CN105056912A - 固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒的制备方法及其应用,属于纳米材料和蛋白质纯化技术领域。涉及一种以壳聚糖季铵盐修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒为吸附载体,经Fe3+修饰后用于PPPs的富集。本发明制备的壳聚糖季铵盐磁性纳米颗粒具有超顺磁性及良好的水分散性,对PPPs的吸附显示出高特异性。建立在此固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒基础上的PPPs的富集明显优于传统方法。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料和蛋白质分离纯化技术领域,特别涉及一种固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒的制备及其富集卵黄高磷蛋白磷酸肽的方法。
背景技术
钙是人体中含量最多的微量元素,具有重要的生理功能,被称为人体的“环境卫士”。然而钙的缺乏和吸收效率低已成为当今的全球性问题,因此补钙已成为当务之急。卵黄高磷蛋白磷酸肽(PhosvitinPhosphopeptides,简称PPPs)是从卵黄高磷蛋白酶解物中提取的一种多种短肽的混合物,可促进钙、铁和锌等金属离子的吸收。而且大量的研究结果表明:相比于已商品化的补钙产品-酪蛋白磷酸肽(CaseinPhosphopeptides,简称CPPs),PPPs在抑制钙形成不溶性的化合物方面具有明显优势。因此可见,开发PPPs作为补钙产品具有广阔的应用潜力与实际研究、应用价值。
目前,可用于PPPs富集的方法主要有乙醇钙沉淀法,离子交换法和膜分离法。其中,乙醇钙沉淀法具有乙醇消耗量大,且溶剂残留;离子交换法操作复杂,且需要大量的酸液碱液再生,对环境会造成较大程度的污染;而膜分离法工序繁琐,对设备条件要求较高。因此,寻找一种高效、安全、成本低,工艺简单的PPPs富集方法具有重要的研究价值。
1975年Porath首先提出了固定化金属离子亲和色谱(Immobilizedmetalaffinitychromatography,IMAC),该技术主要是利用络合配基将金属离子固定在载体基质上,通过所固定的金属离子与目标蛋白质之间的配位作用进行吸附与分离。经过几十年的发展,目前已经成为最为普及的磷酸化肽富集方法。而随着磁性纳米技术的发展,将IMAC技术与磁性纳米技术相结合用于生物物质的分离纯化已成为当今研究的热点。其中四氧化三铁磁性纳米颗粒毒性较低,制备方法简单,当粒径小于30nm时,则表现出超顺磁性,即在外加磁场作用下具有较强的磁响应性,当撤离磁场时,磁性迅速消失,剩磁为零,不会被永久磁化。
到目前为止,尚未有采用壳聚糖季铵盐磁性纳米颗粒修饰Fe3+以制备固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒,并将其作为吸附载体用于PPPs富集的报道。本发明制备合成了形貌规整,粒径均一的超顺磁性固定化壳聚糖季铵盐金属离子纳米颗粒,并将其应用于蛋黄中PPPs的富集。
发明内容
本发明的目的在于提供一种超声波辅助化学共沉淀法制备固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒的方法,制备所得的颗粒形貌规整、粒径均一、磁响应性强,具有良好的生物相容性。采用所制备的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒富集PPPs,操作简便、成本低廉,生产周期短,解决了传统PPPs富集困难、步骤繁琐等问题。
本发明提供的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒的制备及其富集PPPs的方法,具体实施方案如下:
1、固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒的制备
采用超声波辅助的化学共沉淀法合成,其化学反应式为:
Fe2++2Fe3++8NH3·H2O=Fe3O4↓+8NH4++4H2O
固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒的制备方法,按照下述步骤进行:
(1)将一定摩尔比例的可溶性Fe2+和Fe3+盐溶解在纯水溶液中,向其中加入表面活性剂,并通氮气30min,反应在超声波体系(F=28KHz)中进行;
(2)将温度升高到40~70℃,在超声波分散状态(F=28KHz)下缓慢滴加碱液到反应体系中,最终使pH值达到10~11,反应30min后继续向体系中加入一定量的浓度为1%的壳聚糖季铵盐溶液,之后将温度升高到80℃反应1~6h,终止反应,之后在外加磁场的作用下分离磁性颗粒,并且用去离子水清洗数次至中性,对收集到的磁性颗粒进行干燥处理,即可得壳聚糖季铵盐磁性纳米颗粒粉末,简写为MNPs。
红外光谱研究表明:壳聚糖季铵盐成功实现了对四氧化三铁的表面修饰,且壳聚糖季铵盐的修饰未对四氧化三铁磁性纳米颗粒粒径及水分散性质引起改变,因此,壳聚糖季铵盐磁性纳米颗粒也具有超顺磁性及良好的水分散性。
采用上述方法制备的MNPs磁性纳米颗粒形貌规整,粒径均一,平均粒径在15~20nm左右,具有超顺磁性,同时在水溶液中具有良好的分散性。
(3)配制一定浓度的FeCl3·6H2O溶液,加入准确称重的MNPs,在室温下振荡吸附2h,使Fe3+与磁性MNP表面基团分子充分反应完全,即可得固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒(MNPsFe3+)。
其中所述的可溶性的Fe2+化合物是四水氯化亚铁或七水硫酸亚铁;可溶性的Fe3+化合物是六水氯化铁;其中Fe2+与Fe3+的摩尔比为1:2~2:1,总铁离子浓度为0.03~0.5M。
其中所述的碱液为氨水或氢氧化钠或两者的混合物。
其中所述的表面活性剂为聚乙二醇6000,十二烷基苯磺酸钠和十六烷基三甲基溴化铵中的任何一种。
2、固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒用于富集PPPs的方法,按照下述步骤进行:(1)PPPs吸附原液的制备
A、新鲜鸡蛋进行蛋清和蛋黄的分离,将蛋黄置于滤纸上除去附着的蛋清,用针挑破膜,收集蛋黄内容物,之后进行喷雾干燥,得蛋黄粉;蛋黄粉经95%乙醇脱脂处理(脱脂率95.2%),之后于60℃烘干,并保存于干燥环境中。
B、脱磷、酶解:称取脱脂蛋黄粉于0.1M的NaOH溶液中,于37℃下反应3h,反应结束后迅速用0.1M盐酸将pH调节至8.0。用去离子水稀释3~5倍,之后用3000K超滤膜进行超滤处理,并将超滤后的滤液转移到酶解反应器里,加入胰蛋白酶(底物:酶量=10:1),pH8.0,50℃下酶解4h,并用0.1MNaOH调节pH,使酶解液的pH维持在8.0。水解结束后于80℃下灭酶10min,待冷却至室温,调节pH至4.5,酶解液于9000r/min4℃下离心10min,取上清液,此上清液作为PPPs的吸附原液,测N、P含量,计算N/P。
(2)PPPs的富集
将MNPsFe3+磁性纳米颗粒加入到含有PPPs的吸附原液中,在一定温度下搅拌反应一定时间,使溶液中的PPPs特定地吸附在MNPsFe3+磁性纳米颗粒表面,在外加磁场的作用下将吸附有PPPs的磁性纳米颗粒从反应溶液中分离出来,用去离子水清洗三次去除杂质,再用洗脱液进行洗脱,收集PPPs的洗脱液,测N、P含量,计算N/P,之后冷冻干燥得到卵黄高磷蛋白磷酸肽。
其中所述的步骤(2)富集过程中选用的温度为15~45℃。
其中所述的步骤(2)富集反应时间为30~240min。
其中所述的步骤(2)富集过程中富集后选用的洗脱液为体积百分比5~15%氨水溶液(pH=10.5)。
其中所述的步骤(2)中PPPs吸附原液中蛋白质含量为1~20mg/mL,缓冲液的pH为4~8。
本发明的有益效果:本发明制备了一种固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒,并将其应用于PPPs的富集。建立在此固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒基础上的PPPs的富集,其N/P下降相当显著,明显优于目前所报道的传统的富集方法。
另外,本发明提供的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒富集PPPs的方法同时具有以下的优点:
(1)本发明提供了一种固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒分离富集PPPs的方法,具有操作简单、分离纯化周期较短,从吸附、清洗到洗脱整个过程在2~4h内完成。
(2)本发明提供的PPPs富集纯化方法N/P下降相当显著(试验中排除了游离磷酸根基团的干扰,由此说明吸附的大部分含氮组分均为磷酸化肽),表明对PPPs的特异性吸附好
(3)本发明提供的PPPs富集方法是在水溶液及室温条件下进行,不会引起其它蛋白质组分及肽的变性。
附图说明
图1壳聚糖季铵盐修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒的FTIR光谱图(A:纯四氧化三铁,B:壳聚糖季铵盐修饰的磁性纳米颗粒)
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步的描述:
实施例1
1、壳聚糖季铵盐四氧化三铁磁性纳米颗粒的制备
(1)将0.01M七水硫酸亚铁和0.02M六水氯化铁溶解在纯水溶液中,加入聚乙二醇6000,通氮气30min,整个反应在超声波体系(F=28KHz)下进行。
(2)将温度升高到40℃,然后缓慢滴加氨水溶液,调节体系的pH值到10左右,得到黑色的磁性颗粒溶液;反应30min后迅速加入1%的壳聚糖季铵盐溶液,升温到80℃反应1h,终止反应,静置冷却,得反应液。
(3)在外加磁场的作用下分离磁性颗粒,并且用去离子水清洗数次至中性,去除未反应完全的化学组分;对收集到的磁性颗粒进行冷冻干燥处理,即可得壳聚糖季铵盐修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒粉末(简写为MNPs)。
2、表面固定Fe3+磁性纳米颗粒(简写为MNPsFe3+)的制备
配制浓度为10mg/mL的FeCl3·6H2O溶液,加入准确称重的MNPs,使MNPs的浓度达到5mg/mL,在室温下振荡吸附2h,使Fe3+与MNPs表面基团分子充分反应完全,即可得MNPsFe3+。图1壳聚糖季铵盐修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒的FTIR光谱图(A:纯四氧化三铁,B:壳聚糖季铵盐修饰的磁性纳米颗粒)
3.固定化金属离子磁性纳米颗粒富集PPPs的应用,步骤如下:
(1)新鲜鸡蛋进行蛋清和蛋黄的分离,将蛋黄置于滤纸上除去附着的蛋清,用针挑破膜,收集蛋黄内容物,之后进行喷雾干燥,得蛋黄粉。蛋黄粉经95%乙醇脱脂处理(脱脂率95.2%),之后于60℃烘干,将原料保存于干燥环境中。
(2)碱法脱磷:称取蛋黄粉于0.1M的NaOH溶液中,于37℃下反应3h,反应结束后迅速用0.1M盐酸将pH调节至8.0,采用去离子水稀释3~5倍。然后用3000K超滤膜进行超滤处理(超滤前先进行抽滤,以免堵塞超滤膜),脱除磷酸根离子。
(3)酶解:将超滤后的滤液转移到酶解反应器里,加入胰蛋白酶(底物:酶量=10:1),pH8.0,50℃下酶解4h,并用0.1MNaOH调节pH,使酶解液的pH维持在8.0,每间隔10min记录V(NaOH)。水解结束后于80℃下灭酶10min,待冷却至室温,调节pH至4.5,酶解液于9000r/min,4℃下离心10min,取上清液,测N、P含量,计算N/P(N/P=40.23)。此上清液作为卵黄高磷蛋白磷酸肽的吸附原液。
(4)富集PPPs:将MNPsFe3+磁性纳米颗粒加入到pH为4,蛋白质含量为1mg/mL的PPPs的吸附原液,在15℃搅拌反应30min,使溶液中的PPPs特定地吸附在MNPsFe3+磁性纳米颗粒表面,在外加磁场的作用下将吸附有PPPs的磁性纳米颗粒从反应溶液中分离出来,用去离子水清洗三次去除杂质,再用5%pH=10.5的氨水溶液进行洗脱,收集洗脱液,测N、P含量,计算N/P(N/P=11.6),最后对洗脱液进行冷冻干燥,即可得卵黄高磷蛋白磷酸肽粉末。
实施例2
1、壳聚糖季铵盐四氧化三铁磁性纳米颗粒的制备
(1)将0.2M四水氯化亚铁和0.1M六水氯化铁溶解在纯水溶液中,加入十二烷基苯磺酸钠,通氮气30min,整个反应在超声波体系(F=28KHz)下进行。
(2)将温度升高到70℃,然后缓慢滴加氢氧化钠水溶液,调节体系的pH值到10左右,得到黑色的磁性颗粒溶液;反应30min后迅速加入1%的壳聚糖季铵盐溶液,升温到80℃反应1h,终止反应,静置冷却,得反应液。
(3)在外加磁场的作用下分离磁性颗粒,并且用去离子水清洗数次至中性,去除未反应完全的化学组分;对收集到的磁性颗粒进行冷冻干燥处理,即可得壳聚糖季铵盐修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒粉末(简写为MNPs)。
2、表面固定Fe3+磁性纳米颗粒(简写为MNPsFe3+)的制备
配制一定浓度的FeCl3·6H2O溶液(10mg/ml),加入准确称重的MNPs,使MNPs的浓度达到5mg/mL,在室温下振荡吸附2h,使Fe3+与MNPs表面基团分子充分反应完全,即可得MNPsFe3+。
3、固定化金属离子磁性纳米颗粒富集PPPs的应用,步骤如下:
(1)新鲜鸡蛋进行蛋清和蛋黄的分离,将蛋黄置于滤纸上除去附着的蛋清,用针挑破膜,收集蛋黄内容物,之后进行喷雾干燥,得蛋黄粉。蛋黄粉经95%乙醇脱脂处理(脱脂率95.2%),之后于60℃烘干,将原料保存于干燥环境中。
(2)碱法脱磷:称取蛋黄粉于0.1M的NaOH溶液中,于37℃下反应3h,反应结束后迅速用0.1M盐酸将pH调节至8.0,采用去离子水稀释3~5倍。然后用3000K超滤膜进行超滤处理(超滤前先进行抽滤,以免堵塞超滤膜),脱除磷酸根离子。
(3)酶解:将超滤后的滤液转移到酶解反应器里,加入胰蛋白酶(底物:酶量=10:1),pH8.0,50℃下酶解4h,并用0.1MNaOH调节pH,使酶解液的pH维持在8.0,每间隔10min记录V(NaOH)。水解结束后于80℃下灭酶10min,待冷却至室温,调节pH至4.5,酶解液于9000r/min,4℃下离心10min,取上清液,测N、P含量,计算N/P(N/P=40.23)。此上清液作为卵黄高磷蛋白磷酸肽的吸附原液。
(4)富集PPPs:将MNPsFe3+磁性纳米颗粒加入到pH=8,蛋白质含量为20mg/mL的PPPs的吸附原液,在45℃搅拌反应240min,使溶液中的PPPs特定地吸附在MNPsFe3+磁性纳米颗粒表面,在外加磁场的作用下将吸附有PPPs的磁性纳米颗粒从反应溶液中分离出来,用去离子水清洗三次去除杂质,再用15%pH=10.5的氨水溶液进行洗脱,收集洗脱液,测N、P含量,计算N/P(N/P=8.52),最后对洗脱液进行冷冻干燥,即可得卵黄高磷蛋白磷酸肽粉末。
实施例3
1、壳聚糖季铵盐四氧化三铁磁性纳米颗粒的制备
(1)将0.2MFe2+和0.3MFe3+溶解在纯水溶液中,加入聚乙二醇6000,通氮气30min,整个反应在超声波体系下进行。
(2)将温度升高到60℃,然后缓慢滴加氨水溶液,调节体系的pH值到10左右,得到黑色的磁性颗粒溶液;反应30min后迅速加入1%的壳聚糖季铵盐溶液,升温到80℃反应1h,终止反应,静置冷却,得反应液。
(3)在外加磁场的作用下分离磁性颗粒,并且用去离子水清洗数次至中性,去除未反应完全的化学组分;对收集到的磁性颗粒进行冷冻干燥处理,即可得壳聚糖季铵盐修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒粉末(简写为MNPs)。
2、表面固定Fe3+磁性纳米颗粒(简写为MNPsFe3+)的制备
配制浓度为10mg/mL的FeCl3·6H2O溶液,加入准确称重的MNPs,使MNPs的浓度达到5mg/mL,在室温下振荡吸附2h,使Fe3+与MNPs表面基团分子充分反应完全,即可得MNPsFe3+。
3、固定化金属离子磁性纳米颗粒富集PPPs的应用,步骤如下:
(1)新鲜鸡蛋进行蛋清和蛋黄的分离,将蛋黄置于滤纸上除去附着的蛋清,用针挑破膜,收集蛋黄内容物,之后进行喷雾干燥,得蛋黄粉。蛋黄粉经95%乙醇脱脂处理(脱脂率95.2%),之后于60℃烘干,将原料保存于干燥环境中。
(2)碱法脱磷:称取蛋黄粉于0.1M的NaOH溶液中,于37℃下反应3h,反应结束后迅速用0.1M盐酸将pH调节至8.0,采用去离子水稀释3~5倍。然后用3000K超滤膜进行超滤处理(超滤前先进行抽滤,以免堵塞超滤膜),脱除磷酸根离子。
(3)酶解:将超滤后的滤液转移到酶解反应器里,加入胰蛋白酶(底物:酶量=10:1),pH8.0,50℃下酶解4h,并用0.1MNaOH调节pH,使酶解液的pH维持在8.0,每间隔10min记录V(NaOH)。水解结束后于80℃下灭酶10min,待冷却至室温,调节pH至4.5,酶解液于9000r/min,4℃下离心10min,取上清液,测N、P含量,计算N/P(N/P=40.23)。此上清液作为卵黄高磷蛋白磷酸肽的吸附原液。
(4)富集PPPs:将MNPsFe3+磁性纳米颗粒加入到pH为4.5,蛋白质含量为10mg/mL的PPPs的吸附原液,在45℃搅拌反应240min,使溶液中的PPPs特定地吸附在MNPsFe3+磁性纳米颗粒表面,在外加磁场的作用下将吸附有PPPs的磁性纳米颗粒从反应溶液中分离出来,用去离子水清洗三次去除杂质,再用10%pH=10.5的氨水溶液进行洗脱,收集洗脱液,测N、P含量,计算N/P(N/P=6.45),最后对洗脱液进行冷冻干燥,即可得卵黄高磷蛋白磷酸肽粉末。
Claims (9)
1.固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒的制备方法,其特征在于按照下述步骤进行:
(1)将一定摩尔比例的可溶性Fe2+和Fe3+盐溶解在纯水溶液中,向其中加入表面活性剂,并通氮气30min,反应在超声波体系(F=28KHz)中进行;之后将温度升高到40~70℃,在超声波分散状态(F=28KHz)下缓慢滴加碱液到反应体系中,最终使pH值达到10~11,反应30min后继续向体系中加入一定量的浓度为1%的壳聚糖季铵盐溶液,之后将温度升高到80℃反应1~6h,终止反应,之后在外加磁场的作用下分离磁性颗粒,并且用去离子水清洗数次至中性,对收集到的磁性颗粒进行干燥处理,即可得壳聚糖季铵盐磁性纳米颗粒粉末,简写为MNPs;
(2)配制一定浓度的FeCl3·6H2O溶液,加入准确称重的MNPs,在室温下振荡吸附2h,使Fe3+与磁性MNP表面基团分子充分反应完全,即可得固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒(MNPsFe3+)。
2.根据权利要求1所述的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒的制备方法,其特征在于其中所述的可溶性的Fe2+化合物是四水氯化亚铁或七水硫酸亚铁;可溶性的Fe3+化合物是六水氯化铁;其中Fe2+与Fe3+的摩尔比为1:2~2:1,总铁离子浓度为0.03~0.5M。
3.根据权利要求1所述的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒的制备方法,其特征在于其中所述的碱液为氨水或氢氧化钠或两者的混合物。
4.根据权利要求1所述的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒的制备方法,其特征在于其中所述的表面活性剂为聚乙二醇6000,十二烷基苯磺酸钠和十六烷基三甲基溴化铵中的任何一种。
5.根据权利要求1所述的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒用于富集PPPs的方法,其特征在于按照下述步骤进行:
(1)PPPs吸附原液的制备
A、新鲜鸡蛋进行蛋清和蛋黄的分离,将蛋黄置于滤纸上除去附着的蛋清,用针挑破膜,收集蛋黄内容物,之后进行喷雾干燥,得蛋黄粉;蛋黄粉经95%乙醇脱脂处理(脱脂率95.2%),之后于60℃烘干,并保存于干燥环境中;
B、脱磷、酶解:称取脱脂蛋黄粉于0.1M的NaOH溶液中,于37℃下反应3h,反应结束后迅速用0.1M盐酸将pH调节至8.0;
用去离子水稀释3~5倍,之后用3000K超滤膜进行超滤处理,并将超滤后的滤液转移到酶解反应器里,加入胰蛋白酶(底物:酶量=10:1),pH8.0,50℃下酶解4h,并用0.1MNaOH调节pH,使酶解液的pH维持在8.0;
水解结束后于80℃下灭酶10min,待冷却至室温,调节pH至4.5,酶解液于9000r/min4℃下离心10min,取上清液,此上清液作为PPPs的吸附原液,测N、P含量,计算N/P;
(2)PPPs的富集
将MNPsFe3+磁性纳米颗粒加入到含有PPPs的吸附原液中,在一定温度下搅拌反应一定时间,使溶液中的PPPs特定地吸附在MNPsFe3+磁性纳米颗粒表面,在外加磁场的作用下将吸附有PPPs的磁性纳米颗粒从反应溶液中分离出来,用去离子水清洗三次去除杂质,再用洗脱液进行洗脱,收集PPPs的洗脱液,测N、P含量,计算N/P,最后冷冻干燥得到卵黄高磷蛋白磷酸肽。
6.根据权利要求5所述的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒用于富集PPPs的方法,其特征在于其中所述的步骤(2)富集过程中选用的温度为15~45℃。
7.根据权利要求5所述的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒用于富集PPPs的方法,其特征在于其中所述的步骤(2)富集反应时间为30~240min。
8.根据权利要求5所述的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒用于富集PPPs的方法,其特征在于其中所述的步骤(2)富集过程中富集后选用的洗脱液为体积百分比5~15%的氨水溶液(pH=10.5)。
9.根据权利要求5所述的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒用于富集PPPs的方法,其特征在于其中所述的步骤(2)中PPPs吸附原液中蛋白质含量为1~20mg/mL,缓冲液的pH为4~8。
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