CN105548059B - 叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种叶酸‑牛血清白蛋白‑铂铋纳米复合材料，通过蛋白质与叶酸分子的交联，合成叶酸‑牛血清白蛋白‑铂铋纳米复合材料。叶酸‑牛血清白蛋白‑铂铋纳米复合材料在保留牛血清白蛋白‑铂铋纳米复合材料高催化活性的基础上还能够特异性识别细胞表面叶酸受体，利用3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺盐酸盐显色反应，可快速灵敏地检测表面叶酸受体高表达的肿瘤细胞。
Description
技术领域
本发明涉及叶酸-牛血清白蛋白-纳米铂铋纳米复合材料及其制备方法，并提供一种基于叶酸-牛血清白蛋白-纳米铂铋纳米复合材料快速灵敏地检测叶酸受体高表达的肿瘤细胞的方法和检测试剂盒。属于纳米技术和生命分析技术领域。
背景技术
叶酸是一种小分子维生素，广泛分布在人体中，起重要的生理作用。自1986年科学家发现叶酸是由受体介导的内吞途径进入细胞以来，人们开始对叶酸作为靶向载体进行深入研究。专家已经证实在卵巢癌、肾癌、头颈部肿瘤、肺癌、乳腺癌、结直肠癌等恶性上皮组织来源肿瘤、关节炎部位有过表达的叶酸受体。因此，叶酸作为其靶向标记物，能够和叶酸受体进行特异性结合就能与叶酸受体特异性结合并选择性浓集于叶酸受体表达丰富的组织（肿瘤）中，如果对结合的叶酸做颜色等标记，我们便可以从各种医学显影手段上定位观察出病灶浓集的区域，并针对该区域进行治疗，其集中性、准确性对于癌症治疗的疗效提供了巨大的帮助。与其他靶向分子如单克隆抗体相比，叶酸相对分子质量小、无免疫原性、价廉易得、稳定性好、与药物或载体之间的化学键合简单易行。
生物分子复合纳米材料是在对生物矿化分子进行充分研究的基础上，利用矿化分子中的小肽和蛋白质设计和制备的无机纳米材料。利用蛋白质为模板制备的复合纳米材料在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围或者由该尺度范围的物质为基本结构单元所构成，其尺度已经接近光的波长并且具有大表面的特殊效应, 因此该类材料是一种典型的介观系统，具有表面效应、小尺寸效应、宏观量子隧道效应和量子限域效应。
本发明以牛血清白蛋白为模板，制备一种牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料，通过蛋白质羧基和叶酸分子的氨基进行交联反应，合成叶酸-牛血清白蛋白-纳米铂铋纳米复合材料。该纳米复合材料具有模拟过氧化物酶活性并能与叶酸受体特异性结合，可用于快速灵敏地检测叶酸受体高表达的肿瘤细胞检测。
发明内容
本发明的目的是以牛血清白蛋白为模板，制备一种牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料，以及通过蛋白质羧基和叶酸分子的氨基进行交联反应，提供一种合成叶酸-牛血清白蛋白-纳米铂铋纳米复合材料的方法。该纳米复合材料具有模拟过氧化物酶活性并能与叶酸受体特异性结合，可用于快速灵敏地检测叶酸受体高表达的肿瘤细胞检测。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明所述的一种叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料，其特征是由以下方法制备而成的：在叶酸水溶液中，加入1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺，反应后，加入牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次，得到叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液，将叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液冷冻干燥得到叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料粉末；所述叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料具有模拟过氧化物酶活性，能催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色，并能识别细胞膜表面叶酸受体。
所述的一种叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料，其特征是在2.79 mL浓度为100 mmol/L，pH =5的磷酸盐缓冲液中依次加入1 mL浓度为2 mol/L的过氧化氢、0.2 mL浓度为16 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐、10 μL浓度为4.76 mg/mL的叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液， 37 ℃温浴10分钟，溶液由无色变为蓝色，在652 nm处有吸收峰。
所述的一种叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料，其特征是能与人乳腺癌细胞MCF-7细胞膜上高表达的叶酸受体特异性识别并结合，而不与低表达叶酸受体的正常细胞人脐带静脉融合细胞EAhy926结合，通过催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐生成蓝色产物，该蓝色产物在652 nm处有最大吸收峰。
本发明所述的一种叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的制备方法，其特征是在叶酸水溶液中，加入1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺，反应后，加入牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次，得到叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液，将叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液冷冻干燥得到叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料粉末。
所述的一种叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料制备方法，其特征是在1 mL浓度为6.8 mmol/L的叶酸水溶液中，加入1 mL浓度为40 mmol/L 的1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺，反应15 min后，加入5 mL浓度为4.76 mg/mL的牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液，室温磁力搅拌反应2小时，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000r/min离心超滤，并水洗3次，得到叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液，将叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液冷冻干燥得到叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料粉末。
本发明所述的一种叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料制备方法，其特征是所使用的牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料由以下方法制备的：在5 mL浓度为50 mg/mL的牛血清白蛋白水溶液中加入5 mL浓度为16 mmol/L氯铂酸溶液和0.5 mL浓度为1.5 mol/L氢氧化钠溶液，混匀后水浴80 ℃反应2 h，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000r/min离心超滤，并水洗3次，得到牛血清白蛋白-纳米铂水溶液，将牛血清白蛋白-纳米铂水溶液冷冻干燥得到牛血清白蛋白-纳米铂粉末；在0.6 mL浓度为23.8 mg/mL的牛血清白蛋白-铂水溶液中加入0.6 mL浓度为0.5 mmol/L的硝酸铋溶液和1.8 mL 浓度为10 mmol/L，pH=7的磷酸盐缓冲液，混匀后水浴80 ℃反应2.5 h，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次，得到牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的水溶液，将牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液冷冻干燥得到牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料粉末。
本发明所述的一种基于叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的肿瘤细胞检测试剂盒，其特征是试剂盒中有叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料溶液、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液、过氧化氢溶液和硫酸溶液，所述叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料溶液作为a液，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液作为b液，过氧化氢溶液作为c液，硫酸溶液作为终止液。
所述a液中含有浓度为0.238 mg/mL的叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的RPMI-1640培养液；b液中含有浓度为16 mmol/L 的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐水溶液；c液中含有用浓度为100 mmol/L，pH =5的磷酸缓冲液配制的浓度为1.05 mol/L的过氧化氢溶液；终止液中含有浓度为0.5 mol/L的硫酸溶液。
本发明所述的一种基于叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的肿瘤细胞检测试剂盒，其特征是能用于测定叶酸受体高表达的MCF-7细胞，能区别肿瘤细胞和正常细胞。
本发明所述的基于叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的肿瘤细胞检测试剂盒的测定方法，包括如下步骤：在96孔板中每实验孔分别加入200 μL MCF-7细胞悬液，培养液为含6wt%胎牛血清的RPMI-1640，培养箱中37℃，体积分数5%二氧化碳条件下培养24小时待完全贴壁，移除培养液，每实验孔分别加入200 μL的a液，培养箱中37℃，体积分数5%二氧化碳条件下孵育1.5小时，移除培养液，用浓度为10 mmol/L，pH =7.4的磷酸缓冲液轻轻吹打冲洗3次，每孔依次加入10 μL的b液，190 μL的c液，充分振荡混匀后，37℃反应15分钟，加入50 μL的终止液，用酶标仪测定450 nm处的吸光度。
本发明采用的具体技术方案为：
（一）牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的制备：在5mL浓度为50mg/mL的牛血清白蛋白水溶液中加入5 mL浓度为16 mmol/L氯铂酸溶液和0.5 mL浓度为1.5 mol/L氢氧化钠溶液，混匀后水浴80 ℃反应2 h，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次，得到牛血清白蛋白-纳米铂水溶液，将牛血清白蛋白-纳米铂水溶液冷冻干燥得到牛血清白蛋白-纳米铂粉末。在0.6 mL浓度为23.8 mg/mL的牛血清白蛋白-纳米铂水溶液中加入0.6 mL浓度为0.5 mmol/L的硝酸铋溶液和1.8 mL 浓度为10 mmol/L，pH=7的磷酸盐缓冲液，混匀后水浴80 ℃反应2.5 h，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次，得到牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的水溶液。将牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液冷冻干燥得到牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料粉末。制备过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。
（二）叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的制备：在1 mL浓度为6.8 mmol/L的叶酸水溶液中，加入1 mL浓度为40 mmol/L 的1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺，反应15 min后加入5 mL方案（一）所制备的浓度为4.76 mg/mL 的牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液，室温磁力搅拌反应2小时。反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次，得到叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液，将叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液冷冻干燥得到叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料粉末。以上过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。
（三）叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料模拟过氧化物酶活性：在2.79 mL浓度为100 mmol/L，pH=5的磷酸盐缓冲液中依次加入1 mL浓度为2 mol/L的过氧化氢，0.2 mL浓度为16 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐，10 μL浓度为4.76 mg/mL的叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液，37 ℃温浴10分钟，测定652 nm处的吸光度。
（四）基于叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料比色法检测叶酸受体高表达的肿瘤细胞：细胞膜表面高表达叶酸受体的肿瘤细胞人乳腺癌细胞MCF-7为实验组；细胞膜表面低表达叶酸受体的正常细胞人脐带静脉融合细胞EAhy926为阴性对照组。待细胞在96孔板内完全贴壁后，每孔各加47.6 μg叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料与细胞孵育1.5小时。每个反应孔用磷酸盐缓冲液轻轻吹打冲洗3次，去除未结合的叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料。每孔依次加入磷酸盐缓冲液，过氧化氢和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐，充分振荡混匀后，室温下反应15分钟，加入0.5 mol/L 浓硫酸终止反应。用酶标仪测定每个反应孔在450 nm处的吸光度，根据颜色变化或吸光度对细胞进行检测。
本发明的另一个目的在于提供一种基于叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料模拟过氧化物酶活性的叶酸受体高表达肿瘤细胞检测试剂盒。试剂盒中包括提供叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料溶液（a液），3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液（b液），过氧化氢溶液（c液），硫酸溶液（终止液）。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
（五）叶酸受体高表达肿瘤细胞检测试剂盒：a液包括含有浓度为0.238 mg/mL的叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的RPMI-1640培养液；b液包括浓度为16 mmol/L 的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐水溶液；c液包括用浓度为100 mmol/L，pH =5的磷酸缓冲液配制的浓度为1.05 mol/L的过氧化氢溶液；终止液包括浓度为0.5 mol/L的硫酸溶液。
（六）叶酸受体高表达肿瘤细胞检测方法：培养液为含6 %胎牛血清的RPMI-1640，培养环境为恒温37℃的5%二氧化碳培养箱。将细胞加入至96孔板中，培养箱中培养24小时待完全贴壁。每孔加入200 μL技术方案（五）的a液，培养箱中孵育1.5小时。用浓度为10mmol/L，pH =7.4的磷酸盐缓冲液轻轻吹打冲洗3次，每孔依次加入10 μL技术方案（五）的b液和190 μl技术方案（五）的c液，充分振荡混匀后，37℃下反应15分钟，加入50 μL终止液终止反应，用酶标仪测定每个反应孔在450 nm处的吸光度。
本发明的优点：
（1）本发明的叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料制备方法简单易行。
（2）本发明的叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料具有良好的过氧化物酶活性。
（3）本发明的叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料能特异性结合叶酸受体，经过显色反应，目视观察和吸光度测定均可以检测出叶酸受体高表达肿瘤细胞。
（4）本发明提供的叶酸受体高表达肿瘤细胞检测试剂盒，具有操作简便、稳定性好、灵敏度高、特异性强等优点，易于推广使用。
附图说明
图1 为叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的紫外吸收光谱图。
图2为叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料用于细胞检测的吸光度对比图。（a）空白对照组；（b）叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料无细胞对照组；（c）牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料人乳腺癌细胞MCF-7组；（d）叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料人乳腺癌细胞MCF-7组；（e）叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料人乳腺癌细胞MCF-7叶酸封闭组；（f）叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料人脐带静脉融合细胞EAhy926组。
图3为MCF-7细胞测定显色体系吸光度与细胞数关系图。
具体实施方式
实例1：
在5 mL浓度为50 mg/mL的牛血清白蛋白水溶液中加入5 mL浓度为16 mmol/L氯铂酸溶液和0.5 mL浓度为1.5 mol/L氢氧化钠溶液，混匀后水浴80 ℃反应2 h，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次，得到牛血清白蛋白-纳米铂水溶液，将牛血清白蛋白-纳米铂水溶液冷冻干燥得到牛血清白蛋白-纳米铂粉末。在0.6mL浓度为23.8 mg/mL的牛血清白蛋白-铂水溶液中加入0.6 mL浓度为0.5 mmol/L的硝酸铋溶液和1.8 mL 浓度为10 mmol/L，pH=7的磷酸盐缓冲液，混匀后水浴80 ℃反应2.5 h，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次，得到牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的水溶液。将牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液冷冻干燥得到牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料粉末。
实例2：
在1 mL浓度为6.8 mmol/L的叶酸水溶液中，加入1 mL浓度为40 mmol/L 的1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺，反应15 min后，加入5 mL实例1所制备的浓度为4.76mg/mL的牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液，室温磁力搅拌反应2小时，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次，得到叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液，将叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液冷冻干燥得到叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料粉末。
实例3：
在2.79 mL浓度为100 mmol/L，pH =5的磷酸盐缓冲液中依次加入1 mL浓度为2mol/L的过氧化氢、0.2 mL浓度为16 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐、10 μL浓度为4.76 mg/mL的叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液， 37 ℃温浴10分钟，溶液由无色变为蓝色，如图1所示，显色产物在652 nm处有吸收峰，表明叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料具有模拟过氧化物酶活性。
实例4：
空白对照组：96孔板中每实验孔分别加入200 μL RPMI-1640培养液，培养箱中37℃，5%二氧化碳条件下孵育1.5小时，移除培养液，用浓度为10 mmol/L，pH =7.4的磷酸缓冲液轻轻吹打冲洗3次，每孔依次加入90 μL浓度为100 mmol/L，pH =5的磷酸盐缓冲液，100 μL浓度为2 mol/L的过氧化氢和10 μL浓度为16 mmol/L 的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐，充分振荡混匀后，37℃反应15分钟，加入50 μL浓度为0.5 mol/L的硫酸溶液终止反应，用酶标仪测定450 nm处的吸光度（图2a）。
实例5：
叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料无细胞对照组：96孔板中每实验孔分别加入200 μL含浓度为0.238 mg/mL的叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的RPMI-1640培养液，培养箱中37℃，5%二氧化碳条件下孵育1.5小时，移除培养液，用浓度为10 mmol/L，pH=7.4的磷酸缓冲液轻轻吹打冲洗3次，每孔依次加入90 μL浓度为100 mmol/L，pH =5的磷酸盐缓冲液，100 μL浓度为2 mol/L的过氧化氢和10 μL浓度为16 mmol/L 的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐，充分振荡混匀后，37℃反应15分钟，加入50 μL浓度为0.5 mol/L的硫酸溶液终止反应，用酶标仪测定450 nm处的吸光度。如图2b所示，叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料无细胞对照组吸光度与空白对照组无显著性差异，表明叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料不会在96孔板中产生非特异性吸附。
实例6：
牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料人乳腺癌细胞MCF-7组：96孔板中每实验孔分别加入200 μL MCF-7细胞悬液，培养液为含6 %胎牛血清的RPMI-1640，培养箱中37℃，5%二氧化碳条件下培养24小时待完全贴壁，移除培养液，每实验孔分别加入200 μL含浓度为0.238mg/mL的牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的RPMI-1640培养液，培养箱中37℃，5%二氧化碳条件下孵育1.5小时，移除培养液，用浓度为10 mmol/L，pH =7.4的磷酸缓冲液轻轻吹打冲洗3次，每孔依次加入90 μL浓度为100 mmol/L，pH =5的磷酸盐缓冲液，100 μL浓度为2mol/L的过氧化氢和10 μL浓度为16 mmol/L 的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐，充分振荡混匀后，37℃反应15分钟，加入50 μL浓度为0.5 mol/L的硫酸溶液终止反应，用酶标仪测定450 nm处的吸光度。如图2c所示，牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料人乳腺癌细胞MCF-7组吸光度与空白对照组无显著性差异，表明牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料无法识别人乳腺癌细胞MCF-7。
实例7：
叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料人乳腺癌细胞MCF-7组：96孔板中每实验孔分别加入200 μL MCF-7细胞悬液，培养液为含6 %胎牛血清的RPMI-1640，培养箱中37℃，5%二氧化碳条件下培养24小时待完全贴壁，移除培养液，每实验孔分别加入200 μL含浓度为0.238 mg/mL的叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的RPMI-1640培养液，培养箱中37℃，5%二氧化碳条件下孵育1.5小时，移除培养液，用浓度为10 mmol/L，pH =7.4的磷酸缓冲液轻轻吹打冲洗3次，每孔依次加入90 μL浓度为100 mmol/L，pH =5的磷酸盐缓冲液，100 μL浓度为2 mol/L的过氧化氢和10 μL浓度为16 mmol/L 的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐，充分振荡混匀后，37℃反应15分钟，加入50 μL浓度为0.5 mol/L的硫酸溶液终止反应，用酶标仪测定450 nm处的吸光度。如图2d所示，叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料人乳腺癌细胞MCF-7组吸光度显著高于空白对照组，表明叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料能识别人乳腺癌细胞MCF-7。
实例8：
叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料人乳腺癌细胞MCF-7叶酸封闭组：96孔板中每实验孔分别加入200 μL MCF-7细胞悬液，培养液为含6 %胎牛血清的RPMI-1640，培养箱中37℃，5%二氧化碳条件下培养24小时待完全贴壁，移除培养液，每实验孔分别加入200μL含0.15 mg/mL叶酸的RPMI-1640培养液，培养箱中孵育0.5小时，移除培养液，用浓度为10mmol/L，pH =7.4的磷酸盐缓冲液轻轻吹打冲洗3次，每实验孔分别加入200 μL含浓度为0.238 mg/mL的叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的RPMI-1640培养液，培养箱中37℃，5%二氧化碳条件下孵育1.5小时，移除培养液，用浓度为10 mmol/L，pH =7.4的磷酸缓冲液轻轻吹打冲洗3次，每孔依次加入90 μL浓度为100 mmol/L，pH =5的磷酸盐缓冲液，100 μL浓度为2 mol/L的过氧化氢和10 μL浓度为16 mmol/L 的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐，充分振荡混匀后，37℃反应15分钟，加入50 μL浓度为0.5 mol/L的硫酸溶液终止反应，用酶标仪测定450 nm处的吸光度。如图2e所示，叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料人乳腺癌细胞MCF-7叶酸封闭组吸光度与空白组无显著性差异，表明叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料通过细胞表面高表达的叶酸受体识别人乳腺癌细胞MCF-7。
实例9：
叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料人脐带静脉融合细胞EAhy926组：96孔板中每实验孔分别加入200 μL EAhy926细胞悬液，培养液为含6 %胎牛血清的RPMI-1640，培养箱中37℃，5%二氧化碳条件下培养24小时待完全贴壁，移除培养液，每实验孔分别加入200 μL含浓度为0.238 mg/mL的叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的RPMI-1640培养液，培养箱中37℃，5%二氧化碳条件下孵育1.5小时，移除培养液，用浓度为10 mmol/L，pH =7.4的磷酸缓冲液轻轻吹打冲洗3次，每孔依次加入90 μL浓度为100 mmol/L，pH =5的磷酸盐缓冲液，100 μL浓度为2 mol/L的过氧化氢和10 μL浓度为16 mmol/L 的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐，充分振荡混匀后，37℃反应15分钟，加入50 μL浓度为0.5 mol/L的硫酸溶液终止反应，用酶标仪测定450 nm处的吸光度。如图2f所示，叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料人脐带静脉融合细胞EAhy926组吸光度与空白组无显著性差异，表明叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料不能识别表面没有叶酸受体高表达的人脐带静脉融合细胞EAhy926。
实例10：
一种基于叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料模拟过氧化物酶活性的肿瘤细胞检测试剂盒：试剂盒中包括提供叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料溶液（a液），3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液（b液），过氧化氢溶液（c液），硫酸溶液（终止液）。a液包括含有浓度为0.238 mg/mL的叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的RPMI-1640培养液；b液包括浓度为16 mmol/L 的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐水溶液；c液包括用浓度为100 mmol/L，pH =5的磷酸缓冲液配制的浓度为1.05 mol/L的过氧化氢溶液；终止液包括浓度为0.5 mol/L的硫酸溶液。
实例11：
一种基于叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料模拟过氧化物酶活性的肿瘤细胞检测试剂盒测定叶酸受体高表达的MCF-7细胞：96孔板中每实验孔分别加入200 μL MCF-7细胞悬液，培养液为含6wt %胎牛血清的RPMI-1640，培养箱中37℃，体积分数5%二氧化碳条件下培养24小时待完全贴壁，移除培养液，每实验孔分别加入200 μL实例10的a液，培养箱中37℃，体积分数5%二氧化碳条件下孵育1.5小时，移除培养液，用浓度为10 mmol/L，pH=7.4的磷酸缓冲液轻轻吹打冲洗3次，每孔依次加入10 μL实例10的b液，190 μL实例10的c液，充分振荡混匀后，37℃反应15分钟，加入50 μL实例10的终止液，用酶标仪测定450 nm处的吸光度。如图3所示，随着MCF-7细胞数量的增加，显色体系吸光度增大。
以上所述仅为本发明的典型实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料，其特征是由以下方法制备而成的：在叶酸水溶液中，加入1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺，反应后，加入牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次，得到叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液，将叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液冷冻干燥得到叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料粉末；所述叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料具有模拟过氧化物酶活性，能催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色，并能识别细胞膜表面叶酸受体。
2.根据权利要求1所述的一种叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料，其特征是在2.79 mL浓度为100 mmol/L，pH =5的磷酸盐缓冲液中依次加入1 mL浓度为2 mol/L的过氧化氢、0.2 mL浓度为16 mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐、10 μL浓度为4.76 mg/mL的叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液， 37 ℃温浴10分钟，溶液由无色变为蓝色，在652 nm处有吸收峰。
3.根据权利要求1或2所述的一种叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料，其特征是能与人乳腺癌细胞MCF-7细胞膜上高表达的叶酸受体特异性识别并结合，而不与低表达叶酸受体的正常细胞人脐带静脉融合细胞EAhy926结合，通过催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐生成蓝色产物，该蓝色产物在652 nm处有最大吸收峰。
4.一种叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的制备方法，其特征是在叶酸水溶液中，加入1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺，反应后，加入牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次，得到叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液，将叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液冷冻干燥得到叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料粉末。
5.根据权利要求4所述的一种叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料制备方法，其特征是在1 mL浓度为6.8 mmol/L的叶酸水溶液中，加入1 mL浓度为40 mmol/L 的1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺，反应15 min后，加入5 mL浓度为4.76 mg/mL的牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液，室温磁力搅拌反应2小时，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次，得到叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液，将叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液冷冻干燥得到叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料粉末。
6.根据权利要求4或5所述的一种叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料制备方法，其特征是所使用的牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料由以下方法制备的：在5 mL浓度为50mg/mL的牛血清白蛋白水溶液中加入5 mL浓度为16 mmol/L氯铂酸溶液和0.5 mL浓度为1.5mol/L氢氧化钠溶液，混匀后水浴80 ℃反应2 h，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次，得到牛血清白蛋白-纳米铂水溶液，将牛血清白蛋白-纳米铂水溶液冷冻干燥得到牛血清白蛋白-纳米铂粉末；在0.6 mL浓度为23.8 mg/mL的牛血清白蛋白-铂水溶液中加入0.6 mL浓度为0.5 mmol/L的硝酸铋溶液和1.8 mL 浓度为10mmol/L，pH=7的磷酸盐缓冲液，混匀后水浴80 ℃反应2.5 h，反应后溶液装入截止分子量为3k的超滤管，6000 r/min离心超滤，并水洗3次，得到牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的水溶液，将牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料水溶液冷冻干燥得到牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料粉末。
7.一种基于叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的肿瘤细胞检测试剂盒，其特征是试剂盒中有叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料溶液、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液、过氧化氢溶液和硫酸溶液，所述叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料溶液作为a液，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液作为b液，过氧化氢溶液作为c液，硫酸溶液作为终止液。
8.根据权利要求7所述的一种基于叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的肿瘤细胞检测试剂盒，其特征是所述a液中含有浓度为0.238 mg/mL的叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的RPMI-1640培养液；b液中含有浓度为16 mmol/L 的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐水溶液；c液中含有用浓度为100 mmol/L，pH =5的磷酸缓冲液配制的浓度为1.05 mol/L的过氧化氢溶液；终止液中含有浓度为0.5 mol/L的硫酸溶液。
9.根据权利要求7或8所述的一种基于叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的肿瘤细胞检测试剂盒，其特征是能用于测定叶酸受体高表达的MCF-7细胞，能区别肿瘤细胞和正常细胞。
10.一种权利要求7-9任一所述的基于叶酸-牛血清白蛋白-铂铋纳米复合材料的肿瘤细胞检测试剂盒的测定方法，包括如下步骤：在96孔板中每实验孔分别加入200 μL MCF-7细胞悬液，培养液为含6wt%胎牛血清的RPMI-1640，培养箱中37℃，体积分数5%二氧化碳条件下培养24小时待完全贴壁，移除培养液，每实验孔分别加入200 μL的a液，培养箱中37℃，体积分数5%二氧化碳条件下孵育1.5小时，移除培养液，用浓度为10 mmol/L，pH =7.4的磷酸缓冲液轻轻吹打冲洗3次，每孔依次加入10 μL的b液，190 μL的c液，充分振荡混匀后，37℃反应15分钟，加入50 μL的终止液，用酶标仪测定450 nm处的吸光度。
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