CN110987914B - 基于Zr-MOF纳米酶的磷酸化蛋白检测和区分的方法及α-酪蛋白定量检测 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析化学技术领域，涉及磷酸化蛋白检测，尤其涉及一种基于Zr‑MOF纳米酶的磷酸化蛋白检测和区分的方法。磷酸化蛋白质可以抑制3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺（TMB）的显色而非磷酸化蛋白促进或者无影响TMB的显色，本发明首先配制磷酸化状态不同的蛋白质溶液、Zr‑MOF纳米酶和醋酸缓冲液的混合溶液，再依次加入TMB和H2O2，待显色反应完成后，依据溶液验收差异即可区别二类蛋白。本发明还公开了基于Zr‑MOF纳米酶的α‑酪蛋白定量检测方法，其可检测浓度范围为0.17～5µg/mL，检测限低至0.16µg/mL；其他磷酸化蛋白质亦同理。本发明不仅可以定性区分磷酸化蛋白质和非磷酸化蛋白质，还可以定量检测磷酸化蛋白质，成本低、灵敏度高、重复性好、检测速度快，可用于食品、医学等诸多领域。
Description
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，涉及磷酸化蛋白检测，尤其涉及一种基于Zr-MOF纳米酶的磷酸化蛋白检测和区分的方法及α-酪蛋白定量检测。
背景技术
纳米酶是一类既有纳米材料的独特性能，又有催化功能的模拟酶。纳米酶具有催化效率高、稳定、经济和可规模化制备的特点，近年来，它逐步取代天然酶在医学、化工、食品、农业和环境等领域得到广泛应用。金属有机框架（MOFs）在许多方面得到了广泛使用，包括气体吸附和储存、分子分离、有机催化和药物的持续释放等。随着研究的深入，许多MOFs还发现了纳米酶的特性，使其具有更多的应用价值。因此合成一种具有纳米酶活性的MOFs用于分析检测具有重要意义。
蛋白质磷酸化是调节和控制蛋白质活性和功能的最基本、最普遍、也是最重要的机制。蛋白质的可逆磷酸化过程几乎与所有生命活动密切相关，其中包括调控基因的表达和转录、蛋白质的合成和代谢的调控、肌肉收缩、肿瘤产生以及神经活动等。因此，有必要开展蛋白质磷酸化分析检测，以探索基本的生物学过程以及预防早期疾病等。
目前磷酸化蛋白质检测和区分的方法有：放射性同位素标记法、蛋白质印迹法、酶联免疫吸附法、质谱法、流式细胞术等。中国专利CN109030828A《一种检测组氨酸磷酸化蛋白的ELISA检测试剂盒及检测方法》公开了一种酶联免疫法检测检测组氨酸磷酸化蛋白的方法，该方法操作简单，高效灵敏，易于标准化。中国专利CN106770867A《一种富集检测磷酸化蛋白的方法》公开了一种富集检测磷酸化蛋白的方法，该方法可实现复杂混合物中磷酸化蛋白高选择性、高重复性和高通量地富集检测。
然而上述方法中大多数需要使用昂贵的抗体，提高了检测成本。此外，抗体还会导致免疫组化伪像和不同表位之间的交叉反应，势必影响检测的准确性；部分方法严重依赖于大型仪器设备和专业操作，因此无法实现随时随地的快速检测。因此，开发一种低成本、无抗体、易于操作的方法来检测和区分磷酸化蛋白显得十分重要。
基于以上问题，考虑到比色法检测原理简单、操作简单、成本低廉，是一种较为理想的检测方法。而且，基于Zr-MOF纳米酶的过氧化物酶活性的分光光度法用来检测和区分磷酸化蛋白质，目前尚未见报道。
发明内容
针对上述现有技术中存在的不足，本发明的第一个目的在于公开了基于Zr-MOF纳米酶的磷酸化蛋白检测和区分的方法。
该方法以Zr-MOF为类过氧化酶模拟物，在酸性条件下，催化H2O2与显色剂（TMB）之间的反应，产生显色物质（TMBox）。由于磷酸化蛋白质上的磷酸基团会与Zr-MOF上Zr特异性的结合，导致Zr-MOF上的酶活性位点被掩蔽，从而影响该类过氧化物酶催化底物的能力，导致显色物质呈现出不同的颜色变化。磷酸化蛋白质可以抑制TMB的显色而非磷酸化蛋白促进或者无影响TMB的显色，本发明基于该原理构建比色传感阵列对磷酸化蛋白质和非磷酸蛋白质进行区分。
技术方案如下：
一种基于Zr-MOF纳米酶的磷酸化蛋白检测和区分的方法，包括如下步骤：
1）分别于5 mL离心管中加入0.03 mL 1 mg/mL磷酸化状态不同的蛋白质溶液,0.1 mL 1 mg/mL Zr-MOF纳米酶和0.267 mL醋酸缓冲液，反应1～15 min，优选3 min；所述磷酸化程度不同的蛋白质为α-酪蛋白、卵清蛋白、牛血清白蛋白、甜蛋白、清蛋白、乳铁蛋白和胶原蛋白；
2）再向混合液中依次加入0.1 mL 5 mM的TMB和0.1 mL 200 mM的H2O2，确定溶液最终总体积为3 mL，混匀体系后反应10～60 min，优选30 min；
同时，以不加蛋白质溶液的空白组做对比，处理步骤一致；
3）待测样品按步骤1）-2）进行处理，裸眼观察待测样品溶液和空白组溶液颜色的差异，对磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白进行初步的区分，比空白组颜色浅的样品组的蛋白质为磷酸化蛋白质，而且溶液越浅的样品组中的蛋白质的磷酸程度越高；
或者，
用紫外-可见吸收分光光度计测定各组混合溶液的紫外吸收光谱，并记录波长为652 nm处的吸光度，比较待测样品溶液与空白组溶液吸光度值的大小，待测样品溶液的吸光度值小于空白组吸光度值百分之十及以上的为磷酸化蛋白质，与空白组吸光度值相近或者大于空白组的为非磷酸化蛋白质。
本发明较优公开例中，步骤1）中所述醋酸盐缓冲液pH为4，浓度0.2 M。
本发明还有一个目的，鉴于磷酸化蛋白质可以抑制TMB的显色而非磷酸化蛋白促进或者无影响TMB的显色，还可以对磷酸化蛋白质进行定量检测，本发明以α-酪蛋白质为磷酸化蛋白质的代表，其他磷酸化蛋白质亦同理可用如下方法进行定量检测分析。
一种基于Zr-MOF纳米酶的α-酪蛋白定量检测方法，包括如下步骤：
A）分别于5 mL离心管中加入0.1 mL 不同浓度的α-酪蛋白溶液、0.1 mL 1 mg/mLZr-MOF纳米酶和0.26 mL醋酸缓冲液，反应1～15 min，优选3 min；所述α-酪蛋白溶液在体系内的最终浓度为0.1 µg/ mL、0.17 µg/ mL、0.33 µg/ mL、0.67 µg/ mL、1 µg/ mL、1.67µg/ mL、2.33 µg/ mL、3.33 µg/ mL、4 µg/ mL、5 µg/ mL、6.67 µg/ mL或10 µg/ mL；
B）再向混合液中依次加入0.1 mL 5 mM的TMB和0.1 mL 200 mM的H2O2，确定溶液最终总体积为3 mL，混匀体系后反应10～60 min，优选30 min；
C）用紫外-可见吸收分光光度计测定混合溶液紫外吸收光谱，记录波长为652 nm处的吸光度并绘制以TMB为显色剂的α-酪蛋白浓度-吸光度标准工作曲线；
D）待测α-酪蛋白样品按步骤A）-B）进行处理，测得紫外吸收光谱数值，与标准工作曲线进行比对，即得待测样品中所含α-酪蛋白含量。
本发明较优公开例中，步骤A）中所述醋酸盐缓冲液pH为4，浓度0.2 M。
本发明较优公开例中，步骤D）所述待测α-酪蛋白样品，其可检测浓度范围为0.17～5 µg/ mL，检测限低至0.16 µg/ mL。
利用主成分分析（PCA），本发明进一步对磷酸化和非磷酸化蛋白质进行区分。
基于Zr-MOF纳米酶的磷酸化蛋白检测和区分的主成分分析方法，包括如下步骤：
1）分别将0.1 mL 0.2 mg/mL 四种不同的蛋白质溶液，0.1 mL 1 mg/mL Zr-MOF纳米酶和0.26 mL的醋酸缓冲液混合并添加到4×6区域的24孔微孔板的单孔中，反应1～15min，优选3 min；所述的四种不同的蛋白质为α-酪蛋白、卵清蛋白、牛血清白蛋白和甜蛋白；
2）再向混合液中依次加入0.1 mL 5 mM的TMB和0.1 ml 200 mM的H2O2，确定溶液最终总体积为3 mL，混匀体系后反应10～60 min，优选30 min；
3）用紫外-可见吸收分光光度计测定混合溶液紫外吸收光谱，记录0～30min间每隔3分钟的652 nm波长处的吸光度；
4）重复测量三次实验，并通过主成分分析的方法对获得的数据进行分析，以获得二维的主成分分析图。
本发明较优公开例中，步骤1）中所述醋酸盐缓冲液pH为4，浓度0.2 M。
本发明的第三个目的在于，公开了上述Zr-MOF纳米酶的合成方法，包括如下步骤：
a)将2,2'-联吡啶-4,4'-二羧酸和锆盐溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中搅拌均匀形成反应混合物，加入调节剂，超声处理10min后，移入反应釜中，80～150℃加热8～18h，优选120℃反应12 h；其中，所述2,2'-联吡啶-4,4'-二羧酸：铈盐：DMF：调节剂的摩尔体积比为1mmol：1～3mmol：10～50 mL：1～5 g，优选1mmol：1.2mmol：20 mL：2.9 g；
b)冷却至室温后，离心收集沉淀，分别用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和四氢呋喃(THF)洗涤后，25℃真空干燥6h得到粉红色Zr-MOF纳米酶。
本发明较优公开例中，步骤a）中所述锆盐为ZrCl4、ZrOCl2或Zr(NO3)4，优选ZrCl4；本发明较优公开例中，步骤a）中所述调节剂为乙酸、甲酸或苯甲酸，优选苯甲酸。
在本说明书中，术语“类过氧化物酶”是指具有过氧化物酶催化活性的材料。具体地，本发明的类过氧化物酶以过氧化氢作为电子受体，通过氧化相应底物生成有色物质，用于比色检测。
在本说明书中，术语“TMB”是化合物“3,3’,5,5’-四甲基联苯胺”的缩写名称，二者可互换使用。
在本说明书中，术语“Zr-MOF纳米酶”是指锆金属有机框架类过氧化物酶，二者可互换使用。
有益效果
本发明利用Zr-MOF纳米酶的过氧化物酶活性，在最适pH 4.0左右，实现了对磷酸化蛋白质和非磷酸化蛋白质的区分；实现了对磷酸化蛋白质（以α-酪蛋白为例）的定量检测。利用主成分分析(PCA）的方法，进一步对磷酸化蛋白质和非磷酸化蛋白质的进行区分。本发明不仅可以定性的区分磷酸化蛋白质和非磷酸化蛋白质，还可以定量检测磷酸化蛋白质，其成本低、灵敏度高、重复性好、检测速度快，可用于食品、医学等诸多领域。
附图说明
图1. Zr-MOF纳米酶对磷酸化蛋白检测和区分的原理图；
图2. Zr-MOF纳米酶的扫描电子显微镜图（SEM）；
图3. Zr-MOF纳米酶的过氧化物酶效果图；
图4. Zr-MOF纳米酶的酶活性来源的验证图；
图5. Zr-MOF纳米酶的pH优化效果图；
图6. 区分磷酸化和非磷酸化蛋白质的鉴别图；
图7. α-酪蛋白的定量检测标准工作曲线;
图8. 用主成分分析的方法，对磷酸化和非磷酸蛋白质的区分图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明，以使本领域技术人员更好地理解本发明，但本发明并不局限于以下实施例。
除非另外限定，这里所使用的术语（包含科技术语）应当解释为具有如本发明所属技术领域的技术人员所共同理解到的相同意义。还将理解到，这里所使用的术语应当解释为具有与它们在本说明书和相关技术的内容中的意义相一致的意义，并且不应当以理想化或过度的形式解释，除非这里特意地如此限定。
实施例1
Zr-MOF纳米酶的制备方法，包括以下步骤：
(1) 将0.5 mmol 2,2'-联吡啶-4,4'-二羧酸和0.5 mmol氯化锆（IV），溶解在15mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中；
(2) 将2g苯甲酸加入到(1)中的反应混合物中，超声处理10分钟后，将混合物溶液装入反应釜中，80°C加热8 h；
(3) 等反应釜和内容物冷却至室温后，通过离心收集Zr-MOF，并分别用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和四氢呋喃(THF)洗涤2次后放入25℃真空烘箱干燥6小时得到粉红色产物。
Zr-MOF类过氧化物酶催化过氧化氢氧化其底物反应的应用实验：
取2.7 mL 0.2 M的醋酸盐缓冲液（pH为4），依次向其中加入0.1 mL 200 mM的H2O2，0.1 mL 5 mM 的TMB和0.1 mL 1 mg/mL Zr-MOF的分散溶液，然后将上述溶液混合均匀；用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液反应30 min之内在652 nm处的吸光度。
实施例2
Zr-MOF纳米酶的制备方法，包括以下步骤：
(1) 将0.5 mmol 2,2'-联吡啶-4,4'-二羧酸和1.0 mmol氯化锆（IV），溶解在20mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中；
(2) 将2g苯甲酸加入到(1)中的反应混合物中，超声处理10分钟后，将混合物溶液装入反应釜中，120°C加热12 h；
(3) 等反应釜和内容物冷却至室温后，通过离心收集Zr-MOF，并分别用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和四氢呋喃(THF)洗涤2次后放入25℃真空烘箱干燥6小时得到粉红色产物。
Zr-MOF类过氧化物酶催化过氧化氢氧化其底物反应的应用实验：
取2.7 mL 0.2 M的醋酸盐缓冲液（pH为4），依次向其中加入0.1 mL 200 mM的H2O2，0.1 mL 5 mM 的TMB和0.1 mL 1 mg/mL Zr-MOF的分散溶液，然后将上述溶液混合均匀；用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液反应30 min之内在652 nm处的吸光度。
实施例3
Zr-MOF纳米酶的制备方法，包括以下步骤：
(1) 将0.5 mmol 2,2'-联吡啶-4,4'-二羧酸和1.5 mmol氯化锆（IV），溶解在20mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中；
(2) 将3g苯甲酸加入到(1)中的反应混合物中，超声处理10分钟后，将混合物溶液装入反应釜中，150°C加热18 h；
(3) 等反应釜和内容物冷却至室温后，通过离心收集Zr-MOF，并分别用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和四氢呋喃(THF)洗涤2次后放入25℃真空烘箱干燥6小时得到粉红色产物。
Zr-MOF类过氧化物酶催化过氧化氢氧化其底物反应的应用实验：
取2.7 mL 0.2 M的醋酸盐缓冲液（pH为4），依次向其中加入0.1 mL 200 mM的H2O2，0.1 mL 5 mM 的TMB和0.1 mL 1 mg/mL Zr-MOF的分散溶液，然后将上述溶液混合均匀；用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液反应30 min之内在652 nm处的吸光度。
实施例4
Zr-MOF催化过氧化氢氧化其底物反应的实验
1）实验体系a: 将0.1 mL 1 mg/mL Zr-MOF纳米酶，0.1 mL 5 mM 的TMB，0.1 mL200 mM的H2O2和2.7 mL 0.2 M的醋酸盐缓冲液（pH为4）加入到5mL离心管中，混合均匀；
实验体系b: 将0.1 mL 5 mM 的TMB，0.1 mL 200 mM的H2O2和2.8 mL 0.2 M的醋酸盐缓冲液（pH为4）加入到5mL离心管中，混合均匀；
实验体系c: 将0.1 mL 1 mg/mL Zr-MOF纳米酶，0.1 mL 200 mM的H2O2和2.8 mL0.2 M的醋酸盐缓冲液（pH为4）加入到5mL离心管中，混合均匀；
实验体系d: 将0.1 mL 1 mg/mL Zr-MOF纳米酶，0.1 mL 5 mM 的TMB和2.7 mL0.2 M的醋酸盐缓冲液（pH为4）加入到5mL离心管中，混合均匀；
2）将各实验体系所得混合液在室温下反应30 min；
3）用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外-可见吸收光谱。
如图3所示，实验体系a显示出明显的紫外吸收峰，说明Zr-MOF纳米酶在pH 4.0的条件下具有良好的过氧化物酶活性；实验体系b在652nm处无明显的峰，说明若无Zr-MOF纳米酶作催化剂将无明显反应；实验体系c在652nm处无明显的峰，说明实验体系a中的峰不是由于Zr-MOF纳米酶自身的响应造成的；实验体系d在652nm处无明显的峰，说明Zr-MOF纳米酶不具有氧化酶活性。
实施例5
Zr-MOF纳米酶的酶活性来源验证
1）实验体系a: 将0.1 mL 1 mg/mL 2,2'-联吡啶-4,4'-二羧酸水溶液，0.1 mL 5mM 的TMB，0.1 mL 200 mM的H2O2和2.7 mL 0.2 M的醋酸盐缓冲液（pH为4）加入到5mL离心管中，混合均匀；
实验体系b: 将0.1 mL 1 mg/mL Zr-MOF纳米酶，0.1 mL 5 mM 的TMB，0.1 mL 200mM的H2O2和2.7 mL 0.2 M的醋酸盐缓冲液（pH为4）加入到5mL离心管中，混合均匀；
实验体系c: 将0.1 mL 1 mg/mL的2-氨基对苯二甲酸作为配体的Zr-MOF的水分散液，0.1 mL 5 mM 的TMB，0.1 mL 200 mM的H2O2和2.7 mL 0.2 M的醋酸盐缓冲液（pH为4）加入到5mL离心管中，混合均匀；
实验体系d: 将0.1 mL 1 mg/mL氯化锆（IV）水溶液，0.1 mL 5 mM 的TMB，0.1 mL200 mM的H2O2和2.7 mL 0.2 M的醋酸盐缓冲液（pH为4）加入到5mL离心管中，混合均匀；
2）将各实验体系所得混合液在室温下反应30 min；
3）用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外-可见吸收光谱。
如图4所示，实验体系a和实验体系b在652nm处有明显的紫外吸收峰，而实验体系c和实验体系d在652nm处无明显的峰，说明Zr-MOF纳米酶的活性来源于2,2'-联吡啶-4,4'-二羧酸配体。此外，对比实验体系a和实验体系b在652nm处的紫外吸收峰，明显的看出实验体系b在652nm处的吸收峰远强于实验体系a，说明通过合成MOF的结构可以明显增强2,2'-联吡啶-4,4'-二羧酸配体的酶活性。
实施例6
Zr-MOF纳米酶的pH优化
反应体系为：将0.1 mL 1 mg/mL Zr-MOF纳米酶，0.1 mL 5 mM 的TMB，0.1 mL 200mM的H2O2和2.7 mL 0.2 M不同pH的醋酸盐缓冲液（pH 3.0,4.0,5.0,6.0,7.0）加入到5mL离心管中，然后将上述溶液混合均匀，在室温下反应30 min后，利用紫外-可见吸收分光光度计测定其在652nm处的吸光度值。
如图5所示Zr-MOF纳米酶在pH 4.0的条件下，其过氧化物酶活性最好。
实施例7
磷酸化蛋白质和非磷酸化蛋白质的快速区分
1）分别于5 mL离心管中加入0.03 mL 1 mg/mL磷酸化状态不同的这七种蛋白质溶液（α-酪蛋白，卵清蛋白，牛血清白蛋白，甜蛋白，清蛋白，乳铁蛋白，胶原蛋白）, 0.1 mL 1mg/mL Zr-MOF和0.267 mL 0.2 M醋酸缓冲液（pH为4），反应3min;
2）向混合液中依次加入0.1 mL 5 mM的TMB和0.1 mL 200 mM的H2O2，混匀体系后室温下反应30 min，同时，进行一组不加蛋白质的空白组做对比；
3）用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液反应30 min后在652 nm处的吸光度值。
如图6所示，加入甜蛋白、清蛋白、胶原蛋白或者乳铁蛋白的实验体系在652nm处的吸光值与空白对照组在652nm处的吸光值几乎一样，说明这三种蛋白质对Zr-MOF纳米酶的过氧化物酶活性没有影响，为非磷酸化蛋白质；加入牛血清白蛋白的实验体系在652nm处的吸光值虽然远大于空白对照组的，但它是由于牛血清白蛋白具有类似过氧化物酶活性的缘故，但它并没有抑制Zr-MOF纳米酶的过氧化物酶活性，所以牛血清白蛋白也为非磷酸化蛋白质；加入α-酪蛋白或者卵清蛋白的实验体系在652nm处的吸光值远小于空白对照组的，所以这两种蛋白质为磷酸化蛋白质，其中加入α-酪蛋白的实验体系在652nm处的吸光值最小，说明它的磷酸化程度高于卵清蛋白。此外，通过图6中的照片插图显示还可以用裸眼进行初步的区分。
以上表明，本发明所公开的方法可以成功的用于磷酸化蛋白质和非磷酸化蛋白质的区分。
实施例8
磷酸化蛋白质（以α-酪蛋白为例）的定量检测
1）分别于5 mL离心管中加入0.1 mL 不同浓度的α-酪蛋白溶液, 0.1 mL 1 mg/mLZr-MOF和0.26 mL 0.2 M醋酸缓冲液（pH为4），反应3 min；所述α-酪蛋白溶液在体系内的最终浓度为0.1 µg/ mL、0.17 µg/ mL、0.33 µg/ mL、0.67 µg/ mL、1 µg/ mL、1.67 µg/ mL、2.33 µg/ mL、3.33 µg/ mL、4 µg/ mL、5 µg/ mL、6.67 µg/ mL或10 µg/ mL；
2）再向混合液中依次加入0.1 mL 5 mM的TMB和0.1 mL 200 mM的H2O2，确定溶液最终总体积为3 mL，混匀体系后室温下反应30 min；
3）用紫外-可见吸收分光光度计测定混合溶液紫外吸收光谱，记录波长为652 nm处的吸光度并绘制以TMB为显色剂的α-酪蛋白溶液浓度-吸光度标准工作曲线；
如图7所示，检测的线性范围为0.17—5 µg/ mL，拟合方程为A = -0.0554[α-酪蛋白] (µg/ mL) + 0.41194 (R2 = 0.9959)。此外，上述的检测策略还可以用于其它磷酸化蛋白质的定量检测。
实施例9
利用主成分分析对磷酸化蛋白质和非磷酸化蛋白质进行区分
1）分别将0.1 mL 0.2 mg/mL 四种不同的蛋白质溶液，0.1 mL 1 mg/mL Zr-MOF和0.26 mL 0.2 M的醋酸缓冲液（pH为4）混合并添加到4×6区域的24孔微孔板的单孔中，室温反应3 min；所述的四种不同的蛋白质为α-酪蛋白，卵清蛋白，牛血清白蛋白，甜蛋白；
2）再向混合液中依次加入0.1 mL 5 mM的TMB和0.1 ml 200 mM的H2O2，确定溶液最终总体积为3 mL，混匀体系后室温下反应30 min；
3）用紫外-可见吸收分光光度计测定混合溶液紫外吸收光谱，记录0～30min间每隔3分钟的652 nm波长处的吸光度值；
4）重复测量三次实验，并通过主成分分析的方法对获得的数据进行分析，以获得二维的主成分分析图。
从图8中可以看出这四种蛋白质在主成分分析图中完全分为四类，而且没有错误的分类证明了比色传感器阵列能成功地运用到磷酸化蛋白的鉴别。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (12)
1.一种基于Zr-MOF纳米酶的磷酸化蛋白检测和区分的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）分别于5 mL离心管中加入0.03 mL 1 mg/mL磷酸化程度不同的蛋白质溶液, 0.1 mL1 mg/mL Zr-MOF纳米酶和0.267 mL醋酸盐缓冲液，反应1～15 min；所述磷酸化程度不同的蛋白质为α-酪蛋白、卵清蛋白、牛血清白蛋白、甜蛋白、清蛋白、乳铁蛋白和胶原蛋白；
2）再向混合液中依次加入0.1 mL 5 mM的TMB和0.1 mL 200 mM的H2O2，确定溶液最终总体积为3 mL，混匀体系后反应10～60 min；
同时，以不加蛋白质溶液的空白组做对比，处理步骤一致；
3）待测样品按步骤1）-2）进行处理，裸眼观察待测样品溶液和空白组溶液颜色的差异，对磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白进行初步的区分，比空白组颜色浅的样品组的蛋白质为磷酸化蛋白质，而且溶液越浅的样品组中的蛋白质的磷酸化程度越高；
或者，
用紫外-可见吸收分光光度计测定各组混合溶液的紫外吸收光谱，并记录波长为652nm处的吸光度，比较待测样品溶液与空白组溶液吸光度值的大小，待测样品溶液的吸光度值小于空白组吸光度值百分之十及以上的为磷酸化蛋白质，与空白组吸光度值相近或者大于空白组的为非磷酸化蛋白质；
上述Zr-MOF纳米酶，其合成方法包括如下步骤：
a)将2,2'-联吡啶-4,4'-二羧酸和锆盐溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中搅拌均匀形成反应混合物，加入调节剂，超声处理10min后，移入反应釜中，80～150℃加热8～18 h；其中，所述2,2'-联吡啶-4,4'-二羧酸：锆盐：DMF：调节剂的摩尔体积比为1mmol：1～3mmol：10～50 mL：1～5g；
b)冷却至室温后，离心收集沉淀，分别用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和四氢呋喃(THF)洗涤后，25℃真空干燥6h得到粉红色Zr-MOF纳米酶。
2.根据权利要求1所述基于Zr-MOF纳米酶的磷酸化蛋白检测和区分的方法，其特征在于：步骤1）中所述反应3 min。
3.根据权利要求1所述基于Zr-MOF纳米酶的磷酸化蛋白检测和区分的方法，其特征在于：步骤1）中所述醋酸盐缓冲液pH为4，浓度0.2 M。
4.根据权利要求1所述基于Zr-MOF纳米酶的磷酸化蛋白检测和区分的方法，其特征在于：步骤2）中所述混匀体系后反应30min。
5.根据权利要求1所述基于Zr-MOF纳米酶的磷酸化蛋白检测和区分的方法，其特征在于：步骤a）中所述移入反应釜中，120℃反应12 h。
6.根据权利要求1所述基于Zr-MOF纳米酶的磷酸化蛋白检测和区分的方法，其特征在于：步骤a）中所述2,2'-联吡啶-4,4'-二羧酸：锆盐：DMF：调节剂的摩尔体积比为1mmol：1.2mmol：20mL：2.9g。
7.根据权利要求1所述基于Zr-MOF纳米酶的磷酸化蛋白检测和区分的方法，其特征在于：步骤a）中所述锆盐为ZrCl4、ZrOCl2或Zr(NO3)4；所述调节剂为乙酸、甲酸或苯甲酸。
8.一种基于Zr-MOF纳米酶的α-酪蛋白定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
A）分别于5 mL离心管中加入0.1 mL 不同浓度的α-酪蛋白溶液、0.1 mL 1 mg/mL Zr-MOF纳米酶和0.26 mL醋酸盐缓冲液，反应1～15 min；所述α-酪蛋白溶液在体系内的最终浓度为0.1 µg/ mL、0.17 µg/ mL、0.33 µg/ mL、0.67 µg/ mL、1 µg/ mL、1.67 µg/ mL、2.33µg/ mL、3.33 µg/ mL、4 µg/ mL、5 µg/ mL、6.67 µg/ mL或10 µg/ mL；
B）再向混合液中依次加入0.1 mL 5 mM的TMB和0.1 mL 200mM的H2O2，确定溶液最终总体积为3 mL，混匀体系后反应10～60min；
C）用紫外-可见吸收分光光度计测定混合溶液紫外吸收光谱，记录波长为652nm处的吸光度并绘制以TMB为显色剂的α-酪蛋白浓度-吸光度标准工作曲线；
D）于5 mL离心管中加入0.1 mL 待测α-酪蛋白样品、0.1 mL 1 mg/mL Zr-MOF纳米酶和0.26 mL醋酸盐缓冲液，反应1～15 min，再向混合液中依次加入0.1 mL 5 mM的TMB和0.1mL 200mM的H2O2，确定溶液最终总体积为3 mL，混匀体系后反应10～60min，测得波长为652nm处的紫外吸收光谱数值，与标准工作曲线进行比对，即得待测样品中所含α-酪蛋白含量；
所述Zr-MOF纳米酶，其合成方法包括如下步骤：
（1）将2,2'-联吡啶-4,4'-二羧酸和锆盐溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中搅拌均匀形成反应混合物，加入调节剂，超声处理10min后，移入反应釜中，80～150℃加热8～18 h；其中，所述2,2'-联吡啶-4,4'-二羧酸：锆盐：DMF：调节剂的摩尔体积比为1mmol：1～3mmol：10～50 mL：1～5g；
（2） 冷却至室温后，离心收集沉淀，分别用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和四氢呋喃(THF)洗涤后，25℃真空干燥6h得到粉红色Zr-MOF纳米酶。
9.根据权利要求8所述基于Zr-MOF纳米酶的α-酪蛋白定量检测方法，其特征在于：步骤A）中所述反应3min。
10.根据权利要求8所述基于Zr-MOF纳米酶的α-酪蛋白定量检测方法，其特征在于：步骤A）中所述醋酸盐缓冲液pH为4，浓度0.2M。
11.根据权利要求8所述基于Zr-MOF纳米酶的α-酪蛋白定量检测方法，其特征在于：步骤B）中所述混匀体系后反应30min。
12.根据权利要求8所述基于Zr-MOF纳米酶的α-酪蛋白定量检测方法，其特征在于：步骤D）所述待测α-酪蛋白样品，其可检测浓度范围为0.17～5 µg/ mL，检测限低至0.16 µg/mL。
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Patent Citations (2)
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Non-Patent Citations (1)
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| 金属-有机框架在光催化中的应用;梁祥等;《科学通报》;20180131;第63卷(第03期);248-265 * |
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