CN103551143A

CN103551143A - 多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料模拟过氧化物酶

Info

Publication number: CN103551143A
Application number: CN201310557888.4A
Authority: CN
Inventors: 陈伟; 张灵娜; 林逢林; 何少斌; 林小青
Original assignee: Fujian Medical University
Current assignee: Fujian Medical University
Priority date: 2013-11-11
Filing date: 2013-11-11
Publication date: 2014-02-05
Anticipated expiration: 2033-11-11
Also published as: CN103551143B

Abstract

本发明公开一种多孔铂 - 氧化石墨烯复合纳米材料模拟过氧化物酶，所述多孔铂 - 氧化石墨烯复合纳米材料是以氧化石墨烯为基底，原位合成多孔结构的铂纳米粒子，制备多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料模拟过氧化物酶。多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料具有优良的过氧化酶活性，可催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色。对底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐有良好的亲和力。可用于检测低浓度的过氧化氢，催化产物吸光度与0.02-0.35mmol/L浓度范围内的过氧化氢浓度呈线性相关，检测限为0.0088mmol/L。

Description

多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料模拟过氧化物酶

技术领域

本发明涉及具有模拟过氧化物酶特性的多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料，属于纳米技术和仿生技术领域。

背景技术

天然酶因其催化效率高、专一性强、反应条件温和而受到广泛的关注和应用。然而天然酶易受到多种物理、化学因素的影响而失去活性，并且还具有来源有限，提纯困难，价格昂贵等缺点，极大地限制了它们的应用。近年来，四氧化三铁等一些纳米材料模拟过氧化物酶的发现，使得纳米材料在生物催化领域的应用受到了广泛关注。纳米人工模拟酶具有制备简单、经济、快捷、耐高温和耐酸碱、性质稳定等诸多优势，在模拟生物酶方面显示出极其诱人的应用前景。

在人工模拟酶中，复合纳米材料的发展尤其引人关注，其特殊的结构能够协同增强两种或两种以上材料的功能，表现出强大的催化活性和特异性。贵金属（银，金，铂等）由于它们的化学稳定性好，熔点高等特点使其在物理，材料科学，生物和医学领域优势突出。但是，它们的团聚沉降是制约其应用的重要因素，如何保证纳米粒子在水体系的分散稳定性是解决问题的关键。

本发明提供了一种基于多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料的高活性、高稳定性模拟过氧化物酶。

发明内容

本发明的目的是提供一种以氧化石墨烯为基底，原位合成具有多孔结构的铂纳米粒子-氧化石墨烯复合材料，利用多孔结构的铂纳米粒子-氧化石墨烯复合材料的优良催化特性模拟过氧化物酶。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明所述的多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料模拟过氧化物酶，其特征是多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料具有过氧化物酶特性，其催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色。

所述多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料由以下方法制备的：往100 ml 0.5 mg/mL的氧化石墨烯水溶液中加入10 ml 7.9 mmol/L 氯铂酸溶液,混匀后水浴80℃下反应24小时，所得的水溶液冷却至室温后以5000 转每分钟离心5 分钟，弃去极少量沉淀物，取上清液，得到多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液，冷冻干燥后得到多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料粉末。

所使用的基底氧化石墨烯的制备方法为：称取325目鳞片石墨1.2 g，加入到144 mL浓度为18 mol/L的浓硫酸和16 mL浓度为15 mol/L的磷酸的混合溶液中；充分搅拌后，置于在0℃冰浴中；将7.2 g高锰酸钾以少量多次方式缓慢加入到以上混合溶液中；保持0℃冰浴，磁力搅拌3小时后，将所得墨绿混悬液转移至50℃温水浴中，控温12小时，得到的紫黑色混悬液缓慢加入到160 mL冰水混合物中，剧烈搅拌1小时；继而往溶液中逐滴滴加4 mL质量浓度为30%的过氧化氢溶液，溶液颜色突变为亮黄色，所得溶液经孔径为20-30微米的G1砂芯漏斗过滤，继而4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液；加入80 mL 双蒸水充分振荡洗涤，4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色呈土黄色；再加入80 mL质量浓度为30%的盐酸充分振荡洗涤，经为孔径20-30微米的G1砂芯漏斗过滤去除不溶颗粒，滤液4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色继续加深；接着多次用无水乙醇将沉淀物洗至pH值为中性，4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀呈棕黄色；最后用乙醚冲洗沉淀，经孔径为1.5-2.5微米的G5砂芯漏斗过滤，获得滤饼，滤饼在室温下过夜晾干，得到棕色的氧化石墨；取50 mg棕色的氧化石墨溶解于100 mL双蒸水，常温下超声3小时，充分剥离后得到0.5 mg/mL透明澄清的棕黄色氧化石墨烯水溶液。

催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐生成蓝色产物，该产物在652 nm处有最大吸收峰。

多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐的活性在磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲盐溶液pH范围在4.5-5.5内达到最大，在30℃以下温浴显色，催化体系不产生絮状物。

多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐产生的显色产物吸光值由多孔结构铂-氧化石墨烯复合纳米材料的浓度、3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐浓度和过氧化氢浓度来决定。

多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料对3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐的米氏常数为0.1864 mmol/L，对过氧化氢的米氏常数为221.4 mmol/L。

多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐的显色产物吸光值与0.02-0.35 mmol/L浓度范围内的过氧化氢呈线性关系，其r=0.997，式中r指相关系数，线性方程为A=0.6795C(mmol/L)+0.01124，检测限为0.0088 mmol/L。

为了实现上述目的，本发明采用的具体技术方案为：

（一）氧化石墨烯的制备：称取325目鳞片石墨，加入到体积比为9:1的浓硫酸和磷酸混合溶液中。充分搅拌后，置于在0℃冰浴中。将高锰酸钾少量多次，缓慢加入到以上混合溶液中。保持0℃冰浴，磁力搅拌3小时后，将所得墨绿色混悬液转移至50℃温水浴中，控温12小时。得到的紫黑色混悬液缓慢加入到冰水混合物中，剧烈搅拌1小时。继而往溶液中逐滴滴加30%过氧化氢溶液，至溶液颜色突变为亮黄色。所得溶液经G1砂芯漏斗（孔径20-30微米）过滤，继而4000转每分钟离心30分钟，分别经过水洗一次，酸洗一次，醇洗至中性，最后用乙醚冲洗后经G5砂芯漏斗（孔径1.5-2.5微米）过滤。滤饼在室温下过夜晾干，得到氧化石墨，称取质量。氧化石墨溶解于双蒸水，常温下超声3小时，充分剥离后得到氧化石墨烯水溶液。

（二）多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料的制备：

配制氧化石墨烯水溶液0.5 mg/mL，超声3小时完全分散后与7.9 mmol/L的氯铂酸水溶液以体积比10:1混合均匀，80℃水浴加热24小时。所得的水溶液冷却至室温后，以5000转每分钟离心5 分钟，取上清液。得到的多孔铂-氧化石墨烯水溶液呈棕色，所负载的纳米铂粒子平均粒径为50 nm，4 ℃保存，能保持2个月以上的相对稳定。以上过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。

（三）多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料模拟过氧化物酶活性：

通过多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料催化过氧化物酶底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐（TMB）产生蓝色底物，验证和比较其过氧化物酶活性。在磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中依次加入过氧化氢、3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐和多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液，混合后温浴10分钟，肉眼观察颜色的变化或测定652 nm波长处的吸光度值。根据溶液颜色或通过测定吸光度值进行比较过氧化物酶活性。

（四）多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料模拟过氧化物酶检测过氧化氢：

通过多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料催化过氧化物酶底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐产生蓝色底物，检测低浓度过氧化氢。最优条件下，在磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中依次加入过氧化氢、3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐和多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液，混合后温浴10分钟，测定652 nm波长处的吸光度值。通过吸光度值标准曲线对过氧化氢浓度进行定量。

本发明的优点：

（1）本发明所得到的多孔结构的铂纳米粒子直接在氧化石墨烯片层表面还原得到，无需其他的还原剂和稳定剂。制备方法绿色环保，操作简便快速。

（2）本发明多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料具有良好的过氧化物酶活性。

（3）本发明多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料对底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐的亲和力高。

（4）本发明多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料能定量检测过氧化氢，检测限低，灵敏度高。

附图说明

图1为多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的颜色变化图，图中从左到右溶液由无色变为蓝色。

图2为多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的紫外吸收光谱图。

图3为多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料终浓度对催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的影响图。

图4为pH值对多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的影响图。

图5为温浴温度对多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的影响图。

图6为3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐浓度对多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的影响图。

图7为多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料对于3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐的稳态动力学曲线图。

图8为多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料对于过氧化氢的稳态动力学曲线图。

图9为多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料检测过氧化氢标准曲线图。

具体实施方式

实例1：

称取325目鳞片石墨1.2 g，加入到144 mL浓度为18 mol/L的浓硫酸和16 mL浓度为15 mol/L的磷酸的混合溶液中。充分搅拌后，置于在0℃冰浴中。将7.2 g高锰酸钾少量多次，缓慢加入到以上混合溶液中。保持0℃冰浴，磁力搅拌3小时后，将所得墨绿混悬液转移至50℃温水浴中，控温12小时。得到的紫黑色混悬液缓慢加入到160 mL冰水混合物中，剧烈搅拌1小时。继而往溶液中逐滴滴加4 mL 30%（质量浓度）过氧化氢溶液，溶液颜色突变为亮黄色。所得溶液经G1砂芯漏斗（孔径20-30微米）过滤，滤液4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液；在沉淀中加入80 mL 双蒸水充分振荡洗涤，4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色呈土黄色；再加入80 mL 30%（质量浓度）盐酸充分振荡洗涤，经G1砂芯漏斗（孔径20-30微米）过滤去除不溶颗粒，滤液4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色继续加深；接着多次用无水乙醇将沉淀物洗至pH值为中性，4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀呈棕黄色；最后用乙醚冲洗沉淀，经G5砂芯漏斗（孔径1.5-2.5微米）过滤。滤饼在室温下过夜晾干，得到棕色的氧化石墨烯。取50 mg氧化石墨溶解于100 mL双蒸水，常温下超声3小时，充分剥离后得到0.5 mg/mL透明澄清的棕黄色氧化石墨烯水溶液。

实例2：

往100 ml 0.5mg/mL的氧化石墨烯水溶液中加入10 ml 7.9 mmol/L 氯铂酸溶液，混匀后水浴80℃下反应24小时，所得的水溶液冷却至室温后以5000 转每分钟离心5 分钟，弃去极少量沉淀物，取上清液，得到多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液。冷冻干燥后得到多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料粉末。

实例3：

在3.290 mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH 5，20 mmol/L）中依次加入0.5 mL浓度为4 mol/L的过氧化氢、0.2 mL浓度为16 mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐和10 μL浓度为0.67 mg/mL的多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液，混合后30 ℃温浴10分钟，溶液由无色变为蓝色（见图1），在652 nm处有一吸收峰（见图2）。

实例4：

在pH值分别为3、4、4.5、5、5.5、6、7的3.290 mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（20 mmol/L）中依次加入0.5 mL过氧化氢（4 mol/L）、0.2 mL 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐（16 mmol/L）和10 μL多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液（0.67 mg/mL），混合后30 ℃温浴10分钟，测定652 nm波长处吸光度。多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料的相对催化活性在磷酸盐缓冲液pH值为4.5-5.5时达到最大（见图3）。

实例5：

在3.290 mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH 5，20 mmol/L）中依次加入0.5 mL过氧化氢（4 mol/L）、0.2 mL 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐（16 mmol/L）和10 μL多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液（0.67 mg/mL），混合后分别在不同温度25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃温浴10分钟，测定652 nm波长处吸光度。随着温度升高，多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料的相对催化活性增大（见图4），但反应体系出现蓝色絮状也增多，在30℃时完全不产生絮状物。

实例6：

在3.290 mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH 5，20 mmol/L）中依次加入0.5 mL过氧化氢（4 mol/L）、0.2 mL 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐（16 mmol/L）和10 μL不同浓度的多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液，混合后分别在30℃温浴10分钟，测定652 nm波长处吸光度。显色产物的吸光度随着多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料终浓度增大而增大（见图5）。

实例7：

在3.290 mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH 5，20 mmol/L）中依次加入0.5 mL过氧化氢（4 mol/L）、0.2 mL不同浓度的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐和10 μL多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液（0.67 mg/mL），混合后分别在30℃温浴10分钟，测定652 nm波长处吸光度。显色产物的吸光度随着3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐终浓度增大而增大，当浓度达到0.8 mmol/L后吸光度几乎不再增大（见图6）。

实例8：

在3.380 mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH 5，20 mmol/L）中依次加入0.4 mL过氧化氢（4 mol/L）、0.2 mL不同浓度的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐和20 μL多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液（0.67 mg/mL），混合后在30℃温浴1分钟，测定652 nm波长处吸光度，计算初速度。通过米氏方程拟合，可以得出多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料对底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐的米氏常数为0.1864 mmol/L（见图7）。

实例9：

在3.380 mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH 5，20 mmol/L）中依次加入0.4 mL不同浓度的过氧化氢、0.2 mL 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐（16 mmol/L）和20 μL多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液（0.67 mg/mL），混合后在30℃温浴1分钟，测定652 nm波长处吸光度，计算初速度。通过米氏方程拟合，可以得出多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料对底物过氧化氢的米氏常数为221.4 mmol/L（见图8）。

实例10：

在3.320 mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH 5，20 mmol/L）中依次加入0.4 mL不同浓度的过氧化氢、0.2 mL 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐（16 mmol/L）和80 μL多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液（0.67 mg/mL），混合后在30℃温浴20分钟，测定652 nm波长处吸光度。过氧化氢浓度在0.02-0.35 mmol/L范围内，显色产物的吸光度与过氧化氢浓度呈线性相关（r=0.997），式中r指相关系数，线性方程为A=0.6795C(mmol/L)+0.01124，检测限为0.0088 mmol/L（见图9）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料模拟过氧化物酶，其特征是多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料具有过氧化物酶特性，其催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色。

2.根据权利要求1所述的一种多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料模拟过氧化物酶，其特征是所述多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料由以下方法制备的：往100 ml 0.5 mg/mL的氧化石墨烯水溶液中加入10 ml 7.9 mmol/L 氯铂酸溶液,混匀后水浴80℃下反应24小时，所得的水溶液冷却至室温后以5000 转每分钟离心5 分钟，弃去极少量沉淀物，取上清液，得到多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液，冷冻干燥后得到多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料粉末。

3.根据权利要求2所述的一种多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料模拟过氧化物酶，其特征是所使用的基底氧化石墨烯的制备方法为：称取325目鳞片石墨1.2 g，加入到144 mL浓度为18 mol/L的浓硫酸和16 mL浓度为15 mol/L的磷酸的混合溶液中；充分搅拌后，置于在0℃冰浴中；将7.2 g高锰酸钾以少量多次方式缓慢加入到以上混合溶液中；保持0℃冰浴，磁力搅拌3小时后，将所得墨绿混悬液转移至50℃温水浴中，控温12小时，得到的紫黑色混悬液缓慢加入到160 mL冰水混合物中，剧烈搅拌1小时；继而往溶液中逐滴滴加4 mL质量浓度为30%的过氧化氢溶液，溶液颜色突变为亮黄色，所得溶液经孔径为20-30微米的G1砂芯漏斗过滤，继而4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液；加入80 mL 双蒸水充分振荡洗涤，4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色呈土黄色；再加入80 mL质量浓度为30%的盐酸充分振荡洗涤，经为孔径20-30微米的G1砂芯漏斗过滤去除不溶颗粒，滤液4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色继续加深；接着多次用无水乙醇将沉淀物洗至pH值为中性，4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀呈棕黄色；最后用乙醚冲洗沉淀，经孔径为1.5-2.5微米的G5砂芯漏斗过滤，获得滤饼，滤饼在室温下过夜晾干，得到棕色的氧化石墨；取50 mg棕色的氧化石墨溶解于100 mL双蒸水，常温下超声3小时，充分剥离后得到0.5 mg/mL透明澄清的棕黄色氧化石墨烯水溶液。

4.根据权利要求1或2或3所述的一种多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料模拟过氧化物酶，其特征是催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐生成蓝色产物，该产物在652 nm处有最大吸收峰。

5.根据权利要求1或2或3所述的一种多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料模拟过氧化物酶，其特征是多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐的活性在磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲盐溶液pH范围在4.5-5.5内达到最大，在30℃以下温浴显色，催化体系不产生絮状物。

6.根据权利要求1或2或3所述的一种多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料模拟过氧化物酶，其特征是多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐产生的显色产物吸光值由多孔结构铂-氧化石墨烯复合纳米材料的浓度、3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐浓度和过氧化氢浓度来决定。

7.根据权利要求1或2或3所述的一种多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料模拟过氧化物酶，其特征是多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料对3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐的米氏常数为0.1864 mmol/L，对过氧化氢的米氏常数为221.4 mmol/L。

8.根据权利要求1或2或3所述的一种多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料模拟过氧化物酶，其特征是多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐的显色产物吸光值与0.02-0.35 mmol/L浓度范围内的过氧化氢呈线性关系，其r=0.997，式中r指相关系数，线性方程为A=0.6795C(mmol/L)+0.01124，检测限为0.0088 mmol/L。