CN103954616B - 基于牛血清白蛋白-纳米铂模拟过氧化物酶测定乙酰胆碱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种<b>基于牛血清白蛋白</b><b>-</b><b>纳米铂模拟过氧化物酶测定乙酰胆碱的方法</b>，其是将Tris-盐酸缓冲液、乙酰胆碱、乙酰胆碱酯酶混合温浴后再加入胆碱氧化酶、N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐、4-氨基安替比林和牛血清白蛋白-纳米铂混合温浴。反应体系中乙酰胆碱酯酶催化乙酰胆碱水解生成胆碱，胆碱氧化酶催化氧化胆碱生成过氧化氢，牛血清白蛋白-纳米铂催化过氧化氢氧化N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐与4-氨基安替比林形成紫色产物，该显色产物的最大吸收峰为550nm。显色产物在550nm处吸光度与乙酰胆碱浓度在10~200μmol/L范围内呈线性关系，检测限为2.84μmol/L。该方法可用于血浆中乙酰胆碱的测定。
Description
技术领域
本发明涉及以牛血清白蛋白-纳米铂作为模拟过氧化物酶，催化过氧化氢氧化N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐与4-氨基安替比林，形成稳定的紫色显色产物，测定乙酰胆碱的紫外可见分析方法，属于分析化学和纳米技术领域。
背景技术
乙酰胆碱是一种神经递质，能特异性地作用于各类胆碱受体，在组织内能被胆碱酯酶水解破坏，其作用广泛，对神经系统，心血管系统及胃肠道等都有明显作用。在神经细胞中，乙酰胆碱是由胆碱和乙酰辅酶A在胆碱乙酰移位酶的催化作用下合成的。中枢胆碱能系统与学习、记忆密切相关，乙酰胆碱是中枢胆碱能系统中重要的神经递质之一，其主要功能是维持意识的清醒，在学习记忆中起重要作用。脑内的乙酰胆碱与认知活动，神经信号的传递密切相关，研究认为体内该物质含量与阿尔兹海默病的症状改善显著相关。所以对乙酰胆碱的检测具有非常重要的意义。
乙酰胆碱酯酶可以选择性水解乙酰胆碱，能使乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，再通过胆碱氧化酶氧化胆碱乙酰胆碱生成过氧化氢，过氧化物酶可催化过氧化氢氧化过氧化物酶底物显色。本发明以生物蛋白分子牛血清白蛋白为模板，通过生物矿化作用，制备出具有模拟过氧化物酶活性的牛血清白蛋白-纳米铂。与天然过氧化物酶相比，牛血清白蛋白-纳米铂具有制备简单、经济、快捷、耐高温、耐酸碱、性质稳定等诸多优势，可替代天然过氧化物酶用于乙酰胆碱的测定。
发明内容
本发明的目的是基于牛血清白蛋白-纳米铂良好的模拟过氧化物酶活性，结合乙酰胆碱酯酶可以选择性水解乙酰胆碱成胆碱和乙酸，再通过胆碱氧化酶氧化胆碱生成过氧化氢的过程，提供了一种牛血清白蛋白-纳米铂催化过氧化氢氧化N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐与4-氨基安替比林形成紫色显色产物，并通过紫外可见分光光度法测定550nm处吸光度定量检测乙酰胆碱的新方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：所述的基于牛血清白蛋白-纳米铂模拟过氧化物酶测定乙酰胆碱的方法，其特征是利用乙酰胆碱酯酶催化乙酰胆碱水解生成胆碱，胆碱氧化酶催化胆碱氧化生成过氧化氢，牛血清白蛋白-纳米铂催化过氧化氢氧化N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐）与4-氨基安替比林形成紫色产物以鉴定乙酰胆碱。
所述的基于牛血清白蛋白-纳米铂模拟过氧化物酶测定乙酰胆碱的方法，其特征是在EP管中依次加入Tris-盐酸缓冲溶液、乙酰胆碱、乙酰胆碱酯酶，温浴后加入胆碱氧化酶、N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐、4-氨基安替比林和牛血清白蛋白-纳米铂，将混合液放入恒温水浴中反应，生成紫色产物，用紫外可见分光光度计测定反应产物的吸光度以测定乙酰胆碱。
所述的基于牛血清白蛋白-纳米铂模拟过氧化物酶测定乙酰胆碱的方法，其特征是反应生成紫色产物的最大吸收峰为550nm。
所述的基于牛血清白蛋白-纳米铂模拟过氧化物酶测定乙酰胆碱的方法，其特征是牛血清白蛋白-纳米铂采用以下制备方法制得：在5mL浓度为50mg/ml牛血清白蛋白水溶液中加入5mL浓度为16mmol/L的氯铂酸水溶液，混匀后加入0.5mL浓度为1.5mol/L氢氧化钠水溶液，80℃水浴加热2小时，所得溶液经过超滤并水洗，得到牛血清白蛋白-纳米铂水溶液。反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤离心管，6000r/min离心超滤，并水洗3次。
所述的基于牛血清白蛋白-纳米铂模拟过氧化物酶测定乙酰胆碱的方法，其特征是乙酰胆碱的水解反应体系pH值为7.5，反应温度为37℃，反应时间为30分钟。
所述的基于牛血清白蛋白-纳米铂模拟过氧化物酶测定乙酰胆碱的方法，其特征是恒温水浴中反应体系中N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐的浓度为0.2mmol/L，4-氨基安替比林的浓度为4.2mmol/L，牛血清白蛋白-纳米铂的浓度为9μmol/L，胆碱氧化酶的浓度为0.125U/mL。
所述的基于牛血清白蛋白-纳米铂模拟过氧化物酶测定乙酰胆碱的方法，其特征是恒温水浴中反应体系的反应温度为30℃，反应时间为80分钟。
本发明所述的基于牛血清白蛋白-纳米铂的乙酰胆碱测定方法，其特征是将0.8mL不同浓度的乙酰胆碱，0.1mL浓度为10U/mL的乙酰胆碱酯酶加入到0.95mL浓度为50mmol/L、pH=7.5的Tris-盐酸缓冲液中，混合液在37℃温浴水解反应30分钟，随后向混合液中依次加入0.25mL浓度为2U/mL的胆碱氧化酶，1mL浓度为0.8mmol/L的N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐，0.8mL浓度为21mmol/L的4-氨基安替比林，0.1mL浓度为0.36mmol/L的牛血清白蛋白-纳米铂，混合后在30℃温浴80分钟后测定显色产物在550nm处的吸光度，以吸光度对乙酰胆碱浓度作图得到标准曲线，吸光度与乙酰胆碱浓度在10~200μmol/L范围内呈线性关系，检测限为2.84μmol/L。
本发明所述的基于牛血清白蛋白-纳米铂测定血浆乙酰胆碱的方法，其特征是在EP管中依次加入Tris-盐酸缓冲溶液、血浆样品、乙酰胆碱酯酶，温浴后加入胆碱氧化酶、N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐、4-氨基安替比林和牛血清白蛋白-纳米铂形成混合液，将混合液放入恒温水浴中反应，用紫外可见分光光度计测定在550nm的紫外吸收，根据乙酰胆碱标准曲线计算血浆中乙酰胆碱含量。
所述的基于牛血清白蛋白-纳米铂测定血浆乙酰胆碱的方法，其特征是将0.4mL血浆样品，0.1mL浓度为10U/mL的乙酰胆碱酯酶加入到1.35mL浓度为50mmol/L、pH=7.5的Tris-盐酸缓冲液中，所形成的混合液在37℃温浴水解反应30分钟，随后向混合液中依次加入0.25mL浓度为2U/mL的胆碱氧化酶，1mL浓度为0.8mmol/L的N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐，0.8mL浓度为21mmol/L的4-氨基安替比林，0.1mL浓度为0.36mmol/L的牛血清白蛋白-纳米铂，混合后在30℃温浴80分钟后测定显色产物在550nm处的吸光度，根据乙酰胆碱标准曲线计算血浆中乙酰胆碱含量
具体地说，本发明采用以下技术方案：（一）牛血清白蛋白-纳米铂的制备：
在50mg/ml牛血清白蛋白水溶液中加入16mmol/L的氯铂酸水溶液，混匀后加入1.5mol/L氢氧化钠水溶液，80℃水浴加热2小时。所得溶液经过超滤并水洗，得到牛血清白蛋白-纳米铂水溶液。反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤离心管，6000r/min离心超滤，并水洗3次。以上过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。
（二）乙酰胆碱的测定
在EP管中依次加入Tris-盐酸缓冲溶液、乙酰胆碱、乙酰胆碱酯酶，将混合液置于37℃恒温水浴反应30分钟。30分钟后，依次向EP管加入胆碱氧化酶，N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐，4-氨基安替比林和牛血清白蛋白-纳米铂，将混合液放入30℃恒温水浴中反应80分钟。用紫外可见分光光度计测定反应产物在550nm处的吸光度，以吸光度对乙酰胆碱浓度作图得到标准曲线。
（三）血浆中乙酰胆碱的测定
将乙酰胆碱替换为血浆样品重复步骤二，将所得吸光度代入标准曲线，得到血浆样品中乙酰胆碱的含量。
本发明的优点：
本发明利用牛血清白蛋白-纳米铂良好的模拟过氧化物酶活性，结合乙酰胆碱酯酶催化水解乙酰胆碱和胆碱氧化酶氧化胆碱生成过氧化氢的过程，提供了一种牛血清白蛋白-纳米铂催化过氧化氢氧化N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐与4-氨基安替比林形成稳定的紫色产物，并通过紫外可见分光光度法测定显色产物在550nm的吸光度，从而定量检测乙酰胆碱的新方法。该技术测定乙酰胆碱的线性范围为10~200μmol/L，检测限为2.84μmol/L。本发明方法具有稳定性好，灵敏度高，样品需求量少，重现性好，成本低等优点，可应用于血浆样品中乙酰胆碱的测定。
附图说明
图1为显色体系的外观图，图中a是在没有牛血清白蛋白-纳米铂存在时，不发生显色反应，溶液为透明无色，图中b是在牛血清白蛋白-纳米铂存在时，发生显色反应，溶液为紫色。
图2为显色体系的紫外吸收光谱图。
图3为N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐浓度对显色体系的影响图。
图4为4-氨基安替比林浓度对显色体系的影响图。
图5为牛血清白蛋白-纳米铂浓度对显色体系的影响图。
图6为胆碱氧化酶浓度对显色体系的影响图。
图7为显色反应温度对显色体系的影响图。
图8为显色反应时间对显色体系的影响图。
图9为乙酰胆碱水解时间对显色体系的影像图。
图10为多巴胺，血清素，甘氨酸，天冬氨酸，谷胱甘肽及乙酰胆碱的显色反应吸光度对比图。
图11为乙酰胆碱的标准曲线图。
图12为血浆中乙酰胆碱和缓冲液中乙酰胆碱的线性相关图。
具体实施方式
实例1：
牛血清白蛋白-纳米铂的制备：在5mL浓度为50mg/ml牛血清白蛋白水溶液中加入5mL浓度为16mmol/L的氯铂酸水溶液，混匀后加入0.5mL浓度为1.5mol/L氢氧化钠水溶液，80℃水浴加热2小时。反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000r/min离心超滤，并水洗3次。
实例2：
将0.8mL浓度为1mmol/L的乙酰胆碱，0.1mL浓度为10U/mL的乙酰胆碱酯酶加入到0.95mL浓度为50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH=7.5）中，混合液在37℃温浴水解30分钟，随后向混合液中依次加入0.25mL浓度为2U/mL的胆碱氧化酶，1mL浓度为0.8mmol/L的N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐，0.8mL浓度为21mmol/L的4-氨基安替比林，0.1mL浓度为0.36mmol/L的牛血清白蛋白-纳米铂，混合后在30℃温浴80分钟后观察显色体系的颜色变化。如图1所示，图中a是在没有牛血清白蛋白-纳米铂存在时，不发生显色反应，溶液为透明无色，图中b是在牛血清白蛋白-纳米铂存在时，发生显色反应，溶液为紫色。
实例3：
将0.8mL浓度为1mmol/L的乙酰胆碱，0.1mL浓度为10U/mL的乙酰胆碱酯酶加入到0.95mL浓度为50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH=7.5）中，混合液在37℃温浴水解30分钟，随后向混合液中依次加入0.25mL浓度为2U/mL的胆碱氧化酶，1mL浓度为0.8mmol/L的N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐，0.8mL浓度为21mmol/L的4-氨基安替比林，0.1mL浓度为0.36mmol/L的牛血清白蛋白-纳米铂，混合后在30℃温浴80分钟后测定显色产物的紫外可见吸收光谱。如图2所示，显色产物的最大吸收峰为550nm。
实例4：
将0.8mL浓度为1mmol/L的乙酰胆碱，0.1mL浓度为10U/mL的乙酰胆碱酯酶加入到0.95mL浓度为50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH=7.5）中，混合液在37℃温浴水解30分钟，随后向混合液中依次加入0.25mL浓度为2U/mL的胆碱氧化酶，1mL不同浓度（0.1~2.0mmol/L）的N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐，0.8mL浓度为21mmol/L的4-氨基安替比林，0.1mL浓度为0.36mmol/L的牛血清白蛋白-纳米铂，混合后在30℃温浴，80分钟后测定显色产物在550nm处的吸光度。如图3所示，吸光度随着N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐浓度的增大而增大，并在N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐的终浓度为0.2mmol/L之后达到最大值。
实例6：
将0.8mL浓度为1mmol/L的乙酰胆碱，0.1mL浓度为10U/mL的乙酰胆碱酯酶加入到0.95mL浓度为50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH=7.5）中，混合液在37℃温浴水解30分钟，随后向混合液中依次加入0.25mL浓度为2U/mL的胆碱氧化酶，1mL浓度为0.8mmol/L的N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐，0.8mL不同浓度（0.13~26.25mmol/L）的4-氨基安替比林，0.1mL浓度为0.36mmol/L的牛血清白蛋白-纳米铂，混合后在30℃温浴，80分钟后测定显色产物在550nm处的吸光度。如图4所示，吸光度随着4-氨基安替比林浓度的增大而增大，并在4-氨基安替比林的终浓度为4.2mmol/L之后达到最大值。
实例7：
将0.8mL浓度为1mmol/L的乙酰胆碱，0.1mL浓度为10U/mL的乙酰胆碱酯酶加入到0.95mL浓度为50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH=7.5）中，混合液在37℃温浴水解30分钟，随后向混合液中依次加入0.25mL浓度为2U/mL的胆碱氧化酶，1mL浓度为0.8mmol/L的N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐，0.8mL浓度为21mmol/L的4-氨基安替比林，0.1mL不同浓度（0.072~0.576mmol/L）的牛血清白蛋白-纳米铂，混合后在30℃温浴，80分钟后测定显色产物在550nm处的吸光度。如图5所示，吸光度随牛血清白蛋白-纳米铂浓度的增大而增大，并在牛血清白蛋白-纳米铂的终浓度为9μmol/L之后达到最大值。
实例8：
将0.8mL浓度为1mmol/L的乙酰胆碱，0.1mL浓度为10U/mL的乙酰胆碱酯酶加入到0.95mL浓度为50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH=7.5）中，混合液在37℃温浴水解30分钟，随后向混合液中依次加入0.25mL不同浓度（4~2.8U/mL）的胆碱氧化酶，1mL浓度为0.8mmol/L的N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐，0.8mL浓度为21mmol/L的4-氨基安替比林，0.1mL浓度为0.36mmol/L的牛血清白蛋白-纳米铂，混合后在30℃温浴，80分钟后测定显色产物在550nm处的吸光度。如图6所示，吸光度随胆碱氧化酶浓度的增大而增大，并在胆碱氧化酶的终浓度为0.125U/mL之后达到最大值。
实例9：
将0.8mL浓度为1mmol/L的乙酰胆碱，0.1mL浓度为10U/mL的乙酰胆碱酯酶加入到0.95mL浓度为50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH=7.5）中，混合液在37℃温浴水解30分钟，随后向混合液中依次加入0.25mL浓度为2U/mL的胆碱氧化酶，1mL浓度为0.8mmol/L的N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐，0.8mL浓度为21mmol/L的4-氨基安替比林，实例1制备的0.1mL浓度为0.36mmol/L的牛血清白蛋白-纳米铂，混合后分别置于不同温度（20~50℃）下温浴，80分钟后测定显色产物在550nm处的吸光度。如图7所示，吸光度在反应温度为30℃时达到最大值。
实例10：
将0.8mL浓度为1mmol/L的乙酰胆碱，0.1mL浓度为10U/mL的乙酰胆碱酯酶加入到0.95mL浓度为50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH=7.5）中，混合液在37℃温浴水解30分钟，随后向混合液中依次加入0.25mL浓度为2U/mL的胆碱氧化酶，1mL浓度为0.8mmol/L的N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐，0.8mL浓度为21mmol/L的4-氨基安替比林，实例1制备的0.1mL浓度为0.36mmol/L的牛血清白蛋白-纳米铂，混合后在30℃温浴不同时间（0~90分钟）后测定显色产物在550nm处的吸光度。如图8所示，吸光度随着反应时间的延长而增大，并在反应时间为80分钟之后达到最大值。
实例11：
将0.8mL浓度为1mmol/L的乙酰胆碱，0.1mL浓度为10U/mL的乙酰胆碱酯酶加入到0.95mL浓度为50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH=7.5）中，混合液在37℃温浴水解不同反应时间（0~40分钟），随后向混合液中依次加入0.25mL浓度为2U/mL的胆碱氧化酶，1mL浓度为0.8mmol/L的N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐，0.8mL浓度为21mmol/L的4-氨基安替比林，实例1制备的0.1mL浓度为0.36mmol/L的牛血清白蛋白-纳米铂，混合后在30℃温浴80分钟后测定显色产物在550nm处的吸光度。如图9所示，吸光度随着乙酰胆碱水解反应时间的延长而增大，并在反应时间为30分钟之后达到最大值。
实例12：
将0.8mL不同的干扰物质，0.1mL浓度为10U/mL的乙酰胆碱酯酶加入到0.95mL浓度为50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH=7.5）中，混合液在37℃温浴水解反应30分钟，随后向混合液中依次加入0.25mL浓度为2U/mL的胆碱氧化酶，1mL浓度为0.8mmol/L的N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐，0.8mL浓度为21mmol/L的4-氨基安替比林，实例1制备的0.1mL浓度为0.36mmol/L的牛血清白蛋白-纳米铂，混合后在30℃温浴80分钟后测定显色产物在550nm处的吸光度。如图10所示，与1mmol/L的乙酰胆碱产生的吸光度信号相比，1mmol/L的多巴胺或5mmol/L血清素或5mmol/L甘氨酸或5mmol/L天冬氨酸或5mmol/L谷胱甘肽产生的信号均可忽略不计。
实例13：
将0.8mL不同浓度的乙酰胆碱，0.1mL浓度为10U/mL的乙酰胆碱酯酶加入到0.95mL浓度为50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH=7.5）中，混合液在37℃温浴水解反应30分钟，随后向混合液中依次加入0.25mL浓度为2U/mL的胆碱氧化酶，1mL浓度为0.8mmol/L的N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐，0.8mL浓度为21mmol/L的4-氨基安替比林，实例1制备的0.1mL浓度为0.36mmol/L的牛血清白蛋白-纳米铂，混合后在30℃温浴80分钟后测定显色产物在550nm处的吸光度。如图11所示，以吸光度对乙酰胆碱浓度作图得到乙酰胆碱标准曲线，吸光度与胆碱浓度在10~200μmol/L范围内呈线性关系，检测限为2.84μmol/L。
实例14：
将0.4mL加入了不同浓度含乙酰胆碱的血浆样品，0.1mL浓度为10U/mL的乙酰胆碱酯酶加入到1.35mL浓度为50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH=7.5）中，所形成的混合液在37℃温浴水解反应30分钟，随后向混合液中依次加入0.25mL浓度为2U/mL的胆碱氧化酶，1mL浓度为0.8mmol/L的N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐，0.8mL浓度为21mmol/L的4-氨基安替比林，实例1制备的0.1mL浓度为0.36mmol/L的牛血清白蛋白-纳米铂，混合后在30℃温浴80分钟后测定显色产物在550nm处的吸光度。如图12所示，以吸光度对加入血浆中的乙酰胆碱浓度作图得到标准曲线，将血浆中回收的乙酰胆碱浓度与实例13中测得的乙酰胆碱浓度作线性相关图，得到线性相关系数为0.995，且斜率为0.9981，则证实在血浆样品中能检测乙酰胆碱。
Claims (1)
1.一种基于牛血清白蛋白-纳米铂模拟过氧化物酶测定乙酰胆碱的方法，其特征是利用乙酰胆碱酯酶催化乙酰胆碱水解生成胆碱，胆碱氧化酶催化胆碱氧化生成过氧化氢，牛血清白蛋白-纳米铂催化过氧化氢氧化N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐与4-氨基安替比林形成紫色产物，最大吸收峰为550nm，用紫外可见分光光度计测定反应产物的吸光度以测定乙酰胆碱；所使用的牛血清白蛋白-纳米铂采用以下制备方法制得：在5mL浓度为50mg/ml牛血清白蛋白水溶液中加入5mL浓度为16mmol/L的氯铂酸水溶液，混匀后加入0.5mL浓度为1.5mol/L氢氧化钠水溶液，80℃水浴加热2小时，所得溶液经过超滤并水洗，得到牛血清白蛋白-纳米铂水溶液；反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤离心管，6000r/min离心超滤，并水洗3次；所使用的乙酰胆碱的水解反应体系pH值为7.5，反应温度为37℃，反应时间为30分钟；恒温水浴中反应体系中N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐的浓度为0.2mmol/L，4-氨基安替比林的浓度为4.2mmol/L，牛血清白蛋白-纳米铂的浓度为9μmol/L，胆碱氧化酶的浓度为0.125U/mL，反应温度为30℃，反应时间为80分钟；乙酰胆碱的测定过程如下：将0.8mL不同浓度的乙酰胆碱，0.1mL浓度为10U/mL的乙酰胆碱酯酶加入到0.95mL浓度为50mmol/L、pH=7.5的Tris-盐酸缓冲液中，混合液在37℃温浴水解反应30分钟，随后向混合液中依次加入0.25mL浓度为2U/mL的胆碱氧化酶，1mL浓度为0.8mmol/L的N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐，0.8mL浓度为21mmol/L的4-氨基安替比林，0.1mL浓度为0.36mmol/L的牛血清白蛋白-纳米铂，混合后在30℃温浴80分钟后测定显色产物在550nm处的吸光度，以吸光度对乙酰胆碱浓度作图得到标准曲线，吸光度与乙酰胆碱浓度在10~200μmol/L范围内呈线性关系，检测限为2.84μmol/L。
2.一种基于牛血清白蛋白-纳米铂测定血浆乙酰胆碱的方法，其特征是在EP管中依次加入Tris-盐酸缓冲溶液、血浆样品、乙酰胆碱酯酶，温浴后加入胆碱氧化酶、N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐、4-氨基安替比林和牛血清白蛋白-纳米铂形成混合液，将混合液放入恒温水浴中反应，用紫外可见分光光度计测定在550nm的紫外吸收，根据乙酰胆碱标准曲线计算血浆中乙酰胆碱含量；具体测定过程如下：将0.4mL血浆样品，0.1mL浓度为10U/mL的乙酰胆碱酯酶加入到1.35mL浓度为50mmol/L、pH=7.5的Tris-盐酸缓冲液中，所形成的混合液在37℃温浴水解反应30分钟，随后向混合液中依次加入0.25mL浓度为2U/mL的胆碱氧化酶，1mL浓度为0.8mmol/L的N-乙基-N-（3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐，0.8mL浓度为21mmol/L的4-氨基安替比林，0.1mL浓度为0.36mmol/L的牛血清白蛋白-纳米铂，混合后在30℃温浴80分钟后测定显色产物在550nm处的吸光度，根据乙酰胆碱标准曲线计算血浆中乙酰胆碱含量。
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