CN108659062A - 唾液酸寡糖-磁纳米酶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及流感病毒检测领域，具体涉及一种唾液酸寡糖‑磁纳米酶及其制备方法和应用。本发明提供式Ⅰ或式Ⅱ所示的唾液酸寡糖‑磁纳米酶，所述式Ⅰ和式Ⅱ中，所述x为1‑3的整数，所述m为0‑11的整数；所述Ac为乙酰基，所述R1为羟基或乙酰胺基，所述R2为氢或L‑岩藻糖，所述R3为氢或硫酸酯基，所述R4为羟基或乙酰胺基。本发明提供的唾液酸寡糖‑磁纳米酶，不仅能够富集分离流感病毒，还具有极强的过氧化物酶活性，能够直接催化色原底物显色，无需使用酶标抗体，从而实现流感病毒的快速检测。

Description

唾液酸寡糖-磁纳米酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及流感病毒检测领域，具体涉及一种唾液酸寡糖-磁纳米酶及其制备方法和应用。
背景技术
流行性感冒(流感)是由流感病毒引起的人、兽、禽共患传染病。研究证实，流感病毒表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin，HA)特异识别宿主细胞表面的唾液酸糖链受体，这是流感病毒感染宿主、复制以及传播感染的生物学基础。流感病毒的变体，如H7N9，严重威胁人类和动物的健康。因此，开发简单、快速、准确的流感病毒检测方法是十分有必要的。
随着现代检测技术的不断发展，检测流感病毒的方法越来越多样化。现在常用的方法是夹心酶联免疫吸附实验(Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)，利用辣根过氧化物酶标记二抗最后进行显色。在该方法中，先由捕获抗体将流感病毒固定，接着用酶标记的二抗进行显色，进而实现定性和定量的检测。但是抗体和酶属于生物制品，对其的获取以及优化相对复杂，而且这些反应的灵敏度和结果稳定性大都依赖于反应温度和PH并且价格昂贵。其次，这种方法操作繁琐，对操作人员的技术和熟练程度要求较高，费时费力。此外，对于检测流感病毒含量低、成分复杂的实际样品，具有一定的挑战性。因此，迫切需要开发一种能够实现对样品进行富集分离并且能够替代抗体和酶的检测手段，从而实现高效检测流感病毒。
近年来，随着纳米技术的蓬勃发展，利用纳米材料进行检测和诊断已经成为现实。现在已经发现的纳米材料有金纳米、磁纳米、铂纳米和量子点在内的各种新材料，各自具有独特的理化性质。金属纳米材料是迄今为止被研究最多的纳米材料之一。纳米酶探针分子具有磁性，可对样品分离富集，并且具有催化活性，可使底物显色，提高检测灵敏度。但是，目前应用最多的免疫磁珠或者免疫磁纳米粒子大都依赖于抗体。
流感病毒表面的HA可以特异性识别和结合唾液酸寡糖受体，因此流感病毒对唾液酸的识别和结合有偏好型，禽流感病毒倾向于结合Siaα2,3Gal受体，而人流感病毒则主要结合Siaα2,6Gal受体。禽类的肠道主要含Siaα2,3Gal受体，人类的上呼吸道上皮细胞主要有Siaα2,6Gal受体。合成唾液酸糖链，将其连接到磁纳米上，这样就可以对流感病毒含量极低的复杂的生物样品中对流感病毒进行富集分离及检测。申请号为201611102165.5的中国专利申请公开了一种唾液酸寡糖－磁纳米粒子，能够富集流感病毒，并通过抗相应亚型流感病毒HA的一抗和酶标二抗进行检测，实现了对人流感和禽流感病毒的选择性富集分离。然而，使用该磁纳米粒子进行流感病毒的检测需要使用一抗和酶标二抗，操作繁琐，且价格昂贵。
因此，需要开发一种新型唾液酸寡糖-磁纳米酶，实现不同亚型流感病毒的快捷、经济、灵敏、准确的检测。
发明内容
为简化流感病毒的检测方法，降低检测成本，本发明提供一种唾液酸寡糖-磁纳米酶，不仅能够富集分离流感病毒，还具有极强的过氧化物酶活性，能够直接催化色原底物显色，无需使用酶标抗体，从而实现流感病毒的快速检测。
本发明请求保护的技术方案如下：
式Ⅰ或式Ⅱ所示的唾液酸寡糖-磁纳米酶：
所述式Ⅰ和式Ⅱ中，所述x为1-3的整数，所述m为0-11的整数；所述Ac为乙酰基，所述R1为羟基或乙酰胺基，所述R2为氢或L-岩藻糖，所述R3为氢或硫酸酯基，所述R4为羟基或乙酰胺基。
优选地，所述磁纳米酶按照包括如下步骤的方法制备：将平均粒径为50-300nm的四氧化三铁微球和亚铁氰化钾加入pH＝2-5的水溶液中，30-40℃反应3-10min；所述四氧化三铁微球和亚铁氰化钾的质量比为1：1。
制备所述唾液酸寡糖-磁纳米酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将式Ⅲ或式Ⅳ所示化合物通过酰胺缩合反应连接到表面带有羧基的磁纳米酶上，得到所述唾液酸寡糖-磁纳米酶；
所述式Ⅲ或式Ⅳ中，m，Ac，R1，R2，R3，R4的定义与上述定义相同。
所述磁纳米酶按照包括如下步骤的方法制备：将平均粒径为50-300nm的四氧化三铁微球和亚铁氰化钾加入pH＝2-5的水溶液中，30-40℃反应3-10min；所述四氧化三铁微球和亚铁氰化钾的质量比为1：1。
优选地，所述磁纳米酶的制备方法中，将平均粒径为200nm的四氧化三铁微球和亚铁氰化钾加入pH＝2的盐酸中，36℃反应6min。
优选地，所述酰胺缩合反应中，所述式Ⅲ或式Ⅳ所示化合物与所述表面带有羧基的磁纳米酶按照1:5-15或1:10的质量比混合，室温震荡反应12-36小时或24小时。
用于富集分离流感病毒及HA蛋白的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包括独立包装的试剂A和/或试剂B；
所述试剂A为式Ⅰ所示的唾液酸寡糖-磁纳米酶；
所述试剂B为式Ⅱ所示的唾液酸寡糖-磁纳米酶。
用于检测流感病毒的宿主特异性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括独立包装的试剂A和/或试剂B；
所述试剂A为式Ⅰ所示的唾液酸寡糖-磁纳米酶；
所述试剂B为式Ⅱ所示的唾液酸寡糖-磁纳米酶。
优选地，所述试剂盒还包括链霉亲和素包被的微孔板、生物素化的扎那米韦溶液和/或过氧化物酶的显色底物。
一种检测流感病毒的宿主特异性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将式Ⅰ或式Ⅱ所示的唾液酸寡糖-磁纳米酶与待测流感病毒或其HA蛋白孵育；磁性分离，洗涤，除去未结合的流感病毒或HA蛋白，得到富集流感病毒的唾液酸寡糖-磁纳米酶；
(2)将生物素化的扎那米韦溶液加入链霉亲和素包被的微孔板中，孵育；倒掉微孔板中的溶液，加入BSA溶液，封闭，然后倒掉微孔板中的溶液；
(3)将所述富集流感病毒的唾液酸寡糖-磁纳米酶加入微孔板中，孵育；
(4)倒掉微孔板中的溶液，洗涤，然后加入过氧化物酶的显色底物，孵育显色；
若所述待测流感病毒或其HA蛋白与式Ⅰ所示的唾液酸寡糖-磁纳米酶结合，使显色底物显色，则所述待测流感病毒或其HA蛋白为可感染禽类的流感病毒；
若所述待测流感病毒或其HA蛋白与式Ⅱ所示的唾液酸寡糖-磁纳米酶结合，使显色底物显色，则所述待测流感病毒或其HA蛋白为可感染人类的流感病毒。
式Ⅰ或式Ⅱ所示的唾液酸寡糖-磁纳米酶在制备用于检测流感病毒宿主特异性的产品中的用途。
本发明研究发现，将四氧化三铁微球与亚铁氰化钾在一定的条件下反应，所得到的磁纳米粒子既具有良好的超顺磁性，又具有极强的过氧化物酶活性，可以替代酶进行催化反应，催化3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)生成蓝色的产物，本文将本发明得到的这种磁纳米粒子称为磁纳米酶。将唾液酸寡糖链与磁纳米酶连接，形成的唾液酸寡糖-磁纳米酶既可以在流感病毒含量极低的复杂的生物样品中富集分离流感病毒，又可以作为“酶标”探针直接进行检测，避免了酶和抗体等生物制品的应用，从而实现流感病毒的快速检测。
在合成唾液酸寡糖-磁纳米酶的过程中，唾液酸寡糖、连接链、磁纳米酶之间，采用不同的连接反应所得到的唾液酸寡糖-磁纳米酶的催化活性具有显著差别。如果连接反应不合适，所得到的唾液酸寡糖-磁纳米酶将失去过氧化物酶活性。发明人偶然发现，首先合成式Ⅲ或式Ⅳ所示化合物，然后再与磁纳米酶连接，所得到的唾液酸寡糖-磁纳米酶既具有良好的超顺磁性，又具有很强的过氧化物酶活性。
本发明的唾液酸寡糖-磁纳米酶具有类似辣根过氧化物酶的催化活性，能够对流感病毒浓度较低且成分复杂的样品进行流感病毒的富集分离与检测，具有制备工艺简单、操作简便、价格低廉、易于保存等优点，对流感病毒的防控具有重要意义。
附图说明
图1.本发明唾液酸寡糖-磁纳米酶的制备及流感病毒检测的原理示意图。
图2.本发明制备的磁纳米酶的催化活性验证，
其中，A代表四氧化三铁微球与TMB的反应产物，B代表磁纳米酶与TMB的反应产物；横坐标为四氧化三铁微球和磁纳米酶溶液的浓度，纵坐标为反应产物在650nm处的吸光度。
图3.本发明制备的3’SLac-磁纳米酶的TEM图像。
图4.本发明制备唾液酸寡糖-磁纳米酶过程中，得到的复合磁纳米粒子的磁滞曲线，
其中，A为四氧化三铁微球，B为磁纳米酶，C为3’SLac-磁纳米酶。
图5.采用本发明的唾液酸寡糖-磁纳米酶检测VieH5N1流感病毒的结果，
其中，A为Lac-磁纳米酶(对照组)，B为6’SLac-磁纳米酶，C为3’SLac-磁纳米酶；横坐标为病毒的HA滴度，纵坐标为650nm处的吸收值。
图6.采用本发明的唾液酸寡糖-磁纳米酶检测Ca04H1N1流感病毒的结果，
其中，A为6’SLac-磁纳米酶，B为Lac-磁纳米酶(对照组)，C为3’SLac-磁纳米酶；横坐标为病毒的HA滴度，纵坐标为650nm处的吸收值。
图7.采用本发明的唾液酸寡糖-磁纳米酶检测AnhH7流感病毒的结果，
其中，A为3’SLac-磁纳米酶，B为6’SLac-磁纳米酶，C为Lac-磁纳米酶(对照组)；横坐标为病毒的HA滴度，纵坐标为650nm处的吸收值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，而不以任何方式限制本发明的范围。
本发明使用的流感病毒的毒株信息如下：
VieH5N1：毒株A/Vietnam/1203/2004(H5N1)，简称Viet04，记载在已知文献：J.Stevens,O.Blixt,T.M.Tumpey,J.K.Taubenberger,J.C.Paulson,I.A.Wilson，Structure and Receptor Specificity of the Hemagglutinin from an H5N1InfluenzaVirus,Science 2006,312,404–410.中，其HA蛋白的氨基酸序列的Genbank号为ABW90135.1；已知该病毒HA蛋白识别的受体为宿主细胞分泌的唾液酸α2,3寡糖。
Ca04H1N1：毒株A/California/04/2009(H1N1)，简称09H1，记载在已知文献：W.Zhang,J.Qi,Y.Shi,Q.Li,F.Gao,Y.Sun,X.Lu,Q.Lu,C.J.Vavricka,D.Liu,J.Yan,G.F.Gao，Crystal structure of the swine-origin A(H1N1)-2009influenza A virushemagglutinin(HA)reveals similarantigenicity to that of the 1918pandemicvirus,Protein Cell 2010,1,459–467.中，其HA蛋白的氨基酸序列的Genbank号为ACP41105.1；已知该病毒HA蛋白识别的受体为宿主细胞分泌的唾液酸α2,6寡糖。
毒株A/Anhui/1/2013(H7N9)：简称AnhH7，记载在已知文献：D.Liu,W.Shi,Y.Shi,D.Wang,H.Xiao,W.Li,Y.Bi,Y.Wu,X.Li,J.Yan,W.Liu,G.Zhao,W.Yang,Y.Wang,J.Ma,Y.Shu,F.Lei,G.F.Gao,The Lancet,2013,381,1926–1932.中；已知该病毒HA蛋白及其毒株识别的受体为宿主细胞分泌的唾液酸α2,3或α2,6寡糖。
上述生物材料，本实验室亦有保存，申请人声明自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
主要试剂和仪器：
PBS缓冲液：溶剂为水，溶质为NaH2PO4、Na2HPO4、KCl和NaCl，所述溶质NaH2PO4、Na2HPO4、KCl和NaCl在所述PBS缓冲液中的浓度分别为0.24g/L、1.42g/L、0.2g/L和8.0g/L；pH值为7.4。
PBST缓冲液：溶剂为水，溶质为NaH2PO4、Na2HPO4、KCl、NaCl和吐温20，所述溶质NaH2PO4、Na2HPO4、KCl、NaCl和吐温20在所述PBST缓冲液中的浓度分别为0.24g/L、1.42g/L、0.2g/L、8.0g/L和0.5ml/L；pH值为7.4。
聚苯乙烯磺酸－马来酸共聚物钠盐：购自Sigma公司。
亚铁氰化钾：购自Sigma公司。
TMB显色液：购买自兰博利德生物科技有限公司，单组分TMB显色液500ml。
Pm2,3-ST：多杀巴斯德杆菌α2,3唾液酸转移酶(Pasteurella multocidaα2,3-sialyltransferase)，购自天津尚德药缘科技股份有限公司。
Pd2,6-ST：美人鱼发光杆菌α2,6唾液酸转移酶(Photobacterium damselaα2,6-sialyltransferase)，购自天津尚德药缘科技股份有限公司。
链霉亲和素预包被板，购自北京博特森生物技术有限公司。
Tecan infinite 200pro酶标仪，购自帝肯(上海)贸易有限公司。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过本领域常规方法制备得到或从商业途径购买得到。
实施例1、唾液酸寡糖-磁纳米酶的制备
1.磁纳米酶的制备
聚苯乙烯磺酸－马来酸共聚物钠盐(PSSMA3:1，1g)加到20ml乙二醇中搅拌溶解，随后加入六水合氯化铁(0.54g)、无水乙酸钠(1g)，搅拌到完全溶解。然后将上述溶液转移到25毫升含聚四氟乙烯内衬的高压水热反应釜中，将反应釜置于预先加热至200℃的烘箱中，加热反应10小时。取出反应釜自然冷却至室温，用磁分离方法分离出磁性微球，用纯水洗涤除去未反应的反应物和副产物，真空干燥，制备出四氧化三铁微球(Fe3O4)。
将四氧化三铁微球(平均粒径约200nm)(0.2mg)和亚铁氰化钾(0.2mg)加入PH＝2的盐酸中，36℃反应6min。用磁分离方法分离出磁性微球，用纯水洗涤除去未反应的反应物，然后用PBST洗涤3次，最后用PBST溶解，得到浓度为1mg/ml的磁纳米酶溶液，长久保存于4℃备用。
磁纳米酶的催化活性验证：
A组：用PBST缓冲液配制浓度分别为0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml、0.03125mg/ml、0.015625mg/ml、0.0078125mg/ml的四氧化三铁微球溶液，每个浓度的四氧化三铁微球溶液各取10μL，加入96孔板的不同孔中。加入TMB显色液，避光显色15min，然后加入50μL0.5M的硫酸终止液。用酶标仪读取650nm波长的吸光度。
B组：用PBST缓冲液配制浓度分别为0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml、0.03125mg/ml、0.015625mg/ml、0.0078125mg/ml的磁纳米酶溶液，每个浓度的磁纳米酶溶液各取10μL，加入96孔板的不同孔中。加入TMB显色液，避光显色15min，然后加入50μL 0.5M的硫酸终止液。用酶标仪读取650nm波长的吸光度。
结果如图2所示，按照上述方法制备的磁纳米酶与四氧化三铁微球相比，具有很强的过氧化物酶活性，能够与TMB底物产生明显的显色反应。
2.唾液酸寡糖－连接链的制备
2.1制备N3(CH2CH2O)mCH2CH2NH2
以m＝6为例，合成方法如下：
化合物1的合成：六聚乙二醇(1.41g，5mmol)溶解在三乙胺(3.5mL，25mmol)和干燥二氯甲烷(100mL)中，冰浴，缓慢加入对苯甲磺酰氯(2.4g，15mmol)室温搅拌24小时。TLC(EtOAc)检测反应完成。加入二氯甲烷(200mL)稀释，依次用1M HCl、饱和NaHCO3以及饱和NaCl萃洗，有机相用无水Na2SO4干燥。过滤除去无水Na2SO4后，将有机相减压蒸干溶剂，所得混合物经硅胶柱层析分离纯化(2:1EtOAc/hexanes)，得无色油状产物，即化合物1。1H NMR(500MHz,chloroform-d)d:2.42(s,6H),3.55(s,8H),3.56-3.62(m,8H),3.63-3.68(m,4H),4.08-4.16(m,4H),7.28-7.36(m,4H),7.73-7.81(m,4H).13C NMR(125MHz,chloroform-d)d:21.56,68.58,69.19,70.42,70.47,70.52,70.65,127.91,129.78,132.89,144.77。
化合物2的合成：将化合物1(1g，1.7mmol)溶于DMF(N,N-二甲基甲酰胺，10mL)中，加入叠氮钠(663mg，10.2mmol)80℃搅拌反应24h。TLC(EtOAc)检测反应完成。加水(50mL)稀释，用EtOAc(2＊75mL)萃取。合并有机相，用饱和NaCl萃洗(2＊30mL)萃洗，有机相用无水Na2SO4干燥。过滤除去无水Na2SO4后，将有机相减压蒸干溶剂，得淡黄色油状产物，即化合物2。1H NMR(500MHz,chloroform-d)d:3.61(m,20H),3.34(m,3H).13CNMR(125MHz,chloroform-d)d:70.6,70.5,70.4,70.3,69.1,50.1。
化合物3的合成：将化合物2(600mg，1.8mmol)溶于10ml乙酸乙酯和2ml 1M HCl中，加入Ph3P(520mg，1.98mmol)，室温搅拌12h，TLC(EtOAc)检测反应完成。回收水相，并用(3ml＊3)萃洗有机相，合并水相，减压蒸干溶剂。经碱性Al2O3层析柱(10:1EtOAc/MeOH)纯化，得淡黄色油状产物，即化合物3。1H NMR(500MHz,CD30D)d3.71-3.68(m,br,10H),3.48(t,1H),3.08-3.04(m,1H).13C NMR(125MHz,CD30D)d69.4,69.0,68.2,67.8,49.9(CH2N3),39.1(CH2NH3).E1MS calcd for C12H27N4O3(Mt):307.198,found:307.267。
2.2制备唾液酸寡糖丙炔苷
2.2.1合成唾液酸α2,3寡糖丙炔苷：
取化合物4(终浓度为10mM)和197.5毫克CMP-N-乙酰神经氨酸(CMP-Neu5Ac，终浓度为15mM)溶于20ml的Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中，将反应体系温度升至37℃，然后加入500μl Pm2,3-ST(1U)，2-3小时后，薄层色谱(TLC)检测原料已完全消失，将反应液通过超滤膜除去酶蛋白，冷冻干燥浓缩后经凝胶柱G-15纯化后得化合物5，即唾液酸α2,3寡糖丙炔苷。
化合物4的合成：以乳糖丙炔苷为例(即R1＝OH，R2＝H，R3＝H，R4＝OH，x＝1)，其合成方法见文献：F.Lutz,U.B.Tietze,Chem.Eur.J.1998,4,1179-1183。
2.2.2合成唾液酸α2,6寡糖丙炔苷：
取化合物4(终浓度为10mM)和197.5毫克CMP-N-乙酰神经氨酸(CMP-Neu5Ac，终浓度为15mM)溶于20ml的Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中，将反应体系温度升至37℃，然后加入500μl Pd2,6-ST(1U)，2-3小时后，薄层色谱(TLC)检测原料已完全消失，将反应液通过超滤膜除去酶蛋白，冷冻干燥浓缩后经凝胶柱G-15纯化后得化合物6，即唾液酸α2,6寡糖丙炔苷。
2.3制备唾液酸寡糖-连接链
2.3.1合成唾液酸α2,3寡糖-连接链
以m＝6为例，合成方法如下：
N2保护下，将化合物3，Cu2SO4·5H2O(1mg)和抗坏血酸钠(10mg)加入蒸馏水(6ml)和DMF(6ml)中，超声混匀10分钟，加入唾液酸α2,3寡糖丙炔苷(2mg)，室温震荡反应24小时，得唾液酸α2,3寡糖－连接链。
2.3.2合成唾液酸α2,6寡糖-连接链
以m＝6为例，合成方法如下：
N2保护下，将化合物3，Cu2SO4·5H2O(1mg)和抗坏血酸钠(10mg)加入蒸馏水(6ml)和DMF(6ml)中，超声混匀10分钟，加入唾液酸α2,6寡糖丙炔苷(2mg)，室温震荡反应24小时，得唾液酸α2,6寡糖-连接链。
3.唾液酸寡糖-磁纳米酶的制备
取200μl 1mg/ml的磁纳米酶溶液(含磁纳米酶0.2mg)和适量的唾液酸寡糖-连接链溶液(含唾液酸寡糖-连接链20μg)，室温200rpm震荡反应24小时，用磁分离方法分离终产物唾液酸寡糖-磁纳米酶，用PBST洗涤，除去未反应的反应物，最后用PBST(0.05％Tween-20)溶解唾液酸寡糖-磁纳米酶，得到浓度为1mg/ml的唾液酸寡糖-磁纳米酶溶液，长久保存于4℃备用。
按照上述方法分别制备得到唾液酸α2,3乳糖-磁纳米酶溶液(简称为3’SLac-磁纳米酶)、唾液酸α2,6乳糖-磁纳米酶溶液(简称为6’SLac-磁纳米酶)和乳糖-磁纳米酶溶液(简写为Lac-磁纳米酶)。
实施例2、用唾液酸寡糖-磁纳米酶富集分离流感病毒
将含有流感病毒的水溶液50μl加入200μl的PBS缓冲液中，然后加入100μl 1mg/ml的唾液酸寡糖-磁纳米酶溶液，4℃孵育8小时。用磁分离法分离出带有流感病毒的唾液酸寡糖-磁纳米酶，用PBST洗涤3次，除去未反应的反应物和副产物。最后用PBST(0.05％Tween-20)溶解富集流感病毒的唾液酸寡糖-磁纳米酶，得到富集流感病毒的唾液酸寡糖-磁纳米酶溶液。
实施例3、具有α2,3结合特征的流感病毒的检测(以VieH5N1为例)
配制不同浓度的VieH5N1流感病毒水溶液，HA滴度分别为0，1，2，4，8，16。
1号实验组：将每个浓度的流感病毒水溶液50μl分别加入200μl的PBS缓冲液中，之后向每个管中加入100μl 1mg/ml的3’SLac-磁纳米酶，4℃孵育8小时。用磁分离法分离出富集流感病毒的3’SLac-磁纳米酶，用PBST洗涤3次，除去未反应的反应物。最后用800μl的PBST缓冲液溶解富集流感病毒的3’SLac-磁纳米酶，得到1号实验组溶液。
2号实验组：将每个浓度的流感病毒水溶液50μl分别加入200μl的PBS缓冲液中，之后每个管中加入100μl 1mg/ml的6’SLac-磁纳米酶，4℃孵育8小时。用磁分离法分离出富集流感病毒的6’SLac-磁纳米酶，用PBST洗涤3次，除去未反应的反应物。最后用800μl的PBST缓冲液溶解富集流感病毒的6’SLac-磁纳米酶，得到2号实验组溶液。
对照组：将每个浓度的流感病毒水溶液50μl分别加入200μl的PBS缓冲液中，之后每个管中加入100μl 1mg/ml的Lac-磁纳米酶，4℃孵育8小时。用磁分离法分离出Lac-磁纳米酶，用PBST洗涤3次，除去未反应的反应物。最后用800μl的PBST缓冲液溶解Lac-磁纳米酶，得到对照组溶液。
将缀合有生物素的扎那米韦溶解于PBS缓冲液中，配制成0.3125μM的生物素化的扎那米韦溶液。向链霉亲和素预包被板的三列(设为A列，B列，C列)孔中加入生物素化的扎那米韦溶液，每孔加入50μl，室温200rpm震荡孵育2小时；然后去除孔中溶液，向各孔中加入50μl3％的BSA溶液，室温封闭1小时；然后倒掉BSA溶液，向A列的各孔中分别加入1号实验组溶液，向B列的各孔中分别加入2号实验组溶液，向C列的各孔中分别加入对照组溶液，4℃孵育8小时后，倒掉孔中溶液，用PBST缓冲液洗涤3次，去除未结合的3’SLac-磁纳米酶，6’SLac-磁纳米酶或Lac-磁纳米酶。加入TMB显色液显色10min，利用Tecan infinite 200pro酶标仪读取650nm的吸收值。
结果：经肉眼观察，A列中，除HA滴度为0的孔无色外，其余各孔显蓝色，并呈现很好的梯度变化，表明存在不同浓度的感染禽类的VieH5N1流感病毒。B列和C列无色，表明不含有VieH5N1流感病毒。定量结果如图5所示，HA滴度＝log2(流感病毒浓度)。
实施例4、具有α2,6结合特征的流感病毒的检测(以Ca04H1N1为例)
配制不同浓度的Ca04H1N1流感病毒水溶液，HA滴度分别为0，1，2，4，8，16。
1号实验组：将每个浓度的流感病毒水溶液50μl分别加入200μl的PBS缓冲液中，之后向每个管中加入100μl 1mg/ml的6’SLac-磁纳米酶，4℃孵育8小时。用磁分离法分离出富集流感病毒的6’SLac-磁纳米酶，用PBST洗涤3次，除去未反应的反应物。最后用800μl的PBST缓冲液溶解富集流感病毒的6’SLac-磁纳米酶，得到1号实验组溶液。
2号实验组：将每个浓度的流感病毒水溶液50μl分别加入200μl的PBS缓冲液中，之后每个管中加入100μl 1mg/ml的3’SLac-磁纳米酶，4℃孵育8小时。用磁分离法分离出富集流感病毒的3’SLac-磁纳米酶，用PBST洗涤3次，除去未反应的反应物。最后用800μl的PBST缓冲液溶解富集流感病毒的3’SLac-磁纳米酶，得到2号实验组溶液。
对照组：将每个浓度的流感病毒水溶液50μl分别加入200μl的PBS缓冲液中，之后每个管中加入100μl 1mg/ml的Lac-磁纳米酶，4℃孵育8小时。用磁分离法分离出Lac-磁纳米酶，用PBST洗涤3次，除去未反应的反应物。最后用800μl的PBST缓冲液溶解Lac-磁纳米酶，得到对照组溶液。
将缀合有生物素的扎那米韦溶于PBS缓冲液，配成0.3125μM的生物素化的扎那米韦溶液。向链霉亲和素预包被板的三列(设为A列，B列，C列)孔中加入生物素化的扎那米韦溶液，每孔加入50μl，震荡孵育2小时；然后去除孔中溶液，向各孔中加入50μl 3％的BSA溶液，室温封闭1小时；然后倒掉BSA溶液，向A列的各孔中分别加入1号实验组溶液，向B列的各孔中分别加入2号实验组溶液，向C列的各孔中分别加入对照组溶液，4℃孵育8小时后，倒掉孔中溶液，用PBST缓冲液洗涤3次，去除未结合的3’SLac-磁纳米酶，6’SLac-磁纳米酶或Lac-磁纳米酶。加入TMB显色液显色10min，利用Tecan infinite 200pro酶标仪读取650nm的吸收值。
结果：经肉眼观察，A列中，除HA滴度为0的孔无色外，其余各孔显蓝色，并呈现很好的梯度变化，表明存在感染人类的Ca04H1N1流感病毒。B列和C列无色，表明不含有Ca04H1N1流感病毒。定量结果如图6所示，其中，HA滴度为log2(流感病毒浓度)。
实施例5、同时具有α2,6和α2,3结合特征的流感病毒的检测(以AnhH7为例)
配制不同浓度的AnhH7流感病毒水溶液，HA滴度分别为0，1，2，4，8，16。
1号实验组：将每个浓度的流感病毒水溶液50μl分别加入200μl的PBS缓冲液中，之后向每个管中加入100μl 1mg/ml的3’SLac-磁纳米酶，4℃孵育8小时。用磁分离法分离出富集流感病毒的3’SLac-磁纳米酶，用PBST洗涤3次，除去未反应的反应物。最后用800μl PBST缓冲液溶解富集流感病毒的3’SLac-磁纳米酶，得到1号实验组溶液。
2号实验组：将每个浓度的流感病毒水溶液50μl分别加入200μl的PBS缓冲液中，之后每个管中加入100μl 1mg/ml的6’SLac-磁纳米酶，4℃孵育8小时。用磁分离法分离出富集流感病毒的6’SLac-磁纳米酶，用PBST洗涤3次，除去未反应的反应物。最后用800μl的PBST缓冲液溶解富集流感病毒的6’SLac-磁纳米酶，得到2号实验组溶液。
对照组：将每个浓度的流感病毒水溶液50μl分别加入200μl的PBS缓冲液中，之后每个管中加入100μl 1mg/ml的Lac-磁纳米酶，4℃孵育8小时。用磁分离法分离出Lac-磁纳米酶，用PBST洗涤3次，除去未反应的反应物。最后用800μl的PBST缓冲液溶解Lac-磁纳米酶，得到对照组溶液。
将缀合有生物素的扎那米韦溶于PBS缓冲液，配成0.3125μM的生物素化的扎那米韦溶液。向链霉亲和素预包被板的三列(设为A列，B列，C列)孔中加入生物素化的扎那米韦溶液，每孔加入50μl，震荡孵育2小时；然后去除孔中溶液，向各孔中加入50μl 3％的BSA溶液，室温封闭1小时；然后倒掉BSA溶液，向A列的各孔中分别加入1号实验组溶液，向B列的各孔中分别加入2号实验组溶液，向C列的各孔中分别加入对照组溶液，4℃孵育8小时后，倒掉孔中溶液，用PBST缓冲液洗涤3次，去除未结合的3’SLac-磁纳米酶，6’SLac-磁纳米酶或Lac-磁纳米酶。加入TMB显色液显色10min，利用Tecan infinite 200pro酶标仪读取650nm的吸收值。
结果：经肉眼观察，A列和B列中，除HA滴度为0的孔无色外，其余各孔显蓝色，并呈现很好的梯度变化，表明存在既感染人类又感染禽类的AnhH7流感病毒。C列各孔均为无色，表明不含有AnhH7流感病毒。定量结果如图7所示，其中，HA滴度为log2(流感病毒浓度)。
可见，本发明的方法能够用于检测是否存在流感病毒，并区分流感病毒的宿主特异性。

Claims (10)

1.式Ⅰ或式Ⅱ所示的唾液酸寡糖-磁纳米酶：
所述式Ⅰ和式Ⅱ中，所述x为1-3的整数，所述m为0-11的整数；所述Ac为乙酰基，所述R1为羟基或乙酰胺基，所述R2为氢或L-岩藻糖，所述R3为氢或硫酸酯基，所述R4为羟基或乙酰胺基。
2.根据权利要求1所述的唾液酸寡糖-磁纳米酶，其特征在于，所述磁纳米酶按照包括如下步骤的方法制备：将平均粒径为50-300nm的四氧化三铁微球和亚铁氰化钾加入pH＝2-5的水溶液中，30-40℃反应3-10min；所述四氧化三铁微球和亚铁氰化钾的质量比为1：1。
3.制备权利要求1或2所述唾液酸寡糖-磁纳米酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将式Ⅲ或式Ⅳ所示化合物通过酰胺缩合反应连接到表面带有羧基的磁纳米酶上，得到所述唾液酸寡糖-磁纳米酶；
所述式Ⅲ或式Ⅳ中，m，Ac，R1，R2，R3，R4的定义与权利要求1中的定义相同；
所述磁纳米酶按照包括如下步骤的方法制备：将平均粒径为50-300nm的四氧化三铁微球和亚铁氰化钾加入pH＝2-5的水溶液中，30-40℃反应3-10min；所述四氧化三铁微球和亚铁氰化钾的质量比为1：1。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述磁纳米酶的制备方法中，将平均粒径为200nm的四氧化三铁微球和亚铁氰化钾加入pH＝2的盐酸中，36℃反应6min。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酰胺缩合反应中，所述式Ⅲ或式Ⅳ所示化合物与所述表面带有羧基的磁纳米酶按照1:5-15或1:10的质量比混合，室温震荡反应12-36小时或24小时。
6.用于富集分离流感病毒及HA蛋白的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包括独立包装的试剂A和/或试剂B；
所述试剂A为权利要求1或2所述的式Ⅰ所示的唾液酸寡糖-磁纳米酶；
所述试剂B为权利要求1或2所述的式Ⅱ所示的唾液酸寡糖-磁纳米酶。
7.用于检测流感病毒的宿主特异性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括独立包装的试剂A和/或试剂B；
所述试剂A为权利要求1或2所述的式Ⅰ所示的唾液酸寡糖-磁纳米酶；
所述试剂B为权利要求1或2所述的式Ⅱ所示的唾液酸寡糖-磁纳米酶。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括链霉亲和素包被的微孔板、生物素化的扎那米韦溶液和/或过氧化物酶的显色底物。
9.一种检测流感病毒的宿主特异性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将权利要求1或2所述的式Ⅰ或式Ⅱ所示的唾液酸寡糖-磁纳米酶与待测流感病毒或其HA蛋白孵育；磁性分离，洗涤，除去未结合的流感病毒或HA蛋白，得到富集流感病毒的唾液酸寡糖-磁纳米酶；
(2)将生物素化的扎那米韦溶液加入链霉亲和素包被的微孔板中，孵育；倒掉微孔板中的溶液，加入BSA溶液，封闭，然后倒掉微孔板中的溶液；
(3)将所述富集流感病毒的唾液酸寡糖-磁纳米酶加入微孔板中，孵育；
(4)倒掉微孔板中的溶液，洗涤，然后加入过氧化物酶的显色底物，孵育显色；
若所述待测流感病毒或其HA蛋白与式Ⅰ所示的唾液酸寡糖-磁纳米酶结合，使显色底物显色，则所述待测流感病毒或其HA蛋白为可感染禽类的流感病毒；
若所述待测流感病毒或其HA蛋白与式Ⅱ所示的唾液酸寡糖-磁纳米酶结合，使显色底物显色，则所述待测流感病毒或其HA蛋白为可感染人类的流感病毒。
10.权利要求1或2所述的式Ⅰ或式Ⅱ所示的唾液酸寡糖-磁纳米酶在制备用于检测流感病毒宿主特异性的产品中的用途。
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