CN103436501A - 一种基于氨基酸末端羧基的漆酶改性方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于漆酶氨基酸残基末端的羧基(-COOH)与L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐的氨基发生交联反应使漆酶活性、稳定性提高的改性方法,包括将漆酶、L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐在一定温度下进行混合反应,得到改性后的漆酶。与未改性漆酶相比,改性漆酶的活性、稳定性得到提高。该改性漆酶可用于再生植物纤维改性,在使再生植物纤维所抄造纸页强度性能提高的同时可节省漆酶用量。
Description
技术领域
本发明涉及制浆造纸及生物工程领域,具体涉及一种漆酶活性、稳定性提高的改性方法及改性漆酶在再生植物纤维改性的应用。
背景技术
与原生植物纤维相比,再生植物纤维的润胀性能、纤维强度和纸页物理性能均有下降。再生植物纤维强度的降低大大影响了其回收利用,为了提高再生植物纤维的强度性能,提高其利用水平和价值,有必要对其进行改性处理。在再生植物纤维改性的众多方法中,漆酶及漆酶介体体系是目前较为理想的一种再生植物纤维生物改性方法。其优点有:(1)反应条件温和;(2)对纤维造成的损伤很少;(3)对环境不会造成二次污染。
漆酶是一类多铜氧化还原酶,可以催化氧化氨基苯酚、多酚、聚胺、芳基二胺和部分无机离子等,广泛存在于植物、真菌、细菌中。由于漆酶的催化氧化反应只需空气中的氧气,副产物只有水,被称为“绿色催化剂”。另外,由于漆酶具有化学试剂所没有的一些独特性质,其在食品工业、化学分析、医学、环保、造纸工业等方面都有很好的应用潜能。然而由于漆酶在高温和其它极端环境下(如pH、温度、盐浓度或酶系统中外来物质的存在)不稳定、极易失活限制了它在工业上的应用。因此,有必要对漆酶进行一定的改性处理,使其活性、稳定性得以提高。
研究者已采用聚乙二醇、乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺、戊二醛、葡聚糖、右旋糖苷、邻苯二甲酸酐、丁二酸酐、马来酸酐、柠康酸酐对漆酶进行了化学改性,研究了它们的改性效果。研究显示这些物质化学改性后的漆酶稳定性在一定程度上得到了改善,但是改性酶的活性低于未改性酶;或者化学改性后漆酶活性在一定程度上得到了改善,但是改性酶的稳定性下降了。另外,有些改性后的漆酶活性和稳定性均提高了,但其提高百分比不大,而且目前的改性方法步骤繁琐,反应条件苛刻,处理成本较高,不适用于工厂实际应用。例如,右旋糖苷改性漆酶前,需用活化剂溴化氰进行活化,且需要严格控制右旋糖苷与溴化氰的用量和比例,溴化氰及其产物右旋糖苷亚胺碳酸盐有毒,而且亚胺碳酸盐在水溶液中不稳定,活化的右旋糖苷须通过凝胶色谱进行脱盐处理并须立即使用,此外,右旋糖苷活化时间较长,通常为18~24h,活化产物见光容易分解,所以活化和修饰过程都必须避光进行。本发明用L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐试剂来改性漆酶,不会引入和产生有毒物质,在漆酶活性和稳定性提高的同时,所需改性时间较短。
发明内容
本发明的目的之一解决了现有漆酶改性存在的问题和不足,提出了一种新的漆酶活性、稳定性提高的改性方法。
本发明通过以下技术方案予以实现:
(1)向原漆酶水溶液中加入L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐水溶液和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液,进行反应;
(2)反应完成后,用醋酸/醋酸钠缓冲溶液或磷酸氢二钾/柠檬酸缓冲溶液透析,得到改性后的漆酶。
上述方法中,步骤(1)所述原漆酶水溶液中溶质原漆酶来源于可以产生漆酶的植物、真菌或细菌中任一种,包括如桃树、灵芝、嗜热菌、曲霉菌或毛栓菌。
上述方法中,步骤(1)所述L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐用量为相对于原漆酶固体量的质量百分数0.001%-10%。
上述方法中,步骤(1)所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐用量为相对于原漆酶固体量的质量百分数0.001%-2%。
上述方法中,步骤(1)所述原漆酶水溶液和L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐水溶液均用pH为2.0-6.5的磷酸二氢钾/磷酸氢二钾(KH2PO4/K2HPO4)缓冲溶液配制。
上述方法中,步骤(1)所述反应的温度为2-25℃,所述反应的反应时间为0.5-12h。
上述方法中,步骤(1)所述反应是在搅拌条件下进行。
上述方法中,步骤(2)所述醋酸/醋酸钠缓冲溶液或磷酸氢二钾/柠檬酸缓冲溶液的pH为3.5-6.0。
上述方法中,步骤(2)所述透析的时间为12-72h。
本发明的又一目的在于解决现有技术的不足之处而提供一种改性漆酶在再生植物纤维改性中的应用。
本发明所采用的反应原理:
首先用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化漆酶中氨基酸残基末端的羧基(-COOH),然后活化的漆酶与L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐中的氨基发生交联反应形成肽键,使得漆酶链上的活性基团羧基得以保护,漆酶天然构象产生一定的刚性,不易伸展失活,并减少了漆酶分子内部基团的热振动,使得漆酶活性、热稳定性得到提高。
与现有技术相比较,本发明具有以下优点:
(1)本发明的改性方法不但能使漆酶活性得到大幅度提高,而且漆酶稳定性也有明显提高,应用于再生植物纤维改性中可明显减少漆酶使用量,这将带来巨大的社会效益、经济效益和环境效益。
(2)本发明的漆酶改性方法操作步骤简单,所需化学药品加入量少,无有毒化学药品摄入,所需反应条件温和。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解,以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
改性步骤:将5mL、10mg/mL漆酶液(漆酶SUKALacc由曲霉菌产生),与0.4mg/mL、5mL L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐溶液混合,向混合溶液中加入1.0mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐1-Ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl)carbodiimidehydrochloride(EDC),在25℃、磁力搅拌条件下反应4h,其中漆酶溶液和L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐溶液均用pH为5.8、浓度为0.06mol/L的磷酸二氢钾/磷酸氢二钾(KH2PO4/K2HPO4)缓冲溶液配制。反应完成后,将混合溶液转入透析袋中,在pH为5.0、浓度0.2mol/L的磷酸氢二钾/柠檬酸缓冲溶液中室温下透析48h除掉多余的L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐和EDC,得到改性后漆酶溶液,定容到25mL,冷冻保存备用,测定原漆酶与改性漆酶的活性和热稳定。
漆酶活性和半衰期分析:漆酶活性由2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)的氧化确定。漆酶活性定义:定义1min催化1μmol ABTS的酶量为一个酶活单位(U)。具体操作步骤为:准确移取pH为4.8的乙酸-乙酸钠缓冲溶液、0.5mmol/L ABTS各10mL,混合,摇匀,30℃水浴。测试在紫外分光光度计中进行,取上述混合试剂1mL于比色皿中,420nm处调零。准确加入待测酶液0.5mL,立即记录前3min吸光度的变化,取平均值,折算成每分钟的吸光度变化(OD420变化)。
漆酶活性计算:每升酶液所含有的酶活量计算公式如下:
其中,漆酶催化ABTS形成的产物摩尔吸光系数为36000mol·L-1·cm-1,X为加入的待测漆酶的体积。
漆酶半衰期分析:取一定量的漆酶液在50℃下保温一定时间(10min,20min,30min,40min,50min,60min,90min,120min...)后迅速冷却。取出0.5mL经处理的漆酶液,按上述漆酶活性测定步骤确定残余活性,所得到的数据使用对数法就可以算出半衰期。漆酶活性和半衰期数据见表1。
表1原漆酶与改性后漆酶的活性和热稳定性
样品 | 相对活性(%) | 相对半衰期(%) |
原漆酶 | 100 | 100 |
改性漆酶(实施例1) | 249.5 | 175.6 |
改性漆酶(实施例2) | 238.8 | 205.2 |
改性漆酶(实施例3) | 185.9 | 219.5 |
注:未改性原漆酶的相对活性定义为100%,改性后的漆酶活性以原漆酶为基准;未改性原漆酶的相对半衰期定义为100%,改性后的漆酶相对半衰期以原漆酶为基准。
从表1中的数据可以看出经过L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐处理后的漆酶活性和半衰期分别增加了149.5%和75.6%,说明改性处理后的漆酶不但热稳定提高了,其活性也提高了。可见,经过本发明的改性方法,改性漆酶能够耐受较复杂的环境,提高了其在工业上的应用潜能。
本发明方法与其它已有方法的改性效果对比见表2。
表2不同漆酶改性方法效果对比
注:增量均以控制样指标为比较标准。
从表2数据可以看出,与其它漆酶改性方法相比,本发明方法可以显著提高漆酶活性,且漆酶热稳定也得以提高。
实施例2
将5mL、10mg/mL漆酶液(漆酶SUKALacc由曲霉菌产生)与0.2mg/mL、6mLL-苯丙氨酸甲酯盐酸盐溶液混合,向混合溶液中加入0.8mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐1-Ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl)carbodiimide hydr℃hloride(EDC),在25℃、磁力搅拌条件下反应4h,其中漆酶溶液和L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐溶液均用pH5.8、0.06mol/L的磷酸二氢钾/磷酸氢二钾(KH2PO4/K2HPO4)缓冲溶液配制。反应完成后,将混合溶液转入透析袋中,在pH为5.0、浓度为0.2mol/L的磷酸氢二钾/柠檬酸缓冲溶液中室温下透析24h除掉多余的L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐和EDC,得到改性后漆酶溶液,定容到25mL,冷冻保存备用,漆酶活性和半衰期测定按照实施例1所述方法进行。漆酶活性和半衰期数据见表1。
从表1中的数据可以看出经过L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐处理的漆酶活性和半衰期分别增加了138.8%和105.2%,说明改性处理后的漆酶不但热稳定提高了,其活性也提高了。可见,经过本发明的改性方法,改性漆酶能够耐受较复杂的环境,提高了其在工业上的应用潜能。
实施例3
将5mL、10mg/mL漆酶液(漆酶SUKALacc由曲霉菌产生)与0.1mg/mL、10mLL-苯丙氨酸甲酯盐酸盐溶液混合,向混合溶液中加入1.0mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐1-Ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl)carbodiimide hydrochloride(EDC),在25℃、磁力搅拌条件下反应4h,其中漆酶溶液和L-苯丙氨酸甲酯盐酸溶液均用pH5.8、0.06mol/L的磷酸二氢钾/磷酸氢二钾(KH2PO4/K2HPO4)缓冲溶液配制。反应完成后,将混合溶液转入透析袋中,在pH为5.0、浓度为0.2mol/L的磷酸氢二钾/柠檬酸缓冲溶液中室温下透析12h除掉多余的L-色氨酸甲酯盐酸盐和EDC,得到改性后漆酶溶液,定容到25mL,冷冻保存备用,漆酶活性和半衰期测定按照实施例1所述方法进行。漆酶活性和半衰期数据见表1。
从表1中的数据可以看出经过L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐处理的漆酶活性和半衰期分别增加了85.9%和119.5%,说明改性处理后的漆酶不但热稳定提高了,其活性也提高了。可见,经过本发明的改性方法,改性漆酶能够耐受较复杂的环境,提高了其在工业上的应用潜能。
实施例4改性漆酶在再生植物纤维改性中的应用
再生植物纤维经过了制浆造纸全过程,其抄造纸页的强度性能大幅度下降,限制了其回收利用。为了提高再生植物纤维的回用潜能,目前有多种方法对其进行改性处理,从而提高其强度性能。其中漆酶及漆酶介体体系改性处理方法具有其明显的优点(反应条件温和;对纤维造成的损伤很少;对环境不会造成二次污染),使其成为再生植物纤维改性方法的首选。
再生植物纤维漆酶改性步骤:
向相当于绝干浆为24g的OCC浆中加入0.024g的漆酶和0.12g组氨酸,与水进行混合,使最终的浆浓为5%,用0.1mol/L的NaHCO3溶液调节pH=7。
在搅拌条件下进行反应,反应在室温下进行,反应时间为120min。
反应结束后,用水进行洗涤过滤,直至滤液呈无色。
所得浆样在密封袋中平衡水分后,一部分用于测定浆样水分含量。其余用于抄造纸页,所得纸页用于测定纸张的各种强度。
表3原漆酶和改性漆酶对再生植物纤维强度性能的影响
从表3可以看出,与未加入漆酶处理再生植物纤维相比,加入原漆酶和改性漆酶后再生植物纤维各项强度性能均有明显提高。与加入相同量的原漆酶相比,加入改性漆酶后的再生植物纤维所抄造纸页的抗张强度、耐破强度、撕裂强度分别提高了20.5%、14.6%和12.0%。因此使用改性漆酶对再生植物纤维进行改性处理,不但可以提高纸页的物理强度性能,而且可以减少漆酶使用量,这对于当前制浆造纸工程行业推行的节能减排具有重大的意义。
成本分析
采用本发明的改性方法来处理一千克漆酶的费用分析。
表4本发明方法处理一千克漆酶费用分析
表5采用丁二酸酐的改性方法来处理一千克漆酶的费用分析。
从表4和表5可以看出,本发明方法处理一千克漆酶费用为16元,要低于采用丁二酸酐改性法(25.5元)。
Claims (10)
1.一种基于氨基酸末端羧基的漆酶改性方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)向原漆酶水溶液中加入L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐水溶液和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液 ,进行反应;
(2)反应完成后,用醋酸/醋酸钠缓冲溶液或磷酸氢二钾/柠檬酸缓冲溶液透析,得到改性后的漆酶。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(1)所述原漆酶水溶液中溶质原漆酶来源于可以产生漆酶的植物、真菌或细菌中任一种,包括如桃树、灵芝、嗜热菌、曲霉菌或毛栓菌。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(1)所述L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐用量为相对于原漆酶固体量的质量百分数0.001%-10%。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(1)所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐用量为相对于原漆酶固体量的质量百分数0.001%-2%。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(1)所述原漆酶水溶液和L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐水溶液均用pH为 2.0-6.5的磷酸二氢钾/磷酸氢二钾(KH2PO4/ K2HPO4)缓冲溶液配制。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(1)所述反应的温度为2-25℃,所述反应的反应时间为0.5-12 h。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(1)所述反应是在搅拌条件下进行。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(2)所述醋酸/醋酸钠缓冲溶液或磷酸氢二钾/柠檬酸缓冲溶液的pH为3.5-6.0。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(2)所述透析的时间为12-72 h。
10.权利要求1所述的一种基于氨基酸末端羧基的漆酶改性方法所制得的改性后的漆酶应用于再生植物纤维改性。
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