CN110157741B - 一种磁性纳米粒子、其制备方法及在转染试剂中的应用 - Google Patents

一种磁性纳米粒子、其制备方法及在转染试剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种磁性纳米粒子、其制备方法及在转染试剂中的应用，包括：通过共沉淀法合成磁性纳米粒子；将所述磁性纳米粒子加入氢氧根离子溶液中，得到氢氧根离子修饰的四氧化三铁纳米粒子；将所述氢氧根离子修饰的磁性纳米粒子加入到金属阳离子溶液中，得到表面带正电荷的磁性纳米粒子，以用于磁转染。通过这种方法合成的磁性纳米粒子粒径较小，适于内吞，且表面分布有正电荷，能通过静电相互作用与核酸结合，起到浓缩、折叠核酸的作用。本发明提供的磁性纳米粒子用于磁转染时有效降低了转染对细胞造成的安全风险，进一步增强转染效率。

Description

一种磁性纳米粒子、其制备方法及在转染试剂中的应用
技术领域
本发明涉及磁性材料及纳米技术研究领域，更具体地，涉及一种磁性纳米粒子、其制备方法及在转染试剂中的应用。
背景技术
基因转染是将具有生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使其维持生物功能的过程。基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究和基因治疗研究，前者主要包括基因表达调控、信号转导和药物筛选等研究，而后者主要针对肿瘤、艾滋病和遗传病等的基因治疗。由于核酸尺寸较大，且带有负电性，难以独自通过渗透作用穿越同样带有负电性的细胞膜。就算通过内吞作用进入细胞膜，核酸也很可能被溶酶体降解。此外，细胞质中存在核酸酶，自由的核酸极易被核酸酶降解。而且，由于细胞骨架的存在，大分子在细胞质内难以通过扩散作用运动，进而难以通过核孔进入细胞核。
为了更好地使基因在体内发挥作用，基因往往需要与载体结合形成转染复合物再进行转染。所使用的载体主要有病毒基因载体和非病毒基因载体两类。但病毒载体的应用存在较大的安全风险，如引起插入突变、活化致癌基因、导致细胞分化以及免疫原性等，这些风险也限制了病毒载体在临床上的广泛应用。非病毒基因载体在临床应用上的风险虽远远低于病毒基因载体，但其转染效率也低于病毒基因载体。磁转染是近年来出现的一种潜在的能有效提高非病毒基因载体的转染效率的手段。磁转染是将磁性纳米粒子与基因载体结合，形成具有磁响应性的转染复合物，然后在外加梯度磁场的作用下，加速转染复合物的沉积、提高其在细胞膜表面的聚集，进而实现高效基因转染的目的。
磁性纳米粒子与核酸结合，主要通过两种方法，一是同时与阳离子聚合物、脂质体等载体结合形成三元转染复合物，操作复杂，二是用阳离子聚合物修饰磁性纳米粒子使其表面带正电荷，再通过静电相互作用与负电性核酸结合。但阳离子聚合物还导致细胞毒性以及与血浆蛋白等血液成分的非特异性相互作用，限制了其临床应用。因此，设计和制备不用阳离子聚合物修饰而带正电荷的磁性纳米粒子具有重要的科学研究价值和临床治疗意义。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于解决现有磁转染技术中所用的磁性纳米粒子与核酸结合方法操作复杂，以及用阳离子聚合物修饰磁性纳米粒子导致细胞毒性和血液成分非特异性相互作用限制临床应用的技术问题。
为实现上述目的，第一方面，本发明提供一种磁性纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
通过共沉淀法合成磁性纳米粒子；
将所述磁性纳米粒子加入氢氧根离子溶液中，得到氢氧根离子修饰的四氧化三铁纳米粒子；
将所述氢氧根离子修饰的磁性纳米粒子加入到金属阳离子溶液中，得到表面带正电荷的磁性纳米粒子，以用于磁转染。
可选地，所述磁性纳米粒子为四氧化三铁纳米粒子。
可选地，所述金属阳离子溶液为亚铁离子溶液。
可选地，所述氢氧根离子溶液为氢氧化钠溶液。
可选地，所述磁性纳米粒子与氢氧根离子的摩尔比不大于1:1。
可选地，所述磁性纳米粒子与金属阳离子的摩尔比不大于1:1。
第二方面，本发明提供一种基于上述第一方面所述的磁性纳米粒子的制备方法制备的用于磁转染的磁性纳米粒子。
第三方面，本发明提供一种基于上述第一方面所述的磁性纳米粒子的制备方法制备的磁性纳米粒子在转染试剂中的应用，包括如下步骤：
将所述表面带正电荷的磁性纳米粒子加入到待转染基因溶液中孵育，所述正电荷与待转染基因通过静电相互作用进行转染，得到转染复合物。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明中所述的磁性纳米粒子表面带正电荷，可直接与基因结合通过静电相互作用形成复合物进行转染，不必与其他载体结合形成三元复合物，转染过程操作简单。
(2)本发明中所述的磁性纳米粒子表面所带的正电荷由离子修饰而来，现有技术中类似磁性载体表面所带正电荷多由阳离子聚合物修饰而来，阳离子聚合物还导致固有的细胞毒性以及与血浆蛋白等血液成分的非特异性相互作用，本发明中的磁性纳米粒子毒性更低，相对安全。
(3)本发明中的磁性纳米粒子不经严格封装，携核酸进入溶酶体后，在酸性环境中会有一定程度的溶解，即会不断消耗溶酶体中氢离子，进而引起氯离子和水分子内流，引发溶酶体肿胀破裂，此种溶解也有助于核酸从载体上脱离，最终使磁性纳米粒子所携载的基因可以从溶酶体逃逸、释放，并进入细胞核，将进一步增强转染效率。
附图说明
图1为本发明提供的磁性纳米粒子的制备方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明根据磁转染的临床需求，设计并制备了一种工艺简单、毒性极低、表面带正电荷的磁性纳米粒子作为磁转染的载体。此磁性纳米粒子分三步合成。第一步，合成四氧化三铁纳米粒子；第二步，使四氧化三铁纳米粒子修饰上氢氧根离子；第三步，使修饰上氢氧根离子的四氧化三铁纳米粒子修饰上正价阳离子。通过这种方法合成的磁性纳米粒子粒径较小，适于内吞，且表面分布有正电荷，能通过静电相互作用与核酸结合，起到浓缩、折叠核酸的作用。并且此正电荷并非像以往的磁转染实验那样由带毒性的阳离子聚合物修饰而来，有效降低了转染对细胞造成的安全风险。还有就是，磁性载体不经严格封装，携核酸进入溶酶体后，可能会溶解并消耗溶酶体中氢离子，引起肿胀，此种溶解也有助于核酸从载体上脱离，最终导致溶酶体破裂和核酸的释放，进一步增强转染效率。
图1为本发明提供的磁性纳米粒子的制备方法流程图，如图1所示，包括如下步骤：
S101，通过共沉淀法合成磁性纳米粒子；
S102，将所述磁性纳米粒子加入氢氧根离子溶液中，得到氢氧根离子修饰的四氧化三铁纳米粒子；
S103，将所述氢氧根离子修饰的磁性纳米粒子加入到金属阳离子溶液中，得到表面带正电荷的磁性纳米粒子。
在一个具体的示例中，磁性纳米粒子为四氧化三铁纳米粒子。内核的四氧化三铁纳米粒子通过共沉淀法合成；将所述内核加入到氢氧根离子溶液中，搅拌，并伴以加热、超声或微波条件作用10～30分钟，可获得氢氧根离子修饰的磁性纳米粒子。将所述氢氧根离子修饰的磁性纳米粒子加入到金属阳离子溶液中，搅拌，并伴以加热、超声或微波条件作用10～30分钟，获得表面带正电荷的磁性纳米粒子。
可选地，该磁性纳米粒子可用于制备磁转染试剂。具体地，该制备方法还包括如下步骤：将表面带正电荷的磁性纳米粒子加入到待转染基因溶液中孵育，所述正电荷与待转染基因通过静电相互作用进行转染，得到转染复合物。
可选地，所述金属阳离子溶液为亚铁离子溶液。
可选地，所述氢氧根离子溶液为氢氧化钠溶液。
可选地，所述磁性纳米粒子与氢氧根离子的摩尔比不大于1:1。
可选地，所述磁性纳米粒子与金属阳离子的摩尔比不大于1:1。
可选地，氢氧根离子溶液中氢氧根离子的浓度不大于0.1mol/L。
可选地，金属阳离子溶液中金属阳离子浓度不大于0.1mol/L。
本发明根据磁转染的临床需求，设计并制备了一种工艺简单、毒性极低、表面带正电荷的磁性纳米粒子，并将其应用于磁转染实验中。磁性纳米粒子，内核是通过共沉淀法合成的四氧化三铁纳米粒子。四氧化三铁是由Fe2+，Fe3+，O2-通过离子键组成的反尖晶石结构的复杂离子晶体。四氧化三铁内核加入氢氧根离子溶液中，搅拌，并伴以加热、超声或微波条件作用一段时间后，可收获氢氧根离子修饰的磁性纳米粒子。搅拌有助于四氧化三铁纳米粒子均匀分布，加热、超声或微波条件有助于离子键或配位键的形成。
优选地，本发明中选用的氢氧根离子溶液是氢氧化钠溶液。常见的氢氧根离子溶液还有氨水，但氨水中同时存在氢氧化铵分子、铵根离子，定量不易且容易造成生成的磁性纳米粒子成分不纯。
氢氧根离子修饰的磁性纳米粒子加入到金属阳离子溶液中，搅拌，并伴以加热、超声或微波条件作用一段时间后，可收获表面带正电荷的磁性纳米粒子。搅拌有助于磁性纳米粒子均匀分布，加热、超声或微波等条件有助于离子键或配位键的形成。
优选地，本发明中选用的金属阳离子溶液为是亚铁离子溶液。铁是生物体必需的元素而且是大量元素，是构成血红蛋白、肌红蛋白及多种酶的重要成分。三价铁离子容易导致氧化还原反应，选用二价铁离子作为修饰离子有利于进一步降低临床风险。
本发明中通过共沉淀法合成的四氧化三铁纳米粒子一般粒径较小，离子的修饰也不会对粒径造成过多影响，有利于细胞对磁性转染复合物的有效摄取。
本发明还提供了用所述的离子修饰的磁性纳米粒子制备磁转染试剂的方法，例如可以将所述磁性纳米粒子加入到待转染基因溶液中，37℃、静置条件下共孵育30min，获得转染复合物。
本发明中的磁性纳米粒子对待转染基因的大小和种类无选择，待转染基因可以是各种报告基因、各类试验中所需的功能基因及功能性信使RNA、小干扰RNA等。
在一个具体的实例中，本发明提供的磁性纳米粒子的制备方法可包括如下具体步骤：
1.共沉淀法合成四氧化三铁纳米粒子
①连接好实验装置。将搅拌棒和塞子连接在500mL三口烧瓶上，再将搅拌棒连接在搅拌机上。
②往三口烧瓶中添加50mL去离子水，一端通N2以防止生成物氧化，搅拌机转速调节至800rpm。
③按顺序往三口烧瓶中添加FeSO4·7H2O(1.390g，5mmol)和FeCl3·6H2O(2.703g，10mmol)反应物。
④通过滴液漏斗往三口烧瓶中逐滴加入50mL的氨水溶液，以提供碱性反应环境。
⑤滴加完毕后，将三口烧瓶置于水浴锅中水浴加热30min，温度为80℃，以使得反应物反应生成四氧化三铁纳米粒子。
⑥用大号培养皿收集步骤5生成的产品，用去离子水清洗至中性(清洗时用磁铁分离)，再用乙醇清洗数次，在60℃时进行真空干燥。
具体地，通过磁铁吸附在培养皿外侧底部，使四氧化三铁纳米粒子析出。
2.离子修饰四氧化三铁纳米粒子
①连接好实验装置。将搅拌棒和塞子连接在500mL三口烧瓶上，再将搅拌棒连接在搅拌机上。
②往三口烧瓶中添加50mL的NaOH溶液(0.1mol/L)，一端通N2以防止四氧化三铁纳米粒子氧化，搅拌机转速调至800rpm。
具体地，氢氧根离子溶液还可以为KOH溶液。
③往三口烧瓶中添加1g上述合成的四氧化三铁纳米粒子，在80℃的条件下反应半小时，使得氢氧根离子吸附。
④用磁铁收集磁性纳米粒子，用去离子水洗涤，直到上清液达到中性。
⑤将所得的粒子与50mL的FeSO4·7H2O溶液(0.1mol/L)在80℃、800rpm的条件下反应半小时，使得二价铁阳离子吸附。
⑥用大号培养皿收集产品，用去离子水清洗至中性(清洗时用磁铁分离)，再用乙醇清洗数次，去除水的成分，加速干燥，防止四氧化三铁纳米粒子氧化，在60℃时进行真空干燥。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
通过共沉淀法合成磁性纳米粒子，所述磁性纳米粒子为四氧化三铁纳米粒子，四氧化三铁是由Fe2+，Fe3+，O2-通过离子键组成的反尖晶石结构的复杂离子晶体；
将所述磁性纳米粒子加入氢氧根离子溶液中，所述氢氧根离子溶液为NaOH溶液或KOH溶液，然后搅拌，并伴以加热、超声或微波条件作用预设时间后，得到氢氧根离子修饰的四氧化三铁纳米粒子；
将所述氢氧根离子修饰的磁性纳米粒子加入到金属阳离子溶液中，得到表面带正电荷的磁性纳米粒子；所述金属阳离子溶液为亚铁离子溶液；
所述表面带正电荷的磁性纳米粒子用于加入到待转染基因溶液中孵育，所述正电荷与待转染基因通过静电相互作用进行转染，得到转染复合物；选用二价铁离子作为修饰离子有利于降低临床风险；
所述磁性纳米粒子的表面带正电荷，能够直接与基因结合通过静电相互作用形成复合物进行转染，转染过程操作简单；
利用共沉淀法合成四氧化三铁纳米粒子，包括：
①连接好实验装置，将搅拌棒和塞子连接在500 mL三口烧瓶上，再将搅拌棒连接在搅拌机上；
②往三口烧瓶中添加50 mL去离子水，一端通N2以防止生成物氧化，搅拌机转速调节至800 rpm；
③按顺序往三口烧瓶中添加5mmol的FeSO4·7H2O和10mmol的FeCl3·6H2O反应物；
④通过滴液漏斗往三口烧瓶中逐滴加入50 mL的氨水溶液，以提供碱性反应环境；
⑤滴加完毕后，将三口烧瓶置于水浴锅中水浴加热30 min，温度为80 ℃，以使得反应物反应生成四氧化三铁纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述氢氧根离子溶液为氢氧化钠溶液。
3.根据权利要求1所述的磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述磁性纳米粒子与氢氧根离子的摩尔比不大于1:1。
4.根据权利要求1所述的磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述磁性纳米粒子与金属阳离子的摩尔比不大于1:1。
5.一种基于权利要求1至4任一项所述的磁性纳米粒子的制备方法制备的磁性纳米粒子。
6.一种基于权利要求1至4任一项所述的磁性纳米粒子的制备方法制备的磁性纳米粒子在转染试剂中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
将所述表面带正电荷的磁性纳米粒子加入到待转染基因溶液中孵育，所述正电荷与待转染基因通过静电相互作用进行转染，得到转染复合物。
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