CN1212011A

CN1212011A - 一种具有半乳聚糖酶活性的酶

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Publication number: CN1212011A
Application number: CN97192594A
Authority: CN
Inventors: L·V·科弗德; M·S·科宾南; L·N·安德森; I·G·克劳森; A·米勒茨
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1996-03-01
Filing date: 1997-02-28
Publication date: 1999-03-24
Anticipated expiration: 2017-02-28
Also published as: CA2246732A1; AU727785C; AU727785B2; JP2000505303A; EP0885296B1; AU2090997A; US6242237B1; ATE346144T1; CN1274820C; DE69736975T2; US6485954B1; DE69736975D1; WO1997032014A1; DK0885296T3; JP4267696B2; EP0885296A1

Abstract

本发明涉及一种具有半乳聚糖酶活性的酶、编码具有半乳聚糖酶活性的酶的DNA构建体、产生所说酶的方法、含有所说的具有半乳聚糖酶活性的酶的酶组合物以及所说的酶和酶组合物在许多工业上的用途。

Description

一种具有半乳聚糖酶活性的酶

本发明涉及一种具有半乳聚糖酶活性的酶、编码具有半乳聚糖酶活性的DNA构建体、产生所说酶的方法、含有所说的具有半乳聚糖酶活性的酶的酶组合物以及所说的酶和酶组合物的许多工业上的用途。

半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖作为果胶多毛区的成分存在于许多植物中。它们通常与多毛区的鼠李半乳糖醛酸骨架的鼠李糖残基O-4相连。侧链的分布和组成随不同的细胞类型和生理状态变化较大，但是，一般来说，鼠李半乳糖醛酸区大约一半的鼠李糖基单元具有结合的侧链。在大部分植物中，半乳聚糖侧链为1型半乳聚糖，这些半乳聚糖是由带有一些分支点的通过β-1,4连接的吡喃半乳糖组成的，总长度多达60个糖单元(DP60)。阿拉伯呋喃糖残基或短的阿拉伯聚糖寡聚物可以在半乳糖基单元的O-3上与半乳聚糖链连接，因此将其命名为阿拉伯半乳聚糖。半乳聚糖(或阿拉伯半乳聚糖)在初生细胞壁中具有重要作用，它们与细胞壁中的其它结构成分(例如木葡聚糖和阿糖基木聚糖)相互作用。因此，它们的作用是将果胶基质锚定在细胞壁中。而且，它们增加了水合和结合水的能力，并减少了链间经果胶聚合物的缔合，这被认为是调节孔隙率和被动扩散的重要因素(Carpita和Gibeaut,1993，植物杂志3,1-30；O′Neill等，1990，植物生物化学方法，415-441；Selvendran,1983，植物细胞壁化学，食用纤维；Hwang等，食用水状胶质，7,39-53；Fry,1988，正在生长的植物细胞壁：化学和代谢分析)。

β-1,4半乳聚糖酶(E.C.3.2.1.89)能够降解半乳聚糖(和阿拉伯半乳聚糖)，并已经从各种微生物来源中纯化得到了这种酶(Nakano等，1985，农业生物化学，49,3445-3454；Emi和Yamamoto,1972，农业生物化学，36,1945-1954；Araujo和Ward,1990，工业微生物学杂志，6,171-178；VanDe Vis等，1991，碳水化合物聚合物，16,167-187)。

已知存在的真菌半乳聚糖酶的最适pH是低pH范围。因此，Araujo等(工业微生物学杂志(1990)6:171-178)描述了一种最适pH为5.8的真菌半乳聚糖酶(Thielaiaterrestris)；Hirofumi等(Kagaku to Kogyo(科学)(科学和工业)，(1990)Vol.64,no.9,pp.440-445)描述了一种来源于黑曲霉的最适pH大约为4.0的真菌半乳聚糖酶。

尽管已经纯化出了很多β-1,4-半乳聚糖酶，但是克隆并进行DNA测序的只有一种。因此WO 92/13945描述了真菌β-1,4-半乳聚糖酶(棘孢曲霉,Aspergillus aculeatus)的克隆和DNA测序的方法。

本发明的目的是提供具有中性或碱性最适pH范围的新半乳聚糖酶。

本发明是以克隆和鉴定从粪壳目(Sordariales)的真菌菌株获得的两种DNA序列为基础的，这两种DNA序列都编码具有半乳聚糖酶活性且最适pH至少为5.9的真菌酶。

本发明的半乳聚糖酶是第一个已知的纯化的最适pH大于5.8的真菌半乳聚糖酶。这种真菌半乳聚糖酶目前被认为对许多工业(例如动物饲料工业)有很大作用(例如参见本文公开的一个实施例(参见下文))。

因此本发明的第一方面涉及最适pH大于5.9的真菌半乳聚糖酶。

本发明的另一方面确定了从粪壳目中获得的两种半乳聚糖酶的氨基酸序列中的两种氨基酸基元。目前人们认为这些基元是粪壳目的半乳聚糖酶的特征。在上述的两种基元的基础上已经产生了简并的PCR DNA引物，并且认为从粪壳目中可能克隆出和上述的两种半乳聚糖酶具有相似特性的其它半乳聚糖酶。尤其是对许多工业(参见下文)有用的具有高的最适pH分布的半乳聚糖酶。

因此，在本发明的另一方面涉及从粪壳目的真菌菌株获得的DNA构建体，所说的构建体编码具有半乳聚糖酶活性的酶，并且此DNA序列在低严格性条件下和探针杂交，所说的探针是由从Humicola insolens (DSM1800)中分离的DNA和/或从Myceliophthora thermophila(CBS 117.65)中分离的DNA和下面的PCR引物对进行的PCR反应的产物：

＂5′-CTA TTC GGA TCC AG(C/T)GA(C/T)AC(A/C)TGG GC(G/C)GA(C/T)CC(G/T)GC(G/T)C-3′＂[SEQ ID NO 5]作为有义引物，和

＂5′-CTA ATG TCT AGA(A/G)AT CCA(A/G/C/T)GC(A/G/C/T)GG

(C/T)TC CCA(A/G)TA AAA-3′＂[SEQ ID NO 6]作为反义引物。

本发明的另一方面涉及一种DNA构建体，这种DNA构建体含有编码

本发明半乳聚糖酶的DNA序列。

本发明的另一方面提供了重组表达载体，这种重组表达载体能够重组产生本发明的酶。因此可以产生一种单组分的半乳聚糖酶组合物，这种组合物对许多工业是非常有用的。

本发明的另一个方面涉及一种具有半乳聚糖酶活性的分离的酶，所说的酶包含下列的部分氨基酸序列：

a)Ser(S)-Asp(D)-Thr(T)-Trp(W)-Ala(A)-Asp(D)-Pro(p)-Ala(A)-

His(H)和/或Phe(F)-Tyr(Y)-Trp(W)-Glu(E)-Pro(P)-Ala(A)-Trp(W)-Ile(I).

最后，本发明涉及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)菌株DSM No.9983(此菌株含有编码半乳聚糖酶的DNA序列，如SEQ ID NO 1所示)(DNA序列的半乳聚糖酶编码部分克隆到存在于酿酒酵母DSM 9983的质粒pYES 2.0中)的分离的实质上纯的生物培养物，所说的DNA序列来源于丝状真菌Myceliophthora thermophila的菌株或者所说的仍保留编码半乳聚糖酶能力的酿酒酵母菌株的任何突变体；和

最后，本发明涉及酿酒酵母菌株DSM No.9976(此菌株含有编码半乳聚糖酶的DNA序列，如SEQ ID NO 3所示)(DNA序列的半乳聚糖酶编码部分克隆到存在于酿酒酵母DSM 9976的质粒pYES 2.0中)的分离的实质上纯的生物培养物，所说的DNA序列来源于丝状真菌Myceliophthorathermophila的菌株或者所说的仍保留编码半乳聚糖酶能力的酿酒酵母菌株的任何突变体。定义

在进一步详细地讨论本发明之前，首先定义下面的术语。

“DNA构建体”：术语“DNA构建体”指按照遗传工程所用的标准克隆方法克隆的DNA序列，以便将DNA片段从它的天然来源处重新定位在不同的其将复制的位点。所说的克隆方法包括切除和分离所需的DNA片段、将DNA片段插入到载体分子中以及将重组载体引入到DNA片段的多个拷贝或克隆体将被复制的细胞中。

另外，本发明的“DNA构建体”也可以表述为“克隆的DNA序列”或“分离的DNA序列”。

“从…获得”：在本发明中，本文使用的和特殊微生物来源有关的术语“从…获得”是指通过特定来源或通过其中已经插入了特定来源的基因的细胞来产生所说的酶。

“分离的多肽”：本文所定义的用于本发明半乳聚糖酶的术语“分离的多肽”或“分离的半乳聚糖酶”是一种半乳聚糖酶或半乳聚糖酶部分制剂，这种制剂的纯度至少大约为20％，优选的纯度至少大约为40％，更优选的纯度大约为60％，更优选的纯度大约为80％，最优选的纯度大约为90％，甚至最优选的纯度大约为95％(通过SDS-PAGE测定)。

术语“分离的多肽”也可以表述为“纯化的多肽”。

“同源杂质”：本文使用的术语“同源杂质”是指来源于同源细胞(从其中原始获得本发明的酶)的杂质(例如不同于本发明的酶的其它多肽)。在本发明中，例如同源细胞可以是H.insolens的菌株和/或M.thermophilum的菌株。

“半乳聚糖酶编码部分”：用于本文的与DNA序列有关的术语“半乳聚糖酶编码部分”是指与翻译成多肽序列的区域相对应的DNA序列区。在SEQ ID NO 1所示的DNA序列中，所说的部分是在第一个“ATG”起始密码子(mRNA中为“AUG”密码子)和后面的终止密码子(“TAA”、“TAG”或“TGA”)之间的区域。换句话说，它是翻译后的多肽。

除了显示半乳聚糖酶活性的成熟序列之外，翻译的多肽还包括N-末端信号序列。信号序列通常引导多肽的分泌。为获得进一步的信息请参见(Stryer,L.,“生物化学”，W.H.,Freeman和Company/纽约，ISBN 0-7167-1920-7)。

在本文中，术语“半乳聚糖酶编码部分”是指包括翻译后的多肽以及它的成熟部分。

“半乳聚糖酶”：在本发明中的半乳聚糖酶是按照酶学分类(EC)来定义的，其EC号为：3.2.1.89。

正式名称：阿拉伯半乳聚糖内切-1,4-β-半乳糖苷酶。

其它名称：

内切-1,4-β-半乳聚糖酶。

半乳聚糖酶。

阿拉伯半乳聚糖酶。

催化的反应：

在阿拉伯半乳聚糖中的1,4-β-D-半乳糖苷键的内水解。最适pH大于5.9的真菌半乳聚糖酶

本发明首次提供了最适pH大于5.8的真菌半乳聚糖酶。

“最适pH为5.9”是指在2.5-10.0的pH范围内，和其它pH值时的活性相比，本发明的酶在pH 5.9时具有最大活性。30℃时在柠檬酸/磷酸缓冲液中培养15分钟后，以从AZCL-半乳聚糖中释放的蓝色量度酶的活性，为获得详细描述请参见实施例3。因此，在本发明中，“最适pH大于5.9”是指本发明的酶在大于5.9的pH值时具有最大的活性。

最适pH优选地大于5.9，更优选地大于6.0，更优选地大于6.25，更优选地大于6.5，更优选地大于7.0，更优选地大于7.5。以不同方式表述的本发明的半乳聚糖酶的最适pH的优选范围为5.8-10，更优选的为6.0-10，更优选的是6.5-10，更优选的是7.0-10，更优选的是7.5-10。

不受任何原理的限制，目前认为可以从其它的真菌中得到最适pH大于5.9的真菌半乳聚糖酶。因此，可以从丝状真菌和酵母中得到所说的酶。优选地，所说的酶是从粪壳目的真菌中得到的，特别是腐质霉属(Humicola)、毁丝霉属(Myceliophthora)、蛾柱霉属(Scytalidium)、毛壳菌属(Chaetomium)、黑孢壳属(Melanospora)、Cercophora、麻孢壳属(Gelasinospora)、脉孢菌属(Neurospora)、柄孢壳属(Podospora)或梭孢壳属(Thielavia)的真菌。更优选地，本发明的半乳聚糖酶是从Myceliophorathermophila或Humicola insolens的菌株中克隆的。DNA构建体编码最适pH大于5.9的真菌半乳聚糖酶的DNA构建体

本发明还提供了含有编码本发明酶的DNA序列的DNA构建体，所说的本发明的酶具有半乳聚糖酶活性并其最适pH大于5.9。

例如，通过纯化所说的酶、氨基酸测序以及制备基于所说的氨基酸序列的合适的探针或PCR引物，从而可以由能够产生所说酶的有机体中分离DNA序列。

下面描述了其它分离DNA的合适方法。

在一个特定的实施方案中，编码最适pH大于5.9的真菌半乳聚糖酶的本发明的DNA构建体是下文进一步详细描述的特征a)-f)限定的DNA构建体或者按照本发明的第三方面的DNA构建体。通过使用氨基酸序列基元确定的编码半乳聚糖酶的DNA构建体

优选地，按照本发明第三方面的DNA构建体(即以与使用SEQ ID NO5和6所示的PCR引物按上述产生的PCR探针进行杂交为基础的DNA序列)编码具有半乳聚糖酶活性的酶，所说的酶含有下列部分氨基酸序列：

a)Ser(S)-Asp(D)-Thr(T)-Trp(W)-Ala(A)-Asp(D)-Pro(P)-Ala(A)-

His(H)和/或

b)Phe(F)-Tyr(Y)-Trp(W)-Glu(E)-Pro(P)-Ala(A)-Trp(W)-Ile(I).

更优选地，所说的DNA构建体编码具有半乳聚糖酶活性并含有SEQID NO 2或SEQ ID NO 4的氨基酸序列的酶。

目前认为可以从下面“微生物来源”部分详细描述的任何微生物来源得到按照本发明该方面的DNA构建体。优选地，克隆的DNA序列来源于粪壳目的菌株。参考SEQ ID NO 1和3确定的DNA构建体

在本发明的另一方面，本发明涉及含有编码具有半乳聚糖酶活性的酶的DNA序列的DNA构建体，所说的DNA序列含有：

(a)克隆到存在于酿酒酵母DSM 9983中的质粒pYES 2.0中的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分；

(b)在SEQ ID NO 1的1-1050位、更优选55-1050位中所示的DNA序列或者它的互补链；

(c)(a)或(b)中限定的DNA序列的类似物，其和所说的DNA序列至少有70％的同源性；

(d)在低的严格性条件下与SEQ ID NO 1的1-1050位所示的DNA序列杂交的DNA序列；

(e)一种DNA序列，由于遗传密码的简并性，其不能和(b)或(d)序列杂交，但是其编码与由这些DNA序列中任一种编码的多肽具有相同的氨基酸序列的多肽；或

(f)一种DNA序列，其是(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中限定的DNA序列的等位形式或片段。

本发明也涉及含有编码具有半乳聚糖酶活性的酶的DNA序列的DNA构建体，这种DNA序列包含：

(a)克隆到存在于酿酒酵母DSM 9976中的质粒pYES 2.0中的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分；

(b)在SEQ ID NO 3的1-1047位、更优选的为58-1047位中所示的DNA序列或者它的互补链；

(d)在低的严格性条件下与SEQ ID NO 3的1-1047位所示的DNA序列杂交的DNA序列；

(e)一种DNA序列，由于遗传密码的简并性，其不能和(b)或(d)序列杂交，但是其编码与由这些DNA序列中任一项编码的多肽具有相同的氨基酸序列的多肽；或

一种DNA序列，其是(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中限定的DNA序列的等位形式或片段。

目前认为克隆到存在于DSM 9983中的质粒pYES 2.0中的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分和SEQ ID NO 1中所示的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分具有同一性。

因此，可以相互代替使用术语“克隆到存在于DSM 9983中的质粒pYES 2.0中的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分”和“SEQ ID NO 1所示的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分”。

目前认为克隆到存在于DSM 9976中的质粒pYES 2.0中的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分和SEQ ID NO 3中所示的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分具有同一性。

因此，可以相互代替使用术语“克隆到DSM 9976的质粒pYES 2.0中的编码半乳聚糖酶的部分序列”和“SEQ ID NO 3的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分”。

所说的DNA序列可以是染色体组、cDNA或者合成来源的或它们的任意组合。

本发明也包括编码具有半乳聚糖酶活性的酶的克隆DNA序列，所说的酶具有如SEQ ID NO 2的成熟部分(即19-350位)所示的氨基酸序列，由于遗传密码的简并性，这种DNA序列和SEQ ID NO 1不同。

本发明也包括编码具有半乳聚糖酶活性的酶的克隆DNA序列，所说的酶具有如SEQ ID NO 4的成熟部分(即19-349位)所示的氨基酸序列，由于遗传密码的简并性，这种DNA序列和SEQ ID NO 3不同。

可以从微生物(例如细菌、酵母或丝状真菌)中得到SEQ ID NO 1、3所示的DNA序列和/或本发明的类似DNA序列。优选地从丝状真菌中得到，在“微生物来源”部分(参见下文)给出了合适的例子。

另外，可以在SEQ ID NO 1或3的半乳聚糖酶编码部分所示的DNA序列(即它们的亚序列)的基础上，和/或通过引入核苷酸取代来构建类似序列(所说的核苷酸取代不会产生由所说的DNA序列编码的半乳聚糖酶的另外氨基酸序列，但是所说的取代与用于产生酶的宿主生物体所用的密码子使用相对应)，或者通过引入可以产生不同的氨基酸序列的核苷酸取代也可以构建类似序列。

当进行核苷酸取代时，氨基酸的改变优选的是不重要的属性(也就是不能显著地影响蛋白质折叠或活性的保守氨基酸的取代，1-大约30个氨基酸的小的缺失)；氨基酸的改变也可以是氨基或羧基末端小的延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基、多达大约20-25个残基的小接头肽、便于纯化的小的延伸(例如多组氨基酸序列、抗原表位或结合区域)。

保守取代的例子在下列氨基酸组范围内：碱性氨基酸(例如精氨酸，赖氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰氨和天冬酰胺)、疏水氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)、芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸)。如果想得到核苷酸取代的一般信息，参见Ford等(1991)的“蛋白质的表述和纯化2，95-107”。

对本领域的技术人员来说，可以在分子功能关键区之外产生这样的取代并且仍产生活性多肽是显而易见的。可以按照本领域熟知的方法来确定对本发明的DNA构建体编码的多肽的活性有重要作用的氨基酸(优选的是不取代它们)，例如这些方法包括定点诱变或丙氨酸扫描诱变(例如参见Cunningham和Well，(1989)，科学244,1081-1085)。在后一技术中，在分子的每一个残基中引入了突变，并检验了所得的突变分子的生物(即半乳聚糖酶)活性以确定与分子活性密切相关的氨基酸残基。通过分析由核磁共振分析方法、晶体学或者光亲和性标记等技术确定的晶体结构也可以确定底物-酶相互作用位点(例如参见de Vos等，(1992)，科学255,306-312；Smith等，(1992)，分子生物学杂志224,899-904；Wlodaver等，(1992)，FEBS通讯309,59-64)。

测定了在上面(c)中所说的DNA序列的同源性，其作为两个序列间的同一性程度，结果表明第一个序列是由第二个序列衍生的。可以通过本领域熟知的计算机程序(例如GCG程序包提供的GAP，威斯康星程序包程序手册，第8版，1994年8月，遗传学计算机组，575科学Drive,Maison，威斯康星，美国，53711)测定同源性(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)，分子生物系杂志，48,443-453)。使用具有下列设置的GAP进行DNA序列比较：5.0 GAP产生罚分，0.3 GAP延长罚分，上述的类似DNA序列的编码区与SEQ ID NO 1所示的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分相比，优选地显示出至少70％，更优选地至少有80％，更优选地至少有90％，更优选地至少有95％，更优选地至少有97％的同一性。

下面详细地描述了上面所说的用于限定类似DNA序列(此类似DNA序列在上文(d)中限定)的杂交条件，所说的类似DNA序列与SEQ ID NO 1所示的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分(即核苷酸1-1050)和/或SEQID NO 3所示的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分(即核苷酸1-1047)在至少低严格条件下，但优选的是在中等或高的严格条件下能够杂交。

同样地，在本发明的第三部分，作为PCR反应产物的探针至少在低的严格条件下(但优选的是在中等或高的严格条件下)和从粪壳目中得到的编码半乳聚糖酶的DNA序列杂交，在后面详细描述了此杂交条件。

确定核苷酸探针和同源DNA或RNA序列间在低、中等或高的严格性条件下杂交的合适的实验条件包括：将含有待杂交DNA片段或RNA的滤膜预浸在5×SSC(氯化钠/柠檬酸钠，Sambrook等，1989)中10分钟；将滤膜在5×SSC、5×Denhardt’s溶液(Sambrook等，1989)、0.5％SDS和100μg/ml变性的声波处理的鲑精DNA(Sambrook等，1989)的溶液中预杂交；接下来在大约45℃下在含有浓度为10ng/ml的随机引发的(Feinberg,A.P.和Vogelstein,B.(1983)分析生物化学132:6-13)、³²P-dCTP标记的(比活＞1×10⁹cpm/μg)探针的同一溶液中杂交12小时。然后，在至少55℃(低严格性)、更优选的在至少60℃(中等严格性)、更优选的在至少65℃(中/高严格性)、甚至更优选的在至少70℃(高严格性)和甚至更优选的在至少75℃(非常高的严格性)下，在2×SSC、0.5％SDS中将滤膜洗涤两次，每次30分钟。

使用X光片检测在这些条件下和寡核苷酸探针杂交的分子。

使用Sambrook等(1989)描述的标准的方法(分子克隆：实验手册，冷泉港实验室；冷泉港，NY)可以从菌株酿酒酵母DSM No.9983和/或酿酒酵母DSM No.9976中分离编码本发明的半乳聚糖酶的DNA序列。

编码本发明的具有半乳聚糖酶活性的酶的DNA序列，可以通过任何常规的方法分离。这些方法包括：

-在合适的载体上，从任何期望能够产生感兴趣的半乳聚糖酶的有机体中克隆cDNA文库；

-用所说载体转化合适的酵母宿主细胞；

-在合适的条件下培养酵母细胞，以便表达cDNA文库中的克隆所编码的感兴趣的酶；

-通过测定由所说的克隆产生的酶的任何半乳聚糖酶活性来筛选阳性克隆；和

-从所说的克隆中分离编码酶的DNA。

在WO 93/11249或WO 94/14953中公开了普通的分离方法，其内容本文一并参考。本文以工作实施例给出了筛选方法的更详细的描述(参见下文)。

另外，按照公知的方法使用合成的寡核苷酸探针(在本文公开的DNA序列的基础上制备的)可以从合适的来源(例如下面提到的任何有机体)中分离编码本发明的半乳聚糖酶的DNA。例如，可以在SEQ ID NO 1和/或SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列的半乳聚糖酶编码部分，或者它们的任何合适的亚序列的基础上，或者在SEQ ID NO 2和/或SEQ ID NO 4的氨基酸序列的基础上制备合适的寡核苷酸探针。

另外，使用以本文公开的DNA序列为基础(特别是在本发明第三部分公开的简并PCR引物的基础上)制备的PCR引物可以克隆出所说的DNA序列。微生物来源

目前认为也可以从其它的微生物中获得本发明的克隆的DNA序列。例如，同样地筛选其它微生物的cDNA文库可以得到所说的DNA序列，所说的其它微生物特别是真菌，例如曲霉属的种的菌株(特别是棘孢曲霉、黑曲霉的菌株)；木霉属(Trichoderma)的种的菌株(特别是T.reesei、绿色木霉(T.viride)、T.longibrachiatum、T.harzianum或康宁木霉(T.koningii)的菌株)；或者镰孢属(Fusarium)的种的菌株(特别是尖镰孢，F.oxysporum的菌株)；或者腐质霉属的种的菌株；或者Neocallimastix的种的菌株；Piromyces的种的菌株；青霉属的种的菌株；短梗霉属(Aureobasidium)的种的菌株；嗜热子囊菌属(Thermoascus)的种的菌株；拟青霉属(Paecilomyces)的种的菌株；Talaromyces的种的菌株；Magnaporthe的种的菌株；裂褶菌属(Schizophyllum)的种的菌株；Filibasidium的种的菌株；隐球酵母属(Cryptococcus)的种的菌株。

在一个优选的实施方案中，从粪壳目科的菌株(例如腐质霉属、毁丝霉属、梭孢壳属，特别是H.insolens或M.thermophilum的菌株)得到编码本发明的半乳聚糖酶的克隆DNA序列。

已经将含有编码本发明的半乳聚糖酶的全长DNA序列(SEQ ID NO 1所示)的表达质粒pYES 2.0转化到酿酒酵母的菌株中，此菌株由发明人按照国际公认的用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约在DeutsheSammlung von Mikroorganismen und Zllkulturen GmbH.,MasheroderWeg Ib,D-38124 Raunschweig，联邦德国(DSM)保藏。

保藏日期：11.05.95

保藏者编号：NN049019

DSM名称：酿酒酵母DSM No.9983。

已经将含有编码本发明的半乳聚糖酶的全长cDNA序列(SEQ ID NO 3所示)的表达质粒pYES 2.0转化到酿酒酵母的菌株中，此菌株由发明人按照国际公认的用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约在DeutsheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.,MasheroderWeg Ib,D-38124 Raunschweig，联邦德国(DSM)保藏。

保藏日期：11.05.95

保藏者编号：NN049018

DSM名称：酿酒酵母DSM No.9976。表达载体

在另一方面，本发明提供了含有本发明DNA构建体的重组表达载体。

本发明的表达载体可以是任何可以很方便地以重组DNA方法操作的表达载体，载体的选择经常是根据此载体引入的宿主细胞而定。因此，载体可以是自主复制载体，也就是说以染色体外的实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒。另外，所说的载体也可以是这样一种载体，当将其引入到宿主细胞中时，它能整合到宿主细胞的基因组上，并且能与其整合的染色体一起复制。

在表述载体中，将编码半乳聚糖酶的DNA序列可操作地与合适的启动子及终止子序列连接。所说的启动子可以是任何在选择的宿主细胞中显示出转录活性的DNA序列，其可以来源于编码与宿主细胞同源或者异源的蛋白质的基因。用于分别连接编码半乳聚糖酶的DNA序列、启动子和终止子以及将它们插入到合适的载体的方法是本领域技术人员公知的(例如参见Sambrook等，(1989)，分子克隆，实验室手册，冷泉港，纽约)。

用于丝状真菌宿主细胞的合适的启动子的例子，例如，ADH3启动子(McKnight等，EMBO J.4(1985),2093-2099)或者tpiA启动子。其它有用的启动子的例子来源于编码米曲酶(Asperigillus oryzae)TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉的酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉或者泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(gluA)、Rhizomucor miehei脂肪酶、米曲酶碱性蛋白酶、米曲酶丙糖磷酸异构酶或者构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶的基因的那些启动子。宿主细胞

在另一个方面，本发明提供了含有本发明DNA构建体和/或本发明重组表达载体的宿主细胞。

对宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码多肽的基因和它的来源。所说的宿主细胞可以是单细胞微生物(例如原核生物)或者非单细胞微生物(例如真核生物)。

优选地，本发明的宿主细胞是真核细胞，特别是真菌细胞(如酵母或者丝状真菌细胞)。具体地说，这些细胞可以属于木霉属的种(优选的是Trichoderma harzianum或者Trichoderma reesei)、或者曲霉属的种(最优选的是米曲酶或者黑曲霉)、或者镰孢属的种(最优选的是镰孢属的种，其具有镰孢属ATCC 20334的鉴定特征，PCT/US/95/07743对其进行了进一步的描述)。

可以通过已经熟知的方法转化真菌细胞，这种方法包括原生质体的形成和原生质体的转化，之后是细胞壁的再生。EP 238 023(Novo NordiskA/S)中描述了曲霉属作为宿主微生物的用途，其全部内容本文一并参考。所说的宿主细胞也可以是酵母细胞，例如酵母属(Saccharomyces)的菌株，特别是酿酒酵母、克鲁弗酵母(S.kluyveri)、或者葡萄汁酵母(S.uvarum)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的种(如粟酒裂殖酵母，S.pombe)的菌株、汉逊酵母属(Hansenula)的种、毕赤酵母属(Pichia)的种、Yarrowia的种(如Yarrowia lipolytica)或者克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的种(乳酸克鲁维酵母，K.lactis)的菌株。产生半乳聚糖酶的方法

本发明提供了产生按照本发明的分离的酶的方法，其中将用编码此酶的DNA序列转化的合适的宿主细胞在允许产生此酶的条件下培养，并从培养物中回收所得的酶。

当将包含编码此酶的DNA序列的表达载体转化到异源宿主细胞时，异源重组产生本发明酶的是可能的。

因此产生高度纯化的半乳聚糖酶组分是可能的，其特征在于不含同源杂质。

在本发明中，同源的宿主细胞例如可以是H.insolens或者M.thermophilum的菌株。

用于培养转化的宿主细胞的培养基可以是任何适合于所讨论的宿主细胞生长的常规培养基。所表达的半乳聚糖酶可以方便地分泌到培养基中，并且可以通过公知的方法从培养基中回收，所说的公知的方法包括从培养基中通过离心或者过滤分离细胞，通过盐法(如硫酸铵)沉淀培养基的蛋白质组分，其后进行层析(如离子交换层析、亲和层析等等)。本发明的酶

另一方面，本发明涉及具有半乳聚糖酶活性的分离的酶，其特征在于(ⅰ)不含同源杂质和(ⅱ)所说的酶是使用异源宿主细胞如上所述产生的。

在另一方面，本发明涉及具有半乳聚糖酶活性的分离的酶，这种酶包含下列部分氨基酸序列a)Ser(S)-Asp(D)-Thr(T)-Trp(W)-Ala(A)-Asp(D)-Pro(P)-Ala(A)-

His(H)和/或b)Phe(F)-Tyr(Y)-Trp(W)-Glu(E)-Pro(P)-Ala(A)-Trp(W)-Ils(I).

优选地，按照这一实施方案的酶具有下文立即描述的酶的a)-d)性质。

在另一方面，本发明涉及具有半乳聚糖酶活性的分离的酶，所说的酶选自：

(a)由DNA序列的半乳聚糖酶编码部分编码的多肽，所说的DNA序列已经克隆到存在于酿酒酵母DSM 9983中的质粒pYES 2.0中；

(b)包含如SEQ ID NO:2的19-350位所示的氨基酸序列的多肽；

(c)(a)或者(b)所限定的多肽的类似物，其与所说的多肽至少具有70％的同源性；和

(d)(a)、(b)或者(c)的等位形式或片段。

在另一方面，本发明涉及具有半乳聚糖酶活性的分离的酶，所说的酶选自下组：

(a)由DNA序列的半乳聚糖酶编码部分编码的多肽，所说的DNA序列已经克隆到存在于酿酒酵母DSM 9976中的质粒pYES 2.0中；

(b)包含如SEQ ID NO:4的19-349位所示的氨基酸序列的多肽；

(a)、(b)或者(c)的等位形式或片段。

本发明多肽的同源性(指本发明多肽的上述性质(c))是指两个序列的相同程度，它表明第一条序列来源于第二条序列。可以通过本领域公知的计算机程序方法确定同源性，如GCG程序包中提供的GAP(威斯康星程序包程序手册，第8版，1994年8月，遗传学计算机组，575科学Drive,Madison，威斯康星，美国，53711)(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)，分子生物学杂志，48,443-453)。使用具有下列用于多肽序列比较的配置的GAP:3.0 GAP产生罚分和0.1 GAP延伸罚分，由本发明的类似DNA序列编码的多肽的成熟部分与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的成熟部分(即SEQ ID NO:2的19-350位)和/或与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的成熟部分(即SEQ ID NO:4的19-349位)相比，优选地显示出至少70％的等同性、更优选地显示出至少80％的等同性、更优选地显示出至少90％的等同性、更优选地显示出至少95％的等同性、尤其是至少97％的等同性。

本发明也涉及半乳聚糖酶的变体，所说的变体具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:2和/或者SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的成熟部分之间的差异不超过三个氨基酸，优选地不超过两个氨基酸，更优选地不超过一个氨基酸。

本发明的酶可以来源于“微生物来源”部分中所描述的任何来源。酶组合物

在另一方面，本发明涉及对降解植物细胞壁组分有用的酶组合物，所说的组合物富含上文所述的具有半乳聚糖酶活性的酶。以这一方式，使所说的酶组合物降解细胞壁的能力得到加强。

富含本发明酶的酶组合物可以是，例如，含有多种酶促活性的酶组合物，特别是含有多种降解植物细胞壁酶(Biofeed+、Biofeed Wheat、Energex、Viscozym、Pectinex、Pectinex Ultra SP、PhytaseNovo、Celluclast或Celluzyme，所有这些酶都可从Novo Nordisk A/S买到)的酶组合物。

在本文中，术语“富含”旨在于表明酶组合物的半乳聚糖酶活性增加了，例如1.1的富含因子，可以通过加入用上述方法制备的本发明的酶而很方便地得到。

除了本发明的半乳聚糖酶外，本发明的酶组合物可以含有一种或多种其它酶，例如那些具有木聚糖分解或者果胶分解活性的酶，如α-阿拉伯糖苷酶、α-葡萄糖苷酸酶(α-glucuronisidase)、β-木糖苷酶、木聚糖乙酰酯酶、阿拉伯聚糖酶(arabinanase)、鼠李半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonase)、果胶乙酰酯酶、植酸酶、半乳聚糖酶、聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)、果胶裂解酶、果胶酸裂解酶、葡聚糖酶、果胶甲基酯酶、漆酶、或者氧化还原酶。其它的酶可以经属于曲霉属(优选的是黑曲霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉或米曲酶)、木霉属或者Humicolainsolens的微生物来产生。

另外，富含具有半乳聚糖酶活性的酶的酶组合物可以以本发明的酶作为主要的酶促组分，例如单组分的酶组合物。

可以按照本领域公知的方法制备所说的酶组合物，并且这种酶组合物可以以液体或者干燥组合物的形式存在。例如，酶组合物可以以粒状或者微粒状存在。可以将包含在此组合物中的酶按照本领域公知的方法稳定。

下文给出了优选使用的本发明的酶组合物的例子。基于本领域公知的方法确定本发明酶组合物的剂量和使用此组合物的其它条件。

按照本发明的酶组合物至少可以用于下列目的之一。植物材料的降解或者改良

由于本发明的半乳聚糖酶降解植物细胞壁的能力高，按照本发明的酶组合物优选用作降解或改良植物细胞壁或者任何起源于植物细胞壁的含有半乳聚糖物质的试剂。

本发明的半乳聚糖酶能够水解半乳聚糖的β-1,4键。半乳聚糖是具有由β-1,4键连接的半乳糖组成的骨架的多糖。此骨架可以具有侧链，如阿拉伯糖。侧链的组成和数目取决于半乳聚糖的来源。(Stephen,A.M.,1983，多糖，第3章，Vol 2,Ed.Aspinall,G.O.)。

全部或部分地除去侧链有利于半乳聚糖酶对半乳聚糖的降解。可以通过温和的酸处理或者α-阿拉伯糖苷酶处理除去阿拉伯糖侧链基团。由半乳聚糖酶或者上文提到的组合在一起的半乳聚糖酶与侧链水解酶释放的寡聚体可以由β-半乳糖苷酶进一步降解成游离的半乳糖。

可以在没有其它果胶或者半纤维素分解酶存在的情况下，或者在存在其它果胶或者半纤维素分解酶的限定活性的情况下，使用本发明的半乳聚糖酶降解半乳聚糖以便产生寡糖。这些寡糖可以用作填充剂，如大豆细胞壁物质释放的寡糖阿拉伯半乳聚糖或者植物材料的或多或少纯化的阿拉伯半乳聚糖。

本发明的半乳聚糖酶可以与其它果胶或者半纤维素分解酶结合使用，以便将半乳聚糖降解成半乳糖及其它的单糖。

可以单独使用本发明的半乳聚糖酶，也可以将其与其它酶(如葡聚糖酶、果胶酶和/或者半纤维素)一起使用，以便改进富含油的植物材料中油的提取，象大豆的豆油、橄榄的橄榄油或油菜籽的油菜籽油、向日葵的向日葵油。

本发明的半乳聚糖酶可以用于分离植物细胞物质的组分。特别令人感兴趣的是把富含糖或者淀粉的植物材料分离成具有可观的商业价值的组分(如从甜菜中分离蔗糖，从马铃薯中分离淀粉)与价值较低的组分(如糟泊或壳组分)。另外，特别令人感兴趣的是将富含蛋白质或富含油的作物分成有价值的蛋白质及油和无价值的外皮组分，可以使用本领域公知的方法完成分离过程。

本发明的半乳聚糖酶也可以用于制备水果或者蔬菜汁以便增加产量，也可以用于各种来源于植物细胞壁的物质或者废物的酶促水解，如来源于酒或者果汁生产、农业残留物(如蔬菜壳、大豆壳、甜菜果肉、橄榄果肉、土豆果肉等)。

可以降解植物材料，以便改进各种不同的加工过程、有利于其它非半乳聚糖的组分的纯化或者提取(象从柑橘类植物中纯化果胶)、提高饲料的价值，降低水结合能力、改进废水厂的降解能力、促进植物材料转变成青贮饲料，等等。

借助于本发明的酶制剂，调节所处理的水果或者蔬菜的稠度和外观是可能的。已经证明稠度和外观是用于加工的酶实际组合的产物，即本发明的半乳聚糖酶与其它酶结合的特异性。例子包括例如由苹果、梨或者草莓产生澄清的果汁；例如从苹果、梨、草莓、柑橘类植物或者番茄产生稳定的悬液果汁；和例如从胡萝卜和番茄产生纯品(puree)。

本发明的半乳聚糖酶可以用于改进由植物细胞壁衍生的材料的粘度。例如，半乳聚糖酶可以用来降低含有半乳聚糖的饲料的粘度，并且改进包含半乳聚糖的胶粘材料的加工。在适合于全部或部分降解含有半乳聚糖的材料的条件下，使用本发明的酶制剂处理含有半乳聚糖的植物材料可以降低粘度。

例如，所说的半乳聚糖酶可以与其它的酶结合使用以便从植物纤维中除去果胶物质。例如，在产生织物纤维或者其它纤维材料时，除去果胶物质是十分重要的。为此，在适合于全部或部分降解与植物纤维材料结合的果胶物质的条件下，使用适量的本发明的半乳聚糖酶处理植物纤维材料。动物饲料添加剂

本发明的半乳聚糖酶可以用于改进动物饲料，并且可以在体外(通过改变饲料的组分)或者体内发挥作用。这种半乳糖聚酶特别适合于加入到阿拉伯半乳聚糖或者半乳聚糖含量很高的动物饲料组合物中，如含有来源于大豆、油菜籽和羽扇豆的植物材料的饲料。当将半乳聚糖酶加入到饲料中可以明显地改进植物细胞壁材料的体内降解，因此可以使动物更好地利用植物营养物。因此，改进了动物的生长速率和/或饲料的转化率(即摄取的饲料的重量与增加的体重的比)。例如，不能消化的半乳聚糖经半乳聚糖酶(例如与β-半乳糖苷酶组合使用)降解成动物可以消化的半乳糖或者半乳糖低聚物，因此可以提高这些饲料可利用的能量。另外，通过半乳聚糖的降解，半乳聚糖酶可以提高非碳水化合物饲料组分(如蛋白质、脂肪和矿物质)的可消化性和吸收性。

进一步的描述参照PCT/DK 96/00443和本文的工作实施例(参见下文)。酒和果汁的加工

本发明的酶制剂在生产蔬菜汁或者果汁(特别是苹果汁或者梨汁)时可以用于果胶的降解和粘度的降低。使用本发明的酶制剂以能够降解包含在果汁或蔬菜汁中的含有果胶的物质的有效量处理果汁或蔬菜汁可以达到此目的。

所说的酶制剂可以用于处理水果和蔬菜的浆状物，以便改进浆状物的可提取性或降解性。例如，所说的酶制剂在果汁的生产过程中可以用于处理苹果和梨的浆状物，及在酒的生产过程可以处理葡萄的浆状物。单组分半乳聚糖酶的优点

从上文的描述可知，很明显可以以单组分酶制剂的形式生产本发明的半乳聚糖酶，其本质上不含其它酶活性(如通常在市售的含有半乳聚糖酶的果胶分解、半纤维素分解或者纤维素分解酶制剂中发现的果胶甲基酯酶和其它果胶分解酶)。

为此，本发明的半乳聚糖酶的用途在不需要所说的其它酶的活性时是特别有利的。使用它的例子包括稳定悬液果汁的生产和纯品果汁的生产。在这些生产中，例如果胶甲基酯酶(在常规的果胶分解酶制剂中通常发挥的是辅助活性)的存在，可以降低稳定悬液果汁的稳定性，或者使纯品果汁脱水收缩。

此外，由于本发明的半乳聚糖酶的实际纯度，其可以用来改良果胶，这样只有含有半乳聚糖的果胶部分降解。如果存在常规的果胶分解活性，将增加果胶的降解程度，结果将降低果胶的粘结(viscosifying)或者胶凝能力。

最后，可以使用实质上纯化的半乳聚糖酶有选择地从用于饲料的植物材料中释放半乳糖和半乳糖低聚物。动物可以很容易地消化半乳糖。具有半乳聚糖酶活性的常规果胶分解或者半纤维素分解酶制剂除了半乳聚糖酶外，还含有胞内酶和胞外酶的混合物，这些酶在饲料中产生不受欢迎的木糖和半乳糖醛酸。

通过下列实施例进一步详细描述本发明，这种实施例无意于以任何方式限制权利要求所限定的本发明的范围。材料和方法保藏的有机体：

含有所说质粒的酿酒酵母DSM 9983，该质粒含有穿梭载体pYES 2.0的全长DNA序列，此序列编码本发明的半乳聚糖酶(如SEQ ID NO:1所示)。

含有所说质粒的酿酒酵母DSM 9976，该质粒含有穿梭载体pYES 2.0的全长cDNA序列，此序列编码本发明的半乳聚糖酶(如SEQ ID NO:3所示)。其它菌株：

Myceliophthora thermophila CBS No.117.65包含本发明的编码半乳聚糖酶的DNA序列(如SEQ ID NO:1所示)。

Humicola insolens DSM No.1800包含本发明的编码半乳聚糖酶的DNA序列(如SEQ ID NO:3所示)。

酵母菌株：所用的酿酒酵母菌株是W3124(MATa；ura 3-52；leu 2-3,112；his 3-D200；pep 4-1137；prc1::HIS3；prb1::LEU2；cir+)。

大肠杆菌(E.Coli)菌株：DH5α(Life Technologies A/S)质拉：

曲霉属表达载体pHD414是质粒p775的衍生物(如EP 238 023所述)。WO 93/11249进一步描述了pHD414的构建。pYES 2.0(Invitrogen)一般的分子生物学方法：

除非另有说明，使用分子生物学的标准方法(Sambrook等(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；Ausubel,F.M．等(编辑)的“当代分子生物学方法”，John Wiley和Sons,1995；Harwood,C.R.，和Cutting,S.M．(编辑)“杆菌属的分子生物学方法”，John Wiley和Sons,1990)进行DNA操作和转化。

按照厂商的说明使用用于DNA操作的酶。用于DNA操作的酶：

除非另有说明，所有用于DNA操作的酶(例如限制性核酸内切酶、连接酶等等)都从新英格兰生物实验室公司购买。用于mRNA分离的Humicola insolens DSM 1800的发酵方法：

将Humicola insolens DSM 1800从菌丝体生长的平板接种到含有100ml培养基PD液体肉汤(24g土豆葡萄糖肉汤、Difco 0549、加去离子水至1000ml；高压灭菌(121℃,15-20分钟))的摇瓶中，所说的培养基含有玉米渣。

将培养物在26℃下发酵5天。所得的培养物肉汤经纱布过滤，将菌丝体在液氮中冷冻。

如H.Dalboege等(分子基因遗传学(1984)243:253-260；WO93/11249；WO 94/14953)的描述从此培养物的菌丝体中分离mRNA。用于mRNA分离的Myceliophtora thermophila CBS No.117.65的发酵方法：

将Myceliophtora thermophila CBS No.117.65由生长有菌丝体的平板中接种到含有100ml培养基(所说的培养基含有纤维素)PD液体肉汤(24g土豆葡萄糖肉汤，Difco 0549，加去离子水至1000ml；高压灭菌(121℃,15-20分钟))的摇瓶中。

将培养物在26℃下发酵5天。将所得的培养物肉汤经纱布过滤，将菌丝体在液氮中冷冻。

如H.Dalboege等(分子基因遗传学(1994)243:253-260)及WO93/11249；WO 94/14953)的描述从此培养物的菌丝体中分离mRNA。

使用硫氰酸胍，然后经5.7M CsCl垫层超速离心来提取总RNA，同时使用WO 94/14953中描述的方法通过寡(dT)-纤维素亲和层析分离聚(A)⁺RNA。cDNA合成：通过RNase H方法(Gubler和Hoffman(1983)基因25:263-269,Sambrook等(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)由5mg聚(A)+RNA合成双链cDNA。将聚(A)⁺RNA(5mg，在5ml DEPC处理过的水中)在70℃下于预先硅烷化的无RNase的Eppendorph管中加热8分钟，在冰上冷却，用含有1mM dATP、dGTP和dTTP和0.5mM 5-甲基-dCTP(Pharmacia)、40个单位的人胎盘核糖核酸酶抑制物(RNasin,Promega)、1.45mg寡(dT)18-NotⅠ引物(Pharmacia)和1000个单位的SuperScriptⅡ RNase H反转录酶(Bethesda研究实验室)的反转录酶缓冲液(50mM Tris-Cl(pH 8.3)、75mM KCl、3mM MgCl₂、10mM DTT,Bethesda研究实验室)加至最终体积为50ml。通过将反应混合物在45℃温育1小时来合成首链cDNA。合成后，按照厂商的说明将mRNA:cDNA杂交混合物经MicroSpin S-400 HR(Pharmacia)旋转柱进行凝胶过滤。

在凝胶过滤后，将杂交体在含有200mM各种dNTP、60个单位大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ(Pharmacia)、5.25单位RNase H(Promega)和15个单位大肠杆菌DNA连接酶(Boehringer Mannheim)的250ml第二条链缓冲液(20mM Tris-Cl,pH7.4、90mM KCl、4.6mM MgCl₂、10mM(NH₄)₂SO₄、0.16mM bNAD+)中稀释。通过将反应管在16℃温育2小时，然后在25℃温育15分钟来合成第二条链cDNA。加入EDTA，使之终浓度为20mM以便终止反应，之后进行酚和氯仿抽提。

绿豆核核酸酶处理：通过加入2倍体积的96％EtOH、0.2倍体积的10M的NH₄Ac在-20℃将双链cDNA沉淀12小时，经离心回收，在70％EtOH中洗涤，干燥并重悬浮在30ml含有25个单位绿豆核酸酶(Pharmacia)的绿豆核酸酶缓冲液(30mM NaAc,pH4.6、300mMNaCl、1mM ZnSO₄、0.35mM DTT、2％甘油)中。通过将反应物在30℃温育30分钟，之后加入70ml 10mM Tris-Cl(pH7.5)、1mMEDTA，酚抽提，使用2倍体积的96％EtOH和0.1倍体积的3MNaAc(pH5.2)在冰上沉淀30分钟来剪辑(clip)单链发夹DNA。

使用T4 DNA聚合酶补平：通过离心回收双链cDNAs，在含有0.5mM各种dNTP和5个单位的T4 DNA聚合酶(新英格兰的生物实验室)的30ml T4 DNA聚合酶缓冲液(20mM Tris-醋酸盐(pH7.9)、10mM MgAc、50mM KAc、1mM DTT)中，于16℃下将反应混合物温育1小时来补平末端。加入EDTA，使之终浓度为20mM以便终止反应，之后进行酚和氯仿抽提，通过加入2倍体积的96％EtOH和0.1倍体积的3MNaAc(pH5.2)在-20℃下沉淀12小时。衔接头连接，NotⅠ消化和大小选择：

在补平反应后，通过离心回收所说的cDNAs，在70％EtOH中洗涤，并且干燥。将cDNA沉淀重悬浮在含有2.5mg非回文BstⅪ衔接头(Invitrogen)和30个单位T4连接酶(Promega)的25ml连接缓冲液(30mM Tris-Cl(pH7.8)、10mM MgCl₂、10mM DTT、0.5mM ATP)中，并在16℃下温育12小时。在65℃下加热20分钟，然后在冰上冷却5分钟来终止反应。加入20ml水、5ml 10x NotⅠ限制酶缓冲液(新英格兰生物实验室)和50个单位NotⅠ(新英格兰生物实验室)，之后在37℃下温育2.5小时来用NotⅠ限制酶消化连接(adapted)的cDNA。在65℃下加热10分钟终止此反应。在0.8％SeaPlaque GTG低熔点琼脂糖凝胶(FMC)上于1×TBE中通过凝胶电泳对cDNAs按大小进行分级分离，以便将未连接的衔接头与小的cDNA分开。使用0.7 kb的截断值按大小对所说的cDNA进行选择，使用b-琼脂糖酶(新英格兰生物实验室)按照厂商的说明从凝胶中拯救所说的cDNA，通过加入2倍体积的96％EtOH和0.1倍体积的3M NaAc(pH5.2)将cDNA在-20℃下沉淀12小时。

文库的构建：通过离心回收定向的，按大小选择的cDNA，在70％的EtOH中洗涤，干燥，重悬浮在30ml 10mM Tris-Cl(pH7.5)、1mMEDTA中。按照厂商的说明通过经MicroSpin S-300 HR(Pharmacia)旋转柱的凝胶过滤使所说的cDNAs脱盐。在10ml含有5ml双链cDNA(反应管1和2)、15个单位T4连接酶(Promega)和30ng(管1)、40ng(管2)和40ng(管3，载体背景对照)BstⅪ-NotⅠ切割的pYES 2.0载体的连接缓冲液(30mM Tris-Cl(pH7.8)、10mM MgCl₂、10mM DTT、0.5mMATP)中进行3个实验连接。连接反应如下：16℃下温育12小时，70℃下加热20分钟，向每个管中加入10ml水。如Sambrook等((1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)的描述将1ml每种连接混合物电穿孔到40ml大肠杆菌DH10B电感受态细胞(Bethesda研究实验室)中。使用最佳条件在由各个集合体组成的大肠杆菌中构建文库。每个集合体的产生是：将转化的大肠杆菌涂布在LB+氨苄青霉素的琼脂平板上，37℃下培养24小时后，每个平板产生15.000-30.000个菌落。将20ml LB+氨苄青霉素加入到所说的平板中，并将所说的细胞悬浮在其中。37℃下将细胞悬液在50ml的管中振荡1小时。按照厂商的说明使用QIAGEN质粒试剂盒从这些细胞中分离质粒DNA，并将其贮存在-20℃。

将1ml从各个集合体中得到的纯化的质粒DNA(100ng/ml)的等份试样通过电穿孔法转化到酿酒酵母W3124中(Becker和Guarante(1991)酶学方法194:182-187)，将转化体接种在含有2％葡萄糖的SC琼脂上，并在30℃下培养。阳性克隆的鉴定：

将转化体接种在含有0.1％AZCL半乳聚糖(Megazyme，澳大利亚)和2％半乳糖的SC琼脂上，并在30℃下培养3-5天。

有蓝晕围绕的菌落被鉴定为半乳聚糖酶阳性菌落。用于在曲霉属中表达的cDNA基因的分离：

将产生半乳聚糖酶的酵母菌落接种在50ml玻璃试管中的20mlYPD肉汤中。30℃下将所说的试管振荡2天。在3000rpm下离心10分钟来收获细胞。

按照WO 94/14953分离DNA，并将其溶解在50ml的水中。通过标准的方法将所说的DNA转化到大肠杆菌中。使用标准的方法从大肠杆菌中分离质粒DNA，并通过限制酶分析法进行分析。使用合适的限制酶切除cDNA插入物，并将其连接到曲霉属表达载体中。米曲霉或者黑曲霉的转化

如WO 95/02043(16页21行-17页12行，本文一并参考)的描述制备原生质体。

将100μl原生质体悬液与5-25μg适当DNA的10μl STC(1.2M山梨醇、10mM Tris-HCl(pH=7.5)、10mM CaCl₂)溶液混合。将原生质体与感兴趣的曲霉属载体混合。混合物在室温下放置25分钟。加入0.2ml 60％PEG 4000(BDH 29576)、10mM CaCl₂和10mM Tris-HCl(pH7.5)，认真混合(两次)，最后再加入0.85ml同样的溶液，认真混合。将混合物在室温下放置25分钟，在2500g下涡旋15分钟，将沉淀重悬浮在2ml 1.2M山梨醇中。再沉淀一次后，将原生质体涂布在含有1.0M蔗糖(pH7.0)、10mM乙酰胺作为氮源和抑制背景生长的20mM CsCl的基本平板(Cove，生物化学和生物物理学报113(1966)51-56)上。37℃下培养4-7天后，挑取孢子，并将其涂布成单菌落。重复此过程，在第二次再分离后，将单菌落的孢子贮存为限定的转化体。米曲酶转化体的检验

将每种转化体接种在10ml YPM(参见下文)中，进行繁殖。30℃下培养2-5天后，除去上清液。通过将10μl上清液加入到在含有0.2％AZCLO半乳聚糖(Megazyme，澳大利亚)的琼脂平板中打出的直径为4毫米的孔中来鉴定半乳聚糖酶活性。然后通过蓝晕鉴定半乳聚糖酶活性。补料分批(fed batch)发酵：

在含有麦芽糖糊精(碳源)、脲(氮源)和酵母提取物的培养基中进行补料分批发酵。通过在含有3.5％碳源和0.5％氮源的培养基中接入所讨论的米曲霉宿主细胞的摇瓶培养物来进行补料分批发酵。在pH7.0和34℃下培养24小时之后，开始连续供给另外的碳和氮源。碳源一直作为限制因子，保证氧的过量存在。补料分批培养持续4天。SEO ID NO.1所示的DNA序列的分离：

可以通过本领域公知的方法(Sambrook等，(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)经质粒DNA的提取从保藏有机体酿酒酵母DSM 9983中获得编码本发明的半乳聚糖酶的如SEQ ID No.1所示的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分。如SEQ ID No.3所示的DNA序列的分离：

可以通过本领域公知的方法(Sambrook等，(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)经质粒DNA的提取从保藏有机体酿酒酵母DSM 9976中获得编码本发明的半乳聚糖酶的如SEQ ID No.3所示的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分。培养基

YPD:10g酵母提取物，20g蛋白胨，加H2O至900毫升。高压灭菌，再加入100ml 20％葡萄糖(无菌过滤)。

YPM:10g酵母提取物，20g蛋白胨，加H2O至900毫升。高压灭菌，再加入100ml 20％麦芽糖糊精(无菌过滤)。

10x基本盐：75g酵母氮碱，113g琥珀酸，68g NaOH，加H₂O至1000毫升，无菌过滤。

SC-URA:100ml 10x基本盐，28ml没有维生素的20％酪蛋白氨基酸，10ml 1％色氨酸，加H₂O至900毫升，高压灭菌，加入3.6ml 5％苏氨酸和100ml 20％葡萄糖或者20％半乳糖。

SC-琼脂：SC-URA，加入20g/l琼脂。

SC-不同的琼脂：20g琼脂，20ml 10x基本盐，加H₂O至900毫升，高压灭菌。

AZCL半乳聚糖(Megazyme，澳大利亚)

PEG 4000(聚乙二醇，分子量=4,000)(BDH，英国)

实施例

实施例1从Myceliophthora thermophila CBS No.117.65中克隆并表达半乳聚糖酶

从Myceliophthora thermophila,CBS No.117.65中分离mRNA，所说的菌株生长在含有纤维素的培养基中，同时在培养过程中不断搅拌以确保通气充分。生长3-5天后，收获菌丝，立即在液氮中冷冻，并贮存在-80℃。如上所述使用1％载体背景在大肠杆菌中构建含有大约9×10⁵个克隆的Myceliophthora thermophila CBS No.117.65文库。将一些集合体的质拉DNA转化到酵母中，从每一个集合体获得含有250-400个酵母菌落的50-100平板。

鉴定半乳聚糖酶阳性菌落，并使用AZCL木聚糖测定方法在SC-琼脂平板上分离。从所说的酵母菌落直接扩增cDNA插入物，并如上文材料和方法部分的描述进行定性。编码半乳聚糖酶的cDNA的DNA序列如SEQ ID No.1所示，相应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。在SEQ IDNo.1中，1-1050的DNA核苷酸被确定为半乳聚糖酶的编码区。

可以从DSM 9983中的质粒中获得cDNA。

从酵母菌落分离总DNA，并如上所述通过转化大肠杆菌拯救质粒DNA。为了在曲霉属中表达半乳聚糖酶，使用适当的限制酶消化DNA，在凝胶上按大小进行分级分离，纯化相当于半乳聚糖酶基因的片段。然后将此基因连接到用适当的限制酶消化的pHD414中，得到质粒pA2G53。

在大肠杆菌中进行DNA扩增后，如上所述将质粒转化到米曲霉中。米曲霉转化体的检验

如上所述，检验每种转化体的酶活性。一些转化体具有明显大于米曲霉背景的半乳聚糖酶活性。这表明半乳聚糖酶有效地在米曲霉中表达。

实施例2

将编码本发明的半乳聚糖酶的DNA序列(SEQ ID No.1)对核苷酸和蛋白质数据库进行同源性检索。同源性检索表明最相关的半乳聚糖酶是棘孢曲霉的β-1,4-半乳聚糖酶。

按照“本发明详细描述”的方法使用计算机程序GAP确定本发明的半乳聚糖酶与大多数现有的半乳聚糖酶相比的DNA同源性。本发明的半乳聚糖酶与棘孢曲霉的β-1,4-半乳聚糖酶(WO 92/13945)仅具有59％的DNA同源性。这表明本发明的半乳聚糖酶实际上不同于任何已知的半乳聚糖酶。

实施例3从M.thermophilum中纯化重组半乳聚糖酶

将表达重组酶的米曲霉发酵培养物的上清液离心，并经0.2μm的滤膜过滤以除去菌丝体。将250ml过滤的上清液在Filtron ultracette或者带有10kDa膜的Amicon超滤装置上超滤，同时，在同一装置上进行两次连续的超滤时将缓冲液改变成25mM Tris-HCl(pH8.0)。将所得的40ml样品以1.5毫升/分钟加入到在25mM Tris-HCl pH8.0中平衡的Pharmacia HR16/20 Fast Flow Q琼脂糖凝胶阴离子交换柱上。加入样品后，用2倍柱体积的25mM Tris-HCl pH8.0洗涤此柱，使用溶解在25mMTris-HCl pH8.0中的线型增加的NaCl梯度(0-0.5M NaCl)洗脱结合的蛋白质。在AZCL-半乳聚糖中检验级分的半乳聚糖酶活性，合并具有活性的级分。

在柱上没有保留M.thermophilum半乳聚糖酶，收集并浓缩此阴离子交换步骤中的洗涤级分，缓冲液换成10mM柠檬酸钠pH4.0。将此物质以1.5毫升/分钟加入到在10mM柠檬酸钠pH4.0中平衡的PharmaciaHR16/20 Fast Flow Q琼脂糖凝胶阳离子交换柱上。加入样品后，用2倍柱体积的同种缓冲液洗涤此柱，使用溶解在10mM柠檬酸钠pH4.0中的线型NaCl梯度(0-0.35M NaCl)洗脱结合的蛋白质。大约在0.1M NaCl时洗脱出的半乳聚糖酶活性和含该活性的级分在Filtron Macrosep10kDa超滤装置上浓缩到500μl。将450μl以0.5毫升/分钟加入到Pharmacia HR10/30 Superdex 75凝胶过滤柱上，使用0.25M醋酸铵(pH5.5)以0.5毫升/分钟洗脱所说的蛋白质。以电泳纯的形式从此柱中洗脱出M.thermophilum半乳聚糖酶。

使用“Bio-Rad蛋白质测定”按照制造者(Bio-Rad实验室GmbH)的建议测定蛋白质的浓度。

实施例4M.thermophilum的重组半乳聚糖酶的鉴定

如WO 94/21785的描述确定此酶的分子量与等电点。

通过羽扇豆半乳聚糖(MegaZyme，澳大利亚)释放的还原糖或者通过AZCL-马铃薯-半乳聚糖(MegaZyme，澳大利亚)释放的蓝色来测定此酶的活性。

将0.5ml 0.4％AZCL-马铃薯-半乳聚糖与0.5ml最适pH的0.1M柠檬酸/磷酸缓冲液混合，然后加入10μl适当稀释的酶溶液。30℃下(如果没有特别说明)在Eppendorf Thermomixers中温育15分钟，然后95℃下热灭活此酶20分钟。设3个酶温育重复，加入酶但立即灭活的为空白。离心后，在微量滴定板中于620nm下测量上清液的吸收率，并减空白值。

在0.1M最适pH(如果没有特殊说明)的柠檬酸/磷酸缓冲液中配制羽扇豆半乳聚糖的0.5％溶液，将10μl适当稀释的酶溶液加入到1ml的底物中，30℃下温育15分钟，之后在95℃下热灭活20分钟。在微量滴定板中通过与PHBAH试剂反应测量还原糖，所说的PHBAH试剂含有0.15g对羟基苯甲酸酰肼(Sigma H-9882)、0.50g酒石酸钾钠(Merck 8087)、2％NaOH溶液(将体积定溶为10.0ml)。减去空白的结果。半乳糖用作标准。

在AZCL-半乳聚糖上测量最适pH和温度。使用0.1M柠檬酸/磷酸缓冲液的pH(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)确定最适pH。为了确定最适温度，使用最适pH的0.1M柠檬酸/磷酸缓冲液在不同的温度下反应15分钟。

Km和比活的研究如下：在各种(0.025-1.5％)羽扇豆半乳聚糖浓度(S)下温育，测量产生的还原糖，然后计算反应速率(v)，以S为自变量作出S/v图，进行线性回归分析，得到斜率(=1/Vmax)和截距(Km/Vmax)，计算Km和比活(=Vmax/E)，其中的E是加入的酶量。

酶 M.thermophilum

Mw 42kDa

pI 7.8

最适pH 6.0

最适温度 70℃

Km(％半乳聚糖) 0.5-0.9

比活(μmol/分钟/毫克) 800-1200氨基末端序列

使用带有应用生物系统设备(ABI 473A蛋白质测序仪，应用生物系统，美国)的Edman降解，按照厂商的说明进行氨基末端分析。

N端序列：

对于具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的本发明的半乳聚糖酶，其N端序列是：N端Ala-Leu-Thr-Tyr-Arg-Gly-Val-

N端氨基酸Ala位于SEQ ID NO:2的19位上。这表明本发明的成熟半乳聚糖酶从SEQ ID NO:2的19位开始。

因此，成熟的序列为SEQ ID NO:2的19-350。

实施例5

从Humicola insolens 1800中克隆并表达半乳聚糖酶

从Humicola insolens DSM 1800中分离mRNA，所说的菌株生长在含有玉米粉的培养基中，同时在培养过程中不断搅拌以确保通气充分。生长3-5天后，收获菌丝，立即在液氮中冷冻，并贮存在-80℃。如上所述使用1％载体背景在大肠杆菌中构建含有大约9×10⁵个克隆的Humicolainsolens DSM 1800文库。将一些集合体的质拉DNA转化到酵母中，从每一个集合体获得含有250-400个酵母菌落的50-100个平板。

鉴定半乳聚糖酶阳性菌落，并使用AZCL木聚糖测定方法在SC-琼脂平板上分离。从所说的酵母菌落直接扩增cDNA插入物，并如上文材料和方法部分的描述进行鉴定。编码半乳聚糖酶的cDNA的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，相应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

可以从DSM 9976中的质粒中获得cDNA。

从酵母菌落分离总DNA，并如上所述通过转化大肠杆菌拯救质粒DNA。为了在曲霉属中表达半乳聚糖酶，使用适当的限制酶消化DNA，在凝胶上按大小进行分级分离，纯化相当于半乳聚糖酶基因的片段。然后将此基因连接到用适当的限制酶消化的pHD414中，得到质粒pA2G51。

实施例6

将编码本发明的半乳聚糖酶的DNA序列(SEQ ID No.3)对核苷酸和蛋白质数据库进行同源性检索。同源性检索表明最相关的半乳聚糖酶是棘孢曲霉的β-1,4-半乳聚糖酶。

按照“本发明详细描述”的方法使用计算机程序GAP确定本发明的半乳聚糖酶与大多数现有的半乳聚糖酶相比的DNA同源性。本发明的半乳聚糖酶与棘孢曲霉的β-1,4-半乳聚糖酶(WO 92/13945)仅具有55％的DNA同源性。这表明本发明的半乳聚糖酶实际上不同于任何已知的半乳聚糖酶。

实施例7从H.insolens中纯化重组半乳聚糖酶

将表达重组酶的米曲霉发酵培养物的上清液离心，并经0.2μm的滤膜过滤以除去菌丝体。将250ml过滤的上清液在Filtron ultracette或者带有10kDa膜的Amicon超滤装置上超滤，同时，在同一装置上进行两次连续的超滤时将缓冲液改变成25mM Tris-HCl(pH8.0)。将所得的40ml样品以1.5毫升/分钟加入到在25mM Tris-HCl pH8.0中平衡的Pharmacia HR16/20 Fast F1ow Q琼脂糖凝胶阴离子交换柱上。加入样品后，用2倍柱体积的25mM Tris-HCl pH8.0洗涤此柱，使用溶解在25mMTris-HCl pH8.0中的线型增加的NaCl梯度(0-0.5M NaCl)洗脱结合的蛋白质。在AZCL-半乳聚糖中检验级分的半乳聚糖酶活性，合并具有活性的级分。

柱上保留了H.insolens半乳聚糖酶。以电泳纯的形式使用NaCl进行洗脱。

实施例8H.insolens的重组半乳聚糖酶的鉴定

如WO 94/21785的描述确定此酶的分子量与等电点。

酶 H.insolens

Mw 44kDa

pI 8.5

最适pH 7.5

最适温度 60℃

Km(％半乳聚糖) 0.7-1.0

比活(μmol/分钟/毫克) 475-575氨基末端序列

N端序列：

对于具有如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列的本发明的半乳聚糖酶，其N端序列是：

N端Leu-Gln-Tyr-Lys-Gly-Val-Asp-

N端氨基酸Gln位于SEQ ID NO:4的19位上。这表明本发明的成熟半乳聚糖酶从SEQ ID NO:4的19位开始。

因此，成熟的序列为SEQ ID NO:4的19-349。

实施例9半乳聚糖酶对动物饲料的效应：

本实验所用的半乳聚糖酶是从H.insolens中获得的本发明的半乳聚糖酶，并将其如实施例7的描述进行纯化。

本实验所用的乳糖酶是名为Sumilact L(Shinnihon日本)的商品乳糖酶。

将威斯塔氏雄性大鼠(66-68g)分成5组，这些处理的平均重量不超过±0.5g。将大鼠分别饲养在各个代谢笼中，分开收集尿和粪便。实验时期分成4天环境适应性期(使大鼠能够适应笼子和饲料)和4天平衡期，这期间每天收集粪便和尿。

每个动物每天食用10g DM(干物质)。日常饮食包括600g/kg羽扇豆和400g/kg无N的混合物(8.9％蔗糖，5.2％纤维素粉，5.2％植物油，80.7％玉米淀粉)、维生素、矿物质和1.2g DL-甲硫氨酸。加入甲硫氨酸是为了刺激食欲，因为羽扇豆的含硫氨基酸的含量很低。每天在同一时间喂养大鼠一次。

在实验结束时，分别将大鼠称重，并用CO2杀死。

通过冷冻干燥测定日常饮食和粪便中的干物质。

通过Kjeltec消化方法、蒸馏和滴定测定日常饮食、尿和粪便样品中的氮含量。

此实验的结果，即蛋白质的真正可消化性和DM的可消化性如下表1所示。

日常饮用	表观蛋白质可消化性	DM可消化性
日常饮用	表观蛋白质可消化性	DM可消化性	对照	80.99	75.94
10.6g半乳聚糖酶	83.84	77.08	对照	80.99	75.94
10.6g半乳聚糖酶	83.84	77.08	32.0g半乳聚糖酶	84.19	75.90
10.6g半乳聚糖酶+1g乳糖酶	84.65	76.16	32.0g半乳聚糖酶	84.19	75.90
10.6g半乳聚糖酶+1g乳糖酶	84.65	76.16	32.0g半乳聚糖酶+1g乳糖酶	84.39	73.90

剂量是在日常饮食中每千克羽扇豆中含有半乳聚糖酶或者乳糖酶制剂的克数。

实施例10对粪壳目菌株半乳聚糖酶基因有特异性的PCR片段的分离

鉴定了从粪壳目中获得的两个半乳聚糖酶(具有如SEQ ID No.2和4所示的氨基酸序列)的氨基酸序列的两个氨基酸基元；a)Ser(S)-Asp(D)-Thr(T)-Trp(W)-Ala(A)-Asp(D)-Pro(P)-Ala(A)-

His(H)(SEQ ID 2的101-109位，SEQ ID 4的100-108位)；b)Phe(F)-Tyr(Y)-Trp(W)-Glu(E)-Pro(P)-Ala(A)-Trp(W)-Ile(I)(SEQ ID 2的312-319位和SEQ ID 4的311-318位)；

为了确定两个上述基元是否已经存在于现有技术中，在SWISS-PROT氨基酸数据库中进行了计算机分析。

这两个基元的任何一个都没有检测到，这也表明在现有的棘孢曲霉的真菌半乳聚糖酶的氨基酸序列中还没有这些基元(WO 92/13945)。

以上述两个基元为基础合成简并的PCR DNA引物a)＂5′-CTA TTC GGA TCC AG(C/T)GA(C/T)AC(A/C)TGG GC(G/C)

GA(C/T)CC(G/T)GC(G/T)C-3′″[SEQ ID NO 5]有义引物；和

andb)＂5′-CTA ATG TCT AGA(A/G)AT CCA(A/G/C/T)GC(A/G/C/T)GG

(C/T)TC CCA (A/G)TA AAA-3′″[SEQ ID NO6]反义引物。(黑体序列是接头序列，目的是有利于PCR片段的克隆)。

使用上述引物和棘孢曲霉CBS 101.43、Myceliophthora thermophilaCBS No.117.65、Humicola insolens DSM No.1800的cDNA文库进行3个独立的PCR扩增。在这3个PCR反应中，每一个都使用大约10ng的DNA作为模板DNA。

如本文所述由Myceliophthora thermophila CBS No.117.65、Humicola insolens DSM No.1800构建cDNA文库。如WO 92/13945的描述构建棘孢曲霉CBS 101.43的cDNA文库。

按照厂商的方案使用Clontech的Tag-Start试剂盒。上述两个引物的浓度均为0.5mM。使用Touch-down PCR进行扩增(Don,R.H.等(1991)，核酸研究19:4008)。首先将DNA在95℃下变性3分钟，然后以下列每个退火温度进行两次循环：60℃、59℃、58℃、57℃、56℃、55℃、54℃、53℃、52℃和51℃，每次退火时间为1分钟。退火前，加热温育至95℃，1分钟；退火后，在72℃下延伸30秒。按如下进行第21-35循环：95℃下，变性1分钟；50℃下退火1分钟；72℃下延伸30秒。

从两个独立的以Myceliophthora thermophila(CBS No.117.65和Humicola insolens DSM No.1800 DNA为模板DNA的PCR反应中，都获得了一条大约为700 bp的PCR带，而在以棘孢曲霉CBS 101.43 DNA为模板的PCR反应中没有获得特异的PCR带。

这说明上述确定的两个基元和相应推断的简并引物对粪壳目的半乳聚糖酶是特异的。

目前认为，从粪壳属的菌株中克隆其它的半乳聚糖酶是可能的，例如在标准的杂交克隆方法中使用上述产生的这两种简并PCR片段的任何一种作为探针。

序列表

SEQ ID No.1显示出转化到保藏的酿酒酵母DSM 9983中的包含在所说的DNA构建体中的全长DNA序列的DNA序列。序列表(2)SEQ ID NO:1的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：1050碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅵ)原始来源：

(A)有机体：Myceliophthpora thermophila

(B)菌株：CBS 117.65

(ⅸ)特征：

(A)关键词：CDS

(B)位置：1..1050

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:ATG ATG CTC ACA CGC TTC GTG GCT GGC CTG CTC GGC ATC TCC GCC GCG 48Met Met Leu Thr Arg Phe Val Ala Gly Leu Leu Gly Ile Ser Ala Ala1 5 10 15GAT GCC GCC CTC ACC TAC AGA GGC GTG GAT TGG TCC TCA GTG GTG GTT 96Asp Ala Ala Leu Thr Tyr Arg Gly Val Asp Trp Ser Ser Val Val Val

20 25 30GAG GAA CGG GCC GGC GTC TCG TAC AAG AAC ACC AAC GGG AAT GCC CAA 144Glu Glu Arg Ala Gly Val Ser Tyr Lys Asn Thr Asn Gly Asn Ala Gln

35 40 45CCG CTT GAG AAC ATC CTG GCT GCC AAT GGC GTC AAC ACG GTG CGG CAG 192Pro Leu Glu Asn Ile Leu Ala Ala Asn Gly Val Asn Thr Val Arg Gln

50 55 60CGA GTC TGG GTT AAC CCC GCG GAC GGC AAC TAC AAC CTC GAC TAC AAC 240Arg Val Trp Val Asn Pro Ala Asp Gly Asn Tyr Asn Leu Asp Tyr Asn65 70 75 80ATC GCG ATC GCG AAG AGG GCG AAG GCT GCC GGG CTT GGC GTG TAC ATC 288Ile Ala Ile Ala Lys Arg Ala Lys Ala Ala Gly Leu Gly Val Tyr Ile

85 90 95GAC TTC CAC TAC AGC GAC ACC TGGGCC GAT CCT GCT CAT CAG ACC ATG 336Asp Phe His Tyr Ser Asp Thr Trp Ala Asp Pro Ala His Gln Thr Met

100 105 110CCC GCT GGG TGG CCG AGC GAC ATT GAC AAC CTC TCC TGG AAG CTC TAC 384Pro Ala Gly Trp Pro Ser Asp Ile Asp Asn Leu Ser Trp Lys Leu Tyr

115 120 125AAC TAC ACT CTG GAC GCC GCC AAC AAG CTC CAG AAC GCG GGT ATC CAG 432Asn Tyr Thr Leu Asp Ala Ala Asn Lys Leu Gln Asn Ala Gly Ile Gln

130 135 140CCC ACC ATC GTG TCC ATC GGT AAC GAG ATC CGG GCC GGT CTG CTA TGG 480Pro Thr Ile Val Ser Ile Gly Asn Glu Ile Arg Ala Gly Leu Leu Trp145 150 155 160CCC ACA GGG AGA ACC GAG AAC TGG GCC AAC ATT GCC CGG TTG TTG CAC 528Pro Thr Gly Arg Thr Glu Asn Trp Ala Asn Ile Ala Arg Leu Leu His

165 170 175TCC GCT GCT TGG GGT ATC AAG GAC TCG TCG CTC AGC CCG AAG CCA AAG 576Ser Ala Ala Trp Gly Ile Lys Asp Ser Ser Leu Ser Pro Lys Pro Lys

180 185 190ATC ATG ATC CAC CTC GAC AAC GGA TGG GAC TGG GGT ACC CAG AAT TGG 624Ile Met Ile His Leu Asp Asn Gly Trp Asp Trp Gly Thr Gln Asn Trp

195 200 205TGG TAC ACG AAT GTC TTG AAG CAG GGT ACA CTT GAG CTG TCC GAC TGT 672Trp Tyr Thr Asn Val Leu Lys Gln Gly Thr Leu Glu Leu Ser Asp Cys

210 215 220GAC ATG ATG GGC GTC TCG TTC TAC CCC TTT TAC TCG TCG TCG GCA ACC 720Asp Met Met Gly Val Ser Phe Tyr Pro Phe Tyr Ser Ser Ser Ala Thr225 230 235 240TTG AGC GCC CTG AAA TCG AGC TTG GAC AAC ATG GCC AAA ACC TGG AAC 768Leu Ser Ala Leu Lys Ser Ser Leu Asp Asn Met Ala Lys Thr Trp Asn

245 250 255AAG GAG ATT GCC GTG GTC GAG ACC AAT TGG CCA ATC TCT TGT CCC AAC 816Lys Glu Ile Ala Val Val Glu Thr Asn Trp Pro Ile Ser Cys Pro Asn

260 265 270CCA AGG TAC AGT TTC CCC TCG GAC GTC AAG AAC ATC CCC TTC TCG CCG 864Pro Arg Tyr Ser Phe Pro Ser Asp Val Lys Asn Ile Pro Phe Ser Pro

275 280 285GAA GGA CAG ACG ACC TTC ATC ACC AAC GTG GCC AAC ATC GTG TCC TCG 912Glu Gly Gln Thr Thr Phe Ile Thr Asn Val Ala Asn Ile Val Ser Ser

290 295 300GTA AGC CGC GGC GTA GGC CTG TTT TAT TGG GAA CCC GCT TGG ATT CAC 960Val Ser Arg Gly Val Gly Leu Phe Tyr Trp Glu Pro Ala Trp Ile His305 310 315 320AAT GCA AAC CTG GGC TCG TCG TGC GCC GAC AAC ACC ATG TTT TCG CAA 1008Asn Ala Asn Leu Gly Ser Ser Cys Ala Asp Asn Thr Met Phe Ser Gln

325 330 335TCC GGG CAG GCT TTG TCC AGC TTG TCC GTT TTC CAG AGA ATC 1050Ser G1y Gln Ala Leu Ser Ser Leu Ser Val Phe Gln Arg Ile

340 345 350(2)SEQ ID NO:2的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：350个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:Met Met Leu Thr Arg Phe Val Ala Gly Leu Leu Gly Ile Ser Ala Ala1 5 10 15Asp Ala Ala Leu Thr Tyr Arg Gly Val Asp Trp Ser Ser Val Val Val

20 25 30Glu Glu Arg Ala Gly Val Ser Tyr Lys Asn Thr Asn Gly Asn Ala Gln

35 40 45Pro Leu Glu Asn Ile Leu Ala Ala Asn Gly Val Asn Thr Val Arg Gln

50 55 60Arg Val Trp Val Asn Pro Ala Asp Gly Asn Tyr Asn Leu Asp Tyr Asn65 70 75 80Ile Ala Ile Ala Lys Arg Ala Lys Ala Ala Gly Leu Gly Val Tyr Ile

85 90 95Asp Phe His Tyr Ser Asp Thr Trp Ala Asp Pro Ala His Gln Thr Met

100 105 110Pro Ala Gly Trp Pro Ser Asp Ile Asp Asn Leu Ser Trp Lys Leu Tyr

115 120 125Asn Tyr Thr Leu Asp Ala Ala Asn Lys Leu Gln Asn Ala Gly Ile Gln

130 135 140Pro Thr Ile Val Ser Ile Gly Asn Glu Ile Arg Ala Gly Leu Leu Trp145 150 155 160Pro Thr Gly Arg Thr Glu Asn Trp Ala Asn Ile Ala Arg Leu Leu His

165 170 175Ser Ala Ala Trp Gly Ile Lys Asp Ser Ser Leu Ser Pro Lys Pro Lys

180 185 190Ile Met Ile His Leu Asp Asn Gly Trp Asp Trp Gly Thr Gln Asn TrpIle Met Ile His Leu Asp Asn Gly Trp Asp Trp Gly Thr Gln Asn Trp

195 200 205Trp Tyr Thr Asn Val Leu Lys Gln Gly Thr Leu Glu Leu Ser Asp Cys

210 215 220Asp Met Met Gly Val Ser Phe Tyr Pro Phe Tyr Ser Ser Ser Ala Thr225 230 235 240Leu Ser Ala Leu Lys Ser Ser Leu Asp Asn Met Ala Lys Thr Trp Asn

245 250 255Lys Glu Ile Ala Val Val Glu Thr Asn Trp Pro Ile Ser Cys Pro Asn

260 265 270Pro Arg Tyr Ser Phe Pro Ser Asp Val Lys Asn Ile Pro Phe Ser Pro

275 280 285Glu Gly Gln Thr Thr Phe Ile Thr Asn Val Ala Asn Ile Val Ser Ser

290 295 300Val Ser Arg Gly Val Gly Leu Phe Tyr Trp Glu Pro Ala Trp Ile His305 310 315 320Asn Ala Asn Leu Gly Ser Ser Cys Ala Asp Asn Thr Met Phe Ser Gln

325 330 335Ser Gly Gln Ala Leu Ser Ser Leu Ser Val Phe Gln Arg Ile

340 345 350

SEQ ID No.3显示出转化到保藏的酿酒酵母DSM 9976中的包含在所说的DNA构建体中的编码半乳聚糖酶的DNA序列的DNA序列。

序列表(2)SEQ ID NO:3的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：1047个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅵ)原始来源：

(A)有机体：Humicola insolens

(B)菌株：DSM 1800

(ⅸ)特征：

(A)关键词：CDS

(B)位置：1..1047

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:ATG CGC GCG CTT CTG TCT ACT CTC CTC CTC GGC CTC GCG ACG GCC GTC 48Met Arg Ala Leu Leu Ser Thr Leu Leu Leu Gly Leu Ala Thr Ala Val1 5 10 15GAC GCC CTC CAA TAC AAG GGC GTT GAC TGG TCG TCC GTC ATG GTC GAG 96Asp Ala Leu Gln Tyr Lys Gly Val Asp Trp Ser Ser Val Met Val Glu

20 25 30GAG CGG GCG GGT GTC CGC TAC AAG AAC GTC AAC GGC CAG GAG AAG CCG 144Glu Arg Ala Gly Val Arg Tyr Lys Asn Val Asn Gly Gln Glu Lys Pro

35 40 45CTC GAG TAC ATC CTG GCC GAG AAC GGC GTC AAC ATG GTG CGG CAG CGC 192Leu Glu Tyr Ile Leu Ala Glu Asn Gly Val Asn Met Val Arg Gln Arg

50 55 60GTC TGG GTC AAC CCG TGG GAC GGC AAC TAC AAC CTC GAC TAC AAC ATC 240Val Trp Val Asn Pro Trp Asp Gly Asn Tyr Asn Leu Asp Tyr Asn Ile65 70 75 80CAG CTC GCG CGG CGG ACC AAG GCG GCC GGT CTG GGC CTC TAC ATC AAC 288Gln Leu Ala Arg Arg Thr Lys Ala Ala Gly Leu Gly Leu Tyr Ile Asn

85 90 95TTC CAC TAC AGC GAC ACC TGG GCC GAC CCG GCG CAC CAGACC ACG CCG 336Phe His Tyr Ser Asp Thr Trp Ala Asp Pro Ala His Gln Thr Thr Pro

100 105 110GCC GGG TGG CCG TCC GAC ATC AAC AAC CTG TCC TGG AAG CTG TAC AAC 384Ala Gly Trp Pro Ser Asp Ile Asn Asn Leu Ser Trp Lys Leu Tyr Asn

115 120 125TAC ACC CTC GAC TCG ATG AAC CGG TTC GCC GAC GCT GGG ATC CAG GTC 432Tyr Thr Leu Asp Ser Met Asn Arg Phe Ala Asp Ala Gly Ile Gln Val

130 135 140GAC ATC GTC TCC ATC GGC AAC GAG ATC ACC CAG GGC CTG CTG TGG CCC 480Asp Ile Val Ser Ile Gly Asn Glu Ile Thr Gln Gly Leu Leu Trp Pro145 150 155 160CTG GGC AAG ACC AAC AAC TGG TAC AAC ATC GCG AGG CTG CTG CAC TCG 528Leu Gly Lys Thr Asn Asn Trp Tyr Asn Ile Ala Arg Leu Leu His Ser

165 170 175GCC GCG TGG GGC GTC AAG GAC TCG AGG CTG AAC CCC AAG CCC AAG ATC 576Ala Ala Trp Gly Val Lys Asp Ser Arg Leu Asn Pro Lys Pro Lys Ile

180 185 190ATG GTG CAC CTG GAC AAC GGA TGG AAC TGG GAC ACC CCA AAC TGG TGG 624Met Val His Leu Asp Asn Gly Trp Asn Trp Asp Thr Pro Asn Trp Trp

195 200 205TAC ACC AAC GTG CTG TCC CAA GGC CCC TTC GAG ATG TCC GAC TTC GAC 672Tyr Thr Asn Val Leu Ser Gln Gly Pro Phe Glu Met Ser Asp Phe Asp

210 215 220ATG ATG GGC GTG TCC TTC TAC CCC TTC TAC TCG GCC TCG GCG ACG CTG 720Met Met Gly Val Ser Phe Tyr Pro Phe Tyr Ser Ala Ser Ala Thr Leu225 230 235 240GAC TCG CTG CGC CGG AGC CTC AAC AAC ATG GTG TCA CGC TGG GGC AAG 768Asp Ser Leu Arg Arg Ser Leu Asn Asn Met Val Ser Arg Trp Gly Lys

245 250 255GAG GTG GCC GTG GTC GAG ACC AAC TGG CCC ACG TCG TGC CCG TAT CCG 816Glu Val Ala Val Val Glu Thr Asn Trp Pro Thr Ser Cys Pro Tyr Pro

260 265 270CGC TAC CAG TTC CCG GCC GAC GTC CGC AAC GTG CCC TTC TCA GCG GCC 864Arg Tyr Gln Phe Pro Ala Asp Val Arg Asn Val Pro Phe Ser Ala Ala

275 280 285GGG CAG ACG CAG TAC ATC CAG AGC GTT GCG AAC GTG GTG TCG TCG GTC 912Gly Gln Thr Gln Tyr Ile Gln Ser Val Ala Asn Val Val Ser Ser Val

290 295 300AGC AAG GGA GTG GGG CTG TTT TAC TGG GAG CCG GCG TGG ATT CAC AAT 960Ser Lys Gly Val Gly Leu Phe Tyr Trp Glu Pro Ala Trp Ile His Asn305 310 315 320GCC AAC CTG GGG TCG TCG TGC GCG GAT AAC ACC ATG TTT ACG CCG TCG 1008Ala Asn Leu Gly Ser Ser Cys Ala Asp Asn Thr Met Phe Thr Pro Ser

325 330 335GGT CAG GCA TTG TCG AGT TTG TCG GTG TTC CAT AGG ATT 1047Gly Gln Ala Leu Ser Ser Leu Ser Val Phe His Arg Ile

340 3452)SEQ ID NO:4的信息:

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：349个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:Met Arg Ala Leu Leu Ser Thr Leu Leu Leu Gly Leu Ala Thr Ala Val1 5 10 15Asp Ala Leu Gln Tyr Lys Gly Val Asp Trp Ser Ser Val Met Val Glu

20 25 30Glu Arg Ala Gly Val Arg Tyr Lys Asn Val Asn Gly Gln Glu Lys Pro

35 40 45Leu Glu Tyr Ile Leu Ala Glu Asn Gly Val Asn Met Val Arg Gln Arg

50 55 60Val Trp Val Asn Pro Trp Asp Gly Asn Tyr Asn Leu Asp Tyr Asn Ile65 70 75 80Gln Leu Ala Arg Arg Thr Lys Ala Ala Gly Leu Gly Leu Tyr Ile Asn

85 90 95Phe His Tyr Ser Asp Thr Trp Ala Asp Pro Ala His Gln Thr Thr Pro

100 105 110Ala Gly Trp Pro Ser Asp Ile Asn Asn Leu Ser Trp Lys Leu Tyr Asn

115 120 125Tyr Thr Leu Asp Ser Met Asn Arg Phe Ala Asp Ala Gly Ile Gln Val

130 135 140Asp Ile Val Ser Ile Gly Asn Glu Ile Thr Gln Gly Leu Leu Trp Pro145 150 155 160Leu Gly Lys Thr Asn Asn Trp Tyr Asn Ile Ala Arg Leu Leu His Ser

165 170 175Ala Ala Trp Gly Val Lys Asp Ser Arg Leu Asn Pro Lys Pro Lys Ile

180 185 190Met Val His Leu Asp Asn Gly Trp Asn Trp Asp Thr Pro Asn Trp Trp

195 200 205Tyr Thr Asn Val Leu Ser Gln Gly Pro Phe Glu Met Ser Asp Phe Asp

210 215 220Met Met Gly Val Ser Phe Tyr Pro Phe Tyr Ser Ala Ser Ala Thr Leu225 230 235 240Asp Ser Leu Arg Arg Ser Leu Asn Asn Met Val Ser Arg Trp Gly Lys

245 250 255Glu Val Ala Val Val Glu Thr Asn Trp Pro Thr Ser Cys Pro Tyr Pro

260 265 270Arg Tyr Gln Phe Pro Ala Asp Val Arg Asn Val Pro Phe Ser Ala Ala

275 280 285Gly Gln Thr Gln Tyr Ile Gln Ser Val Ala Asn Val Val Ser Ser Val

290 295 300Ser Lys Gly Val Gly Leu Phe Tyr Trp Glu Pro Ala Trp Ile His Asn305 310 315 320Ala Asn Leu Gly Ser Ser Cys Ala Asp Asn Thr Met Phe Thr Pro Ser

325 330 335Gly Gln Ala Leu Ser Ser Leu Ser Val Phe Mis Arg Ile

340 345(2)SEQ ID NO:5的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：37个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：cDNA

CTATTCGGAT CCAGYGAYAC MTGGGCSGAY CCKGCKC2)SEQ ID NO:6的信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：36个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ⅱ)分子类型：cDNA

CTAATGTCTA GARATCCANG CNGGYTCCCA RTAAAA

Claims

1．一种从真菌中获得的半乳聚糖酶，这种酶的最适pH大于5.9。

2．按照权利要求1的半乳聚糖酶，这种酶来源于丝状真菌的菌株或者酵母的菌株。

3．按照权利要求2的半乳聚糖酶，其中所说的丝状真菌的菌株是核菌纲的菌株。

4．按照权利要求3的半乳聚糖酶，其中所说的核菌纲的菌株是粪壳目的菌株，如腐质霉属、毁丝霉属、蛾柱霉属、毛壳菌属、黑孢壳属、Cercophora、麻孢壳属、脉孢菌属、柄孢壳属、梭孢壳属的菌株，特别是M.Thermophilum或者H.insolens的菌株。

5．一种含有DNA序列的DNA构建体，所说的DNA序列编码按照权利要求1-4中任一项的半乳聚糖酶。

6．一种编码显示出半乳聚糖酶活性的酶的DNA构建体，这种DNA序列在低严格条件下能够与探针杂交，所说的探针是用从Humicolainsolens(DSM 1800)分离的DNA和/或从Myceliophthora Thermophila(CBS 117.65)分离的DNA与下列PCR引物对进行的PCR反应的产物：

＂5′-CTA TTC GGA TCC AG(C/T)GA(C/T)AC(A/C)TGG GC(G/C)GA(C/T)CC(G/T)GC(G/T)C-3′″[SEQ ID NO 5]作为有义引物，和

＂5′-CTA ATG TCT AGA(A/G)AT CCA(A/G/C/T)GC(A/G/C/T)GG(C/T)TC CCA(A/G)TA AAA-3′″[SEQ ID NO 6]作为反义引物。

7．按照权利要求6的DNA构建体，其中所说的DNA序列编码具有半乳聚糖酶活性的酶，这种酶包含下列部分氨基酸序列：

a)Ser(S)-Asp(D)-Thr(T)-Trp(W)-Ala(A)-Asp(D)-Pro(P)-Ala(A)-

His(H)和/或

b)Phe(F)-Tyr(Y)-Trp(W)-Glu(E)-Pro(P)-Ala(A)-Trp(W)-Ile(I)。

8．一种包含DNA序列的DNA构建体，这种DNA序列编码显示出半乳聚糖酶活性的酶，此DNA序列包括：

(a)克隆到质粒pYES 2.0中的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分，所说的质粒存在于酿酒酵母DSM 9983中；

(b)在SEQ ID NO 1的1-1050位、更优选55-1050位中所示的DNA序列，或者它的互补链；

(c)在(a)或(b)中限定的DNA序列的类似物，其和所说的DNA序列至少有70％的同源性；

9．一种包含DNA序列的DNA构建体，这种DNA序列编码显示出半乳聚糖酶活性的酶，此DNA序列包括：

(a)克隆到质粒pYES 2.0中的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分，所说的质粒存在于酿酒酵母DSM 9976中；

(b)在SEQ ID NO 3的1-1047位、更优选58-1047位中所示的DNA序列或者它的互补链；

10．按照权利要求6-9中任一项的DNA构建体，其中编码显示出半乳聚糖酶活性的酶的DNA序列是可以从微生物，优选的是丝状真菌、酵母或者细菌获得的。

11．按照权利要求10的DNA构建体，其中所说的DNA序列是可以从曲霉属的种的菌株，特别是棘孢曲霉、黑曲霉的菌株；疫霉属的种的菌株，特别是致病疫霉、大雄疫霉、恶疫霉的菌株；Talaromyces的种的菌株，特别是Talaromyces byssochlamydoides、Talaromyces emersonii的菌株；嗜热子囊菌属的种的菌株，特别是嗜热子囊菌的菌株；侧孢属的种的菌株，特别是Sporotrichum celluphilum的菌株；或者青霉属的种的菌株，特别是桔青霉、沙门柏干酪青霉或娄地青霉的菌株获得的。

12．按照权利要求10的DNA构建体，其中所说的DNA序列是可以从粪壳科，如腐质霉属、毁丝霉属或梭孢壳属的菌株，特别是Humicolainsolens或者Myceliophthora thermophilum的菌株获得的。

13．按照权利要求12的DNA构建体，其中所说的DNA序列是从Myceliophthora thermophila CBS No.117.65菌株的DNA文库或者Humicola insolens DSM No.1800菌株的DNA文库分离的，或者以此为基础获得的。

14．按照权利要求10的DNA构建体，其中所说的DNA序列是从酿酒酵母DSM No.9983或者是从酿酒酵母DSM No.9976中分离的。

15．一种重组表达载体，这种载体包含按照权利要求5-14中任一项的DNA构建体。

16．一种宿主细胞，这种细胞包含按照权利要求5-14中任一项的DNA构建体或者按照权利要求15的重组表达载体。

17．按照权利要求16的宿主细胞，这种细胞是真核细胞，特别是真菌细胞，如酵母细胞或丝状真菌细胞。

18．按照权利要求17的细胞，这种细胞是镰孢属、或者曲霉属、或者木霉属的菌株，特别是禾本科镰孢、Fusarium cerealis、黑曲霉、米曲酶、Trichoderma harzianum、Trichoderma reesei的菌株。

19．按照权利要求17的细胞，这种细胞是毁丝霉属的种或者腐质霉属的种的菌株，特别是Myceliophthora thermophila CBS No.117.65或者Humicola insolens DSM No.1800。

20．一种产生具有半乳聚糖酶活性的酶的方法，这种方法包括在允许产生此酶的条件下培养权利要求16-19中任一项的细胞，并且从培养物中回收所说的酶。

21．一种具有半乳聚糖酶活性的分离的酶，其特征在于(ⅰ)不含同源杂质，(ⅱ)所说的酶是由按照权利要求16-18中任一项的宿主细胞并用按照权利要求20的方法产生的。

22．一种具有半乳聚糖酶活性的分离的酶，这种酶包含下列部分氨基酸序列：

a)Ser(s)-Asp(D)-Thr(T)-Trp(W)-Ala(A)-Asp(D)-Pro(P)-Ala(A)-

His(H)和/或

b)Phe(F)-Tyr(Y)-Trp(W)-Glu(E)-Pro(P)-Ala(A)-Trp(W)-Ile(I)。

23．一种具有半乳聚糖酶活性的分离的酶，所说的酶选自下组：

(a)由克隆到质粒pYES 2.0中的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分编码的多肽，所说的质粒存在于酿酒酵母DSM 9983中；

(b)包含SEQ ID NO 2的19-350位所示的氨基酸序列的多肽；

(c)(a)或(b)中限定的多肽的类似物，其和所说的多肽至少具有70％的同源性；和

(d)(a)、(b)或者(c)的等位形式或片段。

24．一种具有半乳聚糖酶活性的分离的酶，所说的酶选自下组：

(a)由克隆到质粒pYES 2.0中的DNA序列的半乳聚糖酶编码部分编码的多肽，所说的质粒存在于酿酒酵母DSM 9976中；

(b)包含SEQ ID NO 4的19-349位所示的氨基酸序列的多肽；

(c)(a)或(b)中限定的多肽的类似物，其和所说的多肽至少具有70％的同源性；

和

(d)(a)、(b)或者(c)的等位形式或片段。

25．一种组合物，其包含按照权利要求1-4、23和24中任一项的酶。

26．一种酶组合物，这种酶组合物富含按照权利要求1-4、23和24中任一项的具有半乳聚糖酶活性的酶。

27．按照权利要求24的组合物，这种组合物还包含α-阿拉伯糖苷酶、木聚糖酶，β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酸酶、β-木糖苷酶、木聚糖乙酰酯酶、阿拉伯聚糖酶、鼠李半乳糖醛酸酶、果胶乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、植酸酶、果胶酸酯裂解酶、葡聚糖酶、果胶甲基酯酶。

28．按照权利要求1-4、23和24中任一项的酶或者按照权利要求25-27中任一项的酶组合物在制备饲料或食品方面的用途。

29．按照权利要求1-4、23和24中任一项的酶或者按照权利要求25-27中任一项的酶组合物在降低植物细胞壁来源的材料的粘度或水结合能力方面的用途。

30．按照权利要求1-4、23和24中任一项的酶或者按照权利要求25-27中任一项的酶组合物在酒或果汁生产中的用途。

31．一种保藏菌株酿酒酵母DSM No.9983的分离的实质上纯化的生物培养物。

32．一种保藏菌株酿酒酵母DSM No.9976的分离的实质上纯化的生物培养物。