 한 측면으로, SEQ ID NO: 8 의 위치 28 내지 341 의 아미노산 서열, 또는 펙틴 리아제가 탈활성화되지 않고 돌연변이가 SEQ ID NO: 8 의 위치 233 및 238 에 있는 아르기닌 (R233 및 R238)을 보존한다면 하나 또는 둘 이상의 아미노산 잔기의 결실, 대체 또는 첨가 (이하 돌연변이라 언급함)에 의하여 그것으로부터 유도되는 아미노산 서열을 가지고 있는 펙테이트 리아제 효소에 관한 것이다. 또한, 돌연변이 정도는 상기 설명된 R233 및 R238 이 보존되기만 한다면 특별하게 제한되지는 않는다. 바람직하게도, 천연 또는 모 펙틴 리아제 효소의 그러한 돌연변이 변이체들 사이에는, SEQ ID NO: 8 의 성숙한 서열에 대하여 계산되는 바, 42 % 또는 그 이상의 상동성이 존재한다. 보다 바람직한 것은, 상동성이 50 % 이상, 보다 바람직하게는 60 % 이상, 특히 70 % 이상, 특히 80 % 이상인 경우이다.

본 발명의 펙틴 분해 효소는 촉매작용을 하는 도메인을 포함하고 있는 효소 코아 외에, 또한 셀룰로스 결합 도메인 (CBD), 셀룰로스 결합 도메인 및 효소가 작동가능하게 연결되는 효소 코아 (촉매적으로 활성인 도메인)를 포함한다. 셀룰로스 결합 도메인 (CBD)은 코드화된 효소의 통합 부분으로서 존재하거나, 또는 다른 기원의 CBD 가 펙틴 분해 효소안에 도입되어 효소 하이브리드가 생성될 수도 있다. 이런 맥락에서, 용어 ″셀룰로스-결합 도메인″ 은 피터 톰 등에 의해 규정된 바와 같이 이해될 것으로 의도된다 (Peter Tomme et al., ″Cellulose-Binding Domains: Classification and Properties″ in ″Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates″, John N. Saddler and Michael H. Penner (Eds.), ACS Symposium Series, No. 618, 1996). 이 정의는 120 개 이상의 셀룰로스-결합 도메인을 10 개의 패밀리 (I - X)로 분류하며, CBD 가 다양한 효소, 예컨대 셀룰라제, 크실라나제, 만난나제, 아라비노퓨라노시다제, 아세틸 에스테라제 및 키티나제에서 발견되는 것을 증명해주고 있다. CBD 는 또한 조류 (algae)에서, 예컨대 적색 조류인 포르피라 푸르푸레아에서 비-가수분해성 다당-결합 도메인으로서 발견되었다 (Tomme et al., 상기 인용). 그러나, 대부분의 CBD 는 셀룰라제 및 크실라나제로부터 유래되며, CBD 는 단백질의 N 및 C 말단에서 발견되거나 또는 단백질 내부에 있다. 효소 하이브리드는 당해 기술분야에 공지이며 (WO 90/00609 및 WO 95/16782 참조), 링커와 함께 또는 링커 없이 펙틴 분해효소를 코드화하는 DNA 서열에 결찰된 셀룰로스-결합 도메인을 코드화하는 DNA 의 최소한 한 단편을 포함하고 있는 DNA 구성물을 숙주 세포안에 형질전환시키고, 그 숙주 세포를 융합된 유전자가 발현되도록 성장시킴으로써 제조될 수 있다. 효소 하이브리드는 다음 식으로 나타낼 수 있다:

CBD - MR - X

상기 식에서, CBD 는 최소한 셀룰로스-결합 도메인에 상응하는 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단 영역이고; MR 은 중간 영역 (링커)으로, 결합, 또는 바람직하게는 약 2 내지 약 100 개의 탄소 원자, 보다 바람직하게는 2 내지 40 개의 탄소 원자의 짧은 연결기이며; 또는 바람직하게는 약 2 내지 약 100 개의 아미노산, 보다 바람직하게는 2 내지 40 개의 아미노산이고; X 는 본 발명의 펙틴 분해 효소의 N-말단 또는 C-말단 영역이다.

바람직하게도, 본 발명의 효소는 최소한 8, 바람직하게는 최소한 8.5, 보다 바람직하게는 최소한 9, 보다 더 바람직하게는 최소한 9.5, 보다 더 바람직하게는 최소한 10, 여전히 더 바람직하게는 최소한 10.5, 특히 최소한 11 의 pH 에서 그것의 최대 촉매 활성을 가지며; 효소의 최대 활성은 바람직하게는 최소한 50 ℃, 보다 바람직하게는 최소한 55 ℃ 에서 얻어진다.

단백질 제조:

본 발명의 폴리펩티드는 전체 길이의 단백질, 그것의 단편 및 융합 단백질을 포함하여, 종래의 기법을 따르는 유전공학적으로 조작된 숙주 세포에서 제조될 수 있다. 적당한 숙주 세포는 외인성 DNA 로 형질전환될 수 있고, 배양중에 성장할 수 있는 그런 유형의 세포이며, 박테리아, 진균 세포, 및 배양된 고등 진핵 세포를 예로 들 수 있다. 박테리아 세포, 특히 그람-포지티브 유기체인 배양된 세포가 바람직하다. 바실루스 속으로부터 얻어지는 그람-포지티브 세포가 특히 바람직한데, 예를 들면 바실루스 서브틸리스, 바실루스 렌투스, 바실루스 브레비스, 바실루스 스테아로써모필루스, 바실루스 알칼로필루스, 바실루스 아밀로리퀴에파시엔스, 바실루스 코아귤란스, 바실루스 써큘란스, 바실루스 클라우씨, 바실루스 라우투스, 바실루스 튜링기엔시스, 바실루스 아가라드해렌스, 또는 특히 바실루스 리케니포르미스이다. ATCC 14580 은 바실루스 리케니포르미스 타입의 스트레인이다.

클론된 DNA 분자를 조작하고 외인성 DNA 를 다양한 숙주 세포에 도입시키는 기법들은 샘브룩 등에 의해 설명되었다 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987; and Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, Sonensheim et al., 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C.).

일반적으로, 본 발명의 펙테이트 리아제를 코드화하는 DNA 서열은 그것의 발현에 필요한 다른 유전자 엘레먼트, 통상 발현 벡터내에 있는 전사 프로모터 및 터미네이터를 포함한 다른 유전자 엘레먼트에 작동가능하게 연결된다. 벡터는 또한 통상적으로 하나 또는 둘 이상의 선택가능한 마아커 및 하나 또는 둘 이상의 복제 기원을 함유하겠지만, 또한 당업자들은 특정한 시스템내에서는 선택가능한 마아커가 별도의 벡터상에 제공될 수 있으며, 외인성 DNA 의 복제가 숙주 세포 게놈안으로의 도입에 의하여 제공될 수 있음을 인지할 것이다. 프로모터, 터미네이터, 선택가능한 마아커, 벡터 및 다른 엘레먼트들의 선택은 당업자의 수준내에 있는 기본적인 디자인의 문제이다. 많은 그러한 엘레먼트들이 문헌에 설명되어 있고, 상업적인 공급자들을 통하여 활용가능하다.

숙주 세포의 분비 경로안에 폴리펩티드를 특정하기 위하여, 발현 벡터안에 분비 신호 서열 (또한 리더 서열, 프레프로 서열 또는 프레서열로도 알려져 있음)이 제공된다. 분비 신호 서열은 폴리펩티드의 분비 신호 서열일 수 있으며, 또는 다른 분비된 단백질 또는 새롭게 합성된 단백질로부터 유도될 수 있다. 많은 적당한 분비 신호 서열이 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 특히 바실루스 숙주 세포에서의 분비를 위한 적당한 분비 신호 서열에 대한 추가의 설명은 문헌을 참조한다 (Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, Sonensheim et al, 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C.; and Cutting, S.M.(eds.) ″Molecualr Biological Methods for Bacillus″. John Wiley and Sons, 1990). 분비 신호 서열은 정확한 리딩 프레임내에서 DNA 서열에 결합되어 있다. 분비 신호 서열은 통상 관심의 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 서열에 대하여 5' 쪽에 위치하지만, 특정 신호 서열은 관심의 DNA 서열의 그 밖의 곳에 위치할 수도 있다 (예컨대 Welch et al., 미국 특허 제 5,037,743 호; Holland et al., 미국 특허 제 5,143,830 호).

형질전환된 숙주 세포들은 종래 과정을 따라 선택된 숙주 세포의 성장에 필요한 영양분 및 다른 성분들을 함유하고 있는 배양 배지중에서 배양된다. 규정된 배지 및 복합 배지를 포함하여 다양한 적당한 배지가 당해 기술분야에 공지이며, 배지는 일반적으로 탄소 공급원, 질소 공급원, 필수 아미노산, 비타민 및 미네랄을 포함한다. 배지는 또한 성장 인자 또는 혈청과 같은 성분들을 필요에 따라 함유할 수 있다. 성장 배지는 일반적으로 외래적으로 첨가된 DNA 를 함유하고 있는 세포를, 예를 들면 발현 벡터상에 운반된 또는 숙주 세포안에 함께 형질전환된 선택가능한 마아커에 의하여 상쇄되는 필수 영양분중에서의 약물 선택 또는 결핍에 의하여 선택할 것이다.

본 발명의 폴리펩티드는 또한 바실루스 속에 속하는 야생형 스트레인, 바람직하게는 바실루스 리케니포르미스 종 및 모든 종이 배열된 16S rDNA 서열을 토대로 바실루스 리케니포르미스에 최소한 99 % 상동하는 경우의 매우 밀접하게 관련된 바실루스 종으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있는 스트레인을 발효시킴으로써 제조될 수 있다. 특이하고 매우 바람직한 실예는 바실루스 리케니포르미스, ATCC 14580 이다.

나아가, 본 발명의 폴리펩티드는 상기 언급된 스트레인으로부터 유도된 돌연변이체 또는 변이체를 발효시킴으로써 제조될 수 있다. 그러한 돌연변이체는 보다 높은 펙티나제 활성을 제공하는 돌연변이체에 대한 종래의 기법 및 선택법을 사용하여 얻어질 수 있다.

발효는 다른 필수 영양분과 함께 탄소 및 질소 공급원을 함유하고 있는 영양 배지중에서 산소가 존재하는 조건하에서 스트레인을 배양함으로써 수행될 수 있고, 이 때 배지는 공지된 기술 원리에 따라 구성된다. 배지는 복합체가 풍부한 배지 또는 최소 배지일 수 있다. 질소 공급원은 무기 및/또는 유기 성질의 것일 수 있다. 적당한 무기 질소 공급원은 니트레이트 및 암모늄 염이다. 유기 질소 공급원중에서 아주 많은 수가 발효에 정규적으로 사용된다. 그러한 것의 실예로는 콩가루, 카제인, 옥수수, 콘스팁 액, 효모 추출물, 우레아 및 알부민이 있다. 적당한 탄소 공급원은 탄수화물 또는 탄수화물 함유 물질이다. 바람직한 영양 배지는 탄소 공급원 및/또는 펙티나제 생성의 유도자로서 더 높은 등급 또는 더 낮은 등급으로 에스테르화된 펙테이트, 폴리갈락투론산 및/또는 펙틴을 함유한다. 또는 달리, 배지는 펙틴이 풍부한 물질, 예컨대 콩가루, 사과의 과육 또는 감귤류의 껍질을 함유한다.

본 발명의 바실루스 종이 친알칼리성이기 때문에, 배양은 바람직하게는 최소한 pH 8 또는 최소한 pH 9 와 같은 알칼리성 pH 값에서 수행되며, 상기의 pH 값은 성장 배지를 멸균시킨 후에 탄산 나트륨 또는 탄산 나트륨과 중탄산 나트륨의 혼합물과 같은 적당한 완충제를 첨가함으로써 얻어질 수 있다.

적당한 배지에서의 야생형 스트레인 또는 돌연변이체의 발효는 배양 육즙 1 리터당 최소한 0.5 g 의 펙티나제 단백질의 수율, 또는 최소한 1 g/l 또는 2 g/l 의 수율을 유발할 수 있는 것으로 예상된다.

단백질 단리:

발현된 야생형 또는 재조합 폴리펩티드가 분비되는 때에는, 폴리펩티드는 성장 배지로부터 정제될 수 있다. 바람직하게는 발현 숙주 세포는 폴리펩티드가 정제되기 전에 배지로부터 제거된다 (예컨대 원심분리에 의해).

발현된 재조합 폴리펩티드가 숙주 세포로부터 분비되지 않는 경우에는, 숙주 세포는 바람직하게는 파괴되고, 폴리펩티드가 그러한 정제 기법의 첫 번째 단계인 수성 ″추출물″ 안으로 방출된다. 바람직하게는 발현 숙주 세포는 세포가 파괴되기 전에 배지로부터 제거된다 (예컨대 원심분리에 의해).

세포 파괴는 라이소자임 소화에 의해 또는 세포를 고압력으로 누름에 의해서와 같은 종래의 기법에 의해 수행될 수 있다 (Robert K. Scobes, Protein Purification, Second edition, Springer-Verlag).

발현된 재조합 폴리펩티드 (또는 키메릭 폴리펩티드)가 분비되든지 또는 아니든지, 폴리펩티드는 분획화 및/또는 종래의 정제 방법 및 배지를 사용하여 정제될 수 있다.

샘플의 분획화를 위해서는 황산 암모늄 침전 및 산 또는 카오트로프 추출법이 사용될 수 있다. 예시적인 정제 단계는 히드록시아파타이트, 크기 축출, FPLC 및 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 포함할 것이다. 적당한 음이온 교환 배지로는 유도화된 덱스트란, 아가로스, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 특수 실리카, 등이 있다. PEI, DEAE, QAE 및 Q 유도체들이 바람직하며, DEAE 패스트-플로우 세파로스 (Pharmacia, Piscataway, NJ)가 특히 바람직하다. 예시적인 크로마토그래피 배지로는 페닐, 부틸, 또는 옥틸기로 유도체화된 배지, 예컨대 페닐-세파로스 FF (Pharmacia), Toyopearl 부틸 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), 옥틸-세파로스 (Pharmacia) 등; 또는 폴리아크릴계 수지, 예컨대 Amberchrom CG 71 (Toso Haas) 등이 있다. 적당한 고체 지지체로는 유리 비드, 실리카-기초 수지, 셀룰로스성 수지, 아가로스 비드, 교차-결합된 아가로스 비드, 폴리스티렌 비드, 교차-결합된 폴리아크릴아미드 수지 등이 있으며, 이것들은 그것들이 사용되는 조건하에서 불용성이다. 이들 지지체는 아미노기, 카르복실기, 술프히드릴기, 히드록실기 및/또는 탄수화물 부분에 의한 단백질의 부착을 가능하게 하는 반응성 기를 사용하여 변형될 수 있다. 커플링 화학의 실예로는 시아노겐 브로마이드 활성화, N-히드록시숙신이미드 활성화, 에폭시드 활성화, 술프히드릴 활성화, 히드라지드 활성화, 및 카르보디이미드 커플링 화학을 위한 카르복실 및 아미노 유도체가 있다. 이들 및 다른 고체 배지는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며 널리 사용되고, 상업적인 공급자들로부터 활용가능하다.

특정한 방법의 선택은 기본적인 디자인의 문제이고, 부분적으로는 선택된 지지체의 성질에 의해 결정된다 (Affinity Chromatography: Principles ＆ Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988).

본 발명의 폴리펩티드 또는 그것의 단편은 또한 화학적인 합성법을 통하여 제조될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 단량체 또는 다량체일 수 있고; 글리코실화되거나 또는 글리코실화되지 않을 수 있으며; 페길화되거나 또는 페길화되지 않을 수 있고; 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.

따라서, 추가의 측면으로 본 발명은 본 발명의 효소 제제를 제조하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 효소의 생성을 가능하게 하는 조건하에서 펙테이트 리아제를 생성할 수 있는 미생물을 배양하는 단계와 배양물로부터 효소를 회수하는 단계로 이루어진다. 배양은 종래의 발효 기법, 예컨대 진동 플라스크 또는 발효기에서 펙테이트 리아제의 생성을 유도하는 성장 배지에 대해 충분한 통기를 보장하기 위하여 교반하면서 배양하는 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 성장 배지는 종래의 N-공급원, 예컨대 펩톤, 효모 추출물 또는 카사미노산, 감소된 양의 종래의 C-공급원, 예컨대 덱스트로스 또는 슈크로스, 및 유도자, 예컨대 펙테이트 또는 펙틴 또는 혼성 식물 기질, 예컨대 곡물 브란스 (예컨대 밀 브란 또는 쌀 껍질)를 함유할 수 있다. 회수는 종래의 기법, 예컨대 생체 물질 및 상층액의 원심분리 또는 여과에 의한 분리, 상층액의 회수 또는 관심의 효소가 세포내에 있는 경우 세포의 파괴와, 이어서 EP 0 406 314 에 기재되어 있는 것과 같은 추가의 정제 또는 WO 97/15660 에 기재되어 있는 것과 같은 결정화를 사용하여 수행될 수 있다.

또 다른 측면으로, 본 발명은 상술된 성질을 가지고 있고 동종성 불순물이 없는, 그리고 종래의 재조합 기법을 사용하여 제조되는 단리된 펙틴 분해 효소에 관한 것이다.

트란스제닉 식물:

본 발명은 또한 본 발명의 펙틴 분해 효소를 코드화하는 DNA 서열로 형질전환되고 그로써 회수가능한 양으로 상기 효소를 발현하고 생성하는 트란스제닉 식물, 식물 부분 또는 식물 세포에 관한 것이다. 효소는 식물 또는 식물 부분으로부터 회수될 수 있다. 또는 달리, 재조합 효소를 함유하고 있는 식물 또는 식물 부분 자체가 사용될 수 있다.

트란스제닉 식물은 짧은 쌍떡잎 또는 외떡잎에 대하여 쌍떡잎 식물이거나 또는 외떡잎 식물일 수 있다. 외떡잎 식물의 예로는 풀, 예컨대 메도우 풀 (블루 그래스, 포아풀), 페스투카와 같은 사료, 로리움, 템퍼레이트 그라스, 예컨대 아그로스티스, 및 곡물, 예컨대 밀, 귀리, 호밀, 보리, 쌀, 수수 및 옥수수가 있다.

쌍떡잎 식물의 실예로는 담배, 콩과 식물, 예컨대 루핀스, 감자, 사탕무우, 완두콩, 빈 및 소이빈, 및 십자화과 식물 (겨자과 식물), 예컨대 콜리플라워, 지방 종자 평지 및 밀접하게 관련된 모델 유기체, 아라비돕시스 탈리아나가 있다.

식물 부분의 예로는 줄기, 칼루스 (유합조직), 잎, 뿌리, 과일, 종자, 및 덩이줄기가 있다. 본 명세서에서는 또한 특이한 식물 조직, 예컨대 엽록체, 아포플라스트, 미토콘드리아, 액포, 페르옥시솜, 및 세포질이 식물 부분으로서 간주된다. 나아가, 어떠한 식물 세포가, 그것이 조직 기원이든 아니든 식물 부분으로서 간주된다.

또한 그러한 식물, 식물 부분 및 식물 세포의 자손도 본 발명의 범주에 포함된다.

본 발명의 효소를 발현하는 트란스제닉 식물 또는 식물 세포는 당해 기술분야에 공지되어 있는 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 간단히 설명하면, 식물 또는 식물 세포는 본 발명의 효소를 코드화하는 하나 또는 둘 이상의 발현 구성물을 식물 숙주 게놈안에 통합시키고, 그 결과 변형된 식물 또는 식물 세포를 트란스제닉 식물 또는 식물 세포안에서 증식시킴으로써 제조된다.

편리하게도, 발현 구성물은 선택된 식물 또는 식물 부분에서 유전자의 발현에 필요한 적절한 조절 서열과 함께 작동가능하게 결합되어 있는 본 발명의 효소를 코드화하는 유전자를 포함하고 있는 DNA 구성물이다. 나아가, 발현 구성물은 그 안에 발현 구성물이 통합되어 있는 숙주 세포를 확인하기 위하여 유용한 선택가능한 마아커 및 관심의 식물안에 구성물을 도입시키기 위하여 필요한 DNA 서열을 포함할 수 있다 (후자는 사용되는 DNA 도입 방법에 따라 좌우된다).

조절 서열, 예컨대 프로모터 및 터미네이터 서열 및 임의로 신호 또는 전이 서열의 선택은, 예컨대 효소가 어디서 어떻게 발현되기를 원하는지를 기초로 결정된다. 예를 들어, 본 발명의 효소를 코드화하는 유전자의 발현은 구성성이거나 또는 유도성일 수 있으며, 또는 발생, 단계 또는 조직 특이적일 수 있고, 유전자 생성물은 특이한 조직 또는 식물 부분, 예컨대 종자 또는 잎으로 표적화될 수 있다. 조절 서열은 예를 들면 문헌에 설명되어 있다 (Tague et al., Plant. Phys., 86, 506, 1988).

구성성 발현을 위해서는 35S-CaMV 프로모터가 사용될 수 있다 (Franck et al, 1980, Cell 21:285-294). 기관-특이적 프로모터는 예컨대 저장 장소 조직, 예를 들면 종자, 감자 덩이줄기, 및 과일로부터 (Edwards ＆ Coruzzi, 1990, Annu. Rev. Genet. 24:275-303), 또는 분열조직과 같은 대사 장소 조직으로부터 (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24:863-878) 얻어지는 프로모터, 쌀로부터 얻어지는 글루텔린, 프롤라민, 글로불린 또는 알부민 프로모터와 같은 종자 특이적 프로모터 (Wu et al., Plant and Cell Physiology Vol. 39, No. 8 pp. 885-889 (1998)), 콘라드 등에 의해 설명된 바와 같은 비키아 파바로부터 얻어지는 레구민 B4 및 미지의 종자 단백질 유전자로부터의 비키아 파바 프로모터 (Conrad U. et al., Journal of Plant Physiology Vol. 152, No. 6 pp. 708-711 (1998)), 종자 오일 바디 단백질로부터의 프로모터 (Chen et al., Plant and Cell Physiology Vol. 39, No. 9 pp. 935-941 (1989)), 브라시카 나푸스로부터 얻어지는 저장 단백질 napA 프로모터, 또는 당해 기술 분야에 공지되어 있는, 예컨대 WO 91/14772 에 기재되어 있는 바와 같은 다른 종자 특이적 프로모터이다. 나아가, 프로모터는 잎 특이적 프로모터, 예를 들면 쌀 또는 감자로부터 얻어지는 rbcs 프로모터 (Kyozuka et al., Plant Physiology Vol. 102, No. 3 pp. 991-1000 (1993)), 클로렐라 바이러스 아데닌 메틸트란스페라제 유전자 프로모터 (Mitra, A. and Higgins, DW, Plant Molecular Biology Vol. 26, No. 1 pp. 85-93 (1994)), 또는 쌀로부터 얻어지는 aldP 유전자 프로모터 (Kagaya et al., Molecular and General Genetics Vol. 248, No. 6 pp. 668-674 (1995)), 또는 감자 pin2 프로모터와 같은 상처 유도성 프로모터 (Xu et al., Plant Molecular Biology Vol. 22, No. 4 pp. 573-588 (1993))일 수 있다.

프로모터 인핸서 엘레먼트는 식물에서 효소의 더 높은 수준의 발현을 이루기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 프로모터 인핸서 엘레먼트는 프로모터와 효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열 사이에 위치한 인트론일 수 있다. 예를 들어, 쿠 등은 상기 문헌에서 발현을 증강시키기 위하여 쌀의 액틴 1 유전자의 첫 번째 인트론을 사용하는 것을 개시하였다.

발현 구성물의 선택가능한 마아커 유전자 및 어떠한 다른 부분들은 당해 기술 분야에서 활용가능한 것들로부터 선택될 수 있다.

DNA 구성물은 당해 기술 분야에 공지되어 있는 종래 기법들, 예를 들어 아그로박테리움-매개 형질전환, 바이러스-매개 형질전환, 마이크로 주사, 입자 충격, 바이오리스틱 (biolistic) 형질전환, 및 일렉트로포레이션 (Gasser et al., Science, 244, 1293; Potrykus, Bio/Techn. 8, 535, 1990; Shimamoto et al., Nature, 338, 274, 1989)에 따라 식물의 게놈안에 통합될 수 있다.

현재, 트란스제닉 쌍떡잎 식물을 생성하기 위해 선택된 방법은 아그로박테리움 튜메파시엔스 매개된 유전자 전달이지만 (Hooykas ＆ Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19:15-38), 이 방법은 또한 비록 다른 형질전환 방법이 이들 식물에 대해 일반적으로 바람직하긴 하지만, 외떡잎 식물의 형질전환을 위해서도 사용될 수 있다. 현재, 트란스제닉 외떡잎 식물을 생성하기 위하여 선택된 방법은 배의 (embryonic) 콜리 (calli) 또는 발생하는 배의 입자 충격 (형질전환하는 DNA 로 코팅된 현미경으로 볼 수 있는 금 또는 텅스텐 입자)이다 (Christou, 1992, Plant J. 2:275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5:158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10:667-674). 외떡잎 식물을 형질전환시키기 위한 또 다른 방법은 원형질체 형질전환을 기초로 한다 (Omirulleh S. et al., Plant Molecular Biology Vol. 21, No. 3 pp. 415-428 (1993)).

형질전환에 이어서, 발현 구성물이 통합된 형질전환체들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 선택되고 전체 식물에서 재생된다.

효소 제제:

본 명세서에서 용어 ″효소 제제″ 는 통상 많은 상이한 효소적 활성을 포함하고 있는, 미생물의 단일 종으로부터, 가능하게는 단리되고 정제된 종래의 효소적 발효 생성물; 또는 단일성분 효소들, 바람직하게는 종래의 재조합 기법들을 사용하여 박테리아 또는 진균 종으로부터 유도되고, 발효되었으며 가능하게는 별도로 단리되고 정제되었으며, 상이한 종, 바람직하게는 진균 또는 박테리아 종으로부터 기원하는 효소들의 혼합물; 또는 재조합 펙틴 분해 효소의 발현을 위한 숙주 세포로서 작용하지만, 동시에 다른 효소들, 예컨대 미생물의 자연 발생적인 발효 생성물인 다른 펙틴 분해 효소, 프로테아제, 또는 셀룰라제, 즉 상응하는 자연 발생적인 미생물에 의하여 관례적으로 생성된 효소 복합체를 동시에 생성하는 미생물의 발효 생성물 중 어느 하나를 의미하는 것으로 의도된다.

본 발명의 펙틴 분해 효소 제제는 추가로 프로테아제, 셀룰라제 (엔도-β-1,4-글루카나제), β-글루카나제 (엔도-β-1,3(4)-글루카나제), 리파제, 큐티나제, 과산화효소, 락카제, 아밀라제, 글루코아밀라제, 펙티나제, 환원효소, 산화효소, 페놀옥시다제, 리그니나제, 풀룰라나제, 아라비나나제, 헤미셀룰라제, 만난나제, 크실로글루카나제, 크실라나제, 펙틴 아세틸 에스테라제, 람노갈락투로난 아세틸 에스테라제, 폴리갈락투로나제, 람노갈락투로나제, 갈락타나제, 펙테이트 리아제, 펙틴 리아제, 펙틴 메틸에스테라제, 셀로비오히드롤라제, 트란스글루타미나제, 또는 그것들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 효소들을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 제제중의 하나 또는 둘 이상의 또는 모든 효소들은 재조합 기법을 사용함으로써 제조될 수 있다. 즉, 효소(들)은 다른 효소(들)과 혼합되어 원하는 효소 블렌드를 가지는 효소 제제를 형성하는 단일-성분 효소(들)이다.

면역학적 교차-반응성:

면역학적 교차-반응성을 측정하는 데 사용될 다클론성 항체들 (이것은 주어진 효소 단백질에 대하여 단일 특이적이다)은 정제된 펙틴 분해 효소를 사용함으로써 제조될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 펙틴 분해 효소에 대한 항혈청은 문헌에 기재된 방법에 따라 토끼 (또는 다른 설치류)를 면역시킴으로써 발생되었다 (N. Axelsen et al., in: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Chapter 23, 또는 A. Johnstone and R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 pp. 27-31). 정제된 면역글로불린은 항혈청으로부터, 예를 들면 염 침전 ((NH₄)₂SO₄)과, 이어서, 투석 및 예컨대 DEAE-세파덱스 상에서의 이온 교환 크로마토그래피에 의해 얻어질 수 있다. 단백질의 면역화학적 특성확인은 오크털로니 이중-확산 분석에 의해 (O. Ouchterlony in: Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publications, 1967, pp. 655-706), 교차된 면역 전기영동에 의해 (N. Axelsen et al., 상기 동일, Chapter 3 및 4), 또는 로켓 면역 전기영동에 의해 (N. Axelsen et al., Chapter 2) 이루어질 수 있다.

세제 또는 클리닝 산업에서의 용도

추가의 측면으로, 본 발명은 본 발명의 펙틴 분해 효소 또는 효소 제제를 포함하고 있는 세제 조성물, 본 발명의 펙틴 분해 효소 또는 효소 제제를 함유하고 있는 세척 용액으로 기계식 세척 과정의 세척 사이클중에 직물을 처리하는 것으로 이루어지는 직물의 기계식 처리 방법, 및 월등한 클리닝 성능, 즉 월등한 오염물 제거를 제공하는 본 발명의 펙틴 분해 효소 또는 효소 제제를 포함하고 있는, 세탁, 경질 표면 클리너, 개인용 클린징 및 경구용/구강용 조성물을 포함하는 클리닝 조성물에 관한 것이다.

이 이론에 구속됨이 없이, 본 발명의 만난나제는 갈락토만난을 함유하고 있는 어떠한 얼룩 또는 반점을 효과적으로 분해 또는 가수분해할 수 있고, 따라서 그러한 얼룩 또는 반점을 포함하는 세탁물을 클리닝할 수 있는 것으로 여겨진다.

본 발명의 클리닝 조성물은 최소한 하나의 추가의 세제 성분을 함유하여야 한다. 이들 추가의 성분들의 정확한 성질, 및 그것들의 혼입 수준은 조성물의 물리적 형태, 및 그것들이 사용될 클리닝 작동의 성질에 따라 좌우될 것이다.

본 발명의 클리닝 조성물은 바람직하게도 선택된 계면활성제, 다른 효소, 빌더 및/또는 표백 시스템으로부터 선택된 세제 성분을 추가로 포함한다.

본 발명에 따르는 클리닝 조성물은 액체, 페이스트, 겔, 막대, 정제, 스프레이, 거품, 분말 또는 과립형이다. 과립형 조성물은 또한 ″압축″ 형태일 수 있고, 액체 조성물은 또한 ″농축된″ 형태일 수 있다.

본 발명의 조성물은 예를 들면, 수동 및 자동 접시세척 조성물로서, 세탁 첨가제 조성물 및 얼룩진 직물의 침지 및/또는 예비처리에 사용하기에 적당한 조성물을 포함하는 수동 및 자동 세탁용 세제 조성물, 린스 첨가된 직물 연화제 조성물, 및 일반적인 가정용 경질 표면 클리닝 조작에 사용하기 위한 조성물로서 제형될 수 있다. 그러한 탄수화물을 함유하는 조성물은 또한 살균 제품, 콘택트 렌즈 클린저 및 건강 및 미용 보호 제품, 예컨대 경구/구강 보호 및 개인용 클리닝 조성물로서 제형될 수 있다.

수동 접시세척 방법에 사용하기 위한 조성물로서 제형될 때, 본 발명의 조성물은 바람직하게는 계면활성제 및 바람직하게는 유기 중합체 화합물, 비누거품 증강제, 제 II 군 금속 이온, 용매, 향수성 물질 및 추가의 효소로부터 선택된 다른 세제 화합물을 함유한다.

세탁기 세척 방법에 사용하기에 적당한 조성물로서 제형될 때, 본 발명의 조성물은 바람직하게는 계면활성제와 빌더 화합물 두가지를 모두 함유하고, 추가로 바람직하게는 유기 중합체 화합물, 표백제, 추가의 효소, 비누거품 억제제, 분산제, 라임소우프 분산제, 얼룩 현탁제 및 재침착 억제제 및 부식 억제제로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 세제 성분을 함유한다. 세탁 조성물은 또한 추가의 세제 성분으로서 연화제를 함유할 수 있다. 탄수화물을 함유하고 있는 그러한 조성물은 세탁용 세제 조성물로서 제형되었을 때 직물 클리닝, 오염물 제거, 순백 유지, 연화, 색 발생, 염료 전달 억제 및 살균력을 제공할 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 고체 또는 액체 형태의 세제 첨가제 제품으로서 사용될 수 있다. 그러한 첨가제 제품은 종래의 세제 조성물의 성능을 보충 또는 상승시키기 위해 의도되며, 클리닝 과정의 어떤 단계에서든지 첨가될 수 있다.

필요하다면 본원의 세탁용 세제 조성물의 밀도는 20 ℃ 에서 측정되는 조성물의 리터당 400 내지 1200 g, 바람직하게는 500 내지 950 g 범위이다.

본원의 조성물의 ″압축″ 형태는 밀도 및, 조성물의 견지에서 무기 충전 염의 양에 의해 가장 잘 반영되며; 무기 충전 염은 분말 형태의 세제 조성물의 종래 성분들이고; 종래 세제 조성물에서, 충전 염은 실질적인 양, 전형적으로 총 조성물의 17 내지 35 중량 % 의 양으로 존재한다. 압축 조성물에서, 충전 염은 총 조성물의 15 중량 % 를 초과하지 않는 양으로, 바람직하게는 10 중량 % 를 초과하지 않는 양으로, 가장 바람직하게는 총 조성물의 5 중량 % 를 초과하지 않는 양으로 존재한다. 본 조성물에서 의미하는 것과 같은 무기 충전 염은 술페이트 및 클로라이드의 알칼리 및 알칼리 토금속 염으로부터 선택된다. 바람직함 충전 염은 황산 나트륨이다.

본 발명에 따르는 액체 세제 조성물은 또한 ″농축된 형태″ 일 수 있으며, 그러한 경우에, 본 발명에 따르는 액체 세제 조성물은 종래의 액체 세제와 비교하여 보다 적은 양의 물을 함유할 것이다. 전형적으로 농축된 액체 세제의 물 함량은 바람직하게는 세제 조성물의 40 중량 % 미만, 보다 바람직하게는 30 중량 % 미만, 가장 바람직하게는 20 중량 % 미만이다.

본원에서 사용하기에 적당한 특정 세제 화합물은 WO 97/01629 호에 기재된 것과 같은 특정 화합물들로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

만난나제는 본 발명에 따르는 클리닝 조성물에, 바람직하게는 조성물의 0.0001 내지 2 중량 % 의 순수한 효소의 수준으로, 보다 바람직하게는 0.0005 내지 0.5 중량 % 의 순순한 효소의 수준으로, 가장 바람직하게는 0.001 내지 0.1 중량 % 의 순수한 효소의 수준으로 혼입될 수 있다.

본 발명에 사용할 수 있는 셀룰라제로는 박테리아 또는 진균 기원의 셀룰라제가 있다. 바람직하게도 이 효소들은 5 와 12 사이에서 최적 pH 를 가질 것이며, 50 CEVU/mg (셀룰로스 점성 유니트) 이상의 비활성을 가질 것이다. 적당한 셀룰라제는 미국 특허 제 4,435,307 호, J 61 078384 호 및 WO 96/02653 에 개시된 것들로, 상기 문헌들은 각각 휴미콜라 인솔렌스, 트리코더마, 티엘라비아 및 스포로트리쿰으로부터 생성된 진균성 셀룰라제를 개시한다. EP 739 982 는 신규한 바실루스 종으로부터 단리된 셀룰라제를 설명한다. 적당한 셀룰라제는 또한 GB-A-2075028; GB-A-2095275; DE-OS-22 47 832 및 WO 95/26398 에서 개시된다.

그러한 셀룰라제의 실예는 휴미콜라 인솔렌스의 스트레인 (Humicola grisea var. thermoidea), 특히 스트레인 휴미콜라 인솔렌스, DSM 1800 에 의해 생성된 셀룰라제이다. 다른 적당한 셀룰라제는 분자량이 약 50 kD 이고, 등전점이 5.5 이며, 415 개의 아미노산을 함유하고 있는 휴미콜라 인솔렌스로부터 얻어지는 셀룰라제; 휴미콜라 인솔렌스 DSM 1800 으로부터 유도된 약 43 kD 의 엔도-베타-1,4-글루카나제이고; 바람직한 셀룰라제는 PCT 특허 출원 WO 91/17243 에 개시된 아미노산 서열을 갖는다. 또한 적당한 셀룰라제는 WO 94/21801 에서 설명된 트리코더마 롱지브라키아툼으로부터 얻어지는 셀룰라제이다. 특히 적당한 셀룰라제는 색상 보호 장점을 가지고 있는 셀룰라제이다. 그러한 셀룰라제의 실예는 WO 96/29397, EP-A-0495257, WO 91/17243, WO 91/17244 및 WO 91/21801 에서 기재된 셀룰라제들이다. 직물 보호 및/또는 클리닝 성질에 적당한 다른 셀룰라제들은 WO 96/34092, WO 96/17994 및 WO 95/24471 에 기재되어 있다.

상기 셀룰라제들은 통상 세제 조성물에, 세제 조성물의 0.0001 내지 2 중량 % 의 순수한 효소의 수준으로 혼입된다.

본 발명의 목적에 대해 바람직한 셀룰라제는 알칼리성 셀룰라제, 즉 7 내지 12 의 pH 에서 그것의 최대 활성의 최소한 25 %, 보다 바람직하게는 최소한 40 % 를 가지는 효소이다. 보다 바람직한 셀룰라제는 7 내지 12 의 pH 에서 그것의 최대 활성을 가지는 효소들이다. 바람직한 알칼리성 셀룰라제는 Novo Nordisk A/S 에서 등록상표명 Carezyme^R하에 시판하는 셀룰라제이다.

아밀라제 (α 및/또는 β)가 탄수화물-기초 오염의 제거를 위하여 포함될 수 있다. WO 94/02597 (Novo Nordisk A/S, 1994 년 2 월 3 일에 공개됨)에는 돌연변이 아밀라제가 혼입되어 있는 클리닝 조성물이 기재되어 있다 (WO 95/10603 참조, Novo Nordisk A/S, 1995. 4. 20. 공개). 클리닝 조성물에 사용하기 위한 것으로 알려져 있는 다른 아밀라제들은 α- 및 β-아밀라제들이다. α-아밀라제는 당해 기술분야에 공지이며, 미국 특허 제 5,003, 257 호; EP 252,666; WO 91/00353; FR 2,676,456; EP 285,123; EP 525,610; EP 368,341; 및 영국 특허 명세서 제 1,296,839 호 (Novo)에 개시된 것들을 포함한다. 다른 적당한 아밀라제들은 WO 94/18314 (1994. 8. 18. 에 공개됨) 및 WO 96/05295 (Genencor, 1996. 2. 22. 에 공개됨)에 기재된 안정성-증강된 아밀라제들 및 WO 95/10603 (1995 년 4 월에에 공개됨)에 개시된 것과 같은, Novo Nordisk A/S 로부터 구매할 수 있는 모효소에 추가의 변형이 일어난 아밀라제 변이체들이다. 또한 적당한 아밀라제가 EP 277 216, WO 95/26397 및 WO 96/23873 (모두 Novo Nordisk)에 기재되어 있다.

상업적인 α-아밀라제 제품의 실예로는 Genencor 로부터의 Purafect Ox Am^R, 및 Novo Nordisk A/S (Denmark)로부터 구매할 수 있는 Termamyl^R, Ban^R, Fungamyl^R및 Duramyl^R이 있다. WO 95/26397 호에는 다른 적당한 아밀라제: 25 내지 55 ℃ 의 온도 범위에서 및 8 내지 10 의 pH 범위에서, 파데바스^Rα-아밀라제 활성 검정에 의하여 측정되는 바, Termamyl^R의 비활성보다 최소한 25 % 더 높은 비활성을 가지는 것을 특징으로 하는 α-아밀라제가 기재되어 있다. WO 96/23873 (Novo Nordisk)에 기재되어 있는 상기 효소의 변이체가 또한 적당하다. 활성 수준 및 열안정성과 더 높은 활성 수준의 조합의 관점에서 개선된 성질을 가지고 있는 다른 녹말분해성 효소가 WO 95/35382 에 기재되어 있다.

본 발명의 목적에 대해 바람직한 아밀라제는 상표명 Termamyl, Duramyl 및 Mazamyl 하에 시판되는 아밀라제들 또는 WO 96/23873 에서 SEQ ID NO: 2 로서 개시된 증가된 열안정성을 증명하는 α-아밀라제 변이체이다.

특이한 적용에 대해 바람직한 아밀라제는 알칼리성 아밀라제, 즉 7 내지 12 의 pH 에서 그것의 최대 활성의 최소한 10 %, 바람직하게는 최소한 25 %, 보다 바람직하게는 최소한 40 % 의 효소 활성을 가지고 있는 효소이다. 보다 바람직한 아밀라제는 7 내지 12 의 pH 범위에서 그것의 최대 활성을 가지는 효소들이다.

녹말 분해성 효소들은 본 발명의 세제 조성물에, 바람직하게는 조성물의 0.0001 내지 2 중량 % 의 순수한 효소의 수준으로, 바람직하게는 0.00018 내지 0.06 중량 % 의 순순한 효소의 수준으로, 보다 바람직하게는 0.00024 내지 0.048 중량 % 의 순수한 효소의 수준으로 혼입될 수 있다.

용어 크실로글루카나제는 와게닝겐 대학의 빈켄과 보라겐에 의해 설명된 효소들의 패밀리를 포함하며 (Vincken et al., (1994) Plant Physiol., 104, 99-107), 하야시 등에 의해 설명된 바와 같이 크실로글루칸을 분해할 수 있다 (Hayashi et al., (1989) Plant. Physiol. Plant Mol. Biol., 40:139-168). 빈켄 등은 트리코더마 비리데로부터 정제된 크실로글루카나제 (엔도-IV-글루카나제)에 의하여 단리된 사과 세포벽의 셀룰로스로부터 크실로글루칸 코팅을 제거하는 것을 증명하였다. 이 효소는 세포벽-삽입된 셀룰로스의 효소에 의한 분해를 증강시키며, 펙틴성 효소들과 상조적으로 작용한다. 기스트-브로카데스사로부터 시판되는 라피다제 LIQ+ 는 크실로글루카나제 활성을 함유하고 있다.

이 크실로글루카나제는 바람직하게는 조성물의 0.0001 내지 2 중량 % 의 순수한 효소의 수준으로, 보다 바람직하게는 0.0005 내지 0.5 중량 % 의 순수한 효소의 수준으로, 가장 바람직하게는 0.001 내지 0.1 중량 % 의 순수한 효소의 수준으로 클리닝 조성물에 혼입된다.

특정 적용을 위해 바람직한 크실로글루카나제는 알칼리성 크실로글루카나제, 즉 7 내지 12 의 pH 에서 그것의 최대 활성의 최소한 10 %, 바람직하게는 최소한 25 %, 보다 바람직하게는 최소한 40 % 의 효소 활성을 가지고 있는 효소이다. 보다 바람직한 크실로글루카나제는 7 내지 12 의 pH 범위에서 그것의 최대 활성을 가지는 효소들이다.

상기 언급된 효소들은 어떠한 적당한 기원, 예컨대 식물, 동물, 박테리아, 진균 및 효모 기원의 것일 수 있다. 기원은 또한 메조필릭 (mesophilic) 또는 엑스트레모필릭 (extremophilic) (호저온성, psychrotropic, 호열성, barophilic, 친알칼리성, 호산성, 호염성, 등)일 수 있다. 아들 효소의 정제된 또는 정제되지 않은 형태가 사용될 수 있다. 오늘날, 야생형 효소를 본 발명의 클리닝 조성물에서 그것들의 성능 효력을 최적화시키기 위하여 단백질 또는 유전자 공학 기법을 통하여 변형하는 것은 통상적으로 행해지고 있다. 예를 들어, 변이체들은 그러한 조성물이 통상적으로 만나게 되는 성분들에 대한 효소의 부합성이 증가하도록 디자인될 수 있다. 또는 달리, 변이체들은 효소 변이체의 최적 pH, 표백 또는 킬란트 (chelant) 안정성, 촉매적 활성 등이 특별한 클리닝 적용에 맞도록 디자인될 수 있다.

특히, 표백 안정성의 경우에 산화에 민감한 아미노산에 대해 및 계면활성제 부합성을 위한 표면 전하에 대해 관심이 집중되어야 한다. 그러한 효소들의 등전점은 일부의 하전된 아미노산들의 치환에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 등전점의 증가는 음이온성 계면활성제의 부합성을 개선시키는데 도움을 줄 수 있다. 효소의 안정성은 예컨대 추가의 염 가교의 생성에 의하여 및 킬란트 안정성을 증가시키기 위한 금속 결합 부위에 압력을 가함으로써 추가로 증가될 수 있다.

직물 및 셀룰로스성 섬유 가공 산업에서의 용도

본 발명의 펙틴 분해 효소는 섬유의 생체 제조를 위하여 또는 세제와 조합되어 섬유를 클리닝하기 위하여 단독으로 또는 다른 탄수화물 분해 효소들 (예컨대 아라비난나제, 크실로글루카나제, 만난나제)과 함께 사용될 수 있다. 면섬유는 펙틴을 함유하고 있는 일차적인 세포벽층과 주로 셀룰로스를 함유하고 있는 이차적인 층으로 구성된다. 면 제조 또는 면 정제 과정에서 일차 세포벽의 부분이 제거될 것이다. 본 발명은 일차 세포벽의 제거에 의해 면 정제과정을 보조하거나 또는 면의 클리닝중에 잔여 펙틴성 물질을 제거하고 섬유의 노화를 방지하는 것이다.

본 명세서에서, 용어 ″셀룰로스성 물질″ 은 섬유, 니트, 직조된, 데님, 실, 및 면, 면 혼방 또는 천연 또는 수제 셀룰로스성 직물 (예컨대 목재 펄프로부터 유래되는 것과 같은 크실란-함유 셀룰로스 섬유로부터 기원하는 것)로부터 만들어진 타월류 또는 이것들의 혼방을 포함하여 바느질된 및 바느질이 되지 않은 직물을 의미하는 것으로 의도된다. 혼방의 실예는 면 또는 레이욘/비스코스와 하나 또는 둘 이상의 컴패니온 물질, 예컨대 울, 합성섬유 (예컨대 폴리아미드 섬유, 아크릴계 섬유, 폴리에스테르 섬유, 폴리비닐 알코올 섬유, 폴리비닐 클로라이드 섬유, 폴리비닐리덴 클로라이드 섬유, 폴리우레탄 섬유, 폴리우레아 섬유, 아라미드 섬유), 및 셀룰로스-함유 섬유 (예컨대 레이욘/비스코스, 섬모시풀, 대마, 아마/린넨, 황마, 셀룰로스 아세테이트 섬유, 리오셀)와의 혼방이다.

본 발명의 효소 또는 제제는 대마, 아마 또는 린넨으로부터 섬유의 예비처리 또는 레팅 (retting)을 위한 셀룰로스성 섬유 가공산업에 유용하다.

섬유 산업을 위한, 예컨대 면 섬유로서의 셀룰로스성 물질의 옷 제조를 위해 준비되는 물질로의 가공처리는 여러 단계를 포함한다: 섬유를 실로 방적하는 단계; 실로부터 직조된 또는 니트 직물을 제조하는 단계; 후속되는 제조, 염색 및 마감 조작 단계. 직조된 제품은 일련의 날실들 사이에 실을 채워넣어 짜넣음으로써 제조된다; 실은 두가지 상이한 유형일 수 있다. 편직된 제품은 연속되는 한 실의 길이로부터 양면짜기 루프의 네트웍을 형성함으로써 제조된다. 셀룰로스성 섬유는 또한 비-직조된 섬유에 대해 사용될 수 있다.

제조과정은 직물이 염색 조작에서 적절하게 반응하도록 도와준다. 이 제조과정에 포함된 하위-단계들은 다음과 같다:

a. 예컨대 전분, CMC 또는 PVA 와 같은 중합체 크기를 사용하는 디사이징 (직조된 제품용)을 날실 속도를 증가시키기 위하여 직조전에 첨가한다; 이 물질은 반드시 추가의 처리전에 제거되어야 한다.

b. 연마 단계, 이것의 목적은 면 섬유로부터 비-셀룰로스성 물질, 특히 큐티클 (주로 왁스로 구성됨) 및 일차 세포벽 (주로 펙틴, 단백질 및 크실로글루칸으로 구성됨)을 제거하는 것이다. 적절한 왁스 제거는 높은 습윤성을 얻기 위해 필요한 것이며, 양호한 염색을 얻기 위한 척도가 된다. 일차 세포벽 - 특히 펙틴 -의 제거는 왁스 제거를 개선시키며 보다 고른 염색을 보장해준다. 나아가 이것은 표백 과정에서 순백을 개선시킨다. 연마에 사용된 주요 화학약품은 고농도, 면 1 kg 당 70 g 까지의 고농도 및 80 내지 95 ℃ 의 고온에서 사용되는 수산화 나트륨이다.

c. 표백 단계: 통상적으로 연마 다음에 전체적으로 표백된 (하얀) 직물을 얻기 위하여 또는 염료의 깨끗한 색조를 보장하기 위하여 산화제로서 과산화수소를 사용하는 표백과정이 뒤따른다.

산업 분야에서는 또한 한 단계로 조합된 연마/표백 공정이 사용된다. 비록 제조 과정이 대부분 통상적으로는 직물 상태에서 사용되지만; 연마, 표백 및 염색 조작은 또한 섬유 또는 실 상태에서도 행해질 수 있다.

가공처리 형식은 액체 처리 시스템에 의해 접촉되는 개방된 폭 또는 로프 형태의 직물과 연속식이거나 또는 배치식일 수 있다. 연속적인 조작은 일반적으로 포화기를 사용함으로써, 직물의 중량당 대략 동일한 중량의 화학적 처리액이 직물에 적용되고, 이어서 화학 반응이 일어나는 곳인 가열된 드웰 (dwell) 챔버에 들어가게 된다. 그런 다음 세척 부분이 직물이 다음 처리 단계에 맞도록 준비한다. 배치식 처리는 일반적으로 하나의 처리 조에서 일어나고, 그로써 직물은 그것의 중량의 대략 8 내지 15 배의 화학적 처리액과 접촉하게 된다. 반응 기간이 완료된 후, 화학약품은 배출되고, 직물은 세정된 다음 화학약품이 적용된다. 비연속식 패드-배치식 처리는 포화기를 포함하고, 그로써 직물의 중량 당 대략 동일한 중량의 화학적 처리액이 직물에 적용되고, 이어서 저온 패드-배치인 경우 1 일 또는 그 이상의 기간동안 드웰링된다.

직조된 제품이 섬유 직물 제조의 일반적인 형태이다. 직조 과정은 날실이 마모되는 것을 방지하기 위하여 날실의 ″사이징″을 필요로 한다. 활용성 및 비용 때문에 전분, 폴리비닐 알코올 (PVA), 카르복시메틸 셀룰로스, 왁스 및 아크릴계 결합제가 전형적인 사이징 화학약품으로서 사용된다. 사이징은 직조된 제폼을 제조하는 첫 번째 단계로서 직조 과정후에 제거되어야 한다. 로프 또는 개방된 형태의 사이징된 직물은 디사이징제를 함유하고 있는 처리액과 접촉하게 된다. 사이징의 유형에 따라 사용된 디사이징제는 제거될 것이다. PVA 사이징의 경우, 고온수 또는 산화 과정이 때로 사용된다. 면 직물에 대한 가장 흔한 사이징제는 전분을 기초로 한 것이다. 그러므로, 가장 흔한 직조된 면 직물은 고온수, 전분을 가수분해하기 위한 효소 α-아밀라제 및 습윤제 또는 계면활성제와의 조합물에 의해 디사이징된다. 셀룰로스성 물질은 디사이징이 이루어지기에 충분히 긴 ″보유 기간″ 동안 디사이징 화학약품과 함께 방치된다. 보유 기간은 처리 형식의 유형 및 온도에 따라 좌우되며, 15 분 내지 2 시간으로, 어떤 경우에는 여러날 동안으로 다양할 수 있다. 전형적으로, 디사이징 화학약품은 대체로 약 15 ℃ 내지 약 55 ℃ 범위에 있는 포화기 배쓰에 적용된다. 그런 다음 직물은 디사이징제의 활성을 증강시키기 위하여 충분한 열, 통상 약 55 ℃ 와 100 ℃ 사이의 온도를 제공하는, ″J-상자″ 와 같은 장치안에 보유된다. 제거된 사이징제를 포함하여 화학약품은 보유 기간이 완료된 후에 직물로부터 씻겨나간다.

높은 순백도 또는 양호한 습윤성 및 그 결과의 염색성을 보장하기 위하여, 사이징 화학약품 및 다른 적용된 화학약품들은 철저하게 제거되어야 한다. 일반적으로 효과적인 디사이징이 이어지는 다음 단계의 제조 공정: 연마 및 표백에 매우 중요한 것으로 여겨진다.

연마 공정은 면에서 천연적으로 발견되는 비-셀룰로스성 화합물을 대부분 제거한다. 천연 비-셀룰로스성 불순물외에, 연마로 더러움, 얼룩 및 방적, 코닝 또는 슬래슁 윤활제와 같은 제조공정에 도입된 잔여 물질이 제거될 수 있다. 연마 공정은 수산화 나트륨 또는 관련된 코스티사이징제 (causticizing agent), 예컨대 탄산 나트륨, 수산화 칼륨 또는 그것들의 혼합물을 사용한다. 일반적으로 알칼리 안정성 계면활성제가 소수성 화합물의 가용도를 증강시키고 및/또는 직물상에 그것들의 재침착을 방지하기 위하여 공정에 첨가된다. 처리는 대체로 고온, 예컨대 80 ℃ 내지 100 ℃ 에서, 강알칼리성의 연마 용액, pH 13 내지 14 를 사용하여 이루어진다. 화학적 처리의 비-특이적인 성질로 인하여, 불순물 뿐만 아니라 셀룰로스 자체도 공격을 받으며, 그 결과 강도 또는 다른 바람직한 직물 성질의 손상이 초래된다. 셀룰로스성 직물의 연성은 잔류하는 천연 면 왁스의 작용이다. 고온의 강알칼리성 연마 처리공정의 비-특이적 성질은 바람직한 천연 면 윤활제와 제조시 도입된 윤활제 사이를 구별할 수 없다. 나아가, 종래의 연마 공정은 이들 공정으로부터 나오는 고알칼리성 유출액으로 인하여 환경 문제를 유발할 수 있다. 연마 단계는 직물이 표백시 최적 반응을 보이도록 준비하는 과정이다. 부적절하게 연마된 직물은 후속되는 표백 단계에서 보다 높은 수준의 표백 화합물을 필요로 할 것이다.

표백 단계는 천연 면 안료들을 탈색시키며, 조면 (ginning), 소면 (carding) 또는 연마중에 완전하게 제거되지 못한 어떠한 잔류하는 천연 목재 면 부스러기 성분들을 제거한다. 현재 사용되는 주요 공정은 알칼리성 과산화수소 표백이다. 많은 경우, 특히 매우 높은 순백도가 필요하지 않은 경우에 표백은 연마와 결합될 수 있다.

하기의 실시예에서 연마 단계는 약 50 내지 80 ℃ 의 온도 및 약 7 내지 11 의 pH 에서 본 발명의 펙테이트 리아제 또는 펙테이트 리아제 제제를 사용하여 수행될 수 있고, 그로써 고도의 코스티시이징제를 치환 또는 보충한다. 최적화된 효소 공정은 높은 펙틴 제거 및 전체적인 습윤성을 보장한다.

식물 물질의 분해 또는 변형

본 발명에 따르는 효소 또는 효소 제제는, 바람직하게는 본 발명의 효소의 높은 식물 세포벽 분해 활성으로 인하여 식물 세포벽 또는 식물 세포로부터 기원하는 어떠한 펙틴-함유 물질의 분해 또는 변형을 위한 제제로서 사용된다.

본 발명의 펙틴 분해 효소는 단독으로 또는 다른 효소들, 예컨대 글루카나제, 펙티나제 및/또는 헤미셀룰라제와 함께 사용되어 기름이 풍부한 식물 물질로부터 기름을, 예를 들면 콩으로부터 콩기름을, 올리브로부터 올리브유를, 또는 평지씨로부터 평지씨유를, 또는 해바라기로부터 해바라기 기름을 추출하는 것을 개선시킬 수 있다.

본 발명의 펙틴 분해 효소는 식물 세포 물질의 성분들을 분리하는데 사용될 수 있다. 특히 관심있는 것은 당 또는 전분이 풍부한 식물 물질을 상당히 상업적으로 관심을 끄는 성분들 (예를 들면 사탕 무우로부터의 슈크로스 또는 감자로부터의 전분)과 상업적 관심이 비교적 적은 성분들 (예를 들면 펄프 또는 겉껍질 분획)로 분리하는 것이다. 또한, 특별히 관심을 끄는 것은 단백질-풍부 또는 기름-풍부 곡물을 가치있는 단백질 및 기름과 가치가 없는 겉껍질 분획으로 분리하는 것이다. 분리 공정은 당해 기술분야에 공지되어 있는 방법을 사용함으로써 수행될 수 있다.

본 발명의 펙틴 분해 효소는 또한 수율을 높이기 위한 과일 또는 야채 쥬스의 제조에, 및 예컨대 포도주 또는 쥬스 제조로부터 나오는 다양한 식물 세포벽-유도된 물질 또는 폐물질의 효소적 가수분해에, 또는 농업적 잔류물, 예컨대 야채의 겉껍질, 콩의 겉껍질, 사탕 무 펄프, 올리브 펄프, 감자 펄프, 등의 효소적 가수분해에 사용될 수 있다.

식물 물질은 상이한 종류의 가공처리를 개선시키기 위하여, 감귤류로부터 펙틴의 정제와 같은 갈락탄 이외의 다른 성분들의 정제 또는 추출을 용이하게 하기 위하여, 사료 값을 개선시키기 위하여, 물 결합 용량을 감소시키기 위하여, 폐수 식물에서의 분해성을 개선시키기 위하여, 식물 물질의 생목초로의 전환을 개선시키기 위하여 등의 목적으로 분해될 수 있다.

본 발명의 효소 제제에 의하여 처리된 과일 또는 야채의 굳기 및 외관을 조절하는 것이 가능하다. 굳기 및 외관은 처리에 사용된 효소들의 실제 조합의 산유물, 즉 본 발명의 펙테이트 리아제가 조합되는 효소의 특이성인 것으로 밝혀졌다. 실예로는 예컨대 사과, 배 또는 베리로부터의 투명한 쥬스의 제조; 예컨대 사과, 배, 베리, 감귤류 또는 토마토로부터의 구름같은 안정한 쥬스의 제조; 및 예컨대 당근 및 토마토로부터의 퓌레의 제조를 포함한다.

본 발명의 펙틴 분해 효소는 식물 세포벽으로부터 유도된 물질의 점성을 변형시키기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 펙틴 분해 효소는 갈락탄을 함유하고 있는 사료의 점성을 감소시키기 위하여 및 점성 갈락탄 함유 물질의 처리를 촉진시키기 위하여 사용될 수 있다. 점성 감소는 갈락탄 함유 식물 물질을 본 발명의 효소 제제로, 갈락탄 함유 물질의 완전한 또는 부분적인 분해가 일어나기에 적당한 조건하에서 처리함으로써 얻어질 수 있다.

펙틴 분해 효소는 예컨대 식물 세포로부터의 펙틴성 물질의 제거를 위하여 다른 효소들과 함께 사용될 수 있다. 이런 제거는 예컨대 직물 섬유 또는 다른 셀룰로스성 물질의 제조에 필수적이다. 이런 목적을 위하여 식물 섬유 물질은, 식물 섬유 물질과 결합된 펙틴성 물질의 완전한 또는 부분적인 분해를 얻기에 적당한 조건하에서, 적당한 양의 본 발명의 펙틴 분해효소로 처리된다.

동물 사료 첨가제

본 발명의 펙틴 분해 효소는 동물 사료의 변형을 위해 사용될 수 있고, 그것들의 효과를 시험관내에서 (사료의 성분을 변형시킴으로써) 또는 생체내에서 발휘할 수 있다. 펙틴 분해 효소는 특히 다량의 아라비노갈락탄 또는 갈락탄을 함유하고 있는 동물 사료 성분, 예컨대 콩, 평지씨, 루핀 등으로부터 얻어지는 식물 물질을 함유하고 있는 사료에 대한 첨가에 적당하다. 사료에 첨가될 때 펙틴 분해 효소는 식물 세포벽 물질의 생체내 파괴를 상당히 개선시키고, 그로써 동물에 의한 식물 영양분의 더 좋은 활용이 이루어진다. 그럼으로써, 동물의 성장 속도 및/또는 사료 전환율 (즉 증가된 체중에 대한 섭취된 사료의 중량)이 개선된다. 예를 들어 섭취할 수 있는 갈락탄은 예컨대 β-갈락토시다제와 결합된 펙테이트 리아제에 의해, 동물에 의해 소화될 수 있는 갈락토스 또는 갈락토올리고머로 분해되고, 그로써 사료의 활용가능한 에너지에 기여한다. 또한, 갈락탄의 분해에 의하여 펙틴 리아제는 단백질, 지방 및 미네랄과 같은 비-탄수화물 사료 성분들의 소화율 및 흡수를 개선시킬 수 있다.

추가의 설명에 대한 것은 하기 실시예 및 PCT/DK 96/00443 을 참조한다.

포도주 및 쥬스 가공처리

본 발명의 효소 또는 효소 제제는 야채 또는 과일 쥬스, 특히 사과 또는 배 쥬스의 탈-펙틴화 및 점성 감소에 사용될 수 있다. 이것은 과일 또는 야채 쥬스를, 과일 또는 야채 쥬스에 함유된 펙틴-함유 물질을 분해하기에 효과적인 양의 본 발명의 효소 제제로 처리함으로써 이루어질 수 있다.

본 발명의 효소 또는 효소 제제는 매시의 추출성 또는 분해성을 개선시키기 위하여 과일 및 야채로부터의 매시의 처리에 사용될 수 있다. 예를 들어, 효소 제제는 쥬스 제조를 위한 사과 및 배로부터의 매시의 처리에, 및 포도주 제조를 위한 포도의 매시 처리에 사용될 수 있다.

펙틴 분해 효소의 촉매작용 활성의 측정

점성 검정 APSU:

APSU 유니트: APSU 유니트 검정은 칼슘이 첨가되지 않은 기질 폴리갈락투론산을 사용하는 점성 측정이다.

기질인 5 % 의 폴리갈락투론산 나트륨 염 (Sigma P-1879)을 0.1 M 의 글리신 완충액 pH 10 에 용해시킨다. 4 ml 의 기질을 5 분동안 40 ℃ 에서 예비인큐베이션시킨다. 효소 (250 ㎕ 의 부피)를 첨가하고 10 초동안 혼합기에서 최대 속도에서 혼합한 다음, 20 분동안 40 ℃ 에서 인큐베이션한다. 표준 곡선을 위하여 5 APSU/ml 부터 100 이상의 APSU/ml 의 범위의 농도의 효소의 희석액을, 10 과 60 APSU/ml 사이에서 최소 4 농축액으로 이중 측정한다. 점성은 Sofraser (45700 Villemandeur, France)사에서 시판하는 MIVI 600 을 사용하여 측정한다. 점성은 10 초후에 mV 로서 측정한다.

APSU 유니트를 계산하기 위하여, 상술된 바와 같은 효소 표준 희석액을 사용하여 표준 곡선을 얻었다:

APSU/ml mV

0.00 300

4.00 276

9.00 249

14.00 227

19.00 206

24.00 188

34.00 177

49.00 163

99.00 168

GrafPad 프리즘 프로그램: 이 프로그램을 평평한 부분이 있는 1-상 지수 감소가 있는 비선형 피트를 사용하여 계산에 사용하였다. 평평한 부분과 스팬의 합은 효소 없이 얻어진 mV 이다. 평평한 부분은 100 이상의 APSU 의 mV 이며, 두가지 실시예에서 점성의 절반의 감소는 12 APSU 유니트이고 표준 에러는 1.5 APSU 인 것으로 나타났다.

리아제 검정 (235 nm 에서)

β-제거의 측정을 위하여 235 nm 에서의 흡광도의 감소를 측정하는 검정을, 0.1 M 의 글리신 완충액 pH 10 중에 용해되어 있는 0.1 % 의 폴리갈락투론 산 나트륨 염 (Sigma P-1879) 기질을 사용하여 수행하였다. 촉매작용 속도의 계산에 대해분당 235 유니트에서의 5.2 흡광도의 증가는 1 ㎛ 의 불포화 생성물의 형성에 상응한다 (Nasuna and Starr (1966) J. Biol. Chem. Vol. 241 pp. 5298-5306; Bartling, Wegener and Olsen (1995) Microbiology Vol. 141 pp. 873-881).

고정 상태 조건은 235 nm 에서 흡광도의 연속적인 측정을 할 수 있는 온도 조절된 큐벳 홀더에서 HP 다이오드 배열 분광계상에서 1 cm 의 광경로를 가지고 있는 0.5 ml 의 큐벳을 사용하였다. 고정 상태에 대하여 속도의 계산을 위하여 최소한 200 초동안 선형 증가를 사용하였다. 그것을 분당 생성물의 ㎛ 의 형성으로의 전환에 대해 사용하였다.

아가 검정

펙테이트 리아제 활성은 0.7 w/v % 의 폴리갈락투론산 나트륨 (Sigma P-1879)이 함유되어 있는 아가 플레이트 (예컨대 LB 아가)에 천공되어 있는 4 mm 의 구멍에 시험 용액을 도포함으로써 측정될 수 있다. 그런 다음 플레이트를 6 시간동안 특정한 온도 (예컨대 75 ℃)에서 인큐베이션한다. 그런 다음 플레이트를 (i) 1 M 의 CaCl₂에서 0.5 시간동안 또는 (ii) 1 % 의 혼합 알킬 트리메틸암모늄 Br (MTAB, Sigma M-7635)에서 1 시간동안 침지시킨다. 이들 두가지 과정은 모두 아가내에 폴리갈락투로네이트의 침전을 유발시킨다. 펙테이트 리아제 활성은 침전된 폴리갈락투로네이트의 바탕내에 있는 투명한 조운의 발생에 의해 검출될 수 있다. 검정의 민감성은 펙테이트 리아제의 표준 제제의 희석액을 사용하여 눈금을 정한다.

종점 분석 - 펙테이트 리아제에 대한 235 nm 에서의 트란스엘레미네이션 (고칼슘 방법: 최종 인큐베이션 혼합물중의 1 mM 의 칼슘)

이 방법에서, 기질 및 효소는 20 분동안 37 ℃ 에서 인큐베이션된 다음, 이중 결합의 형성에 대하여 235 nm 에서 측정된다. 마지막으로, 분해 속도는 트란스 유니트의 관점에서 몰 흡광도 계수를 토대로 계산된다.

과정:

0.5 ml 의 효소 희석액을 0.5 ml 의 2*기질 용액과 혼합한다.

기질: 시그마사로부터의 폴리갈락투론산, P-1879 lot 77H3784

완충액 2X: 0.1 M 의 글리신 pH 10 + 2.0 mmol 의 CaCl₂

중지 시약: 0.02 M 의 H₃PO₄

인큐베이션 온도: 37 ℃

반응 시간: 20 분

트란스엘레미네이션의 흡광도 계수: 0.0052 μmol cm^-1

이온이 없는 물에 ml 당 0.5 내지 5 APSU 가 되도록 효소를 희석한다. 중요한 것은 0.5 ml 로 이중으로 한다. 2 X 완충액중의 2 w/v % 기질을 0.5 ml 의 희석된 효소와 혼합하고, 이 두가지는 5 분동안 37 ℃ 의 수조에서 미리 인큐베이션한다. 중지는 5 ml 의 중지 시약을 사용하여 혼합한다. 효소와 중지 시약을 먼저 블랭크로 혼합한 후, 기질을 동일한 부피로 모두에 첨가한다.

효소 0.5 ml

기질 0.5 ml

중지 5 ml

총 부피 6 ml

1 cm 큐벳에서 235 nm 에서 흡광도를 측정한다.

0.0052 μmol cm^-1의 흡광도 계수를 사용하여 분당 트란스엘레미네이션의 형성을 계산한다.

계산: [(주요 + 주요)/2-블랭크]0.0052*6*2*효소 희석/20 분/1000 ml = 분당 μmol.

종점 분석 - pH 9.0 에서의 펙틴 리아제에 대한 235 nm 에서의 트란스엘 레미네이션

이 방법은 상술된 바와 같이 종점 분석에 대하여 수행된다 - 다음의 기질과 완충액을 사용하여 펙테이트 리아제에 대하여 235 nm 에서의 트란스엘레미네이션 (고 칼슘 방법)을 수행한다:

기질: 시그마사로부터의 감귤류로부터 얻어지는 에스테르화된 펙틴, P-9561 lot 125H0123.

완충액 2X: 0.1 M 의 붕산염 pH 9.0, 5 mM 의 EDTA.

재료 및 방법

스트레인

바실루스 리케니포르미스 ATCC 14580.

바실루스 스트레인 PL2306. 이 스트레인은 apr 및 npr 유전자가 파괴된 바실루스 서브틸리스 DN1885 이다 (Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B. R., Sjoholm, C. (1990)). 바실루스 브레비스로부터 얻어지는 엑소효소인 알파-아세토락테이트 데카르복실라제를 코드화하는 aldB 의 클로닝 (J. Bacteriol. 172, 4315-4321)은 공지되어 있는 바실루스 서브틸리스 셀룰라제 유전자의 전사 유니트를 파괴하고, 그 결과 셀룰라제 네가티브 세포를 유발한다. 이 파괴는 본질적으로 문헌에 기재되어 있는 바와 같이 수행되었다 (Eds. A. L. Sonenshein, J.A. Hoch and Richard Losick (1993) Bacillus subtilis and other Gram-Positive Bacteria, American Society for microbiology, p.618).

경합하는 세포가 준비되었고 문헌에 소개된 바와 같이 형질전환되었다 (Yasbin, R.E., Wilson, G.A. and Young, F.E. (1975) Transformation and transfection in lysogenic strains of Bacillus subtilis: evidence for selective induction of prophage in competent cells. J. Bacteriol, 121:296-304).

플라스미드

pMOL944:

이 플라스미드는 본질적으로 바실루스 서브틸리스에서 증식할 수 있는 플라스미드를 만들 수 있는 엘레먼트, 카나마이신 내성 유전자를 함유하고 있고, 강한 프로모터와 바실루스 리케니포르미스 ATCC 14580 의 amyL 유전자로부터 클론된 신호 펩티드를 가지고 있는 pUB110 유도체이다. 신호 펩티드에는 신호 펩티드와 융합하는 단백질의 성숙한 부분을 코드화하는 DNA 를 클론하는 것을 편리하게 만들어주는 SacII 부위가 함유되어 있다. 이것은 프레-단백질의 발현이 세포의 외부를 향하여 지정되는 것을 유발한다.

플라스미드는 하기에서 간단하게 설명되는 종래의 유전 공학적 기법에 의하여 제조되었다.

pMOL944 의 제조:

pUB110 플라스미드 (Mckenzie, T. et al., 1986, Plasmid 15:93-103)를 유일한 제한 효소 NciI 로 소화시켰다. 플라스미드 pDN1981 (P.L. Jorgensen et al., 1990, Gene, 96, p. 37-41)상에 코드화된 amyL 프로모터로부터 증폭된 PCR 단편을 NciI 으로 소화시키고, NciI 소화된 pUB110 안에 삽입하여 플라스미드 pSJ2624 를 만들었다.

사용된 두 개의 PCR 프라이머는 다음의 서열을 갖는다:

#LWN5494 5'-GTCGCCGGGGCGGCCGCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC -3'

#LWN5495 5'-GTCGCCCGGGAGCTCTGATCAGGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAG

GCAGCAAGAAGAT -3'

프라이머 #LWN5494 는 플라스미드안에 NotI 부위를 삽입시킨다.

그런 다음 플라스미드 pSJ2624 를 SacI 및 NotI 으로 소화시키고, pDN1981 상에 코드화된 amyL 프로모터에 대해 증폭된 새로운 PCR 단편을 SacI 및 NotI 으로 소화시킨 후, 이 DNA 단편을 SacI-NotI 소화된 pSJ2624 에 삽입하여 플라스미드 pSJ2670 을 얻었다.

이 클로닝으로, 동일하지만 반대 방향으로 존재하는 프로모터로 처음의 amyL 프로모터가 교체되었다. PCR 증폭에 사용된 두 개의 프라이머는 다음의 서열을 갖는다:

#LWN5938 5'-GTCGGCGGCCGCTGATCACGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGA

AGAT-3'

#LWN5939 5'-GTCGGAGCTCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC -3'

플라스미드 pSJ2670 을 제한 효소 PstI 과 BclI 으로 소화시키고, 알칼리성 아밀라제 SP722 (국제 특허 출원 공보 WO 95/26397 에 개시됨)를 코드화하는 클론된 DNA 서열로부터 증폭된 PCR 단편을 PstI 및 BclI 으로 소화시킨 후, 삽입하여 플라스미드 pMOL944 를 얻었다. PCR 증폭에 사용된 두 개의 프라이머는 다음의 서열을 갖는다:

#LWN7864 5'-AACAGCTGATCACGACTGATCTTTTAGCTTGGCAC -3'

#LWN7901 5'-AACTGCAGCCGCGGCACATCATAATGGGACAAATGGG -3'

프라이머 #LWN7901 은 플라스미드에 SacII 부위를 삽입시킨다.

일반적인 분자 생물학 방법

다른 언급이 없는 한, DNA 분자 및 형질전환은 분자 생물학의 표준 방법을 사용하여 수행되었다 (Sambrook et al., (1989) Molecular Clonoing: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F.M. et al., (eds.) ″Current protocols in Molecular Biology″ John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C.R., and Cutting, S.M. (eds.) ″Molecular Biological Methods for Bacillus″, John Wiley and Sons, 1990).

DNA 조작을 위한 효소들은 공급자의 명세에 따라 사용되었다 (예컨대 제한 엔도뉴클레아제, 리가제 등은 New England Biolabs, Inc. 로부터 얻음).

배지

TY (Ausubel, F.M. et al. (eds.) ″Current protocols in Molecular Biology″ John Wiley and Sons, 1995 에서 설명된 바와 같음).

LB 아가 (Ausubel, F.M. et al. (eds.) ″Current protocols in Molecular Biology″ John Wiley and Sons, 1995 에서 설명된 바와 같음).

LBPG 는 0.5 %의 글루코스와 0.05 M 의 인산 칼륨 pH 7.0 이 첨가된 LB 아가이다.

BPX 배지는 EP 0 506 780 (WO 91/09129)에 기재되어 있다.

다음의 실시예는 본 발명을 예시한다.

실시예 1

바실루스 리케니포르미스로부터의 펙테이트 리아제 (II)의 클로닝,

발현, 정제 및 특성 확인

게놈 DNA 제조

바실루스 리케니포르미스 스트레인 ATCC 14580 을 ATCC (American Type Culture Collection, USA)에 의해 특정된 액체 배지 3 에서 증식시켰다. 37 ℃ 에서 및 300 rpm 에서 18 시간동안 인큐베이션한 후에, 세포를 수득하고, 피쳐 등에 의해 설명된 방법에 의해 게놈 DNA 를 단리하였다 (Pitcher, D.G., Saunders, N.A., Owen, R.J. (1989), Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Lett. Appl. Microbiol., 8, 151-156).

본 발명의 펙테이트 리아제 II 를 코드화하는 DNA 서열(상기 참조, 아미노산 서열 SEQ ID NO: 8 로 표시됨)을 하기의 두 개의 올리고 뉴클레오티드로 구성되는 PCR 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭시켰다:

Pecl.B.lich.upper.SacII

5' -CTA ACT GCA GCC GCG GCA GCT TCT GCC TTA AAC TCG GGC -3'

Pecl.B.lich.lower.NotI

5' -GCG TTG AGA CGC GCG GCC GCT GAA TGC CCC GGA CGT TTC ACC -3'

제한 부위 SacII 와 NotI 은 밑줄로 표시한다.

상술된 바와 같이 바실루스 리케니포르미스 ATCC 14580 으로부터 단리된 염색체 DNA 를, 공급자의 지시를 따라 Amplitaq DNA 중합효소 (Perkin Elmer)를 사용하는 PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다. PCR 반응은 200 μM 의 각각의 dNTP, 2.5 유니트의 AmpliTaq DNA 중합효소 (Perkin-Elmer, Cetus, USA) 및 100 pmol 의 각각의 프라이머를 함유하고 있는 PCR 완충액 (10 mM 의 트리스-HCl, pH 8.3, 50 mM 의 KCl, 1.5 mM 의 MgCl₂, 0.01 % (w/v)의 젤라틴)중에서 세팅하였다.

PCR 반응을 DNA 열 사이클러 (Landgraf, Germany)를 사용하여 수행하였다. 94 ℃ 에서 1 분동안 인큐베이션한 후, 이어서 94 ℃ 에서 30 초동안 변성, 60 ℃ 에서 1 분동안 아닐링, 및 72 ℃ 에서 2 분동안 연장시키는 사이클 프로필을 사용하여 수행되는 PCR 을 30 사이클을 수행하였다. 5 ㎕ 의 증폭 생성물의 분취액을 0.7 % 의 아가로스 겔 (NuSieve, FMC)에서의 전기영동에 의하여 분석하였다. 1.0 kb 크기의 DNA 단편의 발생이 유전자 절편이 적절하게 증폭되었음을 나타낸다.

PCR 단편의 하위클로닝

상술된 바와 같이 생성된 PCR 생성물의 45 ㎕ 분취액을, QIAquick 정제 키트 (Qiagen, USA)를 사용하여 제조자의 지시를 따라 정제하였다. 정제된 DNA 를 50 ㎕ 의 10 mM 의 트리스-HCl, pH 8.5 에서 용출시켰다. 5 ㎍ 의 pMOL944 및 25 ㎕ 의 정제된 PCR 단편을 SacII 및 NotI 으로 소화시킨 후, 0.8 % 의 낮은 겔화 온도를 가지고 있는 아가로스 (SeaPlaque GTG, FMC) 겔에서 전기영동시키고, 관련된 단편을 겔로부터 절출시킨 다음, QIAquick 겔 추출 키트 (Qiagen, USA)를 사용하여 제조자의 지시를 따라 정제하였다. 그런 다음 단리된 PCR DNA 단편을 SacII-NotI 소화되고 정제된 pMOL944 에 결찰시켰다. 결찰은 0.5 ㎍ 의 각각의 DNA 단편, 1 U 의 T4 DNA 리가제 및 T4 리가제 완충액 (Boehringer Mannheim, Germany)을 사용하여 16 ℃ 에서 하룻밤동안 수행하였다.

결찰 혼합물을 사용하여 경합하는 바실루스 서브틸리스 PL2306 을 형질전환하였다. 형질전환된 세포를 LBPG-10 ㎍/ml 의 카나마이신 플레이트위에 플레이팅하였다. 37 ℃ 에서 18 시간동안 인큐베이션 한 후, 여러개의 클론을 새로운 아가 플레이트위에 재스트리킹하고, 다시 10 ㎍/ml 의 카나마이신이 첨가된 액체 TY 배지에서 성장시켜서 37 ℃ 에서 하룻밤동안 인큐베이션하였다. 다음날, 1 ml 의 세포를 취하여, Qiaprep Spin 플라스미드 Miniprep 키트 #27106 을 사용하여, 바실루스 서브틸리스 플라스미드 제조를 위한 제조자의 권고를 따라 세포로부터 플라스미드를 단리하였다. 이 플라스미드 DNA 를 DNA 서열화를 위한 주형으로서 사용하였다.

펙테이트 리아제 유전자를 함유하고 있는 한 클론을 택하여 이 클론을 MB541 로 명명하였다.

펙테이트 리아제의 성숙한 부분에 상응하는 DNA 를, Taq 데옥시-말단 사이클 서열화 키트 (Perkin-Elmer, USA), 형광 표지된 터미네이터 및 주형으로서 적절한 올리고뉴클레오티드를 사용하는 프라이머워킹에 의한 DNA 서열화에 의하여 특성을 확인하였다.

서열 데이터에 대한 분석을 문헌에 따라 수행하였다 (Devereux et al., (1984), Nucleic Acids Res. 12, 387-395). 클론된 DNA 서열은 바실루스 서브틸리스에서 발현되었고, 상층액에 나타난 단백질은 SEQ ID NO: 8 로 표시된 성숙한 단백질에 상응하였다.

정제

두 개의 500 ml 의 배플된 진동 플라스크중에서 10 ㎍/ml 의 카나마이신이 첨가된 25 × 200 ml 의 BPX 배지에서 MB541 을 5 일동안 37 ℃ 에서 성장시킴으로써, 3500 ml 의 배양 육즙을 얻었다. 아세트산을 사용하여 pH 를 5.0 으로 조정하고, 응집을 위하여 교반하는 동안 100 ml 의 양이온성 제제 (C521) 및 200 ml 의 음이온성 제제 (A130)를 첨가하였다. 응집된 물질을 10000 rpm 에서 30 분동안 6 ℃ 에서 Sorval RC 3B 원심분리를 사용하여 원심분리함으로써 분리하였다. 그 결과의 상층액은 총 부피 3600 ml 중에 ml 당 370 APSU 를 함유하였다.

상층액을 훠트만 유리 필터 GF/D 및 C 를 사용하여 정화시키고, 마지막으로 컷 오프값이 10 kDa 인 필트론 UF 멤브레인상에서 농축하였다. 2000 ml 의 총 부피를 pH 8.5 로 조정하였다. 50 g 의 DEAE A-50 세파덱스 (Pharmacia)를 2000 ml 의 50 mM 의 트리스 pH 8.5 에서 팽창시켰다. 초과량의 완충액을 버리고, 투명한 농축 효소 용액을 슬러리와 15 분동안 혼합하였다. 효소를 이온-교환 물질로부터 부흐너 깔대기상에서의 흡인에 의해 분리하였다. 그 결과의 용액을 컷 오프값이 10 kDa 인 필트론상에서 최종 부피 800 ml 로 농축하였다.

고도로 정제된 펙테이트 리아제를 얻기 위하여, S-세파로스 양이온-교환 크로마토그래피를 사용하는 최종 단계를 수행하였다. ml 당 950 APSU 의 용액 50 ml (상기 참조)을 아세트산을 사용하여 pH 5.0 으로 조정하였다. 그것을 50 mmol 의 아세트산 나트륨 pH 5.0 의 완충액으로 평형시켜 놓은 S-세파로스 (Pharmacia)를 함유하고 있는 50 ml 의 칼럼에 적용하였다. 결합된 펙테이트 리아제를 0.5 M 의 염화 나트륨의 구배를 사용하여 용출하였다.

특성확인

순수한 효소는 SDS-PAGE 에서 35 kDa 의 단일 밴드로서 나타나고, 6.1 정도의 등전점을 나타낸다.

단백질 농도를 57750 의 몰 흡광도 계수를 사용하여 측정하였다 (서열로부터 추론된 아미노산 조성을 토대로 함).

235 nm 에서 측정될 수 있는 이중 결합의 형성에 의해 절단의 형성을 검출하는 검정을 사용하여 다음의 데이터를 얻었다.

1. (조건: pH 10; 글리신 완충액; 칼슘 없음; 기질로서 폴리갈락투론산 Sigma P-1879): 분당 mg 당 1 μmol.

2. (조건: pH 10; 글리신 완충액; 칼슘 없음; 기질로서 DE35 (35 % 의 에스테르화된 펙틴): 분당 mg 당 4 μmol.

순수한 효소를 EDTA 에 대하여 pH 8.0 (20 mM 의 트리스 pH 8.0)에서, 및 pH 10 에서 (20 mM 의 글리신 pH 10) 투석하고, 원형 이색성으로 분석한 결과, EDTA 가 있을 때와 없을 때의 스펙트럼의 차이가 없었다.

4 가지 샘플에 대한 미분 스캐닝 열량 측정 결과, 효소는 pH 8.0 에서 가장 안정하며, 트리스 pH 8.0 에서 70 ℃ 주위의 용융점을 가지고, EDTA 에 대한 투석 후에는 75 ℃ 의 용융점을 갖는다. pH 10 에서는 효소는 EDTA 가 있을 때나 없을 때나 55 ℃ 에서 용융되었다.

촉매작용 활성 : 펙테이트 리아제의 촉매작용 활성은 기질과 함께 인큐베이션되는 동안 EDTA 의 존재에 의해 억제되지만, EDTA 에 대하여 투석된 효소는 기질과 함께 인큐베이션되는 동안 EDTA 가 없어도 여전히 활성이다. Fe++, Li++, Mg++, Cu++, Mn++ 과 같은 이가의 양이온은 촉매작용 활성에 영향을 미치지 않는다.

상이한 pH 값에서의 β-트란스엘레미네이션 활성 (235 nm 에서 리아제 검정을 사용함)을 다음의 완충제를 사용하여 40 ℃ 에서 고정 상태 역학으로서 측정하였다:

pH 6.0: Na-MES 0.1 M

pH 6.5, 7.0 ＆ 7.5: Na-MOPS 0.1 M

pH 8.0 ＆ 8.5: 트리스 0.1 M

pH 9.0, 9.5, 10.0 ＆ 10.5: Na-글리신 0.1 M

pH 11 - 11.5: Na-탄산염 0.1 M

MES: 시그마사로부터, No. M-8250 (2[N-모르폴리노] 에탄 술폰산).

MOPS: 시그마사로부터, No. M-1254 (3-[N-모르폴리노] 프로판 술폰산).

트리스: Merck Co. 로부터, No. 1.08382

글리신: MERCK 사로부터

탄산 나트륨: Merck No. 6392.

상대적인 활성 (비율)을 최적 활성의 백분율로서 계산하였고, 다음의 결과를 얻었다:

pH % 활성

6.5 1

7 5

7.5 4

8 4

8.5 4

9 6

9.5 23

10 100

10.5 n.d.

11 52

11.2 0

따라서, 상이한 온도에서의 (pH 10) 상대 활성도 발견되었다:

온도, ℃ % 활성

40 65

50 87

55 87

60 100

65 90

세제에서의 활성: 완충제 대신 상업적인 세제를 사용하여 20 분동안 40 ℃ 에서 폴리갈락투론산 나트륨 염 (Sigma P-1879)과 함께 인큐베이션한 후, 환원당을 측정하였다. 효소는 유럽형 시판용 분말 세제 Ariel Futur 에서 44 % 의 상대 활성을 보였고, US Tide 시판 분말에서 51 % 의 상대활성을 보였으며, US Tide 시판 액체 세제에서는 30 % 의 상대 활성을 보였다. 상기 활성은 모두 글리신 완충액에서 측정하였다. 측정에 사용된 세제 농도는 권장 농도였고, 물은 유럽형 조건하에서는 18 도의 독일 경도를 가지고, 미국 조건하에서는 9 도의 경도를 가지는 수돗물이었다.

면역학적 성질: 덴마아크의 회사인 DAKO 에서, 종래의 기법을 사용하여 고도로 정제된 펙테이트 리아제에 대하여 토끼에서 다클론성 모노-특이적 혈청을 발생시켰다. 이 혈청은 아가로스 겔에서 본 발명의 펙테이트 리아제와 함께 깨끗한 단일 침전을 형성하였고, Novo Nordisk A/S 로부터의 Pulpzyme HC 배치 No. CKF0054 또는 배치 No. CKN00009 와 같은 바실루스 리케니포르미스 미정제 생성물에 대해서는 주된 하나의 침전만이 형성되었다.

실시예 2

바실루스 리케니포르미스로부터의 펙테이트 리아제 (I)의 클로닝,

발현, 정제 및 특성 확인

게놈 DNA 제조

스트레인 ATCC 14580 을 ATCC (American Type Culture Collection, USA)에 의해 특정된 액체 배지 3 에서 증식시켰다. 37 ℃ 에서 및 300 rpm 에서 18 시간동안 인큐베이션한 후에, 세포를 수득하고, 피쳐 등에 의해 설명된 방법에 의해 게놈 DNA 를 단리하였다 (Pitcher, D.G., Saunders, N.A., Owen, R.J.: Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Lett. Appl. Microbiol., 8, 151-156).

본 발명의 서열의 규정

서열을 본 발명의 펙테이트 리아제의 전체 오픈 리딩 프레임의 중폭을 위해 후속되는 PCR 반응에서 사용될 수 있는 다음의 두 개의 프라이머에 의하여 규정한다:

Pecl3.orf.PstI

5' - CAC ATC TGC AGC ATG AAG AGA TTA GCA GGT ACG GTT ATT TTG TC - 3'

Pecl3.Licheniformis.lower.NotI

5' - CTC ATC ATG CGG CCG CAG GGG CCT TTA TTT GCA ATC AGT G - 3'

클로닝 목적을 위한 제한 효소 부위는 밑줄로 표시한다.

전체 orf 는 상기 실시예 1 에서와 같이 수행된 PCR 에서 상기 프라이머를 사용하여 클론될 수 있다. 0.7 kb 크기의 DNA 의 단편의 발생은 유전자 절편이 적절하게 증폭되었음을 나타낸다. 이 DNA 단편은 대장균, 바실루스 서브틸리스 또는 다른 것에서 클로닝하기에 적당한 벡터라면 어떠한 벡터에도 클론될 수 있다. 단편은 PstI-NotI 단편으로서 클론된다. PCR 단편 또는 클론된 단편에 대하여 DNA 서열화를 수행하였을 때, 그로 인해 나타나는 DNA 서열의 오픈 리딩 프레임은 SEQ ID NO: 3 에 표시된다.

바실루스 서브틸리스에서의 펙테이트 리아제의 하위클로닝 및 발현

본 발명의 펙테이트 리아제를 코드화하는 DNA 서열 (SEQ ID NO: 3)을 다음의 두 개의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PCR 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭시켰다:

Pecl3.Licheniformis.upper.PstI

5' - CAC ATC TGC AGC CGC GGC AGC CGA GGT CGT TCA CAA AAC G - 3'

Pecl3.Licheniformis.lower.NotI

5' - CTC ATC ATG CGG CCG CAG GGG CCT TTA TTT GCA ATC AGT G - 3'

제한 부위 PstI 및 NotI 은 밑줄로 표시한다.

상술된 바와 같이 바실루스 리케니포르미스로부터 단리된 염색체 DNA 는 상기 실시예 1 에서 설명된 바와 같이 수행된 PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다. 0.6 kb 크기의 DNA 단편의 발생은 유전자 절편이 적절하게 증폭되었음을 나타낸다.

PCR 단편의 하위클로닝

이 과정을 상기 실시예 1 에서와 같이 수행하되, 단 정제된 PCR 단편을 PstI 및 NotI 으로 소화시켰다. 여러 개의 클론을, 하룻밤동안의 배양 육즙으로부터의 플라스미드 DNA 를 단리함에 의해 분석하였다.

하나의 그러한 포지티브 클론을 상기에서 사용된 것과 같은 아가 플레이트위에 여러번 재스트리킹하고, 이 클론을 MB750 으로 명명하였다. 클론 MB750 을 TY-10 ㎍/ml 의 카나마이신중에서 37 ℃ 에서 밤새 성장시키고, 다음날 1 ml 의 세포를 취하여, Qiaprep Spin 플라스미드 Miniprep 키트 #27106 을 사용하여, 바실루스 서브틸리스 플라스미드 제조를 위한 제조자의 권고를 따라 세포로부터 플라스미드를 단리하였다. 이 DNA 를 DNA 서열화하였고, 그 결과 펙테이트 리아제의 성숙한 부분에 상응하는 DNA 서열, 즉 첨부된 SEQ ID NO: 3 의 위치 85 에서 666 의 DNA 서열을 나타냈다. 유도된 단백질 서열은 SEQ ID NO: 4 에 열거된다.

발효 및 정제

상술된 바와 같이 얻어진 클론 MB750 을 두 개의 500 ml 의 배플된 진동 플라스크중의 10 ㎍/ml 의 카나마이신이 첨가된 200 ml 의 BPX 배지에서 5 일동안 37 ℃ 에서 및 300 rpm 에서 성장시켰다.

양이온성 응집제 C521 (10 % 용액) 및 음이온성 제제 A130 의 0.1 % 용액을 사용하여 응집을 수행하였다; pH 6.0 에서의 1300 ml 의 발효 배지에 10 ml 의 C521 (10 %)을 동시에 20 ml 의 A130 (0.1 %)과 함께 교반하에 실온에서 첨가하였다. 응집된 물질을 Sorval RC 3B 원심분리기를 사용하여 10,000 rpm 에서 30 분동안 원심분리함으로써 분리하였다. 액체를 분자량 컷오프가 10 kDa 인 필트론 한외여과를 사용하여 200 ml 로 농축하였다. 이 생성물을 40 % 의 글리세롤을 사용한 멸균후의 적용 시도에 사용하였다 (배치 #9845 는 ml 당 193 트란스 유니트 또는 ml 당 1.97 mg 의 활성 펙테이트 리아제를 함유한다).

25 mM 의 아세트산 나트륨 완충액을 사용하는 pH 5.5 에서의 양이온성 크로마토그래피 S-세파로스 칼럼을 사용하여, NaCl 구배를 사용하여 효소를 용출시키고, 최종 정제 단계로서 0.1 M 의 아세트산 나트륨 완충액중에서 작동하는 슈퍼덱스 200 칼럼상에서의 크기 축출 크로마토그래피를 수행함으로써 고도로 정제된 효소를 얻었다.

특성 확인

순수한 효소는 22 kDa 의 분자량 및 6.2 의 등전점을 가지고 있다.

pH 10 에서의 최적 온도 (상대 활성)는 40 ℃ 이다.

상대 활성은 40 ℃ 의 온도에서 pH 9.5 와 pH 10.5 사이에서 50 % 이상이다.

pH 6.0 에서의 효소의 DSC 는 61 ℃ 의 풀림 온도를 초래하였다.

정제된 펙테이트 리아제의 N-말단은 다음의 서열을 갖는다: AEVVHKTIV (아미노산 서열 SEQ ID NO: 4 의 위치 29 부터 시작함).

이 효소는 다당 리아제의 패밀리 3 에 속한다.

실시예 3

바실루스 리케니포르미스로부터의 펙틴 리아제 (III)의 클로닝, 발현, 정제 및 특성 확인

바실루스 리케니포르미스 펙틴 리아제를 코드화하는 유전자의 클로닝

바실루스 서브틸리스에서의 바실루스 리케니포르미스 펙틴 리아제의 하위클로닝 및 발현

본 발명의 펙틴 리아제를 코드화하는 DNA 서열 SEQ ID NO: 1 을 하기의 두 개의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PCR 프라이머 세팅을 사용하여 PCR 증폭시켰다:

Pect.upepr.PstI

5' - CAT AAA TCT GCA GCC GCG GCA GCA AAC GAA GAT TAT CCG GAA C - 3'

Pect.lower.NotI

5' - GAA AGG AAA AGC GGC CGC CAA ATA TTG AAA AGT GAG CGC AAT GTC G - 3'

제한 부위 PstI 과 NotI 은 밑줄로 표시한다.

상술된 바와 같이 바실루스 리케니포르미스로부터 단리된 염색체 DNA 를, 상기 실시예 1 에서 설명된 바와 같이 수행된 PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다. 대략 1.5 kb 크기의 DNA 단편의 발생은 유전자 절편이 적절하게 증폭되었음을 나타낸다.

PCR 단편의 하위클로닝

하위클로닝을 상기 실시예 1 에서와 같이 수행하되, 단 정제된 PCR 단편을 PstI 및 NotI 으로 소화시켰다. 여러 개의 클론을 하룻밤동안의 배양 육즙으로부터의 플라스미드 DNA 를 단리함에 의해 분석하였다.

하나의 그러한 포지티브 클론을 상기에서 사용된 것과 같은 아가 플레이트위에 여러번 재스트리킹하고, 이 클론을 MB588 로 명명하였다. 클론 MB588 을 TY-10 ㎍/ml 의 카나마이신중에서 37 ℃ 에서 밤새 성장시키고, 다음날 1 ml 의 세포를 취하여, Qiaprep Spin 플라스미드 Miniprep 키트 #27106 을 사용하여, 바실루스 서브틸리스 플라스미드 제조를 위한 제조자의 권고를 따라 세포로부터 플라스미드를 단리하였다. 이 DNA 를 DNA 서열화하였고, 그 결과 첨부된 SEQ ID NO: 1 의 펙틴 리아제의 성숙한 부분에 상응하는 DNA 서열을 나타냈고, 첨부된 단백질 서열 SEQ ID NO: 2 의 단백질 서열에 상응한다.

발효 및 정제

상술된 바와 같이 얻어진 클론 MB588 을, 두 개의 500 ml 의 배플된 진동 플라스크중의 10 ㎍/ml 의 카나마이신이 첨가된 200 ml 의 BPX 배지에서 5 일동안 37 ℃ 에서 및 300 rpm 에서 성장시켰다.

양이온성 응집제 C521 (10 % 용액) 및 음이온성 제제 A130 의 0.1 % 용액을 사용하여 응집을 수행하였다: pH 6.0 의 2000 ml 의 발효 배지에 20 ml 의 C521 (10 %)을 동시에 40 ml 의 A130 과 함께 교반하에 실온에서 첨가하였다. 응집된 물질을 Sorval RC 3B 원심분리기를 사용하여 10,000 rpm 에서 30 분동안 원심분리함으로써 분리하였다. 상층액을 훠트만 유리 필터 No. F 를 사용하여 정화하였다.

액체를 분자량 컷오프가 10 kDa 인 필트론 한외여과를 사용하여 300 ml 로 농축하였는데, 이것은 펙틴에 대해 2,262,000 트란스 유니트를 함유하였다. 여과액을 아세트산 나트륨을 사용하여 pH 5.5 로 조정하고, 50 mM 의 아세트산 나트륨 pH 5.5 로 평형시켜 놓은 S-세파로스 칼럼에 적용하였다. 펙틴 리아제가 칼럼에 결합하였고, 결합된 효소를 NaCl 구배를 사용하여 순수한 단백질로서 용출시켰다.

특성 확인

순수한 효소는 55 kDa 의 분자량 및 9.3 의 등전점을 가지고 있다.

상대 활성은 40 ℃ 의 온도에서 pH 8.5 와 pH 9.3 사이에서 50 % 이상이다 (펙틴은 pH 9.3 이상에서는 안정하게 에스테르화되지 않는다).

이 효소는 다당 리아제의 패밀리 1 에 속한다.

실시예 4

펙테이트 리아제와 CBD 사이의 융합 단백질의 제조 및 발현

클로스트리디움 써모셀룸 스트레인 YS 로부터 얻어지는 CipB 유전자의 CBD 를 코드화하는 DNA 서열 (Poole, D. M., Morag E., Lamed R., Bayer E.A., Hazlewood G.P., Gilbet H.J. (1992), Identification of the cellulose-binding domain of the cellulosome subunit S1 from Clostridium thermocellum YS, Fems Microbiology Letters Vol. 78, No. 2-3 pp. 181-186)을 다음의 두 개의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 PCR 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭시켰다:

CIPCBD.upper.PECL.SalI

5' - CGA CAA TGT CGA CAA TGT AAA ATC AAT CGT CAA GCA AAA TGC CGG AGT CGG CAA AAT CCA GCG CAG ACC GCC AAC ACC GAC CCC GAC TTC ACC GCC AAG CGC AAA TAC ACC GGT ATC AGG CAA TTT G - 3'

CIPCBD.lower.NotI

5' -GCG TTG AGA CGC GCG GCC GCT ATA CCA CAC TGC CAC CGG GTT CTT TAC -3'

제한 부위 SalI 및 NotI 은 밑줄로 표시한다.

CBD 를 코드화하는 염색체 DNA 는 문헌에서 설명된 바와 같이 얻어질 수 있다 (Poole, D. M., Morag E., Lamed R., Bayer E.A., Hazlewood G.P., Gilbet H.J. (1992), Identification of the cellulose-binding domain of the cellulosome subunit S1 from Clostridium thermocellum YS, Fems Microbiology Letters Vol. 78, No. 2-3 pp. 181-186). CBD 를 코드화하는 DNA 샘플을 상기 실시예 1 에서 설명된 바와 같이 수행된 PCR 반응의 주형으로서 사용하였다. 대략 0.5 kb 의 크기를 가지는 DNA 단편의 발생은 유전자 절편의 적절한 증폭을 나타낸다.

PCR 단편의 하위클로닝

하위클로닝을 상기 실시예 1 에서와 같이 수행하되, 단 정제된 PCR 단편을 SalI 및 NotI 으로 소화시켰다. 여러 개의 클론을 하룻밤동안의 배양 육즙으로부터의 플라스미드 DNA 를 단리함으로써 분석하였다.

하나의 그러한 포지티브 클론을 상기에서 사용된 것과 같은 아가 플레이트위에 여러번 재스트리킹하고, 이 클론을 MB914 로 명명하였다. 클론 MB914 를 TY-10 ㎍/ml 의 카나마이신중에서 37 ℃ 에서 밤새 성장시키고, 다음날 1 ml 의 세포를 취하여, Qiaprep Spin 플라스미드 Miniprep 키트 #27106 을 사용하여, 바실루스 서브틸리스 플라스미드 제조를 위한 제조자의 권고를 따라 세포로부터 플라스미드를 단리하였다. 이 DNA 를 DNA 서열화하였고, 그 결과 SEQ ID NO: 9 의 펙테이트 리아제-링커-cbd 의 융합 단백질에 상응하는 DNA 서열 및 첨부된 단백질 서열 SEQ ID NO: 10 의 서열에 상응한다.

펙테이트-리아제-cbd 융합 단백질의 발현 및 검출

MB914 를 20 시간동안 TY-배지에서 37 ℃ 에서 및 250 rpm 에서 인큐베이션하였다. 세포가 없는 상층액 1 ml 를 밀리포아 H20 중의 200 ㎕ 의 10 % 아비셀 (Merck, Darmstadt, Germany)과 혼합하였다. 이 혼합물을 30 분동안 0 ℃ 에서 방치하였다. 아비셀에 펙테이트 리아제-링커-CBD 융합 단백질이 결합된 후에, 단백질이 결합되어 있는 아비셀을 5 분동안 5000 g 에서 원심분리하였다. 생성된 펠렛을 100 ㎕ 의 SDS-PAGE 완충액에 재현탁시킨 후, 95 ℃ 에서 5 분동안 가열한 다음, 5000 g 에서 5 분동안 원심분리하고, 25 ㎕ 를 취하여 4 내지 20 % 의 라엠리 트리스-글리신, SDS-PAGE NOVEX 겔 (Novex, USA)위에 로딩하였다. 샘플을 Xcell^TMMini-Cell (NOVEX, USA)에서 제조자의 지시를 따라 전기영동하였고, 계속해서 쿠마찌를 사용한 염색, 얼룩 제거 및 건조를 포함한 겔의 모든 조작을 제조자의 지시대로 수행하였다.

대략 55 kDa 의 단백질 밴드의 발생은 플라스미드 pMB914 상에 코드화된 펙테이트 리아제-링커-CBD 융합 단백질이 바실루스 서브틸리스에서 발현되었음을 나타낸다.

실시예 5

셀룰로스성 물질의 펙테이트 리아제 처리:

펙틴 제거 및 습윤성에 미치는 온도의 효과

전형적으로 셀룰로스성 물질을 나타내는, 100 % 면 직조 트윌 직물, 디사이징된 시험 직물 #428U 를, 실시예 1 의 바실루스 리케니포르미스 펙테이트 리아제를 함유하고 있는 효소 수용액으로, pH 9 에서 직물 g 당 9 APSU 의 양으로 및 15:1 의 액 비율로 처리하였다. 처리 시간은 2 시간이었고, 온도는 35 ℃ 에서 75 ℃ 로 변화시켰다. 직물을 효소 처리후에 잘 세척하고, 건조시킨 후, 루테니움 적색으로 염색하였다. 염료 흡수는 분광측광계를 사용하여 측정였고, 이것은 섬유에 남아있는 잔류 펙틴의 척도이다. 잔류 펙틴의 백분율은 출발 물질의 염료 흡수를 100 % 잔류 펙틴으로서 사용하고, 전체적으로 화학적으로 연마되고 표백된 직물의 염료 흡수를 0 % 로서 사용하여 계산하였다. 그 결과를 하기 표 6 에 나타낸다. 나아가, 습윤성 (적하 시험 - 물방울이 직물에 의해 흡수되는 시간을 초로 측정함)을 측정하였고, 그 결과를 효소가 없는 대조표준과 비교하였다. 그 결과를 하기 표 7 에 나타낸다.

표 6

% 잔류 펙틴

온도, ℃	35	45	55	65	75
효소 없음	100	100	93	90	85
효소	52	40	32	28	26

- 알칼리성 연마로 인해 전형적으로 20 내지 25 % 의 잔류 펙틴이 남는다 -

표 7

온도, ℃	35	45	55	65	75
효소 없음	32	29	29	12	11
효소	15	10	7	5	3

- 습윤성 표적은 전형적으로 5 초 미만이다. -

온도를 증가시켰을 때의 유익한 효과는 두가지 반응에서 명백하게 알 수 있다.

실시예 6

셀룰로스성 물질의 펙테이트 리아제 처리:

펙틴 제거에 미치는 pH 의 효과

전형적으로 셀룰로스성 물질을 나타내는, 100 % 면 직조 트윌 직물, 디사이징된 시험 직물 #428U 를, 실시예 1 의 바실루스 리케니포르미스 펙테이트 리아제를 함유하고 있는 효소 수용액으로, 직물 g 당 9 APSU 의 양으로 및 15:1 의 액 비율로 처리하였다. 처리 시간은 2 시간이었고, 온도는 55 ℃ 였다. pH 를 8 에서 11 로 변화시켰다. 직물을 효소 처리후에 잘 세척하고, 건조시킨 후, 루테니움 적색으로 염색하였다. 염료 흡수는 분광측광계를 사용하여 측정였고, 이것은 섬유에 남아있는 잔류 펙틴의 척도이다. 잔류 펙틴의 백분율은 출발 물질의 염료 흡수를 100 % 잔류 펙틴으로서 사용하고, 전체적으로 화학적으로 연마되고 표백된 직물의 염료 흡수를 0 % 로서 사용하여 계산하였다. 그 결과를 하기 표 8 에 나타낸다.

표 8

pH	8	9	10	10.5	11
% 잔류 펙틴	35	32	30	48	61

최적 pH 는 대략 9.5 인 것으로 나타나지만, 양호한 활성이 매우 넓은 알칼리성 간격에서도 증명된다.

실시예 7

세제에서의 본 발명의 효소의 용도

상기 실시예 1 에서 설명된 바와 같이 얻어진 정제된 효소 (배치 9751)는, 종래의 시판되는 액체 세제를 사용하여 미니세척 시험에서 1 ppm 의 수준에서 시험하였을 때, 개선된 클리닝 성능을 나타냈다. 시험은 종래의 노오쓰 아메리칸 세척 조건하에서 수행하였다.

실시예 8

바나나 색으로 염색된 면 직물에 대한 탄수화물의 효과

방법:

세 개의 바나나를 갈아서 40 ml 의 물이 첨가된 울트라 Turrax 에서 균등화하였다. 스타일 400 면 (Testfabrics, Inc.)을 용액에 침지시키고, 두 개의 로울 사이에서 압착시킨 다음, 밤새 건조시켰다.

염색된 면 직물을, 각각 0.1 ppm, 0.2 ppm, 1 ppm 및 10 ppm 의 실시예 1 에서 얻어진 펙테이트 리아제가 첨가되어 있는 시판되는 액체 세제 브랜드 Ariel Futur Liquid 중에서 유럽형 세척 조건하에 세척하였다. 이 시험을 반복하였다.

결과:

Ariel 액체: 바나나색 염색의 % 제거 (100 % 는 염색이 전부 제거된 것이다).

	시험 A	시험 B
효소 없음	26 %	32 %
10 ppm 효소, ex 1	59 %	58 %
1 ppm 효소, ex 1	47 %	48 %
0.1 ppm 효소, ex 1	35 %	34 %

출원인 또는 대리인 파일번호:

국제출원번호:

기탁된 미생물에 대한 언급

(PCT 제 13bis 규칙)

A. 상세한 설명 5페이지 16행-6페이지 2행의 미생물과 관련한 선택 용지
B. 기탁의 확인다른 기탁이 추가용지상에서 확인됨
기탁기관명칭도이췌 잠룽 본 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하
기탁기관주소(우편번호와 국가명 포함)독일연방공화국 데-38124 브라운쉬바이크 마쉐르오데르 베크 1베
기탁일1997년 9월 25일	수탁번호DSM 11789
C. 추가지시(적용되지 않을 경우 공란). 별도의 첨부용지상에 본 정보가 계속됨 □
유럽특허 및/또는 호주특허가 등록공고시까지 또는 출원이 거절되거나 포기되는 경우출원일로부터 20년 동안 기탁된 미생물 시료 분양이 시료를 요구하는 사람(EPC 28(4)/호주제정규칙 1991 No 71의 규정 3.25)에 의해서 지정된 전문가에게만 가능하다.
D. 지시가 적용될 지정국가(모든 지정국가에 대한 지시가 아닐 경우)
E. 지시의 별도 제공(적용되지 않을 경우 공란).
이하에 기술된 지시가 이후에 국제사무국에 제출될 것임(예를 들면, 기탁의 수탁번호와 같이지시의 일반적 특성을 특정할 것).
? 본 용지는 국제출원이 출원될 때 국제출원과 함께 접수함 (수리관청이 점검함)-----------(담당자)? 국제사무국에 의한 접수일(출원인으로부터)-----------(담당자)

출원인 또는 대리인 파일번호:

국제출원번호:

기탁된 미생물에 대한 언급

(PCT 제 13bis 규칙)

A. 상세한 설명 8페이지 20행-9페이지 6행의 미생물과 관련한 선택 용지
B. 기탁의 확인다른 기탁이 추가용지상에서 확인됨 □
기탁기관명칭도이췌 잠룽 본 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하
기탁기관주소(우편번호와 국가명 포함)독일연방공화국 데-38124 브라운쉬바이크 마쉐르오데르 베크 1베
기탁일1998년 2월 23일	수탁번호DSM 12030
C. 추가지시(적용되지 않을 경우 공란). 별도의 첨부용지상에 본 정보가 계속됨 □
유럽특허 및/또는 호주특허가 등록공고시까지 또는 출원이 거절되거나 포기되는 경우출원일로부터 20년 동안 기탁된 미생물 시료 분양이 시료를 요구하는 사람(EPC 28(4)/호주제정규칙 1991 No 71의 규정 3.25)에 의해서 지정된 전문가에게만 가능하다.
D. 지시가 적용될 지정국가(모든 지정국가에 대한 지시가 아닐 경우)
E. 지시의 별도 제공(적용되지 않을 경우 공란).
이하에 기술된 지시가 이후에 국제사무국에 제출될 것임(예를 들면, 기탁의 수탁번호와 같이지시의 일반적 특성을 특정할 것).
? 본 용지는 국제출원이 출원될 때 국제출원과 함께 접수함 (수리관청이 점검함)-----------(담당자)? 국제사무국에 의한 접수일(출원인으로부터)-----------(담당자)

출원인 또는 대리인 파일번호:

국제출원번호:

기탁된 미생물에 대한 언급

(PCT 제 13bis 규칙)

A. 상세한 설명 7페이지 18행-8페이지 4행의 미생물과 관련한 선택 용지
B. 기탁의 확인다른 기탁이 추가용지상에서 확인됨 □
기탁기관명칭도이췌 잠룽 본 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하
기탁기관주소(우편번호와 국가명 포함)독일연방공화국 데-38124 브라운쉬바이크 마쉐르오데르 베크 1베
기탁일1998년 2월 23일	수탁번호DSM 12031
C. 추가지시(적용되지 않을 경우 공란). 별도의 첨부용지상에 본 정보가 계속됨 □
유럽특허 및/또는 호주특허가 등록공고시까지 또는 출원이 거절되거나 포기되는 경우출원일로부터 20년 동안 기탁된 미생물 시료 분양이 시료를 요구하는 사람(EPC 28(4)/호주제정규칙 1991 No 71의 규정 3.25)에 의해서 지정된 전문가에게만 가능하다.
D. 지시가 적용될 지정국가(모든 지정국가에 대한 지시가 아닐 경우)
E. 지시의 별도 제공(적용되지 않을 경우 공란).
이하에 기술된 지시가 이후에 국제사무국에 제출될 것임(예를 들면, 기탁의 수탁번호와 같이지시의 일반적 특성을 특정할 것).
? 본 용지는 국제출원이 출원될 때 국제출원과 함께 접수함 (수리관청이 점검함)-----------(담당자)? 국제사무국에 의한 접수일(출원인으로부터)-----------(담당자)

Claims (28)

1. 바실루스 리케니포르미스 ATCC 14580, 또는 모든 종이 바람직하게는 배열된 16S rDNA 서열을 토대로 바실루스 리케니포르미스에 대하여 최소한 99 % 상동하는 바실루스 종으로부터 유도되거나 또는 그것에 내인성인 펙틴 분해 효소로 본질적으로 이루어지는 효소 제제.
2. 제 1 항에 있어서, 펙틴 분해 효소가 8 보다 높은 pH, 바람직하게는 9 보다 높은 pH 에서 그것의 최적 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 효소 제제.
3. 제 1 항에 있어서, 펙틴 분해 효소가 펙테이트 리아제 (EC 4.2.2.2), 펙틴 리아제 (EC 4.2.2.10) 및 폴리갈락투로나제 (EC 3.2.1.15)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 효소 제제.
4. i) 바실루스 리케니포르미스 ATCC 14580 에 의해 생성되는 폴리펩티드이거나, 또는

   ii) SEQ ID NO: 8 의 위치 28 에서 341 사이에 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드이거나; 또는

   iii) 상기 폴리펩티드와 최소한 45 % 상동하는 상기 i) 또는 ii) 에서 규정된 폴리펩티드의 유사체이거나, 또는

   iv) 위치 233 및 238 에 있는 아르기닌이 보존되고 유도된 폴리펩티드가 상기 폴리펩티드와 최소한 42 % 상동한다면 하나 또는 여러 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의하여 상기 폴리펩티드로부터 유도되거나, 또는

   v) 정제된 형태의 상기 폴리펩티드에 대하여 발생된 다클론성 항체와 면역학적으로 반응하는

   펙테이트 리아제.
5. a) SEQ ID NO: 7 의 뉴클레오티드 82 부터 뉴클레오티드 1026 까지에 도시되어 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있는 폴리뉴클레오티드 분자;

   b) SEQ ID NO: 8 의 아미노산 잔기 28 부터 아미노산 잔기 341 까지의 아미노산 서열에 대해 최소한 70 % 동일한 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자; 및

   c) (a) 또는 (b) 의 축퇴성 뉴클레오티드 서열

   로 이루어지는 군으로부터 선택된, 펙테이트 리아제 활성을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
6. i) 바실루스 리케니포르미스 ATCC 14580 에 의해 생성되는 폴리펩티드이거나, 또는

   ii) SEQ ID NO: 4 의 위치 28 에서 221 사이에 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드이거나; 또는

   iii) 상기 폴리펩티드와 최소한 60 % 상동하는 상기 i) 또는 ii) 에서 규정된 폴리펩티드의 유사체이거나, 또는

   iv) 위치 133 및 155 에 있는 라이신 및 위치 158 에 있는 아르기닌이 보존되고 유도된 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 4 의 위치 60 에서 158 까지와 최소한 66 % 상동한다면 하나 또는 여러 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의하여 상기 폴리펩티드로부터 유도되거나, 또는

   v) 정제된 형태의 상기 폴리펩티드에 대하여 발생된 다클론성 항체와 면역학적으로 반응하는

   펙테이트 리아제.
7. a) SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 82 부터 뉴클레오티드 666 까지에 도시되어 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있는 폴리뉴클레오티드 분자;

   b) SEQ ID NO: 4 의 아미노산 잔기 28 부터 아미노산 잔기 221 까지의 아미노산 서열에 대해 최소한 70 % 동일한 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자; 및

   c) (a) 또는 (b) 의 축퇴성 뉴클레오티드 서열

   로 이루어지는 군으로부터 선택된, 펙테이트 리아제 활성을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
8. i) 바실루스 리케니포르미스 ATCC 14580 에 의해 생성되는 폴리펩티드이거나, 또는

   ii) SEQ ID NO: 2 의 위치 31 에서 494 사이에 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드이거나; 또는

   iii) 상기 폴리펩티드와 최소한 60 % 상동하는 상기 i) 또는 ii) 에서 규정된 폴리펩티드의 유사체이거나, 또는

   iv) SEQ ID NO: 2 와 관련하여 위치 377 및 383 에 있는 아르기닌이 보존되고 유도된 폴리펩티드가 상기 폴리펩티드와 최소한 60 % 상동한다면 하나 또는 여러 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의하여 상기 폴리펩티드로부터 유도되거나, 또는

   v) 정제된 형태의 상기 폴리펩티드에 대하여 발생된 다클론성 항체와 면역학적으로 반응하는

   펙틴 리아제.
9. a) SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 91 부터 뉴클레오티드 1395 까지에 도시되어 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있는 폴리뉴클레오티드 분자;

   b) SEQ ID NO: 2 의 아미노산 잔기 31 부터 아미노산 잔기 494 까지의 아미노산 서열에 대해 최소한 70 % 동일한 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자; 및

   c) (a) 또는 (b) 의 축퇴성 뉴클레오티드 서열

   로 이루어지는 군으로부터 선택된, 펙틴 리아제 활성을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
10. i) 바실루스 리케니포르미스 ATCC 14580 에 의해 생성되는 폴리펩티드이거나, 또는

    ii) SEQ ID NO: 6 의 위치 1 에서 415 사이에 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드이거나; 또는

    iii) 상기 폴리펩티드와 최소한 40 % 상동하는 상기 i) 또는 ii) 에서 규정된 폴리펩티드의 유사체이거나, 또는 하나 또는 여러 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의하여 상기 폴리펩티드로부터 유도되거나, 또는 정제된 형태의 상기 폴리펩티드에 대하여 발생된 다클론성 항체와 면역학적으로 반응하는

    폴리갈락투로나제.
11. a) SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 1 부터 뉴클레오티드 1248 까지에 도시되어 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있는 폴리뉴클레오티드 분자;

    b) SEQ ID NO: 6 의 아미노산 잔기 1 부터 아미노산 잔기 415 까지의 아미노산 서열에 대해 최소한 40 % 동일한 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자; 및

    c) (a) 또는 (b) 의 축퇴성 뉴클레오티드 서열

    로 이루어지는 군으로부터 선택된, 폴리갈락투로나제 활성을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
12. 제 5 항, 제 7 항, 제 9 항 또는 제 11 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 DNA 인 것을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
13. 다음의 작동가능하게 연결되어 있는 엘레먼트들을 포함하고 있는 발현 벡터:

    전사 프로모터; a) 펙테이트 리아제 활성을 가지고 있고 SEQ ID NO: 7 의 뉴클레오티드 1 에서 뉴클레오티드 1026 까지의 뉴클레오티드 서열, 또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 82 에서 뉴클레오티드 666 까지의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자, b) SEQ ID NO: 8 의 아미노산 잔기 28 에서 아미노산 잔기 341 까지의 아미노산 서열에 대해 또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 잔기 1 에서 아미노산 잔기 221 까지의 아미노산 서열에 대해 최소한 70 % 동일한, 펙테이트 리아제 활성을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드, (c) SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 91 에서 뉴클레오티드 1485 까지의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있는, 펙틴 리아제 활성을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자, (d) SEQ ID NO: 2 의 아미노산 잔기 31 부터 아미노산 잔기 494 까지의 아미노산 서열에 최소한 70 % 동일한 펙틴 리아제 활성을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자, (e) SEQ ID NO: 5 의 뉴클레오티드 1 에서 뉴클레오티드 1248 까지의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있는, 폴리갈락투로나제 활성을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자, (f) SEQ ID NO: 6 의 아미노산 잔기 1 부터 아미노산 잔기 415 까지의 아미노산 서열에 대해 최소한 70 % 동일한, 폴리갈락투로나제 활성을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자 및 (g) (a), (b), (c), (d), (e) 또는 (f) 의 축퇴성 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된 DNA 절편; 및 전사 터미네이터.
14. 그 안에 제 12 항에 따르는 발현 벡터가 도입되어 있고, DNA 절편에 의해 코드화된 폴리펩티드를 발현하는 배양된 세포.
15. a) 펙테이트 리아제 활성을 가지고 있고 SEQ ID NO: 8 의 잔기 28 부터 잔기 341 까지의 아미노산 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드 분자;

    b) 펙테이트 리아제 활성을 가지고 있고 SEQ ID NO: 8 의 아미노산 잔기 28 부터 아미노산 잔기 341 까지의 아미노산에 최소한 70 % 동일한 폴리펩티드 분자;

    c) 펙테이트 리아제 활성을 가지고 있고 SEQ ID NO: 4 의 잔기 1 부터 잔기 221 까지의 아미노산 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드 분자;

    d) 펙테이트 리아제 활성을 가지고 있고 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 잔기 1 부터 아미노산 잔기 221 까지의 아미노산에 최소한 70 % 동일한 폴리펩티드 분자;

    e) 펙틴 리아제 활성을 가지고 있고 SEQ ID NO: 2 의 잔기 31 부터 잔기 494 까지의 아미노산 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드 분자;

    f) 펙틴 리아제 활성을 가지고 있고 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 잔기 31 부터 아미노산 잔기 494 까지의 아미노산에 최소한 70 % 동일한 폴리펩티드 분자;

    g) 폴리갈락투로나제 활성을 가지고 있고 SEQ ID NO: 6 의 잔기 1 부터 잔기 415 까지의 아미노산 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드 분자;

    h) 폴리갈락투로나제 활성을 가지고 있고 SEQ ID NO: 6 의 아미노산 잔기 1 부터 아미노산 잔기 415 까지의 아미노산에 최소한 70 % 동일한 폴리펩티드 분자; 및

    i) a), b), c), d), e), f), g) 및 h) 의 종 상동체

    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단리된 폴리펩티드.
16. 제 15 항에 따르는 정제된 폴리펩티드를 포함하고 있는 효소 제제.
17. 제 13 항에 따르는 발현 벡터가 그 안에 도입되어 있는 세포를 배양하고, 그로써 상기 세포가 DNA 절편에 의해 코드화된 폴리펩티드를 발현하고, 그 폴리펩티드를 회수하는 것으로 이루어지는, 펙틴 분해 활성을 가지고 있는 폴리펩티드의 제조 방법.
18. 효소가 (i) 동종성 불순물이 없고, (ii) 제 16 항 또는 17 항에 따르는 방법에 의해 제조되는, 펙틴 분해 활성을 가지고 있는 단리된 효소.
19. 제 1 항 또는 제 16 항에 있어서, 추가로 프로테아제, 셀룰라제 (엔도글루카나제), β-글루카나제, 헤미셀룰라제, 리파제, 과산화효소, 락카제, α-아밀라제, 글루코아밀라제, 큐티나제, 펙티나제, 환원효소, 산화효소, 페놀옥시다제, 리그니나제, 풀룰란나제, 아라비노시다제, 만난나제, 크실로글루카나제, 크실라나제, 펙틴 아세틸 에스테라제, 폴리갈락투로나제, 람노갈락투로나제, 갈락타나제, 펙틴 리아제, 다른 펙틴 리아제, 펙틴 메틸에스테라제, 셀로비오히드롤라제, 트란스글루타미나제, 또는 그것들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 효소 제제.
20. 제 1 항 또는 제 16 항에 따르는 효소 제제 또는 제 4 항, 제 6 항, 제 8 항 또는 제 10 항에 따르는 효소와 계면활성제를 포함하고 있는 세제 조성물.
21. 경질 표면을 제 1 항 또는 제 16 항에 따르는 효소 제제 또는 제 4 항, 제 6 항, 제 8 항 또는 제 10 항에 따르는 효소를 함유하고 있는 클리닝 용액으로 처리하는 것으로 이루어지는, 경질 표면의 클리닝 방법.
22. 기계식 세척 공정의 세척 사이클중에, 직물을 제 1 항 또는 제 16 항에 따르는 효소 제제 또는 제 4 항, 제 6 항, 제 8 항 또는 제 10 항에 따르는 효소를 함유하고 있는 세척 용액으로 처리하는 것으로 이루어지는, 직물의 기계식 처리 방법.
23. 섬유, 실 또는 직물이 효과적인 양의 제 1 항 또는 제 16 항에 따르는 효소 제제 또는 효과적인 양의 제 4 항, 제 6 항, 제 8 항 또는 제 10 항에 따르는 효소로 처리되는 것으로 이루어지는, 셀룰로스성 섬유, 실, 직조된 또는 부직 직물의 성질을 개선시키는 방법.
24. 제 23 항에 있어서, 효소 제제 또는 효소가 연마 처리 단계에서 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
25. 식물 물질이 효과적인 양의 제 1 항 또는 제 16 항에 따르는 효소 제제 또는 효과적인 양의 제 4 항, 제 6 항, 제 8 항 또는 제 10 항에 따르는 효소로 처리되는 것으로 이루어지는, 식물 물질의 분해 또는 변형 방법.
26. 제 25 항에 있어서, 식물 물질이 레팅 공정을 받기 쉬운 재순환된 폐지, 기계식 종이-제조 펄프 또는 섬유인 것을 특징으로 하는 방법.
27. 효과적인 양의 제 1 항 또는 제 16 항에 따르는 효소 제제 또는 효과적인 양의 제 4 항, 제 6 항, 제 8 항 또는 제 10 항에 따르는 효소가 동물 사료 첨가제로서 종래의 동물 사료 성분에 첨가되는 것을 특징으로 하는, 동물 사료의 제조 방법.
28. 효과적인 양의 제 1 항 또는 제 16 항에 따르는 효소 제제 또는 효과적인 양의 제 4 항, 제 6 항, 제 8 항 또는 제 10 항에 따르는 효소로 포도주 또는 쥬스를 처리하는 것으로 이루어지는, 포도주 또는 쥬스의 처리 방법.