CN101724017A - L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了通式I所示的L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物，经检测具有较好的PPAR激动活性，是优良的抗糖尿病先导化合物，可进一步开发制备成抗糖尿病药物，在糖尿病治疗领域具有潜在、广阔的应用前景；本发明还提供了所述L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物的制备方法，将L-对硝基苯丙氨酸甲酯盐酸盐与保护氨基酸在缩合剂的作用下偶联即得，反应条件温和，后处理方便，收率高，成本低。

Description

L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种二肽衍生物，特别涉及L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物，还涉及其制备方法和在医药方面的应用。

背景技术

糖尿病(Diabetes Mellitus)是一种以高血糖为主要特征、严重危害健康的内分泌代谢疾病，是世界上第三大非传染性慢性疾病。据国际糖尿病联盟(IDF)最新数据显示，2007年全球约有2.39亿糖尿病患者。预计2010年糖尿病患者将达到2.46亿，2025年将达到3.8亿，即成年人口的7.1％。目前，中国糖尿病患者人数已居世界第二位，预计2025年将达到5931万。2006年，糖尿病位居中国住院患者病因第十位、城市居民死亡原因第六位。因此，糖尿病的防治是国际糖尿病界研究的重大课题。

目前抗糖尿病药物种类繁多，类型各异，临床上使用的II型糖尿病治疗药物主要有磺酰脲类和非磺酰脲类促胰岛素分泌剂、双胍类、噻唑烷二酮类等胰岛素增敏剂、肝糖生成抑制剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂及新型降糖药二肽基肽酶-IV(DPP-IV)抑制剂，但这些药物的治疗效果还不理想或存在较大副作用，因此，研发具有新颖化学结构、高效低毒的糖尿病药物仍然是糖尿病防治工作中的重要任务。

核过氧化酶增殖体激活受体(PPAR)是配体激活转录因子，属于核受体基因家族，在调节血糖、胰岛素敏感性、脂肪贮存与代谢等方面起着至关重要的作用。PPAR有3种亚型：PPARα、PPARδ、PPARγ，其中PPARγ的激活可以提高胰岛素敏感性，减少炎症的发生，降低游离脂肪酸的脂质浓度以及降低血压。近年来突破传统治疗药物的基本结构，研制开发以PPAR为靶点的新型抗糖尿病药物已成为药物研究的一大热点。

葛兰素公司合成了一系列新型的L-酪氨酸衍生物，其中包括GI 262570、GW1929和GW 7845。活性测定发现此类化合物的PPARγ结合活性比噻唑烷二酮类高出10～100倍，其中部分化合物的活性已经达到0.1nmol/L数量级，是迄今为止发现的最强的合成PPARγ激动剂。此外，HQL-975等类型的衍生物也陆续被合成出来。

L-苯丙氨酸是人体必需但自身无法合成的八大氨基酸之一，也是一种重要的医药和食用化学品中间体，用于制备氨基酸输液、复合氨基酸制剂、营养强化剂、氨基酸类抗癌药物、肾上腺素、甲状腺素、黑色素和甜味剂阿斯巴甜等。新型的餐时血糖调节剂那格列奈(Nateglinide)是苯丙氨酸衍生物，直接作用于胰腺β细胞，促使其释放胰岛素，能有效控制餐时血糖水平，起效快，作用时间短。此外，文献报道，L-对硝基苯丙氨酸作为天然氨基酸的替代物可用于研究tRNA运转核糖核酸，也可作为生物物理探针应用于蛋白质结构与功能的研究，并且在某些不对称催化方面表现出优异的活性。因此，L-对硝基苯丙氨酸及其衍生物有广阔的应用前景。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物；目的之二在于提供所述L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物的制备方法；目的之三在于提供所述L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物在医药方面的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物，具有通式I所示结构：

其中，X为

R₁为H或-CH₃，R₂为9-芴甲氧羰基(Fmoc)、苄氧羰基、对甲苯磺酰基、对氯苯磺酰基或对溴苯磺酰基，R₃为H、-CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)CH₂CH₃、-CH₂C₆H₅、-CH₂(C₆H₄(4-OH))、-CH₂OC(CH₃)₃、-CH(CH₃)OC(CH₃)₃、-CH₂CH₂SCH₃、-CH₂SC(C₆H₅)₃、-CH₂CH₂CO₂C(CH₃)₃或-CH₂CO₂C(CH₃)₃；

或者，R₁为H，R₂为H，R₃为H、-CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)CH₂CH₃、-CH₂C₆H₅、-CH₂(C₆H₄(4-OH))、-CH₂OC(CH₃)₃、-CH(CH₃)OC(CH₃)₃、-CH₂CH₂SCH₃、-CH₂SC(C₆H₅)₃、-CH₂CH₂CO₂C(CH₃)₃或-CH₂CO₂C(CH₃)₃。

进一步，所述R₁为H或-CH₃，R₂为9-芴甲氧羰基，R₃为H、-CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)CH₂CH₃、-CH₂C₆H₅、-CH₂(C₆H₄(4-OH))、-CH(CH₃)OC(CH₃)₃或-CH₂SC(C₆H₅)₃；

进一步，所述R₃为H、-CH(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)₂或-CH(CH₃)CH₂CH₃；

进一步，所述R₁为-CH₃，R₃为-CH(CH₃)₂；

进一步，所述R₁为H，R₂为H，R₃为H、-CH₂CH(CH₃)₂或-CH₂C₆H₅。

2、所述L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物的制备方法，包括以下步骤：

a、将L-对硝基苯丙氨酸甲酯盐酸盐与通式II所示保护氨基酸在缩合剂的作用下偶联，得通式I-1所示化合物；化学反应式如下：

b、将通式I-1所示化合物在弱碱性条件下水解，得通式I-2所示化合物；化学反应式如下：

或者，将通式I-1所示化合物在强碱性条件下水解，得通式I-3a所示化合物或结构式I-3b所示化合物；化学反应式如下：

在通式I-1、I-2、I-3a和II中，X、R₁、R₂和R₃具有通式I中所述定义。

进一步，步骤a中所述缩合剂为N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)和N，N’-二异丙基乙胺(DIPEA)的组合物；

进一步，步骤b中所述弱碱性条件为浓度为1mol/L的氢氧化锂；所述强碱性条件为浓度为2mol/L的氢氧化锂；

进一步，步骤a中所述L-对硝基苯丙氨酸甲酯盐酸盐的制备方法包括以下步骤：

①将体积比为1∶1.25～1.5的浓硝酸与浓硫酸的混合液冷却至温度0℃，分批缓慢加入L-苯丙氨酸，L-苯丙氨酸与浓硝酸的投料摩尔比为1∶1.3，加毕，温度0℃搅拌反应60分钟，再升温至室温搅拌反应60分钟，反应完毕后，加入冰水混合物，搅拌冷却至温度0℃，再在冰浴条件下用浓氨水调节pH至6，析出沉淀，过滤，滤饼洗涤，干燥，得L-对硝基苯丙氨酸；

②将无水甲醇冷却至温度0℃，缓慢加入氯化亚砜，加毕，温度0℃搅拌反应20分钟，分批加入L-对硝基苯丙氨酸，搅拌至原料逐渐溶解呈白色浑浊液，再升温至70℃搅拌反应，待L-对硝基苯丙氨酸反应完毕后，减压旋转蒸馏至干，残余物加入甲醇使溶解再减压旋转蒸馏至干，重复操作3次，最后真空干燥，得L-对硝基苯丙氨酸甲酯盐酸盐。

3、所述L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物在制备抗糖尿病药物中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物，经检测具有较好的PPAR激动活性，是优良的抗糖尿病先导化合物，可进一步开发制备成抗糖尿病药物，在糖尿病治疗领域具有潜在、广阔的应用前景；本发明还提供了所述L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物的制备方法，反应条件温和，后处理方便，收率高，成本低。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。

主要试剂和仪器：保护氨基酸Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Thr(t-Bu)-OH、Fmoc-Tyr-OH和Fmoc-Cys(Trt)-OH(成都凯泰新技术有限责任公司)，DIC(山东淄博畅顺工贸有限公司)、HOBt(化学纯，成都凯泰新技术有限责任公司)，DIPEA(化学纯，浙江新德化工有限公司)，四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯、石油醚和甲醇等(分析纯，重庆川东化工有限公司)；熔点测定仪(X-6型，北京福凯仪器有限公司)，核磁共振仪(AV-300型，德国Bruker公司；TMS为内标)，傅里叶变换红外光谱仪(Spectrum GX型，美国Perkin Elmer公司)，大气压电喷雾离子源(API-ES)质谱仪(LC-MSD-1100型，美国Agilent公司)。

实施例1、L-对硝基苯丙氨酸(化合物III)的制备

L-对硝基苯丙氨酸可直接从市场上购得，也可自行制备。本发明采用如下改进方法制得：在圆底烧瓶中，加入体积比为1∶1.3的浓硝酸与浓硫酸的混合液，冰浴冷却至温度0℃，分批缓慢加入L-苯丙氨酸，L-苯丙氨酸与浓硝酸的投料摩尔比为1∶1.3，加毕，温度0℃搅拌反应60分钟，再升温至室温搅拌反应60分钟，反应完毕后，加入少量冰水混合物，搅拌冷却至温度0℃，再在冰浴条件下用浓氨水调节pH至6，析出大量沉淀，冷藏，过滤，滤饼依次用冰水和乙醇洗涤，干燥，得L-对硝基苯丙氨酸；m.p.229.0～231.2℃；[α]_D+7.8°；IR(KBr，ν_max/cm^-1)：3297(s)，2896(bs)，1570(s)，1666(s)，1348(s)，1536(s)，877(s)；ESIMS(m/z)：[M+H]⁺211(100％)，[L-Phe]⁺165(20％)；L-Boc-Phe(p-NO₂)-OH的¹HNMR(CDCl₃，δ/ppm)：1.42(s，9H)，3.17-3.22(m，1H)，3.43-3.51(m，1H)，4.65-4.68(m，1H，CH)，4.97-4.99(m，1H)，7.37(d，2H，J＝8.5Hz)，8.18(d，2H，J＝8.5Hz)。

本发明从反应温度、混酸比例、原料投料比、后处理pH值四个方面对L-对硝基苯丙氨酸的制备方法进行了优化，建立了最佳制备条件，并通过放大实验证实了方法的可靠性。

1、反应温度的影响

本发明考察了两种反应温度控制方式：①先在温度0℃条件下投料并保温反应1小时，再在温度0、20、30、40或60℃条件下保温反应1小时，结果见表1，产物收率为53.2％～58.6％，各组之间相差不大，推测L-苯丙氨酸在加料之后的1小时内基本反应完全，后续反应温度对反应无较大影响。②直接在温度0、20、30、40或60℃条件下投料并保温反应2小时，结果见表2，产物收率为47.3％～63.8％，各组之间有较大差别，0℃的反应收率为63.8％，而60℃的反应收率仅47.3％且产物色泽较差。究其原因，可能是该反应为放热反应，降温有利于反应进行，但温度较低时体系粘度较大，会影响搅拌效果且延长反应时间；而升高温度时苯环发生多取代的可能性增加，会降低产物收率且影响产物质量。因此，优选反应温度为：先在温度0℃条件下投料并保温反应1小时，再升温至室温反应1小时。

表1反应温度的影响(1)

表2反应温度的影响(2)

2、混酸比例的影响

固定L-苯丙氨酸与浓硝酸的比例，改变浓硫酸的用量来选择混酸比例，将8mmol的L-苯丙氨酸分批缓慢加入到冰浴冷却至温度0℃的混酸中，加毕，温度0℃搅拌反应1小时，再升温至室温，搅拌反应1小时，结果见表3，当浓硝酸与浓硫酸的体积比为1∶1.25和1∶1.5时，产物收率相对较高；当浓硝酸与浓硫酸的体积比为1∶1和1∶2时，产物收率相差不大，但产物颜色随着浓硫酸用量的增加而逐渐加深。因此，优选浓硝酸与浓硫酸的体积比为1.25～1.5。

表3混酸比例的影响

3、原料投料比的影响

固定浓硝酸与浓硫酸的体积比为1∶1.3来选择L-苯丙氨酸与混酸的比例，将8mmol的L-苯丙氨酸分批缓慢加入到冰浴冷却至温度0℃的混酸中，加毕，温度0℃搅拌反应1小时，再升温至室温，搅拌反应1小时，结果见表4，当L-苯丙氨酸与浓硝酸的投料摩尔比为1∶1.3时，产物收率达到75.0％；随着混酸量的增加，产物收率有下降趋势且产物颜色加深，可能是生成了多硝化产物。因此，优选L-苯丙氨酸与浓硝酸的投料摩尔比为1∶1.3。

表4原料投料比的影响

4、后处理pH的影响

苯丙氨酸是两性分子，硝化后分子的两性本性没有改变，但pI值会有所变化，可以用浓氨水调节反应液的pH使产物析出。后处理pH的优化实验结果见表5，当pH为4～5时，产物收率最低；当pH为5～6时，产物收率最高；当pH为6～8时，产物收率稍有降低；当pH大于8时，产物收率明显降低。因此，优选后处理pH为6。

表5后处理pH的影响

根据上述研究结果，得出L-对硝基苯丙氨酸的最佳制备条件为：①先在温度0℃条件下投料并保温反应1小时，再升温至室温反应1小时；②浓硝酸与浓硫酸的体积比为1.25～1.5；③L-苯丙氨酸与浓硝酸的投料摩尔比为1∶1.3；④后处理pH为6。

5、放大实验

在上述最佳制备条件下进行放大实验，结果见表6，产物收率高达83.4％，且收率稳定。

表6放大实验结果

实施例2、L-对硝基苯丙氨酸甲酯盐酸盐(化合物IV)的制备

L-对硝基苯丙氨酸甲酯盐酸盐可直接从市场上购得，也可自行制备。本发明采用如下改进方法制得：在圆底烧瓶中加入无水甲醇，冰浴冷却至温度0℃，缓慢加入氯化亚砜，加毕，温度0℃搅拌反应20分钟，分批加入化合物III即L-对硝基苯丙氨酸，搅拌至原料逐渐溶解呈白色浑浊液，再升温至70℃搅拌反应，可见原料很快全部溶解呈黄色澄清液，用薄层色谱法(TLC)监测反应进程；待L-对硝基苯丙氨酸反应完毕后，减压旋转蒸馏至干，残余物加入适量甲醇使溶解再减压旋转蒸馏至干，重复操作3次，最后真空干燥，得L-对硝基苯丙氨酸甲酯盐酸盐。制备条件及结果见表7。

表7L-对硝基苯丙氨酸甲酯盐酸盐的制备条件及结果

文献报道的众多合成氨基酸甲酯盐酸盐的方法中，在后处理时一般采用加入大量乙醚来析出产物沉淀，或采用无水乙醇和无水乙醚反复重结晶来纯化产物，但是用乙醚析出产物沉淀常常不完全，而反复重结晶易造成产物损失。本发明方法采用先减压蒸馏除去过量氯化亚砜，再加入甲醇溶解并减压旋转蒸馏以除去残留的氯化亚砜、氯化氢以及二氧化硫等杂质，产物纯度和收率都较高。

实施例3、L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物Fmoc-AA-Phe(p-NO₂)-OMe的制备

通法：将Fmoc-AA-OH(20mmol)溶于无水THF 10mL中，冰浴、搅拌下加入HOBt(24mmol)、DIC(24mmol)和DIPEA(20mmol)，加毕，冰浴下搅拌反应30～60分钟，用TLC法监测活化酯生成情况；将化合物IV即L-对硝基苯丙氨酸甲酯盐酸盐(20mmol)溶于无水THF 15mL中，加入DIPEA(30mmol)，搅拌，备用；将上述两种溶液混合，室温下搅拌反应，用TLC法监测反应进程；反应完毕后，减压蒸馏除去THF，向残余液中加入水150mL，用乙酸乙酯150mL萃取，分别收集水层和有机层，水层再用乙酸乙酯80mL萃取，合并所有有机层，依次用质量分数为10％的柠檬酸水溶液(150mL×2)、浓度为0.5mol/L的碳酸氢钠水溶液(150mL×2)、饱和氯化钠水溶液(150mL×2)洗涤，再用无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析纯化，得Fmoc-AA-Phe(p-NO₂)-OMe。制备条件及结果见表8。

表8Fmoc-AA-Phe(p-NO₂)-OMe的制备条件及结果

*在制备过程中，由于Gly的活化酯及其偶联产物在THF中的溶解性较差，故加入少量N，N-二甲基甲酰胺(DMF)作为溶剂，使反应能在均相体系中进行。

所得化合物的结构表征数据如下：

Fmoc-Gly-Phe(p-NO₂)-OMe：2-(2-((9H-芴甲氧基)羰基氨基)乙酰氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸甲酯

m.p.182.2～183.1℃；¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ：8.40(d，J＝7.7Hz，1H，H-12)，8.12(d，J＝8.1Hz，2H，H-2)，7.88(d，J＝7.3Hz，2H，H-20)，7.70(d，J＝7.2Hz，2H，H-17)，7.49(m，3H，H-3，H-9)，7.41(t，2H，H-19)，7.32(t，2H，H-18)，4.59(t，1H，H-15)，4.25～4.21(m，3H，H-6，H-14)，3.62(s，3H，H-8)，3.58(s，2H，H-11)，3.20～3.07(m，2H，H-5)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δ：171.5(C＝O，C-7)，169.3(C＝O，C-10)，156.4(C＝O，C-13)，146.6(C-1)，145.5(C-4)，143.8(C-16)，140.7(C-21)，130.6(C-3)，127.7(C-19)，127.1(C-20)，125.2(C-18)，123.3(C-2)，120.1(C-17)，65.7(C-14)，52.9(C-6)，52.1(C-8)，46.6(C-15)，43.1(C-12)，36.4(C-5)。

Fmoc-Ala-Phe(p-NO₂)-OMe：2-(2-((9H-芴甲氧基)羰基氨基)丙酰氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸甲酯

m.p.177.6～178.1℃；¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ：8.39(d，J＝7.6Hz，1H，H-12)，8.12(d，J＝8.3Hz，2H，H-2)，7.8(d，J＝7.4Hz，2H，H-20)，7.71(d，J＝3.5Hz，2H，H-17)，7.51(d，J＝7.6Hz，3H，H-3，H-9)，7.42(t，2H，H-19)，7.32(t，2H，H-18)，4.57(m，1H，H-15)，4.22(d，J＝6.4，2H，H-14)，4.05(t，2H，H-6，H-11)，3.61(s，3H，H-8)，3.24～3.10(m，2H，H-5)，1.7(d，J＝7.0Hz，3H，H-22)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δ：172.7(C＝O，C-7)，171.4(C＝O，C-10)，155.5(C＝O，C-13)，146.3(C-1)，145.5(C-4)，143.9，143.7(C-16)，140.7(C-21)，130.5(C-3)，127.6(C-19)，127.0(C-20)，125.2(C-18)，123.2(C-2)，120.0(C-17)，65.8(C-14)，52.8(C-11)，52.0(C-6)，49.7(C-8)，46.6(C-15)，36.2(C-5)，19.0(C-22)。

Fmoc-Val-Phe(p-NO₂)-OMe：2-(3-甲基-2-((9H-芴甲氧基)羰基氨基)丁酰氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸甲酯

m.p.189.7℃～191.3℃；¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ：8.49(d，J＝7.6Hz，2H，H-12)，8.09(d，J＝8.1Hz，2H，H-2)，7.89(d，J＝7.4Hz，2H，H-20)，7.73(d，J＝6.2Hz，2H，H-17)，7.52(d，J＝8.3Hz，2H，H-3)，7.44～7.30(m，5H，H-9，H-18，H-19)，4.58(m，1H，H-11)，4.27～4.20(m，3H，H-14，H-15)，3.83(m，1H，H-6)，3.60(s，3H，H-8)，3.23～3.06(m，2H，H-5)，1.94～1.87(m，1H，H-22)，0.82(d，J＝6.0Hz，6H，H-23)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δ：171.4(2C＝O，C-7，C-10)，155.9(C＝O，C-13)，146.3(C-1)，145.5(C-4)，143.9，143.7(C-16)，140.7(C-21)，130.5(C-3)，127.6(C-19)，127.0(C-20)，125.3(C-18)，123.1(C-2)，120.1(C-17)，65.7(C-14)，60.1(C-11)，52.6(C-6)，51.9(C-8)，46.7(C-15)，38.7(C-5)，30.3C-22)，19.0，18.3(C-23)。

Fmoc-Leu-Phe(p-NO₂)-OMe：2-(4-甲基-2-((9H-芴甲氧基)羰基氨基)戊酰氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸甲酯

m.p.171.3℃～173.2℃；¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ：8.40(d，J＝7.7Hz，2H，H-12)，8.10(d，J＝8.2Hz，2H，H-2)，7.89(d，J＝7.3Hz，2H，H-20)，7.71(d，J＝7.1Hz，2H，H-17)，7.51(d，J＝8.2Hz，2H，H-3)，7.42(t，2H，H-19)，7.40(d，J＝7.6Hz，1H，H-9)，7.32(t，2H，H-18)，4.58(m，1H，H-15)，4.27(d，J＝8.3Hz，2H，H-14)，4.19(t，1H，H-11)，4.01(m，1H，H-6)，3.60(s，3H，H-8)，3.20～3.08(m，2H，H-5)，1.56(m，1H，H-23)，1.34(m，2H，H-22)，0.84(d，J＝6.0Hz，6H，H-24)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δ：173.4(C＝O，C-7)，172.3(C＝O，C-10)，156.7(C＝O，C-13)，147.2(C-1)，146.4(C-4)，144.9、144.6(C-16)，141.6(C-21)，131.5(C-3)，128.5(C-19)，127.9(C-20)，126.2(C-18)，124.1(C-2)，121.0(C-17)，66.4(C-14)，53.797(C-11)，53.5(C-6)，52.9(C-8)，47.6(C-15)，37.1(C-5)，25.0(C-23)，23.8(C-24)。

Fmoc-Ile-Phe(p-NO₂)-OMe：2-(3-甲基-2-((9H-芴甲氧基)羰基氨基)-戊酰氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸甲酯

m.p.177.6℃～178.8℃；¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ：8.49(d，J＝7.5Hz，1H，H-12)，8.08(d，J＝8.1Hz，2H，H-2)，7.88(d，J＝7.3Hz，2H，H-20)，7.72(d，J＝7.0Hz，2H，H-17)，7.51(d，J＝8.1Hz，3H，H-2，H-9)，7.41(t，2H，H-19)，7.32(t，2H，H-18)，4.59(t，1H，H-15)，4.27～4.19(t，3H，H-11，H-14)，3.85(t，1H，H-6)，3.6(s，3H，H-8)，3.21～3.07(m，2H，H-5)，1.66(m，1H，H-22)，1.34(m，2H，H-24)，1.00(d，J＝6.4Hz，3H，H-23)，0.78(t，3H，H-25)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δ：174.7(C＝O，C-7)，171.5(C＝O，C-10)，155.9(C＝O，C-13)，146.3(C-1)，145.6(C-4)，144.0、143.7(C-16)，140.8(C-21)，130.6(C-3)，127.7(C-19)，127.1(C-20)，125.4(C-18)，123.2(C-2)，120.2(C-17)，65.7(C-14)，59.0(C-11)，52.7(C-6)，52.0(C-8)，46.8(C-15)，36.2(C-5)，25.0(C-22)，23.4(C-24)，15.1(C-23)，10.8(C-25)。

Fmoc-Phe-Phe(p-NO₂)-OMe：2-(3-苯基-2-((9H-芴甲氧基)羰基氨基)丙酰氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸甲酯

m.p.186.7℃～188.6℃；¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ：8.56(d，J＝7.7Hz，1H，H-12)，8.11(d，J＝8.4Hz，2H，H-2)，7.88(d，J＝7.4Hz，2H，H-20)，7.64～7.59(m，3H，H-9，H-17)，7.52(d，J＝8.4Hz，2H，H-3，H-9)，7.40(t，2H，H-19)，7.33～7.18(m，7H，H-18，H-24～H-26)，4.64(m，1H，H-11)，4.16～4.10(m，4H，H-6，H-14，H-15)，3.62(s，3H，H-8)，3.22～3.10(m，2H，H-5)，2.92～2.73(m，2H，H-22)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δ：171.8(C＝O，C-7)，171.4(C＝O，C-10)，155.7(C＝O，C-13)，146.3(C-1)，145.4(C-4)，143.8，143.7(C-16)，140.7(C-21)，138.0(C-23)，130.6(C-3)，129.2(C-25)，128.0(C-24)，127.6(C-19)，127.0(C-20)，126.3(C-26)，125.7(C-18)，123.2(C-2)，120.1(C-17)，65.6(C-14)，55.8(C-11)，52.8(C-6)，52.1(C-8)，46.5(C-15)，37.3(C-5)，36.2(C-22)。

Fmoc-Pro-Phe(p-NO₂)-OMe：2-(1-((9H-芴甲氧基)羰基)吡咯烷-2-甲酰氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸甲酯

m.p.166.1℃～167.3℃；¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ：8.41(d，J＝7.7Hz，1H，H-12)，8.12(d，J＝8.0Hz，2H，H-2)，7.90(d，J＝7.4Hz，2H，H-20)，7.79(d，J＝8.0Hz，2H，H-17)，7.52(d，J＝8.3Hz，3H，H-2，H-9)，7.40(t，2H，H-19)，7.27(t，2H，H-18)，4.59(t，1H，H-15)，4.26～4.17(m，3H，H-6，H-14)，3.95(t，1H，H-11)，3.58(s，3H，H-8)，3.21～3.04(t，2H，H-24)，2.19～2.04(m，4H，H-22，H-23)。

Fmoc-Thr(t-Bu)-Phe(p-NO₂)-OMe：2-(2-((9H-芴甲氧基)羰基氨基)-3-叔丁氧基丁酰氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸甲酯

m.p.136.8℃～138.1℃；¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ：8.24(d，J＝7.7Hz，1H，H-12)，8.12(d，J＝8.3Hz，2H，H-2)，7.89(d，J＝7.4Hz，2H，H-20)，7.73(d，J＝6.1Hz，2H，H-17)，7.50(d，J＝8.4Hz，2H，H-3)，7.42(t，2H，H-19)，7.31(t，2H，H-18)，6.93(d，J＝9.2Hz，1H，H-9)，4.66(d，J＝9.2Hz，1H，H-11)，4.33～4.21(m，3H，H-14，H-15)，3.97(t，1H，H-6)，3.75～3.72(m，1H，H-22)，3.61(s，3H，H-8)，3.21～3.10(m，2H，H-5)，1.11(s，3H，H-23)，1.03(s，9H，H-25)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δ：171.2(C＝O，C-7)，169.7(C＝O，C-10)，155.8(C＝O，C-13)，146.4(C-1)，145.2(C-4)，144.0，143.6(C-16)，140.7(C-21)，130.6(C-3)，127.6(C-19)，127.0(C-20)，125.3(C-18)，123.3(C-2)，120.1(C-17)，73.7(C-24)，67.5(C-22)，65.8(C-14)，59.6(C-11)，52.7(C-6)，52.0(C-8)，46.7(C-15)，36.5(C-5)，28.0(C-25)，19.2(C-23)。

Fmoc-Tyr-Phe(p-NO₂)-OMe：2-(2-((9H-芴甲氧基)羰基氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酰氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸甲酯

m.p.171.8～174.7℃；¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ：8.41(d，J＝7.7Hz，1H，H-12)，8.11(d，J＝8.0Hz，2H，H-2)，7.87(d，J＝7.3Hz，2H，H-20)，7.64(d，J＝7.0Hz，2H，H-17)，7.58(d，J＝8.9Hz，1H，H-9)，7.52(d，J＝8.2Hz，2H，H-3)，7.40(t，2H，H-19)，7.30(t，2H，H-18)，7.17(d，J＝7.8Hz，2H，H-24)，6.80(d，J＝7.8Hz，2H，H-25)，4.62(t，1H，H-15)，4.23～4.10(m，4H，H-6，H-11，H-14)，3.62(s，3H，H-8)，3.21～3.11(m，2H，H-5)，2.88～2.70(m，2H，H-22)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δ：171.8(C＝O，C-7)，171.4(C＝O，C-10)，155.7(C＝O，C-13)，153.4(C-26)，146.3(C-1)，145.4(C-4)，143.7(C-16)，140.7(C-21)，132.5(C-23)，130.6(C-3)，129.7(C-24)，127.7(C-19)，127.1(C-20)，125.3(C-18)，123.2(C-2，25)，120.0(C-17)，65.7(C-14)，55.9(C-11)，52.7(C-6)，52.0(C-8)，46.5(C-15)，36.7(C-22)，36.2(C-5)。

Fmoc-Cys(Trt)-Phe(p-NO₂)-OMe：2-(2-((9H-芴甲氧基)羰基氨基)-3-(三苯甲基巯基)丙酰氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸甲酯

m.p.137.1～140.5℃；¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ：8.36(d，J＝7.7Hz，1H，H-12)，8.02(d，J＝7.9Hz，2H，H-2)，7.89(d，J＝7.4Hz，2H，H-20)，7.73(d，J＝7.1Hz，2H，H-17)，7.66(d，J＝8.7Hz，1H，H-9)，7.45～7.29(m，21H，H-3，H-18，H-19，H-25，H-26，H-27)，4.26～4.23(m，3H，H-14，H-15)，4.04～4.02(m，3H，H-6，H-11)，3.55(s，3H，H-8)，3.21～3.16(m，2H，H-5)，2.29～2.27(m，2H，H-22)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δ：171.4(C＝O，C-7)，170.1(C＝O，C-10)，155.6(C＝O，C-13)，146.2(C-1)，145.4(C-4)，144.3(C-24)，143.9，143.6(C-16)，140.7(C-21)，130.6(C-3)，129.1(C-26)，128.1(C-25)，127.7(C-19)，127.1(C-20)，126.8(C-27)，125.3(C-18)，123.1(C-2)，120.1(C-17)，65.9(C-14)，59.8(C-11)，52.7(C-6)，52.1(C-8)，46.6(C-15)，36.0(C-5)，33.8(C-22)。

由于氨基酸是两性化合物，因此，在将L-对硝基苯丙氨酸与其它氨基酸进行偶联反应之前必须分别对分子中的其它反应基团进行保护。本发明优选保护策略是将L-对硝基苯丙氨酸的羧基用甲酯保护，待偶联氨基酸的氨基用Fmoc保护，再将两种保护的氨基酸进行偶联以得到目标产物。生成酰胺键的缩合方式很多，有活化酯法、混合酸酐法、迭氮物法等，不管采用哪种方法，其关键都是选择适合的缩合剂。缩合剂主要分为碳二亚胺型、苯并三唑鎓盐型、吡啶并三唑鎓盐型、磷酸酯型以及其他类型。本发明在前期研究工作的基础上，优选碳二亚胺型缩合剂使Fmoc-AA-OH生成活性酯的方式进行偶联，同时采用HOBt以降低消旋。

由于L-对硝基苯丙氨酸甲酯盐酸盐中的氨基处于成盐状态，在偶联反应前应通过加碱中和使氨基游离出来。碱的用量过少会使L-对硝基苯丙氨酸甲酯盐酸盐的氨基释放不彻底，不利于酰化反应；但用量过多会使Fmoc-AA-OH的Fmoc发生部分脱除，副产物增多，产物收率降低。实验发现，碱的用量以达到pH为8～9的弱碱性条件为宜。现有方法中常用碱为三乙胺，但三乙胺容易引起消旋，为了减少消旋，本发明中此处的碱优选DIPEA。

实施例4、L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物Fmoc-AA-Phe(p-NO₂)-OH的制备

通法：将Fmoc-AA-Phe(p-NO₂)-OMe(10mmol)溶于THF 20mL中，冰浴、搅拌下加入浓度为1mol/L的氢氧化锂水溶液50mL，加毕，继续搅拌5分钟，再加入乙酸乙酯200mL和浓度为0.3mol/L的盐酸水溶液150mL，继续搅拌5分钟，停止反应，静置分层，分别收集水层和有机层，水层再用乙酸乙酯(80mL×3)萃取，合并所有有机层，用水(80mL×2)洗涤，再用无水硫酸钠干燥，旋转蒸馏除去乙酸乙酯，最后用乙酸乙酯/石油醚重结晶或柱层析纯化，得Fmoc-AA-Phe(p-NO₂)-OH。制备条件及结果见表9。

表9Fmoc-AA-Phe(p-NO₂)-OH的制备条件及结果

所得化合物的化学名和结构式如下：

Fmoc-Gly-Phe(p-NO₂)-OH：2-(2-((9H-芴甲氧基)羰基氨基)-乙酰氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸

Fmoc-Ala-Phe(p-NO₂)-OH：2-(2-((9H-芴甲氧基)羰基氨基)-丙酰氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸

Fmoc-Val-Phe(p-NO₂)-OH：2-(3-甲基-2-((9H-芴甲氧基)羰基氨基)-丁酰氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸

Fmoc-Leu-Phe(p-NO₂)-OH：2-(4-甲基-2-((9H-芴甲氧基)羰基氨基)-戊酰氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸

Fmoc-Ile-Phe(p-NO₂)-OH：2-(3-甲基-2-((9H-芴甲氧基)羰基氨基)-戊酰氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸

Fmoc-Phe-Phe(p-NO₂)-OH：2-(3-苯基-2-((9H-芴甲氧基)羰基氨基)-丙酰氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸

Fmoc-Pro-Phe(p-NO₂)-OH：2-(1-((9H-芴甲氧基)羰基)-吡咯烷-2-甲酰氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸

Fmoc-Thr(t-Bu)-Phe(p-NO₂)-OH：2-(2-((9H-芴甲氧基)羰基氨基)-3-叔丁氧基丁酰氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸

Fmoc-Tyr-Phe(p-NO₂)-OH：2-(2-((9H-芴甲氧基)羰基氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酰氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸

实施例5、L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物H-AA-Phe(p-NO₂)-OH的制备以H-Gly-Phe(p-NO₂)-OH：2-(2-氨基乙酰氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸为例：

将Fmoc-Gly-Phe(p-NO₂)-OMe 5.05g(10mmol)溶于THF 15mL中，冰浴、搅拌下加入浓度为2mol/L的氢氧化锂水溶液20mL，加毕，继续搅拌反应，用TLC法监测反应进程，4小时后反应完毕，减压旋转蒸馏浓缩，向残余液中加入水20mL，用石油醚(30mL×3)萃取，弃去石油醚萃取液，收集水层，减压旋转蒸馏浓缩，再在冰浴下滴加浓度为2mol/L的盐酸水溶液，调节pH至5，析出白色固体，抽滤，真空干燥，得H-Gly-Phe(p-NO₂)-OH 2.19g，收率为81.2％。

参照上述方法，可制得本发明其它H-AA-Phe(p-NO₂)-OH。

实施例6、L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物的抗糖尿病活性检测

本发明将制备的L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物进行PPAR激动活性检测，发现此类化合物具有较好的PPAR激动活性，是优良的抗糖尿病先导化合物，可进一步开发制备成抗糖尿病药物。具体检测方法和检测结果如下：

将转染了含有PPAR基因和萤火虫荧光素酶(Luc)报告基因的质粒pPPRE-Luc的人肝癌细胞(HepG2)接种于96孔板，培养过夜后换用含有待测样品的低糖DMEM培养基，同时设置空白对照(培养基中不加入待测样品)和阳性对照(培养基中加入PPARγ受体激动剂吡格列酮)，每组设双复孔，培养24小时后检测荧光素酶活性(即化学发光强度L值)，重复测定两次，按照下述公式计算激动率：绝对激动率(％)＝(L_样品/L_空白-1)×100；相对激动率(％)＝样品的绝对激动率/阳性对照的绝对激动率×100；相对激动率大于70％的待测样品进一步测定半数效应浓度(EC50)，应用Xlfit软件中的4 Parameter Logistic Model计算EC50。

表10、L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物的激动率测定结果

表11、EC50测定结果

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (10)

1.L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物，其特征在于：具有通式I所示结构：

其中，X为

R₁为H或-CH₃，R₂为9-芴甲氧羰基、苄氧羰基、对甲苯磺酰基、对氯苯磺酰基或对溴苯磺酰基，R₃为H、-CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)CH₂CH₃、-CH₂C₆H₅、-CH₂(C₆H₄(4-OH))、-CH₂OC(CH₃)₃、-CH(CH₃)OC(CH₃)₃、-CH₂CH₂SCH₃、-CH₂SC(C₆H₅)₃、-CH₂CH₂CO₂C(CH₃)₃或-CH₂CO₂C(CH₃)₃；

或者，R₁为H，R₂为H，R₃为H、-CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)CH₂CH₃、-CH₂C₆H₅、-CH₂(C₆H₄(4-OH))、-CH₂OC(CH₃)₃、-CH(CH₃)OC(CH₃)₃、-CH₂CH₂SCH₃、-CH₂SC(C₆H₅)₃、-CH₂CH₂CO₂C(CH₃)₃或-CH₂CO₂C(CH₃)₃。

2.根据权利要求1所述的L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物，其特征在于：所述R₁为H或-CH₃，R₂为9-芴甲氧羰基，R₃为H、-CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)CH₂CH₃、-CH₂C₆H₅、-CH₂(C₆H₄(4-OH))、-CH(CH₃)OC(CH₃)₃或-CH₂SC(C₆H₅)₃。

3.根据权利要求2所述的L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物，其特征在于：所述R₃为H、-CH(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)₂或-CH(CH₃)CH₂CH₃。

4.根据权利要求3所述的L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物，其特征在于：所述R₁为-CH₃，R₃为-CH(CH₃)₂。

5.根据权利要求1所述的L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物，其特征在于：所述R₁为H，R₂为H，R₃为H、-CH₂CH(CH₃)₂或-CH₂C₆H₅。

6.权利要求1所述的L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、将L-对硝基苯丙氨酸甲酯盐酸盐与通式II所示保护氨基酸在缩合剂的作用下偶联，得通式I-1所示化合物；化学反应式如下：

b、将通式I-1所示化合物在弱碱性条件下水解，得通式I-2所示化合物；化学反应式如下：

或者，将通式I-1所示化合物在强碱性条件下水解，得通式I-3a所示化合物或结构式I-3b所示化合物；化学反应式如下：

在通式I-1、I-2、I-3a和II中，X、R₁、R₂和R₃具有通式I中所述定义。

7.根据权利要求6所述的L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物的制备方法，其特征在于：步骤a中所述缩合剂为N，N’-二异丙基碳二亚胺、1-羟基苯并三氮唑和N，N’-二异丙基乙胺的组合物。

8.根据权利要求6所述的L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物的制备方法，其特征在于：步骤b中所述弱碱性条件为浓度为1mol/L的氢氧化锂；所述强碱性条件为浓度为2mol/L的氢氧化锂。

9.根据权利要求6所述的L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物的制备方法，其特征在于：步骤a中所述L-对硝基苯丙氨酸甲酯盐酸盐的制备方法包括以下步骤：

①将体积比为1∶1.25～1.5的浓硝酸与浓硫酸的混合液冷却至温度0℃，分批缓慢加入L-苯丙氨酸，L-苯丙氨酸与浓硝酸的投料摩尔比为1∶1.3，加毕，温度0℃搅拌反应60分钟，再升温至室温搅拌反应60分钟，反应完毕后，加入冰水混合物，搅拌冷却至温度0℃，再在冰浴条件下用浓氨水调节pH至6，析出沉淀，过滤，滤饼洗涤，干燥，得L-对硝基苯丙氨酸；

②将无水甲醇冷却至温度0℃，缓慢加入氯化亚砜，加毕，温度0℃搅拌反应20分钟，分批加入L-对硝基苯丙氨酸，搅拌至原料逐渐溶解呈白色浑浊液，再升温至70℃搅拌反应，待L-对硝基苯丙氨酸反应完毕后，减压旋转蒸馏至干，残余物加入甲醇使溶解再减压旋转蒸馏至干，重复操作3次，最后真空干燥，得L-对硝基苯丙氨酸甲酯盐酸盐。

10.权利要求1所述的L-对硝基苯丙氨酸二肽衍生物在制备抗糖尿病药物中的应用。