CN103433484B

CN103433484B - 牛血清白蛋白-铂复合纳米材料模拟过氧化物酶及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103433484B
Application number: CN201310368447.XA
Authority: CN
Inventors: 陈伟; 何少斌; 邓豪华; 刘爱林; 林新华; 李光文
Original assignee: Fujian Medical University
Current assignee: Fujian Medical University
Priority date: 2013-08-22
Filing date: 2013-08-22
Publication date: 2015-06-17
Anticipated expiration: 2033-08-22
Also published as: CN103433484A

Abstract

本发明公开一种牛血清白蛋白-铂复合纳米材料模拟过氧化物酶及其制备方法和应用，以牛血清白蛋白为模板，通过生物矿化作用，制备牛血清白蛋白-铂复合纳米材料模拟过氧化物酶。其牛血清白蛋白-铂复合纳米材料由下述方法制备而成的：在浓度为牛血清白蛋白水溶液中加入氯铂酸水溶液，混匀后加入氢氧化钠水溶液得混合溶液，水浴加热；将此溶液经过超滤并水洗，得到牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液；牛血清白蛋白-铂复合纳米材料具有优良的过氧化酶活性，可催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色。同时该模拟酶耐酸碱、耐高温、耐高盐，具有优异的短期室温稳定性和长期室温稳定性。

Description

牛血清白蛋白-铂复合纳米材料模拟过氧化物酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及具有模拟过氧化物酶特性的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料及其制备方法和应用，属于纳米技术和仿生技术领域。

背景技术

酶是生物体内非常重要，具有催化活性的蛋白质，它催化效率高、专一性强、反应条件温和，生物体的生长、发育、繁殖等生命活动都离不开酶的催化作用。然而天然酶来源有限，提纯困难，价格昂贵。同时，天然酶容易受到多种物理、化学因素的影响而失去活性，所以在实际应用中对实验的操作条件较为苛刻，使其应用受到了极大的限制。近年来，人工模拟酶的研究开发与应用受到了人们的广泛关注。

过氧化物酶可以高效地催化氧化过氧化氢，而过氧化氢又是生物反应中一种重要的中间物质，所以对过氧化氢以及相关生化物质的精确测定具有重要的意义。过氧化物模拟酶所涉及的物质包括四氧化三铁纳米粒子，血红蛋白，氯化血红素，金属卟啉，金属酞菁等。其中，纳米人工模拟酶具有制备简单、经济、快捷、耐高温和耐酸碱、性质稳定等诸多优势，在模拟生物酶方面显示出极其诱人的应用前景。

本发明提供了一种基于牛血清白蛋白-铂复合纳米材料的高活性、高稳定性模拟过氧化物酶。

发明内容

本发明的目的是以牛血清白蛋白为模板，通过生物矿化作用，制备牛血清白蛋白-铂复合纳米材料，利用纳米尺度金属铂内核的优良催化特性模拟过氧化物酶及其制备方法和应用，利用牛血清白蛋白外壳对模拟酶活性中心起到稳定作用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

（一）本发明所述的一种牛血清白蛋白-铂复合纳米材料模拟过氧化物酶，由下述方法制备而成的：在牛血清白蛋白水溶液中加入氯铂酸水溶液，混匀后加入氢氧化钠水溶液得混合溶液，水浴加热，混合溶液在加热反应后其氯铂酸的三个吸收峰消失（此时说明氯铂酸全部反应）；将此溶液经过超滤并水洗，得到铂纳米粒子-牛血清白蛋白核壳结构水溶液；模拟过氧化酶活性特征为：在磷酸盐缓冲液中依次加入过氧化氢、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液，混合后温浴，溶液由无色变为蓝色，在652 nm处有一吸收峰。

本发明上述的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料的制备中的各组分的配比按本领域常规方法可以完成的。但本发明的优选的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料的制备由以下方法制备：在5 ml 50 mg/ml的牛血清白蛋白水溶液中加入16 mmol/L氯铂酸溶液5 ml和1.5 mol/L氢氧化钠溶液0.5 ml，混匀后水浴80 ℃下反应2 h。反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次。

模拟过氧化酶活性特征优选测试步骤为：在2780 μL pH=4.5，20 mmol/L的磷酸盐缓冲液中依次加入1 ml浓度为2 mol/L的过氧化氢、0.2 ml浓度为16 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和20 μL浓度为0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液，混合后45 ℃温浴10分钟，溶液由无色变为蓝色。

所述的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液可以通过冷冻干燥得到牛血清白蛋白-铂复合纳米材料粉末。以上过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。

本发明所述的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料模拟过氧化物酶的制备方法，包括如下步骤：在牛血清白蛋白水溶液中加入氯铂酸水溶液，混匀后加入氢氧化钠水溶液得混合溶液，水浴加热，混合溶液在加热反应后其氯铂酸的三个吸收峰消失；将此溶液经过超滤并水洗，得到铂纳米粒子-牛血清白蛋白核壳结构水溶液。

（二）本发明的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料的过氧化物酶活性

本发明所述的一种牛血清白蛋白-铂复合纳米材料模拟过氧化物酶，能催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色。具体地说，通过牛血清白蛋白-铂复合纳米材料催化过氧化物酶底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐产生蓝色底物，验证和比较其过氧化物酶活性。在磷酸盐缓冲液中依次加入过氧化氢、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液，混合后温浴10分钟，目视观察颜色的变化或测定652 nm波长处的吸光度值（A₆₅₂）。根据溶液颜色或通过吸光度值标准曲线进行比较过氧化酶活性。

本发明的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料模拟过氧化物酶催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐生成蓝色产物，该产物在652 nm处有最大吸收峰或者牛血清白蛋白-铂复合纳米材料催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐的活性在pH=4.5、45 ℃时达到最大。

本发明的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料模拟过氧化物酶对3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐的米氏常数为0.054 mmol/L，对过氧化氢的米氏常数为14.18 mmol/L。

本发明的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料模拟过氧化物酶在4~95 ℃温度下保存2小时后催化活性均无明显变化，具有良好的稳定性或者在pH 2~12保存2小时后催化活性均无明显变化，具有良好的稳定性。

本发明的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料模拟过氧化物酶在2 mol/L氯化钠溶液中保存2小时后催化活性仍无明显变化，具有良好的稳定性或者具有良好的短期室温稳定性，在24小时内催化活性无明显变化。

本发明的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料模拟过氧化物酶具有良好的短期室温稳定性，在24小时内催化活性无明显变化。具有良好的长期稳定性，在室温下保存30天后，相对催化活性可达到98.9%。

本发明的优点：

（1）本发明所使用的制备方法简便快速，无需还原剂。

（2）本发明中的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料具有良好的过氧化物酶活性。

（3）本发明中的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料稳定性好，过氧化物酶活性受贮存温度、pH值和离子强度的影响小。

（4）本发明具有良好的长期稳定性，在室温下保存30天后，相对催化活性可达到98.9%。

附图说明

图1为牛血清白蛋白-铂复合纳米材料催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的紫外吸收光谱图。

图2为牛血清白蛋白-铂复合纳米材料终浓度对催化反应体系的影响图。

图3为pH值对牛血清白蛋白-铂复合纳米材料催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的影响图。

图4为温浴温度对牛血清白蛋白-铂复合纳米材料催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的影响图。

图5为牛血清白蛋白-铂复合纳米材料对于3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐的稳态动力学曲线图。

图6为牛血清白蛋白-铂复合纳米材料对于过氧化氢的稳态动力学曲线图。

图7为保存温度对牛血清白蛋白-铂复合纳米材料催化活性的影响图。

图8为保存pH值对牛血清白蛋白-铂复合纳米材料催化活性的影响图。

图9为保存盐浓度对牛血清白蛋白-铂复合纳米材料催化活性的影响图。

图10为牛血清白蛋白-铂复合纳米材料的短期室温稳定性曲线图。

具体实施方式

实例1：

在5 ml 50 mg/ml的牛血清白蛋白水溶液中加入16 mmol/L氯铂酸溶液5 ml和1.5 mol/L氢氧化钠溶液0.5 ml，混匀后水浴80 ℃下反应2 h。反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次。超滤后所得溶液冷冻干燥得到牛血清白蛋白-铂复合纳米材料粉末。

实例2：

在2780 μL磷酸盐缓冲液（pH=4.5，20 mmol/L）中依次加入1 ml浓度为2 mol/L的过氧化氢、0.2 ml浓度为16 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和20 μL浓度为0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液，混合后45 ℃温浴10分钟，溶液由无色变为蓝色，在652 nm处有一吸收峰（图1）。

实例3：

在2780 μL磷酸盐缓冲液（pH=4.5，20 mmol/L）中依次加入1 ml浓度为2 mol/L的过氧化氢、0.2 ml浓度为16 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和20 μL不同浓度的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液，混合后45 ℃温浴10分钟，测定652 nm波长处吸光度。由图2可见，显色产物的吸光度随着牛血清白蛋白-铂复合纳米材料终浓度增大而增大。

实例4：

在2780 μL不同pH值的磷酸盐缓冲液（20 mmol/L）中依次加入1 ml浓度为2 mol/L的过氧化氢、0.2 ml浓度为16 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和20 μL浓度为0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液，混合后45 ℃温浴10分钟，测定652 nm波长处吸光度。由图3可见，牛血清白蛋白-铂复合纳米材料的相对催化活性在pH=4.5时达到最大。

实例5：

在2780 μL磷酸盐缓冲液（pH=4.5，20 mmol/L）中依次加入1 ml浓度为2 mol/L的过氧化氢、0.2 ml浓度为16 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和20 μL浓度为0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液，混合后在不同温度下温浴10分钟，测定652 nm波长处吸光度。由图4可见，牛血清白蛋白-铂复合纳米材料的相对催化活性在温度为45 ℃时达到最大。

实例6：

在2780 μL磷酸盐缓冲液（pH=4.5，20 mmol/L）中依次加入1 ml不同浓度的过氧化氢、0.2 ml浓度为16 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐（TMB）和20 μL浓度为0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液，混合后45 ℃温浴1分钟，测定652 nm波长处的吸光度值。通过米氏方程拟合，可以得出牛血清白蛋白-铂复合纳米材料对TMB的米氏常数为0.054 mmol/L（图5）。

实例7：

在2780 μL磷酸盐缓冲液（pH=4.5，20 mmol/L）中依次加入1 ml浓度为2 mol/L的过氧化氢、0.2 ml不同浓度的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和20 μL浓度为0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液，混合后45 ℃温浴1分钟，测定652 nm波长处的吸光度值。通过米氏方程拟合，可以得出牛血清白蛋白-铂复合纳米材料对过氧化氢的米氏常数为14.18 mmol/L（图6）。

实例8：

将牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液置于不同温度下保存2小时后，测定保存温度对其相对催化活性的影响。在2780 μL磷酸盐缓冲液（pH=4.5，20 mmol/L）中依次加入1 ml浓度为2 mol/L的过氧化氢、0.2 ml浓度为16 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和20 μL浓度为0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液，混合后45 ℃温浴10分钟，测定652 nm波长处的吸光度值。由图7可见，牛血清白蛋白-铂复合纳米材料在4~95 ℃温度下保存2小时后催化活性均无明显变化，具有良好的稳定性。

实例9：

将牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液置于不同pH条件下保存2小时后，测定保存温度对其相对催化活性的影响。在2780 μL磷酸盐缓冲液（pH=4.5，20 mmol/L）中依次加入1 ml浓度为2 mol/L的过氧化氢、0.2 ml浓度为16 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和20 μL浓度为0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液，混合后45 ℃温浴10分钟，测定652 nm波长处的吸光度值。由图8可见，牛血清白蛋白-铂复合纳米材料在pH 2~12保存2小时后催化活性均无明显变化，具有良好的稳定性。

实例10：

将牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液置于不同浓度氯化钠条件下保存2小时后，测定保存温度对其相对催化活性的影响。在2780 μL磷酸盐缓冲液（pH=4.5，20 mmol/L）中依次加入1 ml浓度为2 mol/L的过氧化氢、0.2 ml浓度为16 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和20 μL浓度为0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液，混合后45 ℃温浴10分钟，测定652 nm波长处的吸光度值。由图9可见，牛血清白蛋白-铂复合纳米材料在高达2 mol/L氯化钠溶液中保存2小时后催化活性仍无明显变化，具有良好的稳定性。

实例11：

将牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液置于室温下保存不同时间后，测定其相对催化活性。在2780 μL磷酸盐缓冲液（pH=4.5，20 mmol/L）中依次加入1 ml浓度为2 mol/L的过氧化氢、0.2 ml浓度为16 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和20 μL浓度为0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液，混合后45 ℃温浴10分钟，测定652 nm波长处的吸光度值。由图10可见，牛血清白蛋白-铂复合纳米材料具有良好的短期室温稳定性，在24小时内催化活性无明显变化。

实例12：

将牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液置于室温下保存30天后，测定其相对催化活性。在2780 μL磷酸盐缓冲液（pH=4.5，20 mmol/L）中依次加入1 ml浓度为2 mol/L的过氧化氢、0.2 ml浓度为16 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和20 μL浓度为0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液，混合后45 ℃温浴10分钟，测定652 nm波长处的吸光度值。结果表明牛血清白蛋白-铂复合纳米材料具有良好的长期稳定性，在室温下保存30天后，相对催化活性可达到98.9%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种牛血清白蛋白-铂复合纳米材料模拟过氧化物酶，其牛血清白蛋白-铂复合纳米材料是由下述方法制备而成的：在5 ml 50 mg/ml的牛血清白蛋白水溶液中加入16 mmol/L氯铂酸溶液5 ml和1.5 mol/L氢氧化钠溶液0.5 ml，混匀后水浴80 ℃下反应2 h；反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次，得到牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液；模拟过氧化酶活性特征为：在磷酸盐缓冲液中依次加入过氧化氢、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液，混合后温浴，溶液由无色变为蓝色，在652 nm处有一吸收峰。

2.根据权利要求1所述的一种牛血清白蛋白-铂复合纳米材料模拟过氧化物酶，其特征是在2780 μL pH=4.5，20 mmol/L的磷酸盐缓冲液中依次加入1 ml浓度为2 mol/L的过氧化氢、0.2 ml浓度为16 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐和20 μL浓度为0.36 mmol/L的牛血清白蛋白-铂复合纳米材料水溶液，混合后45 ℃温浴10分钟，溶液由无色变为蓝色。

3.一种牛血清白蛋白-铂复合纳米材料模拟过氧化物酶的制备方法，包括如下步骤：在5 ml 50 mg/ml的牛血清白蛋白水溶液中加入16 mmol/L氯铂酸溶液5 ml和1.5 mol/L氢氧化钠溶液0.5 ml，混匀后水浴80 ℃下反应2 h；反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次，得到铂纳米粒子-牛血清白蛋白核壳结构水溶液。

4.权利要求1或2所述的一种牛血清白蛋白-铂复合纳米材料模拟过氧化物酶，在催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征是催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐生成蓝色产物，该产物在652 nm处有最大吸收峰;牛血清白蛋白-铂复合纳米材料催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐的活性在pH=4.5、45 ℃时达到最大。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征是牛血清白蛋白-铂复合纳米材料对3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐的米氏常数为0.054 mmol/L，对过氧化氢的米氏常数为14.18 mmol/L。

7.根据权利要求4或5所述的应用，其特征是在4~95 ℃温度下或者在pH 2~12保存2小时后催化活性均无明显变化，具有良好的稳定性。

8.根据权利要求4或5所述的应用，其特征是在2 mol/L氯化钠溶液中保存2小时后催化活性仍无明显变化，具有良好的稳定性。

9.根据权利要求4或5所述的应用，其特征是具有良好的短期室温稳定性，在24小时内催化活性无明显变化;具有良好的长期稳定性，在室温下保存30天后，相对催化活性可达到98.9%。