CN102108353A - 磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶，它是利用硅烷化试剂3-氨丙基-三乙氧基硅烷修饰Fe3O4纳米颗粒，改善它的水溶性和稳定性，并在其表面引入游离的氨基末端，然后以双功能试剂双硫氰苄将碱性蛋白酶固定到硅烷化试剂修饰过的Fe3O4纳米颗粒上得到的磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶，并将该表面功能化的磁性纳米颗粒为载体固定化碱性蛋白酶应用于生物质绿色转化中。本发明简单、易行，并能通过外加磁场迅速便捷的对生物催化剂进行回收利用，有助于生物催化反应连续化规模化生产的实现。
Description
技术领域
本发明属于生物催化和纳米技术领域，具体涉及一种制备磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶的新方法，该方法在动植物蛋白、动植物油脂和植物纤维素等生物质原料高效绿色转化成多肽、脂肪酸酯、糖等产品等领域有着广泛的应用。
背景技术
酶是一种天然的生物催化剂，催化效率极高，反应专一性强，在食品加工、医药等产业有着极为广泛的应用。然而，由于天然酶稳定性差，不易回收再利用，阻碍了它在工业生产中的应用。近年来基于酶的固定化技术制备固定化生物酶，应用于生物质绿色转化领域得到越来越多的关注。与传统的游离酶相比，固定化酶具有稳定性好，可以回收利用以降低成本低等优点，在当前生物检测、绿色转化等领域获得了一定的应用。
对酶进行固定化处理就要求既要很好的保持酶的天然活性、增强天然酶的稳定性，又要便于与反应液分离达到重复利用的效果。在现有的固定化技术中，固定化后的酶在储存或者反应过程中容易泄露、失活，稳定性不好，回收利用的过程比较繁琐。因此研究一种能防止酶的泄露、提高酶的稳定性、能快捷方便回收利用的固定化酶的制备方法在生物质绿色转化领域中将具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶及其制备方法和其在生物质绿色转化中的应用。
本发明制得的磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶具有与游离碱性蛋白酶相媲美的酶学性质，并能够在外加磁场的作用下方便快捷的实现回收再利用。
实现本发明的技术方案是：
(1)磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶的制备：
首先采用化学共沉淀法或高温裂解法合成磁性Fe3O4纳米颗粒(也可以用商品化的磁性Fe3O4纳米颗粒)；再利用硅烷化试剂3-氨丙基-三乙氧基硅烷((3-aminopropl)triethoxysilane，APTES)修饰Fe3O4纳米颗粒，改善它的水溶性和稳定性，并在其表面引入游离的氨基末端；最后以双功能试剂双硫氰苄(1，4-phenylene dllsothlocyanate，PDC)将碱性蛋白酶固定到硅烷化试剂修饰过的Fe3O4纳米颗粒上，得到磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶；
(2)将得到的磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶用于生物质绿色转化：
首先以酪素作为底物，分析了磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶的相对酶活力、最适反应条件、贮存稳定性、可重复利用性，最后将其应用到菜籽饼粕的生物催化中，进行水解度和电泳分析。
本发明用磁性纳米颗粒为载体，双功能试剂为偶联剂制备磁性纳米颗粒固定化蛋白碱性蛋白酶，该磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶具有很好的稳定性、酶不易泄漏、直接用外加磁场进行回收利用，方便快捷，我们基于磁性纳米颗粒制备了磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶，并应用于生物质绿色转化中，催化酪素和菜籽饼粕的水解，检测其催化活性，得到了很好的效果。本发明为固定化酶技术及生物质绿色转化提供了一种新思路。
附图说明
图1：磁性纳米粒子与对硝基苯甲醛反应后水解产物的紫外图谱，曲线a是修饰APTES的四氧化三铁与对硝基苯甲醛反应后水解产物的紫外图谱，在267nm处的吸收值是0.391，表面氨基含量98.48n mol/mg；曲线b是裸的四氧化三铁与对硝基苯甲醛反应后水解产物的紫外图谱。
图2：室温下Fe3O4(a)、APTES-Fe3O4(b)、APTES-Fe3O4-E(c)的磁滞回线；
图3：不同量的碱性蛋白酶在磁性纳米颗粒载体上的固定.碱性蛋白酶的浓度为0.6U/μl；APTES-Fe3O4浓度固定为3.6mg/ml；
图4：磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶(a)与游离碱性蛋白酶(b)的最适反应温度；
图5：磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶(a)与游离碱性蛋白酶(b)的最适反应pH；
图6：磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶(a)与游离碱性蛋白酶(b)的贮存稳定性；
图7：磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶可回收利用的示意图；
图8：磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶降解2S蛋白和菜籽饼粕得到的产物的电泳图。从左至右依次为：I：游离碱性蛋白酶酶解2S蛋白；II：2S蛋白；III：游离碱性蛋白酶酶解菜籽饼粕；IV：菜籽饼粕；Marker；V：磁性纳米颗粒固定化碱性酶酶解菜籽饼粕(固定化酶冰箱放置20天，50mg菜籽饼粕于80℃水浴30min助溶)；VI：磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶酶解菜籽蛋白(新鲜的固定化酶，50mg菜籽饼粕超声助溶)；VII：磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶酶解菜籽蛋白(新鲜的磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶，50mg菜籽饼粕于80℃水浴30min助溶)；VIII：磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶酶解2S蛋白)。
具体实施方式
实施例1
下面以1ml碱性蛋白酶(0.6U/μl)固定在1ml磁性纳米颗粒(3.6mg/ml)上为例对本发明中磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶制备的实施作具体说明。
(1)配制FeSO4(0.06M)和FeCl3(0.1M)的混合溶液，用盐酸调整pH值为1.5，氩气保护，逐滴滴加25％的氨水并剧烈搅拌，直至pH上升至9，继续通入氩气，搅拌0.5h，之后用磁铁分离Fe3O4颗粒，用水洗5遍，乙醇洗2遍，最终得到的颗粒分散在无水乙醇中，颗粒浓度大约是3.45mg/ml(0.015M)。
(2)取出25ml上述Fe3O4的乙醇溶液，分散在50ml乙醇和75ml水中，通入氩气以排除空气，然后超声0.5h，加入适量APTES，搅拌40h后磁性分离，用无水乙醇洗5遍，分散在25ml乙醇中，得到氨基修饰的纳米磁性颗粒(APTES-Fe3O4)，浓度为3.6mg/ml，分别取2ml Fe3O4和2ml APTES-Fe3O4与对硝基苯甲醛反应，定量检测APTES-Fe3O4表面的氨基含量，结果如图1，APTES-Fe3O4表面的氨基含量为98nm/mg。
(3)将步骤(2)中得到的APTES-Fe3O4分散在DMF中，取出1ml该溶液，加入1ml PDC的DMF溶液(浓度为2mg/ml)，摇床振荡反应2h，之后用DMF、甲醇、丙酮、硼酸缓冲液中(0.2M，pH10.5)各洗一遍，再加入1ml浓度为0.6U/μl的碱性蛋白酶酶液，振荡12h，之后用硼酸缓冲液洗5遍，最后将得到的磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶(E-APTES-Fe3O4)分散在硼酸缓冲液中，浓度为8.5mg/ml。用振动磁强计(VSM)表征Fe3O4、APTES-Fe3O4和E-APTES-Fe3O4的磁性性能，结果如图2，三者的剩磁和矫顽力都较小，接近于超顺磁性，有利于对E-APTES-Fe3O4的回收利用；不同量的碱性蛋白酶在磁性纳米颗粒上的固定结果见图3，当加酶量为700ul时磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶的酶活力趋于饱和。
实施例2
下面以本发明的磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶催化酪素和菜籽饼粕的水解为例对该磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶在生物质绿色转化中的应用的实施做具体说明。
(1)磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶对酪素催化活性的检测
采用福林试剂显色的方法检测磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶的催化活性。取出1ml磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶液，40℃预热2min，加入1ml酪素(10mg/ml)，40℃水浴反应10min，加入2ml三氯乙酸(0.4mol/L)，混匀，5000rad离心10min，取出1ml上清，加入5ml Na2CO3溶液(0.4mol/L)，再加入1ml福林试剂(稀释一倍)，40℃水浴显色20min，于680nm波长，用10mm比色皿测出吸光度值，根据公式X＝A×K×V/T×n计算出样品的酶活力(X-样品的酶活力(本实施例中为2776.1832IU/ml)；A-样品平行试验的平均吸光度(用紫外分光光度计检测，本实施例中为0.427)；K-吸光常数(以不同浓度酪氨酸为标准液，用紫外分光光度计检测其吸光度做标准曲线，根据标曲的线性方程计算所得，本实施例中为96.75)；V-反应试剂的总体积(本实施例中为4ml)；T-反应时间(本实施例中为10min)；n-稀释倍数(用硼酸缓冲液稀释磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶的稀释倍数，本实施例中为168))。
在25℃-75℃范围内研究了磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶的最适反应温度：催化酪素反应时，调节催化反应温度，从25℃开始，每上升10℃测一次磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶的催化活性，结果见图4，磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶和游离碱性蛋白酶的最适反应温度都在60℃-65℃之间，但前者比后者的最适反应温度略微高一点，说明该磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶的热稳定性要比游离碱性蛋白酶好。
在pH 6-12之间研究磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶和游离碱性蛋白酶的最适反应pH：调节缓冲液的pH，检测不同pH时催化酪素反应的催化活性，结果见图5，随着pH的升高，磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶和游离碱性蛋白酶的酶活力都相应升高，当pH为10.0时达到最大，之后继续提高pH，两者的酶活力却迅速下降，固定化酶和游离酶的最适反应pH基本保持一致，都在pH10左右，且在pH8-10范围内，均能保持较高的催化活性。
检测磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶和游离碱性蛋白酶的储存稳定性：将磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶和游离碱性蛋白酶放置在4℃的冰箱中，每隔一段时间，取出一部分样品测其酶活力，结果见图6，磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶比游离碱性蛋白酶具备更好的贮存稳定性，能够更好的保持酶活力，并在较长时间内相对稳定。
检测磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶的操作稳定性即重复利用：将磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶与酪素反应后，磁场分离，再重新反应，重复反应7次，结果见图7，在循环7次之后，酶活力依旧能保持原有的52％左右，且逐步趋于稳定，说明磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶有较好的回收利用能力。
(2)磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶对菜籽饼粕水解度的检测
采用水合茚三酮法来检测固定化酶对菜籽饼粕的水解度。将50mg菜籽饼粕溶解在3ml磷酸缓冲液中(pH10.5)，80℃水浴30min帮助其溶解，再加入2ml磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶，50℃水浴反应2h后，将混合溶液放入沸水浴15min，使磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶失活。将混合溶液离心取上清，稀释一定倍数。取出2ml稀释液，加入1ml茚三酮的乙醇溶液，混匀，沸水浴15min后，待其冷却到室温，加入5ml 45％的乙醇，静置15min后，于570nm波长处测出其吸光度值，根据公式水解度＝水解液中的总氨基氮量/水解原料中的总氮量×100％计算出磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶对菜籽蛋白的水解度，结果见图8，从图中可以看到，菜籽饼粕中蛋白呈现一个较宽的分布(通道IV)，其中含有较多的大分子量蛋白，这一点从2S蛋白的电泳图中也可以得到证实(通道II)。加入游离的碱性蛋白酶后，可发现无论是菜籽饼粕(通道III)还是2S蛋白(通道I)，原本大分子蛋白所在的条带都消失了，只在小于10KD的地方出现了条带，这说明两者中的大分子蛋白被碱性蛋白酶降解了。同样，在固定化酶催化体系中也观察到了同样的结果。可以看到，2S蛋白经固定化酶处理后大分子蛋白的条带消失了(通道VIII)。而无论是新鲜制备的固定化酶(通道VII)还是存放了20天的固定化酶(通道V)，均未检测到大分子蛋白的条带。这说明菜籽饼粕中的大分子蛋白确被碱性蛋白酶降解了，最终的酶解液里可能只有小分子的多肽或氨基酸，证明我们的磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶具有较好的催化能力。
Claims (6)
1.一种磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶，其特征在于，它是利用硅烷化试剂3-氨丙基-三乙氧基硅烷修饰Fe3O4纳米颗粒，改善它的水溶性和稳定性，并在其表面引入游离的氨基末端，然后以双功能试剂双硫氰苄将碱性蛋白酶固定到硅烷化试剂修饰过的Fe3O4纳米颗粒上得到的磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶。
2.一种磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶的制备方法，其特征在于：利用硅烷化试剂3-氨丙基-三乙氧基硅烷修饰Fe3O4纳米颗粒，改善它的水溶性和稳定性，并在其表面引入游离的氨基末端，然后以双功能试剂双硫氰苄将碱性蛋白酶固定到硅烷化试剂修饰过的Fe3O4纳米颗粒上，即得到磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶。
3.权利要求1所述的磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶在生物质绿色转化中的应用。
4.权利要求1所述的磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶在菜籽饼粕的生物催化中的应用。
5.根据权利要求2所述的磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶的制备方法，其特征在于，是采用化学共沉淀法或高温裂解法合成磁性Fe3O4纳米颗粒。
6.根据权利要求5所述的磁性纳米颗粒固定化碱性蛋白酶的制备方法，其特征在于，采用化学共沉淀法或高温裂解法合成磁性Fe3O4纳米颗粒的具体方法是：利用FeSO4(0.06M)和FeCl3(0.1M)或Fe(acac)3、Fe(CO)5为原料合成磁性Fe3O4纳米颗粒，FeSO4和FeCl3的摩尔比为1.6∶1。
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Cited By (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102585993A (zh) * | 2012-01-10 | 2012-07-18 | 东北农业大学 | 一种采用固定化酶制取大豆油脂的方法与装置 |
| CN102604925A (zh) * | 2012-03-16 | 2012-07-25 | 清华大学 | 一种磁性酶纳米凝胶生物催化颗粒及其制备方法 |
| CN103397015A (zh) * | 2013-08-15 | 2013-11-20 | 山东师范大学 | 一种可磁力再生的固载化生物酶的制备方法 |
| CN103865916A (zh) * | 2014-03-24 | 2014-06-18 | 吉林大学 | 磁驱固定化酶、制备方法及其在大水体催化中的应用 |
| CN105271430A (zh) * | 2015-09-28 | 2016-01-27 | 江苏振宇环保科技有限公司 | 一种改性超分散四氧化三铁的制备方法 |
| CN106011206A (zh) * | 2016-05-19 | 2016-10-12 | 天津大学 | 用复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶制备活性肽的方法 |
| CN107629862A (zh) * | 2017-09-25 | 2018-01-26 | 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 | 一种用于辅助降血脂的蚕蛹油脂的制备方法 |
| CN107811162A (zh) * | 2017-12-08 | 2018-03-20 | 玉环县五丰蒸干脱脂鱼粉厂 | 一种海产小糠虾脱苦酶解制备易保藏全虾浆的方法及应用 |
| CN107821728A (zh) * | 2017-12-08 | 2018-03-23 | 玉环县五丰蒸干脱脂鱼粉厂 | 一种海产小杂鱼酶解制备富含小肽的全鱼浆的制备方法及应用 |
| CN107821922A (zh) * | 2017-12-08 | 2018-03-23 | 玉环县五丰蒸干脱脂鱼粉厂 | 一种海产小糠虾脱苦酶解制备全虾浆的方法及应用 |
| CN107981028A (zh) * | 2017-12-08 | 2018-05-04 | 玉环县五丰蒸干脱脂鱼粉厂 | 一种易保藏富含小肽的海产小杂鱼酶解全鱼浆的制备方法 |
| CN109182325A (zh) * | 2018-09-03 | 2019-01-11 | 华南理工大学 | 一种磺化聚苯乙烯微球固定化碱性蛋白酶及其制备方法 |
| CN110157741A (zh) * | 2019-04-29 | 2019-08-23 | 华中科技大学 | 一种磁性纳米粒子、其制备方法及在转染试剂中的应用 |
| CN110804605A (zh) * | 2019-05-07 | 2020-02-18 | 宁波大学 | 一种碱性蛋白酶的共交联固定化方法 |
| CN112813060A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-05-18 | 华南理工大学 | 一种磁性纳米核-壳结构载蛋白酶的光酶催化剂及其制备方法和应用 |
| CN116062798A (zh) * | 2023-02-15 | 2023-05-05 | 中国科学技术大学 | 钴酸镧纳米颗粒作为人工纳米蛋白酶的应用 |
| CN117678656A (zh) * | 2024-01-16 | 2024-03-12 | 广东广牧动物保健品有限公司 | 一种含红茶茶多酚的组合物及其制备方法和应用 |
-
2009
- 2009-12-25 CN CN2009102734066A patent/CN102108353A/zh active Pending
Cited By (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102585993A (zh) * | 2012-01-10 | 2012-07-18 | 东北农业大学 | 一种采用固定化酶制取大豆油脂的方法与装置 |
| CN102604925A (zh) * | 2012-03-16 | 2012-07-25 | 清华大学 | 一种磁性酶纳米凝胶生物催化颗粒及其制备方法 |
| CN102604925B (zh) * | 2012-03-16 | 2014-04-02 | 清华大学 | 一种磁性酶纳米凝胶生物催化颗粒及其制备方法 |
| CN103397015A (zh) * | 2013-08-15 | 2013-11-20 | 山东师范大学 | 一种可磁力再生的固载化生物酶的制备方法 |
| CN103397015B (zh) * | 2013-08-15 | 2016-05-04 | 山东师范大学 | 一种可磁力再生的固载化生物酶的制备方法 |
| CN103865916A (zh) * | 2014-03-24 | 2014-06-18 | 吉林大学 | 磁驱固定化酶、制备方法及其在大水体催化中的应用 |
| CN103865916B (zh) * | 2014-03-24 | 2016-02-10 | 吉林大学 | 磁驱固定化酶、制备方法及其在大水体催化中的应用 |
| CN105271430A (zh) * | 2015-09-28 | 2016-01-27 | 江苏振宇环保科技有限公司 | 一种改性超分散四氧化三铁的制备方法 |
| CN105271430B (zh) * | 2015-09-28 | 2016-08-24 | 江苏振宇环保科技有限公司 | 一种改性超分散四氧化三铁的制备方法 |
| CN105271430B8 (zh) * | 2015-09-28 | 2016-10-12 | 宁波市江东林清环保科技有限公司 | 一种改性超分散四氧化三铁的制备方法 |
| CN106011206A (zh) * | 2016-05-19 | 2016-10-12 | 天津大学 | 用复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶制备活性肽的方法 |
| CN107629862A (zh) * | 2017-09-25 | 2018-01-26 | 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 | 一种用于辅助降血脂的蚕蛹油脂的制备方法 |
| CN107821922A (zh) * | 2017-12-08 | 2018-03-23 | 玉环县五丰蒸干脱脂鱼粉厂 | 一种海产小糠虾脱苦酶解制备全虾浆的方法及应用 |
| CN107981028B (zh) * | 2017-12-08 | 2020-10-20 | 玉环市五丰蒸干脱脂鱼粉厂 | 一种易保藏富含小肽的海产小杂鱼酶解全鱼浆的制备方法 |
| CN107811162A (zh) * | 2017-12-08 | 2018-03-20 | 玉环县五丰蒸干脱脂鱼粉厂 | 一种海产小糠虾脱苦酶解制备易保藏全虾浆的方法及应用 |
| CN107981028A (zh) * | 2017-12-08 | 2018-05-04 | 玉环县五丰蒸干脱脂鱼粉厂 | 一种易保藏富含小肽的海产小杂鱼酶解全鱼浆的制备方法 |
| CN107821728A (zh) * | 2017-12-08 | 2018-03-23 | 玉环县五丰蒸干脱脂鱼粉厂 | 一种海产小杂鱼酶解制备富含小肽的全鱼浆的制备方法及应用 |
| CN107821922B (zh) * | 2017-12-08 | 2020-10-27 | 玉环市五丰蒸干脱脂鱼粉厂 | 一种海产小糠虾脱苦酶解制备全虾浆的方法及应用 |
| CN107821728B (zh) * | 2017-12-08 | 2020-10-20 | 玉环市五丰蒸干脱脂鱼粉厂 | 一种海产小杂鱼酶解制备富含小肽的全鱼浆的制备方法及应用 |
| CN109182325A (zh) * | 2018-09-03 | 2019-01-11 | 华南理工大学 | 一种磺化聚苯乙烯微球固定化碱性蛋白酶及其制备方法 |
| CN110157741A (zh) * | 2019-04-29 | 2019-08-23 | 华中科技大学 | 一种磁性纳米粒子、其制备方法及在转染试剂中的应用 |
| CN110157741B (zh) * | 2019-04-29 | 2021-07-27 | 华中科技大学 | 一种磁性纳米粒子、其制备方法及在转染试剂中的应用 |
| CN110804605A (zh) * | 2019-05-07 | 2020-02-18 | 宁波大学 | 一种碱性蛋白酶的共交联固定化方法 |
| CN110804605B (zh) * | 2019-05-07 | 2023-03-17 | 宁波大学 | 一种碱性蛋白酶的共交联固定化方法 |
| CN112813060A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-05-18 | 华南理工大学 | 一种磁性纳米核-壳结构载蛋白酶的光酶催化剂及其制备方法和应用 |
| CN112813060B (zh) * | 2020-12-31 | 2023-08-18 | 华南理工大学 | 一种磁性纳米核-壳结构载蛋白酶的光酶催化剂及其制备方法和应用 |
| CN116062798A (zh) * | 2023-02-15 | 2023-05-05 | 中国科学技术大学 | 钴酸镧纳米颗粒作为人工纳米蛋白酶的应用 |
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| CN117678656A (zh) * | 2024-01-16 | 2024-03-12 | 广东广牧动物保健品有限公司 | 一种含红茶茶多酚的组合物及其制备方法和应用 |
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