CN110314671B - 一种磷酸化蛋白富集材料的制备方法及其应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明的一种磷酸化蛋白富集材料的制备方法及其应用方法。制备时，制备相应多金属氧酸盐后，将多巴胺与多金属氧酸盐聚合形成的复合物微球为载体，然后将金属离子固定在微球表面，获得富集材料产物。将得到的最终产物作为吸附材料应用于磷酸化蛋白的选择性分离富集。应用的多巴胺具有良好的水溶性，无毒无害和强烈的金属粘合能力。且多金属氧酸盐和磷酸根基团均存在π键，可发生π堆积作用，进一步促进对磷酸化蛋白的吸附作用。该材料具有合成过程简单、成本低、高选择性等优点。

Description

一种磷酸化蛋白富集材料的制备方法及其应用方法

技术领域

本发明属于蛋白质分离富集技术领域，具体涉及一种磷酸化蛋白富集材料的制备及其应用方法。

背景技术

磷酸化蛋白，作为一种非常重要的翻译后修饰蛋白，在许多生物过程，例如信号传导、分子识别、细胞分化和代谢中扮演着重要的角色。蛋白质磷酸化水平的异常涉及到许多人类疾病，例如癌症、心脏病、心血管病的发病机理。然而，磷酸化蛋白在生物样品中的低含量限制了对其的研究。因此，为了深入研究蛋白质的磷酸化修饰，需要采用富集纯化的方法将低丰度的磷酸化蛋白从复杂的实际样品中分离出来。

固定金属离子亲和色谱是分离富集磷酸化蛋白最常用的一种方法，它基于磷酸根离子和金属离子(Ti⁴⁺,Zr⁴⁺,Fe³⁺和Ga³⁺等)强烈的亲和作用。然而，传统的金属螯合试剂，亚氨基二乙酸和次氮基三乙酸与固相载体具有弱的相互作用，并且金属离子容易丢失，因此，选择一种简单的螯合试剂，开发一种新型的吸附材料用于磷酸化蛋白的富集十分重要。

发明内容

为了克服上述存在的技术问题，本发明提出一种磷酸化蛋白富集材料的制备方法及其应用方法，该制备方法选择了一种简单的螯合试剂，多巴胺代替传统的金属螯合试剂。多巴胺具有良好的水溶性，无毒无害和强烈的金属粘合能力。另外，多金属氧酸盐和磷酸根基团都存在π键，可以发生π堆积作用，进一步促进对磷酸化蛋白的吸附作用。因此，本发明将多巴胺与多金属氧酸盐聚合形成的复合物微球为载体，然后将金属钛离子固定在微球表面，将得到的最终产物作为吸附材料应用于磷酸化蛋白的选择性分离富集。该材料具有合成过程简单、成本低、高选择性等优点。

为实现以上目的，具体技术方案如下：

一种磷酸化蛋白富集材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，多金属氧酸盐(M⁺)_xNa_1.5[NaP₅W₃₀O₁₁₀]^14-的制备：

(1)将二水合钨酸钠溶解在去离子水中，形成二水合钨酸钠溶液，所述溶液浓度为0.5～1.1g/mL，将二水合钨酸钠溶液与磷酸溶液，按溶质摩尔比，二水合钨酸钠：磷酸＝1：6混合，搅拌均匀，形成混合物；

(2)将混合物于反应釜中，在120～160℃下反应10-24h，待反应釜自然冷却至室温，取出产物，所述产物成分为(H⁺)_x(Na⁺)_y[NaP₅W₃₀O₁₁₀]^14-；

(3)向产物中加入水搅拌溶解，并在搅拌过程中加入金属氯化物，按摩尔比产物成分：金属氯化物＝1:(10～15)，搅拌过程中生成白色沉淀，成分为含有杂质的(M⁺)_xNa_1.5[NaP₅W₃₀O₁₁₀]^14-，搅拌0.5～1.5h至白色沉淀量无变化后，收集沉淀，并用甲醇洗涤，干燥，获得固体；

(4)对固体进行提纯，得到提纯后产物，即为多金属氧酸盐(M⁺)_xNa_1.5[NaP₅W₃₀O₁₁₀]^14-。

步骤2，聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料(P₅W₃₀/PDA)的制备：

(1)将提纯后产物配成浓度为1～6mg/mL的水溶液，搅拌条件下加入多巴胺，形成混合物，

(2)将混合物于反应釜中，120～160℃下，加热16～36h，待反应釜冷却至室温后，收集产物，用去离子水清洗，干燥，获得聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料(P₅W₃₀/PDA)；

步骤3，金属离子螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料的制备(P₅W₃₀/PDA-Mⁿ⁺)：

(1)将聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料(P₅W₃₀/PDA)加入金属离子溶液中，复合材料加入金属离子配制的溶液，复合材料和溶液中金属化合物溶质按质量比为1：(5～20)混合，磁力搅拌20～40min，形成均匀溶液；

(2)将均匀溶液放置摇床中，25～40℃，200r/min下，振荡培育2～10h，重复离心清洗，至上清液中没有金属离子后，将产物干燥，制得金属离子螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料，即为磷酸化蛋白富集材料，富集材料中金属离子质量占比8～10％。

所述的步骤1(1)中，磷酸溶液质量浓度为85％。

所述的步骤1(1)中，二水合钨酸钠溶液与磷酸溶液的搅拌时间为20～30min。

所述的步骤1(3)中，金属氯化物为氯化钾或氯化钠。

所述的步骤1(4)中，固体提纯过程为：将固体溶于热水，按质量比为固体：热水＝1:(1～3)，将沉淀溶解，冷却后析出白色结晶，减压过滤，干燥，得到提纯后产物。

所述的步骤2(1)中，多巴胺与提纯后产物的质量比为(0.5～1):1。

所述的步骤2(2)中，聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料(P₅W₃₀/PDA)为微球状，所述的微球粒径为500-600nm。

所述的步骤2(2)中，干燥方式为冻干，以保持原有形貌，冻干温度-40～-50℃，时间8～15h。

所述的步骤3(2)中，金属离子为钛离子(Ti⁴⁺)，铁离子(Fe³⁺)，锆离子(Zr⁴⁺)，镓离子(Ga³⁺)。钛离子来源于硫酸钛，铁离子来源于氯化铁，锆离子来源于二氯氧化锆，镓离子来源于氯化镓。

所述的步骤3(2)中，金属离子溶液浓度为0.05～0.1mol/L。

所述的步骤3(2)中，干燥方式为冻干，冻干温度为-40～-50℃，时间8～15h。

所述的磷酸化蛋白富集材料的应用方法，包括以下步骤：

(1)取待富集磷酸化蛋白溶液，向溶液中加入磷酸化蛋白富集材料，按配比，待富集磷酸化蛋白溶液：磷酸化蛋白富集材料＝1：(0.5～2)，单位mL：mg，振荡吸附20～40min，形成混合液；

(2)混合液离心3-7min，移取上清液，用去离子水清洗材料表面，再用洗脱剂振荡洗脱20～40min，形成洗脱液与富集材料表面富集有磷酸化蛋白的混合液，混合液在8000rpm转速下离心3～7min，形成含有磷酸化蛋白的洗脱液，重复洗脱离心步骤3～5次，完成磷酸化蛋白富集。

所述的步骤(1)中，待富集磷酸化蛋白溶液中磷酸化蛋白浓度为50～900μg/mL，优选100μg/mL。

所述的步骤(1)中，待富集磷酸化蛋白溶液为由牛奶、蛋清等含有磷酸化蛋白的成分加入稀释液稀释而成，所述的稀释液pH为4～10。

所述的步骤(1)中，稀释液当pH为7时，稀释液为水；pH为4～7时，稀释液为由水与HCl混合调至而成；当pH为7～10时，稀释液为由水与NaOH混合调至而成。

所述的步骤(1)中，离心转速为8000rpm。

所述的步骤(1)中，待富集磷酸化蛋白溶液中磷酸化蛋白吸附率达到100％。

所述的步骤(2)中，洗脱剂为B-R溶液，咪唑溶液，Tris-HCl溶液或Na₂HPO₄溶液，所述的洗脱剂pH为4～10，浓度为0.04～0.1mol/L。

所述的步骤(2)中，采用所述洗脱剂在材料表面吸附洗脱过程的β-酪蛋白的二级结构不发生改变。

所述的步骤(2)中，当对牛奶进行磷酸化蛋白回收时，磷酸化蛋白回收率达到90％以上，当对蛋清进行磷酸化蛋白回收时，磷酸化蛋白回收率达到90％以上。

所述的步骤(2)中，上清液中含有未结合磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白，经检测，所述上清液中无金属离子。

本发明所述的选择性分离富集磷酸化蛋白的方法具有如下优点：

本发明采用固相萃取技术，吸附材料与溶液分离过程简单、快速。

本发明制备得到的复合材料，相对于其他化学合成材料，具有合成过程简单、成本低、环境友好等优点。

本发明制备得到的复合材料，不仅有钛离子和磷酸化蛋白中磷酸根基团的亲和作用，还存在多金属氧酸盐和磷酸根基团的π堆积作用，与传统的钛功能化材料相比，在分离富集磷酸化蛋白时具有更高的选择性和更大的吸附容量，磷酸化蛋白吸附率达到100％，磷酸化蛋白回收率达到90％以上。

以β-酪蛋白和卵清蛋白为模型蛋白考察了复合材料对磷酸化蛋白的吸附能力。该材料对β-酪蛋白的富集因子可达150，优于商业化的试剂盒，可以实现磷酸化蛋白的富集纯化。另外，该复合材料还实现了复杂实际样品中磷酸化蛋白的选择性分离。

附图说明

图1为本发明实施例1的钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料的合成流程图；

图2为本发明实施例1制备的聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料的扫描电镜图；

图3为本发明实施例1制备的钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料的扫描电镜图；

图4为本发明实施例1制备的聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料的透射电镜图；

图5为本发明实施例1制备的钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料的透射电镜图；

图6为本发明实施例1制备的聚多巴胺-多金属氧酸盐和钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料的XPS全谱图；

图7为本发明实施例1制备的钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料O 1s的XPS分峰图；

图8为本发明实施例1制备的钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料N 1s的XPS分峰图；

图9为本发明实施例1制备的钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料Ti 2p的XPS分峰图；

图10为本发明实施例1中不同pH值稀释液稀释下，钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料对两种磷酸化蛋白和六种非磷酸化的吸附效率图；

图11为本发明实施例1中分别向磷酸化蛋白β-酪蛋白和非磷酸化蛋白BSA中加入不同浓度NaCl盐条件下，钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料对β-酪蛋白和BSA的吸附效率图；

图12为本发明实施例1中β-酪蛋白和BSA在复合材料表面的等温吸附曲线图；

图13为本发明实施例1中β-酪蛋白在复合材料表面的Langmuir吸附模型；

图14为本发明实施例1中不同洗脱剂从复合材料表面洗脱β-酪蛋白的洗脱效率结果图；

图15为本发明实施例1中标准β-酪蛋白和经过复合材料吸附洗脱过程后的β-酪蛋白的圆二色光谱图；

图16为本发明实施例1中经过复合材料和试剂盒处理后不同质量比的BSA和β-酪蛋白的回收液的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

图17为本发明实施例1中不同质量比的BSA和β-酪蛋白的回收率图；

图18为本发明实施例1中不同质量比的BSA和β-酪蛋白的富集因子；

图19为本发明实施例1中复合材料处理的鸡蛋清样品溶液的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

图20为本发明实施例1中复合材料处理的牛奶样品液的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

具体实施方式

本发明以钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料为吸附剂，与磷酸化蛋白相互作用，实现磷酸化蛋白的选择性富集，以下介绍具体实施方式。

以下实施例中，采用的原料均来自于市购；

所述的B-R液浓度为0.04mol/L，咪唑溶液，Tris-HCl溶液，Na₂HPO₄溶液浓度为0.1mol/L；

所述的试剂盒为钛试剂盒。

实施例1：钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料的合成

(1)将33g二水合钨酸钠溶于30mL水中，并加入26.5mL 85％磷酸。磁力搅拌30min后，将混合溶液转移至150mL反应釜中，120℃水热反应12h。待反应釜冷却至室温，内胆聚四氟乙烯壁上有浅绿色晶体，取出产物，加入15mL水，随后加入10g氯化钾，产生白色沉淀。搅拌1h后，至白色沉淀质量不再变化，抽滤收集沉淀，用甲醇3次清洗，60℃干燥。最后，将固体溶于30mL70℃水，固体溶解，冷却后析出白色结晶，减压过滤，60℃干燥，得到提纯后的产物，成分为K_12.5Na_1.5[NaP₅W₃₀O₁₁₀]^14-。

(2)将(1)中得到的产物取40mg，配成2mg/mL水溶液，40mg多巴胺加入上述溶液中，搅拌30min。将混合物转移至50mL反应釜中，160℃水热反应16h。待冷却至室温时，内胆壁和底部均有黑色物质生成，收集产物，用去离子水3次洗涤，-40℃下，冻干10h，得到聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料。

(3)将(2)中得到的产物取0.06g加入50mL 100mmol L^-1硫酸钛水溶液，磁力搅拌30min得到均一溶液。然后将该溶液放置摇床中，37℃ 200r/min振荡培育10h。产物离心，去除上清液中未反应的钛离子，用去离子水3次清洗后，将产物-40℃下，冻干10h，得到钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料，复合材料中Ti⁴⁺质量占比9.45％，钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料的合成流程图见图1所述。

将所述的(2)和(3)得到的产物分别用扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)进行表征，观察复合材料表面形貌。结果如图2～5所示。图2和图4分别为聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料的SEM和TEM照片。图3和图5分别为钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料的SEM和TEM照片。从图中可以看出，聚多巴胺和多金属氧酸盐复合得到尺寸均一的微球结构，粒径为500-600nm。固定钛离子后，微球表面变得粗糙，尺寸和结构没有明显改变。

将所述的(2)和(3)得到的产物用X-射线光电子能谱(XPS)进行表征，得到两种复合材料的化学组成。图6为聚多巴胺-多金属氧酸盐和钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料的XPS全谱图，图7、图8和图9分别为钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料的O 1s，N1s和Ti2p的精细XPS谱图。实验结果表明，本实施例中钛离子能够成功固定在聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料表面。

将上述制备得到的钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料作为吸附剂应用于选择性吸附/洗脱标准磷酸化蛋白。具体应用步骤如下：

(1)将两种磷酸化蛋白模型(卵清蛋白Ova和β-酪蛋白β-ca)和六种非磷酸化蛋白模型(免疫球蛋白IgG、辣根过氧化物酶HRP、转铁蛋白Trf、溶菌酶Lys、α-乳白蛋白α-La、牛血清白蛋白BSA)配成100μg mL^-1水溶液，作为模型蛋白溶液。

(2)取0.5mg钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料于1.5mL离心管中，分别加入1mL(1)中的八种模型蛋白溶液，振荡吸附30min，混合液在8000rpm转速下离心5min，得到上清液。

(3)收集上清液与考马斯亮蓝工作液以体积比1比5混合，并用紫外可见光谱仪在595nm处检测吸光度，计算蛋白质的浓度和相应的吸附效率E₁。

式中，E₁为蛋白质的吸附效率(％)；C₀为蛋白质的原始浓度(μg mL^-1)；C₁为吸附后溶液上清液中蛋白质的浓度(μg mL^-1)

(4)去除吸附后的上清液，用1mL去离子水清洗材料表面，再用1mL pH＝7B-R洗脱剂振荡洗脱30min，混合液在8000rpm转速下离心5min，得到洗脱液并计算洗脱效率E₂。

式中，E₂为蛋白质的洗脱效率(％)；C₀为蛋白质的原始浓度(μg mL^-1)；C₁为吸附后溶液上清液中蛋白质的浓度(μg mL^-1)；C₂为洗脱液中蛋白质的浓度(μg mL^-1)。

pH＝7 B-R洗脱剂(Britton-Robinson，40mmol L^-1)的配制：准确称取0.2470g硼酸于50mL烧杯中，用少量水加热溶解冷却后转入至100mL容量瓶中；准确称取0.2326mL 85％磷酸、0.2292mL冰乙酸于上述容量瓶中，去离子水稀释至刻度，摇匀。用0.2mol L^-1NaOH溶液调节至pH＝7。

(5)吸附实验在常温下进行。用0.1mol L^-1HCl和NaOH调节去离子水，以制得不同pH＝4和pH＝10的稀释液，以及pH＝7水，作为稀释液。用1mol L^-1NaCl与去离子水按不同体积比混合制得不同浓度NaCl。等温吸附实验中，用钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料分别吸附不同浓度磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白至达到吸附平衡。吸附容量Q可根据以下公式得出：

式中，Q为复合材料对β-酪蛋白的吸附容量；C₀为β-酪蛋白的初始浓度(μg mL^-1)；C₁为吸附后上清液中蛋白质的浓度(μg mL^-1)；V为β-酪蛋白溶液的体积(mL)；M为复合材料的质量(mg)。

并根据蛋白的等温吸附曲线进行Langmuir线性拟合。将从材料表面洗脱后的磷酸化蛋白和标准磷酸化蛋白的圆二色光谱图进行对比，研究洗脱剂对蛋白质构象的影响。

不同pH值稀释液稀释下，钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料对两种磷酸化蛋白和六种非磷酸化的吸附效率图如图10所示，不同盐浓度下，钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料对β-酪蛋白和BSA的吸附效率图如图11所示。考察了不同pH值稀释液下，钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料对磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白的吸附效率。由图10可以看出无论在稀释液pH＝4,7,10条件下，Ova和β-酪蛋白的吸附效率都远高于其他非磷酸化蛋白，归因于钛离子和磷酸化蛋白中磷酸根的亲和作用，以及多金属氧酸盐与磷酸根基团的π堆积作用。考察了不同盐浓度下，该复合材料对磷酸化蛋白β-酪蛋白和非磷酸化蛋白BSA的吸附效率。由图11可以看出，按照常规方式，分别向磷酸化蛋白β-酪蛋白和非磷酸化蛋白BSA中加入NaCl，NaCl浓度从0mol L^-1到0.5mol L^-1时，β-酪蛋白的吸附效率均在100％左右，并且远高于BSA的吸附效率，由此可以得出，本申请技术方案在不添加NaCl基础上，即可完成磷酸化蛋白吸附。

钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料对β-酪蛋白和BSA的吸附等温曲线如图12所示。随着蛋白浓度的增加，材料对蛋白的吸附容量随之增加，当β-ca浓度达到900μgmL^-1时，吸附达到平衡，最大吸附容量为1171mg g^-1，而BSA浓度在400μg mL^-1时，吸附已经达到平衡，最大吸附容量为30mg g^-1。磷酸化蛋白的吸附容量高于非磷酸化蛋白39倍，说明钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料对磷酸化蛋白具有较高的选择性。将β-酪蛋白的吸附等温曲线进行Langmuir线性拟合，结果如图13所示。由图可知，该曲线线性良好，R²值可达到0.99以上，说明该吸附过程符合Langmuir吸附模型，即单分子层吸附，理论最大吸附容量可达1250mg g^-1与实验值相符。

本实验选择了几种温和的洗脱剂回收磷酸化蛋白，不同洗脱剂从复合材料表面洗脱β-酪蛋白的洗脱效率结果图如图14所示。该图数据仅为一次洗脱效率图，仅做最优选洗脱剂选取实验，不代表最终洗脱结果。多种洗脱剂均对β-酪蛋白有良好的回收能力，相比之下，pH＝7B-R洗脱剂对β-酪蛋白的回收率最高，可达81.5％，pH＝7咪唑溶液对β-酪蛋白的回收率达74.8％，pH＝8Tris-HCl溶液对β-酪蛋白的回收率达63.3％，pH＝7Na₂HPO₄溶液对β-酪蛋白的回收率达54.6％，因此选择pH＝7B-R作为最优选择洗脱剂。

为了考察上述洗脱剂在回收过程中对蛋白质构象是否有影响，将从材料表面洗脱下来的β-酪蛋白溶液进行圆二色光谱分析，并与标准β-酪蛋白溶液(将β-酪蛋白溶解在pH＝7B-R洗脱剂中)进行对比，标准β-酪蛋白和经过复合材料吸附洗脱过程后的β-酪蛋白的圆二色光谱图结果如图15所示。两个圆二色谱图几乎重合，并且都在200nm处出现一个负吸收峰，此峰归属于β-酪蛋白中类似聚脯氨酸Ⅱ的片段。此实验结果说明：经过在材料表面吸附洗脱过程的β-酪蛋白的二级结构不发生改变，说明该洗脱剂对蛋白质构象无影响。

将上述制备得到的钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料作为吸附剂，应用于吸附标准蛋白混合样，具体应用步骤如下：

(1)固定β-酪蛋白的质量为200μg，将BSA和β-酪蛋白以不同质量比(1:1,10:1,20:1,50:1,100:1)混合，形成五组不同质量比蛋白混合溶液。五组不同质量比蛋白混合溶液中β-酪蛋白浓度200μg/mL，BSA浓度分别为200μg/mL、2000μg/mL、4000μg/mL、10mg/mL、20mg/mL；

(2)取2mg钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料于1.5mL离心管中，加入1mL(1)中五组不同质量比蛋白混合溶液，振荡吸附30min，混合液在8000rpm转速下离心5min。

(3)去除上清液，用1mL去离子水清洗材料表面，再用1mL pH＝7B-R洗脱剂振荡洗脱30min，混合液在8000rpm转速下离心5min。

(4)重复步骤(3)三次，收集所有洗脱液，超滤浓缩至100μL，用于SDS-PAGE分析。商业化磷酸化蛋白富集试剂盒按照说明书步骤用于富集质量比BSA：β-酪蛋白＝100:1混合形成的混合样品作为对比。

(5)蛋白回收率＝(洗脱液中的蛋白质含量/原始蛋白混合物中蛋白质的含量)×100％。富集因子＝磷酸化蛋白的回收率/非磷酸化蛋白的回收率。电泳图中蛋白质的含量采用ImageJ软件测定。BSA和β-酪蛋白的蛋白回收率和富集因子用来评估复合材料对磷酸化蛋白的富集性能。

本实施例的经过复合材料和试剂盒处理后不同质量比的BSA和β-酪蛋白的回收液的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图如图16所示。泳道1为蛋白质标准分子量；泳道2为BSA和β-酪蛋白以质量比1：1混合时的电泳图；泳道3-7为BSA和β-酪蛋白分别以质量比为1：1，10：1，20：1，50：1和100：1混合时，经复合材料吸附洗脱后的回收液电泳图；泳道8为BSA和β-酪蛋白以质量比为100：1混合时，经磷酸化蛋白试剂盒吸附洗脱后的回收液电泳图。从泳道3～7中可以看出，随着BSA质量的不断增加，仍有β-酪蛋白条带在洗脱液中出现，并且在高比例BSA存在时，仍有少量β-酪蛋白洗脱出来，说明复合材料能够从高浓度非磷酸化蛋白中分离出磷酸化蛋白，实现磷酸化蛋白的富集。相比之下，如泳道8所示，当用试剂盒吸附洗脱质量比为100：1的BSA和β-酪蛋白混合液时，洗脱液中存在大量BSA条带以及BSA拖尾的条带，可能的原因是高浓度下BSA的溶解性较差，未溶解的样品在电泳图中会出现拖尾现象。这说明试剂盒对磷酸化蛋白的选择性不如本实验所制备的复合材料。图17为不同质量比的BSA和β-酪蛋白的回收率，图18为不同质量比的BSA和β-酪蛋白的富集因子。图17中β-酪蛋白的回收率可高达72％，而BSA的回收率均在13％以下。磷酸化蛋白的回收率大约是非磷酸化蛋白的12倍，说明本实验的复合材料对磷酸化蛋白具有高回收能力。图18中的富集因子用来评估材料对磷酸化蛋白富集能力的强弱。从图中可以看出，随着BSA与β-酪蛋白质量比的增加，材料的富集因子逐渐增加，当BSA与β-酪蛋白的质量比达到100:1时，富集因子达到150倍，这种富集过程可以被认为是一种蛋白质纯化过程。此结果说明钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料可以实现磷酸化蛋白的富集，且富集效果优于商业化的试剂盒。

将上述制备得到的钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料作为吸附剂，应用于实际样品中磷酸化蛋白的分离，具体应用步骤如下：待富集磷酸化蛋白溶液中磷酸化蛋白浓度为50～900μg/mL，优选100μg/mL。

(1)取新鲜鸡蛋清原液，用去离子水稀释50倍，搅拌均匀，8000rpm离心20min，收集上清液。向50倍蛋清稀释液中加入溶菌酶(Lys，非磷酸化蛋白)标准溶液，配制成100倍蛋清稀释液，作为鸡蛋清样品液，并加标100μg mL^-1Lys。超市购买的新鲜牛奶用去离子水稀释20倍，作为牛奶样品液，以备使用。蛋清原液中各蛋白占比为：卵清蛋白61.9g/L，伴清蛋白29.7g/L，卵转铁蛋白6.0g/L。牛奶原液中各蛋白占比为：α-酪蛋白13.2g/L，β-酪蛋白9.9g/L，β-乳球蛋白3.4～4.5g/L，α-乳清蛋白1.0～1.5g/L。

(2)并行两组实验，分别取2mg钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料于1.5mL离心管中，各自相应加入1mL(1)中实际鸡蛋清样品溶液和牛奶样品溶液，振荡吸附30min，磷酸化蛋白吸附率达到100％，混合液在8000rpm转速下离心5min。

(3)移取上清液。用1mL去离子水清洗材料表面，再用0.2mL pH＝7B-R洗脱剂振荡洗脱30min，形成洗脱液与富集材料表面富集有磷酸化蛋白的混合液，混合液在8000rpm转速下离心5min，形成含有磷酸化蛋白的洗脱液，重复洗脱离心步骤3次，完成磷酸化蛋白富集。

(4)收集原实际样品溶液，吸附后上清液和洗脱液留作SDS-PAGE分析。

图19为复合材料处理的鸡蛋清样品液的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。泳道1为蛋白质标准分子量；泳道2为鸡蛋清样品液加入浓度为100μg mL^-1的溶菌酶；泳道3为经复合材料吸附后，鸡蛋清样品液加入浓度为100μg mL^-1的溶菌酶的上清液；泳道4为经复合材料吸附一次洗脱后，鸡蛋清样品液加入浓度为100μg mL^-1的溶菌酶的洗脱液。泳道5为浓度为100μg mL^-1的卵清蛋白标准溶液。原始蛋清稀释液有许多蛋白条带(泳道2)，包括伴清蛋白(Cona,77.7kDa),卵转铁蛋白(Ovo,49kDa),卵清蛋白(Ova,44.3kDa)和溶菌酶(Lys,14.3kDa)。经过钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料处理后，磷酸化蛋白条带(Ova)变弱，而其他非磷酸化蛋白条带(Cona，Ovo，Lys)基本不变(泳道3)。在洗脱液中(泳道4)，仅有一条Ova蛋白条带出现，并且此条带与标准Ova条带位置一致，说明钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料能够从鸡蛋清中分离得到卵清蛋白。

饮用牛奶样品被用来进一步验证该复合材料对磷酸化蛋白的吸附能力。图20为复合材料处理的牛奶样品液的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。泳道1为蛋白质标准分子量；泳道2为牛奶样品液；泳道3为经复合材料吸附后，牛奶样品液的上清液；泳道4为经复合材料吸附一次洗脱后，牛奶样品液的洗脱液。牛奶原液包含磷酸化蛋白条带从19kDa到35kDa对应于α-酪蛋白(α-ca)，β-酪蛋白(β-ca)和κ-酪蛋白(κ-ca)，还有非磷酸化蛋白条带α-乳清蛋白(α-La,14.2kDa)和β-乳球蛋白(β-Lg,18.4kDa)(泳道2)。经过钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料处理后，洗脱液中仅能看到磷酸化蛋白条带(α-ca和β-ca)(泳道4)，而大多数非磷酸化条带留在了上清液中(泳道3)。这些结果表明，钛螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料对复杂实际样品中的磷酸化蛋白具有较高的吸附选择性。经检测，本实施例制备的磷酸化蛋白富集材料，对牛奶进行富集回收时，磷酸化蛋白回收率达到96％，当对蛋清进行磷酸化蛋白回收时，磷酸化蛋白回收率达到94％。

以上的实施例仅是对本发明的实施方式进行描述，并非对范围进行限定。在不脱离本发明设计精神的前提下，对本实验新型作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种磷酸化蛋白富集材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，多金属氧酸盐(M⁺)_xNa_1.5[NaP₅W₃₀O₁₁₀]^14-的制备：

(1)将二水合钨酸钠溶解在去离子水中，形成二水合钨酸钠溶液，所述溶液浓度为0.5~1.1 g/mL，将二水合钨酸钠溶液与磷酸溶液，按溶质摩尔比，二水合钨酸钠：磷酸=1：6混合，搅拌均匀，形成混合物；

(2)将混合物于反应釜中，在120~160℃下反应10-24 h，待反应釜自然冷却至室温，取出产物；

(3)向产物中加入水搅拌溶解，并在搅拌过程中加入金属氯化物，按摩尔比产物成分：金属氯化物=1:(10~15)，搅拌过程中生成白色沉淀，搅拌0.5~1.5h至白色沉淀量无变化后，收集沉淀，并用甲醇洗涤，干燥，获得固体，其中，所述的金属氯化物为氯化钾或氯化钠；

(4)对固体进行提纯，得到提纯后产物，即为多金属氧酸盐(M⁺)_xNa_1.5[NaP₅W₃₀O₁₁₀]^14-；

步骤2，聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料的制备：

(1)将提纯后产物配成浓度为1~6mg/mL的水溶液，搅拌条件下加入多巴胺，形成混合物；

(2)将混合物于反应釜中，120~160^oC下，加热16~36h，待反应釜冷却至室温后，收集产物，用去离子水清洗，干燥，获得聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料；

步骤3，金属离子螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料的制备：

(1)将聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料加入金属离子溶液中，复合材料加入金属离子配制的溶液，复合材料和溶液中金属化合物溶质按质量比为1：(5~20)混合，磁力搅拌20~40min，形成均匀溶液，其中，所述的金属离子为钛离子，钛离子来源于硫酸钛；

(2)将均匀溶液放置摇床中，25~40^oC，200r/min下，振荡培育2~10h，重复离心清洗，至上清液中没有金属离子后，将产物干燥，制得金属离子螯合聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料，即为磷酸化蛋白富集材料，富集材料中金属离子质量占比8~10%。

2.根据权利要求1所述的磷酸化蛋白富集材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤2(1)中，多巴胺与提纯后产物的质量比为(0.5~1):1。

3.根据权利要求1所述的磷酸化蛋白富集材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤2(2)中，聚多巴胺-多金属氧酸盐复合材料为微球状，所述的微球粒径为500-600nm，所述的干燥方式为冻干，冻干温度-40~-50℃，时间8~15h。

4.根据权利要求1所述的磷酸化蛋白富集材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤3(1)中，所述的金属离子溶液浓度为0.05~0.1mol/L，所述的干燥方式为冻干，冻干温度为-40~-50℃，时间8~15h。

5.根据权利要求1所述的方法制备的磷酸化蛋白富集材料的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取待富集磷酸化蛋白溶液，向溶液中加入磷酸化蛋白富集材料，按配比，待富集磷酸化蛋白溶液：磷酸化蛋白富集材料=1：(0.5~2)，单位mL：mg，振荡吸附20~40min，形成混合液；

(2)混合液离心3-7 min，移取上清液，用去离子水清洗材料表面，再用洗脱剂振荡洗脱20~40min，形成洗脱液与富集材料表面富集有磷酸化蛋白的混合液，混合液在8000 rpm 转速下离心3~7 min，形成含有磷酸化蛋白的洗脱液，重复洗脱离心步骤3~5次，完成磷酸化蛋白富集。

6.根据权利要求5所述的磷酸化蛋白富集材料的应用方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，待富集磷酸化蛋白溶液中磷酸化蛋白浓度为50~900μg/mL，待富集磷酸化蛋白溶液为由牛奶、蛋清含有磷酸化蛋白的成分加入稀释液稀释而成，所述的稀释液pH为4~10，当稀释液pH为7时，稀释液为水；pH为4~7时，稀释液为由水与HCl混合调至而成；当pH为7~10时，稀释液为由水与NaOH混合调至而成。

7.根据权利要求5所述的磷酸化蛋白富集材料的应用方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，待富集磷酸化蛋白溶液中磷酸化蛋白吸附率达到100%。

8.根据权利要求5所述的磷酸化蛋白富集材料的应用方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，洗脱剂为B-R溶液，咪唑溶液，Tris-HCl溶液或Na₂HPO₄溶液，所述的洗脱剂pH为4~10，浓度为0.04~0.1 mol/L。

9.根据权利要求5所述的磷酸化蛋白富集材料的应用方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，当对牛奶进行磷酸化蛋白回收时，磷酸化蛋白回收率达到90%以上，当对蛋清进行磷酸化蛋白回收时，磷酸化蛋白回收率达到90%以上。

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