CN113567601A - 一种糖链聚合物修饰微球材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种糖链聚合物修饰微球材料及其制备方法和应用,属于生物材料技术领域。本发明利用糖链聚合物的糖簇效应实现对样本中病毒或病毒样颗粒的特异性捕捉,将糖链聚合物修饰于改性微球表面,便于实现病毒或病毒样颗粒从样本中快速分离纯化。利用所述糖链聚合物修饰微球材料,通过对含病毒或病毒样颗粒的混合样本进行前处理,可以快速富集或分离纯化目标病毒或病毒样颗粒,进而有效提高现有病毒检测方法的灵敏度并加速病毒和病毒载体疫苗的研究与开发。同时,当糖链聚合物修饰微球材料中微球为琼脂糖凝胶微球或硅胶微球,本发明还提供了其作为病毒亲和色谱柱填料的应用,可以实现病毒培养液中目标病毒或病毒样颗粒的一步连续性快速纯化。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域,尤其涉及一种糖链聚合物修饰微球材料及其制备方法和应用。
背景技术
病毒核酸检测需要昂贵的设备和较长的时间,目前,流感病毒的胶体金试剂盒为临床上广泛使用的快检手段。然而,受采样操作和病程轻重的影响,咽拭子样本中较低的病毒浓度导致的假阴性结果,一直是困扰临床诊断和影响病人治疗的重大问题。
此外,在实际病毒疫苗生产过程中,病毒培养基中除了所需病毒以外,还含有营养物质以及来自培养细胞的蛋白和遗传物质等杂质,这些都是潜在的过敏源。因此,在病毒疫苗(包括灭活疫苗和mRNA疫苗)制备中,必须对病毒进行分离纯化。传统的病毒分离纯化技术包括超速离心沉降、超滤膜和各种离子交换色谱,不仅步骤繁琐、耗时,而且容易造成病毒的失活进而降低病毒回收率,同时上述技术很难实现自动化封闭式连续性生产,存在生产技术人员感染风险。
发明内容
本发明的目的在于提供一种糖链聚合物修饰微球材料及其制备方法和应用,本发明提供的糖链聚合物修饰微球材料中,利用糖链聚合物的糖簇效应实现对样本中病毒或病毒样颗粒的特异性捕捉,将糖链聚合物修饰于改性微球表面,便于实现病毒或病毒样颗粒从样本中快速分离纯化。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种糖链聚合物修饰微球材料,包括改性微球以及修饰于所述改性微球表面的糖链聚合物;
所述糖链聚合物具有式I或式II所示结构:
式I中R2和R3独立地选自碳原子个数为1~5的烷基;
式I中m=5~200,n=0~95,m1=1~20;
式II中R4为-NH2、-OH或-SH;
式II中a=5~200,b=0~50,c=1~50,m2=1~20;
当糖链聚合物为具有式I所示结构的化合物,所述改性微球为表面修饰有链霉亲和素的微球;
当糖链聚合物为具有式II所示结构的化合物,所述改性微球为表面修饰有N-羟基琥珀酰亚胺酯、环氧基团、醛基、碘乙酰基、羧基、酰氯基团与不饱和烃基中至少一种的微球。
优选地,所述微球包括磁珠、琼脂糖凝胶微球或硅胶微球。
优选地,所述磁珠的粒径为0.2~5μm,所述琼脂糖凝胶微球和硅胶微球的粒度独立地为30~165μm。
本发明提供了上述技术方案所述糖链聚合物修饰微球材料的制备方法,包括以下步骤:
将丙烯酰胺、氮-(4-三甲基硅基-3-丁炔)丙烯酰胺和链转移剂混合,在引发剂作用下进行RAFT聚合反应,得到硅烷保护侧链炔基的丙烯酰胺共聚物;所述链转移剂为端基生物素功能化三硫酯类链转移剂或端基脱硫生物素功能化三硫酯类链转移剂;
将所述硅烷保护侧链炔基的丙烯酰胺共聚物进行脱保护反应,得到端基生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物或端基脱硫生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物;
将所述端基生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物或端基脱硫生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物分别与还原末端叠氮化唾液酸寡糖进行第一点击化学反应,得到具有式I所示结构的糖链聚合物;将具有式I所示结构的糖链聚合物与第一改性微球混合,通过生物素-亲和素相互作用进行第一改性处理,得到糖链聚合物修饰微球材料;
或者,将侧基含炔基官能团的丙烯酰胺共聚物、还原末端叠氮化唾液酸寡糖和端基叠氮化聚丙烯醇衍生物进行第二点击化学反应,得到具有式II所示结构的糖链聚合物;将具有式II所示结构的糖链聚合物与第二改性微球混合,通过化学偶联进行第二改性处理,得到糖链聚合物修饰微球材料;
其中,所述第一改性微球为表面修饰有链霉亲和素的微球;
所述第二改性微球为表面修饰有N-羟基琥珀酰亚胺酯、环氧基团、醛基、碘乙酰基、羧基、酰氯基团与不饱和烃基中至少一种的微球;
所述端基生物素功能化三硫酯类链转移剂的结构式如式III所示:
所述端基脱硫生物素功能化三硫酯类链转移剂的结构式如式IV所示:
所述还原末端叠氮化唾液酸寡糖的结构式为Y-N3;
所述侧基含炔基官能团的丙烯酰胺共聚物的结构式如式V所示:
所述端基叠氮化聚丙烯醇衍生物的结构式如式VI所示:
本发明提供了上述技术方案所述糖链聚合物修饰微球材料或上述技术方案所述制备方法制备得到的糖链聚合物修饰微球材料在富集或分离纯化病毒或病毒样颗粒中的应用。
优选地,所述病毒包括流感病毒、腺病毒或腺相关病毒;当富集或分离纯化所述病毒时,富集或分离纯化的样本为临床病原微生物样本、病毒培养液或环境样本。
优选地,所述临床病原微生物样本包括咽拭子样本、肺泡灌洗液样本或肛拭子样本,所述病毒培养液样本包括实验室病毒培养液样本、疫苗/mRNA病毒载体生产过程中的病毒培养液样本或亚单位疫苗生产过程中的病毒培养液裂解样本,所述环境样本包括水样本、土壤样本或食品样本。
优选地,所述病毒样颗粒为表面含有以唾液酸糖链作为特征结合位点的突刺蛋白的病毒样颗粒;当富集或分离纯化所述病毒样颗粒时,富集或分离纯化的样本为内部遗传物质改造后的流感病毒载体疫苗、腺病毒载体疫苗、腺相关病毒载体疫苗或基因治疗载体(例如溶瘤病毒)。
优选地,当所述糖链聚合物修饰微球材料中微球为磁珠时,所述应用过程中的分离方式为在外加磁场条件下磁性吸附后洗脱分离;当所述糖链聚合物修饰微球材料中微球为琼脂糖凝胶微球或硅胶微球时,所述应用过程中的分离方式为色谱柱洗脱分离。
本发明提供了上述技术方案所述糖链聚合物修饰微球材料或上述技术方案所述制备方法制备得到的糖链聚合物修饰微球材料作为病毒亲和色谱柱填料的应用,其中,所述糖链聚合物修饰微球材料中微球为琼脂糖凝胶微球或硅胶微球。
本发明提供了一种糖链聚合物修饰微球材料,包括改性微球以及修饰于所述改性微球表面的糖链聚合物。本发明提供的糖链聚合物修饰微球材料中,利用糖链聚合物的糖簇效应实现对样本中病毒或病毒样颗粒的特异性捕捉,将糖链聚合物修饰于改性微球表面,便于实现病毒或病毒样颗粒从样本中快速分离纯化。因此,利用本发明提供的糖链聚合物修饰微球材料,通过对含病毒或病毒样颗粒的混合样本进行前处理,可以快速富集或分离纯化目标病毒或病毒样颗粒,进而有效提高现有病毒检测方法的灵敏度并加速病毒和病毒载体疫苗的研究与开发。同时,当糖链聚合物修饰微球材料中微球为琼脂糖凝胶微球或硅胶微球,本发明还提供了其作为病毒亲和色谱柱填料的应用,可以实现病毒培养液中目标病毒或病毒样颗粒的一步连续性快速纯化。
本发明提供的糖链聚合物修饰微球材料中糖链聚合物含有唾液酸寡糖结构,其包括氧原子连接的唾液酸寡糖结构(来自于天然型唾液酸寡糖)或硫原子连接的唾液酸寡糖结构(来自于非天然型人工合成的唾液酸寡糖),其中,含有硫原子连接的唾液酸寡糖结构的糖链聚合物,能够避免被病毒(具体如流感病毒)表面的神经氨酸酶(NA)水解,可以更有效的捕捉病毒,便于其进一步富集或分离纯化。
附图说明
图1为实施例1中非天然6'-型唾液酸寡糖的合成路线图;
图2为实施例1中非天然6'-型唾液酸寡糖的质谱图;
图3为实施例3中还原末端叠氮化非天然3'-型唾液酸寡糖的合成路线图;
图4为实施例3中还原末端叠氮化非天然3'-型唾液酸寡糖的质谱图;
图5为实施例4中端基生物素功能化三硫酯类链转移剂的合成路线图;
图6为应用例2中洗脱病毒的细胞侵染活性评价空斑实验图;
图7为应用例3中流感病毒亲和色谱的病毒分离纯化流程示意图;
图8为应用例3中流感病毒分离色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种糖链聚合物修饰微球材料,包括改性微球以及修饰于所述改性微球表面的糖链聚合物;
所述糖链聚合物具有式I或式II所示结构:
式I中R2和R3独立地选自碳原子个数为1~5的烷基;
式I中m=5~200,n=0~95,m1=1~20;
式II中R4为-NH2、-OH或-SH;
式II中a=5~200,b=0~50,c=1~50,m2=1~20;
当糖链聚合物为具有式I所示结构的化合物,所述改性微球为表面修饰有链霉亲和素的微球;
当糖链聚合物为具有式II所示结构的化合物,所述改性微球为表面修饰有N-羟基琥珀酰亚胺酯、环氧基团、醛基、碘乙酰基、羧基、酰氯基团与不饱和烃基中至少一种的微球。
在本发明中,所述式I和式II中Y实际上为含唾液酸寡糖去掉一个-OH后所得基团,即相应的含唾液酸寡糖的结构式为Y-OH。
在本发明中,具体的,式I和式II中Y的结构式及对应的含唾液酸寡糖的具体种类如表1所示,Y-OH的结构式及对应的含唾液酸寡糖的具体种类如表2所示。
表1 Y的结构式(未标注断键位置)及对应的含唾液酸寡糖的具体种类
表2结构式为Y-OH的含唾液酸寡糖的具体种类
在本发明中,所述R2和R3独立地选自碳原子个数为1~5的烷基,具体可以为直链烷基,也可以为支链烷基,进一步可以为-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3或-CH(CH3)2。
在本发明中,所述m=5~200,优选为50~150,更优选为60~100;n=0~95,优选为20~65,更优选为25~40;m1=1~20,优选为1~10,更优选为3~5。
在本发明中,所述a=5~200,优选为50~150,更优选为80~100;b=0~50,优选为20~65,更优选为35~40;c=1~50,优选为3~25,更优选为5~10;m2=1~20,优选为1~10,更优选为2~5。
在本发明中,所述糖链聚合物具体可以为:m=60,n=25,m1=3,R2=R3=-CH3,Y为表2中No.1或No.3对应的基团。
在本发明中,所述微球优选包括磁珠、琼脂糖凝胶微球或硅胶微球,所述磁珠的粒径优选为0.2~5μm,更优选为0.2~1μm;所述琼脂糖凝胶微球和硅胶微球的粒度独立地优选为30~165μm,更优选为45~150μm。
在本发明中,当糖链聚合物为具有式I所示结构的化合物,所述改性微球为表面修饰有链霉亲和素的微球,这种情况下,糖链聚合物与改性微球通过生物素或脱硫生物素与链霉亲和素结合方式连接到一起(即生物偶联)。
在本发明中,当糖链聚合物为具有式II所示结构的化合物,所述改性微球为表面修饰有N-羟基琥珀酰亚胺酯、环氧基团、醛基、碘乙酰基、羧基、酰氯基团与不饱和烃基中至少一种的微球,这种情况下,糖链聚合物与改性微球通过化学键合方式连接到一起(即化学偶联),其中,所述不饱和烃基具体为炔基或烯基。具体的,当所述R4为-NH2时,糖链聚合物与改性微球可以通过N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS活化酯)、醛基或环氧基团进行化学偶联;当所述R4为-OH时,糖链聚合物与改性微球可以通过环氧基团、羧基(-COOH)或酰氯基团(-COCl)进行化学偶联;当所述R4为-SH时,糖链聚合物与改性微球可以通过碘乙酰基、环氧基团或不饱和烃基进行化学偶联。
在本发明中,所述糖链聚合物修饰微球材料中改性微球以及糖链聚合物的连接方式为可逆连接方式或不可逆连接方式,具体的,当糖链聚合物为具有式I所示结构的化合物且Z为(对应脱硫生物素)时,所述糖链聚合物与改性微球的连接方式为可逆连接方式,实际应用过程中,具体可以通过竞争洗脱,将糖链聚合物修饰微球材料上吸附的病毒或病毒样颗粒温和的释放出来,进一步的,在本发明的实施例中,具体可以采用生物素洗脱液进行洗脱(后续会详细说明)。当糖链聚合物为具有式I所示结构的化合物且Z为(对应生物素)时,或者糖链聚合物为具有式II所示结构的化合物时,所述糖链聚合物与改性微球的连接方式为不可逆连接方式,在实际应用过程中,具体可以通过采用酸性PBS缓冲液进行洗脱,以实现病毒或病毒样颗粒温和的释放(后续会详细说明)。
本发明提供了上述技术方案所述糖链聚合物修饰微球材料的制备方法,包括以下步骤:
将丙烯酰胺、氮-(4-三甲基硅基-3-丁炔)丙烯酰胺和链转移剂混合,在引发剂作用下进行RAFT聚合反应,得到硅烷保护侧链炔基的丙烯酰胺共聚物;所述链转移剂为端基生物素功能化三硫酯类链转移剂或端基脱硫生物素功能化三硫酯类链转移剂;
将所述硅烷保护侧链炔基的丙烯酰胺共聚物进行脱保护反应,得到端基生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物或脱硫生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物;
将所述端基生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物或端基脱硫生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物分别与还原末端叠氮化唾液酸寡糖进行第一点击化学反应,得到具有式I所示结构的糖链聚合物;将具有式I所示结构的糖链聚合物与第一改性微球混合,通过生物素-亲和素相互作用进行第一改性处理,得到糖链聚合物修饰微球材料;
或者,将侧基含炔基官能团的丙烯酰胺共聚物、还原末端叠氮化唾液酸寡糖和端基叠氮化聚丙烯醇衍生物进行第二点击化学反应,得到具有式II所示结构的糖链聚合物;将具有式II所示结构的糖链聚合物与第二改性微球混合,通过化学偶联进行第二改性处理,得到糖链聚合物修饰微球材料;
其中,所述第一改性微球为表面修饰有链霉亲和素的微球;
所述第二改性微球为表面修饰有N-羟基琥珀酰亚胺酯、环氧基团、醛基、碘乙酰基、羧基、酰氯基团与不饱和烃基中至少一种的微球;
所述端基生物素功能化三硫酯类链转移剂的结构式如式III所示:
所述端基脱硫生物素功能化三硫酯类链转移剂的结构式如式IV所示:
所述还原末端叠氮化唾液酸寡糖的结构式为Y-N3;
所述侧基含炔基官能团的丙烯酰胺共聚物的结构式如式V所示:
所述端基叠氮化聚丙烯醇衍生物的结构式如式VI所示:
在本发明中,若无特殊说明,所用制备原料均为本领域技术人员熟知的市售商品。
在本发明中,当糖链聚合物修饰微球材料中糖链聚合物为具有式I所示结构的糖链聚合物,改性微球为第一改性微球时,所述糖链聚合物修饰微球材料记为第一糖链聚合物修饰微球材料,其制备方法包括以下步骤:
将丙烯酰胺、氮-(4-三甲基硅基-3-丁炔)丙烯酰胺和链转移剂混合,在引发剂作用下进行RAFT聚合反应,得到硅烷保护侧链炔基的丙烯酰胺共聚物;所述链转移剂为端基生物素功能化三硫酯类链转移剂或端基脱硫生物素功能化三硫酯类链转移剂;
将所述硅烷保护侧链炔基的丙烯酰胺共聚物进行脱保护反应,得到端基生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物或端基脱硫生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物;
将所述端基生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物或端基脱硫生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物分别与还原末端叠氮化唾液酸寡糖进行第一点击化学反应,得到具有式I所示结构的糖链聚合物;
将具有式I所示结构的糖链聚合物与第一改性微球混合,通过生物素-亲和素相互作用进行第一改性处理,得到糖链聚合物修饰微球材料。
本发明将丙烯酰胺、氮-(4-三甲基硅基-3-丁炔)丙烯酰胺和链转移剂混合,在引发剂作用下进行RAFT聚合反应,得到硅烷保护侧链炔基的丙烯酰胺共聚物;所述链转移剂为端基生物素功能化三硫酯类链转移剂或端基脱硫生物素功能化三硫酯类链转移剂。在本发明中,所述端基生物素功能化三硫酯类链转移剂或端基脱硫生物素功能化三硫酯类链转移剂的制备方法在后文详述。
在本发明中,所述丙烯酰胺、氮-(4-三甲基硅基-3-丁炔)丙烯酰胺和链转移剂的质量比优选为1:(6~8):(0.25~0.30),更优选为1:7:(0.26~0.27);所述引发剂优选为偶氮二异丁腈,所述丙烯酰胺和引发剂的质量比优选为30:(0.8~1.2),更优选为30:1;所述RAFT聚合反应优选在二甲基亚砜存在条件下进行,二甲基亚砜作为有机溶剂,其用量保证RAFT聚合反应顺利即可。在本发明中,所述RAFT聚合反应的温度优选为65~75℃,更优选为70℃;时间优选为15~25h,更优选为20h。所述RAFT聚合反应后,本发明优选将所得产物体系进行透析,之后经干燥,得到硅烷保护侧链炔基的丙烯酰胺共聚物。在本发明中,所述透析的时间优选为48h,所述透析用透析袋的截留分子量优选为3500,透析液优选为甲醇和丙酮混合物,所述甲醇和丙酮的体积比优选为1:1;所述干燥优选为真空干燥。
得到硅烷保护侧链炔基的丙烯酰胺共聚物后,本发明将所述硅烷保护侧链炔基的丙烯酰胺共聚物进行脱保护反应,得到端基生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物或端基脱硫生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物。在本发明中,所述脱保护反应优选在四丁基氟化铵和四氢呋喃存在条件下进行,所述四丁基氟化铵和四氢呋喃的用量保证脱保护反应顺利进行即可。在本发明中,所述脱保护反应的温度优选为室温,即不需要额外的加热或降温,在本发明的实施例中,室温具体为25℃;所述脱保护反应的时间优选为10~15h,更优选为12h。所述脱保护反应后,本发明优选将所得产物体系进行透析,之后经干燥,得到端基生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物或端基脱硫生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物。在本发明中,所述透析的时间优选为48h,所述透析用透析袋的截留分子量优选为1000,透析液优选为甲醇和丙酮混合物,所述甲醇和丙酮的体积比优选为1:1;所述干燥优选为真空干燥。
得到端基生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物或端基脱硫生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物后,本发明将所述端基生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物或端基脱硫生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物分别与还原末端叠氮化唾液酸寡糖进行第一点击化学反应,得到具有式I所示结构的糖链聚合物。在本发明中,所述还原末端叠氮化唾液酸寡糖的制备方法在后文详述。
在本发明中,所述端基生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物或端基脱硫生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物的质量与还原末端叠氮化唾液酸寡糖的质量比优选独立为1:(10~15),更优选为1:12。在本发明中,所述第一点击化学反应优选在五水硫酸铜、L-抗坏血酸钠以及三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺存在条件下进行,所述第一点击化学反应用溶剂优选为水-乙腈混合溶剂,所述五水硫酸铜、L-抗坏血酸钠、三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺以及溶剂的用量保证第一点击化学反应顺利进行即可。在本发明中,所述第一点击化学反应优选包括依次进行的两个反应阶段,第一反应阶段的温度优选为55~65℃,更优选为60℃,第一反应阶段的时间优选为5~7h,更优选为6h;第二反应阶段的温度优选为室温,时间优选为10~15h,更优选为12h。在本发明中,随着第一反应阶段的进行,位阻越来越大,反应速率会下降,通过进行第二反应阶段,可以保证反应充分进行。所述第一点击化学反应后,本发明优选将所得产物体系进行透析,之后经干燥,得到具有式I所示结构的糖链聚合物。在本发明中,所述透析的时间优选为48h,所述透析用透析袋的截留分子量优选为3500,所述透析优选包括依次进行的第一阶段透析和第二阶段透析,所述第一阶段透析采用的透析液优选为pH值为4.0的盐酸水溶液,第一阶段透析的时间优选为24h,所述第二阶段透析采用的透析液优选为去离子水,第二阶段透析的时间优选为24h;所述干燥优选为冷冻干燥。
得到具有式I所示结构的糖链聚合物后,本发明将具有式I所示结构的糖链聚合物与第一改性微球混合,通过生物素-亲和素相互作用进行第一改性处理,得到第一糖链聚合物修饰微球材料。在本发明中,所述第一改性微球为表面修饰有链霉亲和素的微球,其中,所述微球具体可以为磁珠、琼脂糖凝胶微球或硅胶微球。
具体的,当第一改性微球中的微球为磁珠时,即第一改性微球为表面修饰有链霉亲和素的磁珠,本发明优选将具有式I所示结构的糖链聚合物、第一改性微球与PBS缓冲液混合,将所得混合体系进行第一改性处理,之后通过外加磁场分离,得到第一糖链聚合物修饰微珠材料。在本发明中,PBS缓冲液的pH值优选为7.2~7.4;所述混合体系中,具有式I所示结构的糖链聚合物的浓度优选为0.8~1.2mg/mL,更优选为1.0mg/mL,第一改性微球的浓度优选为8~12mg/mL,更优选为10mg/mL。在本发明中,所述第一改性处理优选在室温条件下进行,所述第一改性处理的时间优选为25~35min,更优选为30min。
当第一改性微球中的微球为琼脂糖凝胶微球时,即第一改性微球为表面修饰有链霉亲和素的琼脂糖凝胶微球,本发明优选将具有式I所示结构的糖链聚合物、第一改性微球与PBS缓冲液混合,将所得混合体系进行第一改性处理,之后将所得改性处理体系装入色谱柱,用PBS缓冲液冲洗色谱柱,得到储存于色谱柱中的第一糖链聚合物修饰微珠材料,4℃保存备用。在本发明中,所述PBS缓冲液的pH值、混合体系的组成以及第一改性处理的条件优选与上述微球为磁珠时的方案一致,在此不再赘述。在本发明中,用PBS缓冲液冲洗色谱柱时,流速优选为1.8~2.2mL/min,更优选为2mL/min,冲洗时间优选为15~25min,更优选为20min。
当第一改性微球中的微球为硅胶微球时,即第一改性微球为表面修饰有链霉亲和素的硅胶微球,所述第一糖链聚合物修饰微球材料的制备方法优选与微球为琼脂糖凝胶微球时的方案一致,在此不再赘述。
在本发明中,当糖链聚合物修饰微球材料中糖链聚合物为具有式II所示结构的糖链聚合物,改性微球为第二改性微球时,所述糖链聚合物修饰微球材料记为第二糖链聚合物修饰微球材料,其制备方法包括以下步骤:
将侧基含炔基官能团的丙烯酰胺共聚物、还原末端叠氮化唾液酸寡糖和端基叠氮化聚丙烯醇衍生物进行第二点击化学反应,得到具有式II所示结构的糖链聚合物;
将具有式II所示结构的糖链聚合物与第二改性微球混合,通过化学偶联进行第二改性处理,得到糖链聚合物修饰微球材料。
本发明将侧基含炔基官能团的丙烯酰胺共聚物、还原末端叠氮化唾液酸寡糖和端基叠氮化聚丙烯醇衍生物进行第二点击化学反应,得到具有式II所示结构的糖链聚合物。在本发明中,所述侧基含炔基官能团的丙烯酰胺共聚物的制备方法优选参照上述RAFT聚合反应以及脱保护反应进行,不同之处在于RAFT聚合反应所用链转移剂不含生物素或脱硫生物素,采用常规商业化链转移剂即可,例如可以为二硫代苯甲酸酯、三硫代酯或其他双硫代酯。
在本发明中,所述侧基含炔基官能团的丙烯酰胺共聚物、还原末端叠氮化唾液酸寡糖和端基叠氮化聚丙烯醇衍生物的质量比优选为10:(80~120):(2~4),更优选为10:100:3。在本发明中,所述第二点击化学反应优选在五水硫酸铜、L-抗坏血酸钠以及三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺存在条件下进行,所述第二点击化学反应用溶剂优选为水-乙腈混合溶剂,所述五水硫酸铜、L-抗坏血酸钠、三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺以及溶剂的用量保证第二点击化学反应顺利进行即可。在本发明中,所述第二点击化学反应的温度优选为55~65℃,更优选为60℃,时间优选为5~7h,更优选为6h。所述第二点击化学反应后,本发明优选将所得产物体系进行透析,之后经干燥,得到具有式II所示结构的糖链聚合物。在本发明中,所述透析的时间优选为48h,所述透析用透析袋的截留分子量优选为3500,所述透析采用的透析液优选为去离子水;所述干燥优选为冷冻干燥。
得到具有式II所示结构的糖链聚合物后,本发明将具有式II所示结构的糖链聚合物与第二改性微球混合,通过化学偶联进行第二改性处理,得到第二糖链聚合物修饰微球材料。在本发明中,所述第二改性微球为表面修饰有N-羟基琥珀酰亚胺酯、环氧基团、醛基、碘乙酰基、羧基、酰氯基团与不饱和烃基中至少一种的微球,具体的,当具有式II所示结构的糖链聚合物中R4为-NH2时,第二改性微球表面优选修饰有N-羟基琥珀酰亚胺酯、醛基或环氧基团;当R4为-OH时,第二改性微球表面优选修饰有环氧基团、羧基(-COOH)或酰氯基团(-COCl);当R4为-SH时,第二改性微球表面优选修饰有碘乙酰基、环氧基团或不饱和烃基。本发明优选将具有式II所示结构的糖链聚合物、第二改性微球与第一碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液混合,在避光、室温条件下震荡混合5~7h;将所得固体物料洗涤后与乙醇胺、第二碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液混合,在室温条件下震荡10~15h,将所得固体物料洗涤,得到第二糖链聚合物修饰微球材料。在本发明中,所述第一碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液的pH值优选为9.0,所述第二改性微球与第一碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液的用量比优选为10mg:(5~12)mL,更优选为10mg:(8~10)mL。在本发明中,所述第二碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液的pH值优选为8.0,所述第二碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液的体积优选为第一碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液的体积的1.5~2.5倍,更优选为2倍;所述乙醇胺的用量优选以其浓度为8~12mmol/L为基准,更优选为10mmol/L。在本发明中,所述洗涤优选为采用超纯水抽滤洗涤。在本发明的实施例中,所述第二改性微球优选为为表面修饰有N-羟基琥珀酰亚胺酯的琼脂糖凝胶微球,此时R4具体为-NH2。
在本发明中,所述端基生物素功能化三硫酯类链转移剂的结构式如式III所示:
在本发明中,当式III中R2和R3为甲基,m1为3时,所述端基生物素功能化三硫酯类链转移剂即为实施例4中化合物20,按照图5所示反应路线图制备即可;类似的,当R2和/或R3为其它烷基,m1为其它取值时,选择相应的原料,参照图5所示反应路线图制备即可,此处不再赘述。
在本发明中,所述端基脱硫生物素功能化三硫酯类链转移剂的结构式如式IV所示:
在本发明中,所述端基脱硫生物素功能化三硫酯类链转移剂参照所述端基生物素功能化三硫酯类链转移剂的制备方法即可,不同之处仅在于将制备端基生物素功能化三硫酯类链转移剂采用的生物素替换为脱硫生物素,此处不再赘述。
在本发明中,所述还原末端叠氮化唾液酸寡糖的结构式为Y-N3,所述还原末端叠氮化唾液酸寡糖的制备方法优选包括以下步骤:
将唾液酸寡糖和叠氮化钠混合,在2-氯-1,3-二甲基氯化咪唑鎓和三乙胺存在条件下进行水相端基叠氮化反应,得到还原末端叠氮化唾液酸寡糖。
在本发明中,所述唾液酸寡糖和叠氮化钠的质量比优选为1:(0.9~1.2),更优选为1:(1.0~1.1);所述2-氯-1,3-二甲基氯化咪唑鎓和三乙胺的用量保证水相端基叠氮化反应顺利进行即可。在本发明中,所述水相端基叠氮化反应优选在冰水浴(0℃)条件下进行,所述水相端基叠氮化反应的时间优选为1~2h,更优选为1.5h。所述水相端基叠氮化反应后,本发明优选将所得产物体系浓缩,将所得残余物与N,N-二甲基甲酰胺混合,过滤除去未反应的叠氮化钠;将滤液浓缩,将所得残余物溶于水中,采用二氯甲烷将所得体系进行洗涤,收集水相,用阳离子交换树脂色谱柱纯化,干燥后得到还原末端叠氮化唾液酸寡糖。在本发明中,所述阳离子交换树脂色谱柱的型号优选为IR-120;所述干燥优选为冷冻干燥。
在本发明中,所述唾液酸寡糖的结构式为Y-OH,当所述唾液酸寡糖中的X为-O-时,相应的唾液酸寡糖为天然型唾液酸寡糖,优选采用市售商品;以所述天然型唾液酸寡糖为原料,经上述水相端基叠氮化反应即可制备得到还原末端叠氮化唾液酸寡糖。
在本发明中,当X为-S-时,相应的唾液酸寡糖为非天然型唾液酸寡糖,包括非天然6'-型唾液酸寡糖或非天然3'-型唾液酸寡糖,所述非天然型唾液酸寡糖优选自行制备得到。
具体的,在本发明中,当所述非天然型唾液酸寡糖为非天然6'-型唾液酸寡糖,以表2中编号为No.3的化合物(记为No.3化合物)为例,即为实施例1中化合物10,具体是以乳糖为原料,按照图1所示反应路线图制备即可;当非天然6'-型唾液酸寡糖为表2中编号为No.4、No.11或No.12的化合物(分别记为No.4化合物、No.11化合物或No.12化合物)时,优选参照图1所示反应路线图制备即可,不同之处仅在于反应原料不同,具体的,以N-乙酰氨基乳糖为原料制备No.4化合物,以半乳糖为原料制备No.11化合物,以N-乙酰氨基半乳糖为原料制备No.12化合物;之后以所述非天然6'-型唾液酸寡糖为原料,经上述水相端基叠氮化反应即可制备得到还原末端叠氮化唾液酸寡糖。
在本发明中,当所述非天然型唾液酸寡糖为非天然3'-型唾液酸寡糖,可以基于上述方法,以所述非天然3'-型唾液酸寡糖为原料经水相端基叠氮化反应制备得到还原末端叠氮化唾液酸寡糖;为了提高目标产物收率,也可以对受体糖单元先进行叠氮化反应,再经后续一系列反应制备得到还原末端叠氮化唾液酸寡糖,具体的,以表2中编号为No.7的化合物(记为No.7化合物)为例,还原末端叠氮化唾液酸寡糖即为实施例3中化合物16,具体是以乳糖为受体糖单元,按照图3所示反应路线图制备即可;当非天然3'-型唾液酸寡糖为表2中编号为No.8、No.15或No.16的化合物(分别记为No.8化合物、No.15化合物或No.16化合物)时,优选参照图3所示反应路线图制备即可,不同之处仅在于反应原料不同,具体的,以N-乙酰氨基乳糖为原料制备No.8化合物对应的还原末端叠氮化唾液酸寡糖,以半乳糖为原料制备No.15化合物对应的还原末端叠氮化唾液酸寡糖,以N-乙酰氨基半乳糖为原料制备No.16化合物对应的还原末端叠氮化唾液酸寡糖。
本发明提供了上述技术方案所述糖链聚合物修饰微球材料或上述技术方案所述制备方法制备得到的糖链聚合物修饰微球材料在富集或分离纯化病毒或病毒样颗粒中的应用。
在本发明中,所述病毒优选包括流感病毒、腺病毒(AD)或腺相关病毒(AAV),更优选为流感病毒;在本发明的实施例中,具体是以H1N1型流感病毒为例验证本发明提供的糖链聚合物修饰微球材料的富集或分离纯化效果,后续会详细说明。在本发明中,当富集或分离纯化所述病毒时,富集或分离纯化的样本优选为临床病原微生物样本、病毒培养液或环境样本;所述临床病原微生物样本优选包括咽拭子样本、肺泡灌洗液样本或肛拭子样本,所述病毒培养液样本优选包括实验室病毒培养液样本、疫苗/mRNA病毒载体生产过程中的病毒培养液样本或亚单位疫苗生产过程中的病毒培养液裂解样本,所述环境样本优选包括水样本、土壤样本或食品样本,所述食品样本具体可以为冷链食品样本。在本发明的实施例中,具体是以病毒培养液为例验证本发明提供的糖链聚合物修饰微球材料的富集或分离纯化效果,后续会详细说明。
在本发明中,所述病毒样颗粒优选为表面含有以唾液酸糖链作为特征结合位点的突刺蛋白(例如,血凝素蛋白)的病毒样颗粒,具体可以为表面本身含有血凝素(HA)蛋白或表面修饰有HA蛋白的流感病毒样颗粒。在本发明中,当富集或分离纯化所述病毒样颗粒时,富集或分离纯化的样本优选为内部遗传物质(例如,mRNA)改造后的流感病毒载体疫苗、腺病毒载体疫苗、腺相关病毒载体疫苗或基因治疗载体(例如,溶瘤病毒)。
本发明提供的糖链聚合物修饰微球材料中,利用糖链聚合物的糖簇效应实现对样本中病毒或病毒样颗粒的特异性捕捉,将糖链聚合物修饰于改性微球表面,便于实现病毒或病毒样颗粒从样本中快速分离纯化。
在本发明中,当所述糖链聚合物修饰微球材料中微球为磁珠时,糖链聚合物修饰微球材料应用过程中的分离方式优选为在外加磁场条件下磁性吸附后洗脱分离。在本发明中,当所述糖链聚合物修饰微球材料中微球为磁珠,糖链聚合物为具有式I所示结构的化合物且Z为(对应脱硫生物素)时,即当所述糖链聚合物与改性微球的连接方式为可逆连接方式时,实际应用过程中的洗脱方式优选为采用生物素洗脱液进行洗脱,以通过竞争吸附原理完成对吸附的病毒或病毒样颗粒的释放。在本发明中,所述生物素洗脱液的溶剂优选为PBS缓冲液,所述PBS缓冲液的pH值优选为8.5,所述生物素洗脱液中生物素的浓度优选为8mmol/L。在本发明中,采用该方法对病毒或病毒样颗粒进行富集或分离纯化,病毒或病毒样颗粒的回收率超过90%。在本发明中,当所述糖链聚合物修饰微球材料中微球为磁珠,糖链聚合物为具有式I所示结构的化合物且Z为(对应生物素)时,即当所述糖链聚合物与改性微球的连接方式为不可逆连接方式时,实际应用过程中的洗脱方式优选为采用PBS缓冲液进行洗脱,以实现病毒或病毒样颗粒温和的释放,具体的,可以采用pH值为5.0~6.0的PBS缓冲液,在震荡条件下进行洗脱。
在本发明中,当所述糖链聚合物修饰微球材料中微球为琼脂糖凝胶微球或硅胶微球时,糖链聚合物修饰微球材料应用过程中的分离方式优选为色谱柱洗脱分离。在本发明中,当所述糖链聚合物修饰微球材料中微球为琼脂糖凝胶微球或硅胶微球,糖链聚合物为具有式I所示结构的化合物且Z为(对应脱硫生物素)时,即当所述糖链聚合物与改性微球的连接方式为可逆连接方式时,实际应用过程中的洗脱方式优选为采用生物素洗脱液进行洗脱,所述生物素洗脱液的溶剂优选为PBS缓冲液,所述PBS缓冲液的pH值优选为7.5~9.5,更优选为8.5,所述生物素洗脱液中生物素的浓度优选为8mmol/L。在本发明中,当所述糖链聚合物修饰微球材料中微球为琼脂糖凝胶微球或硅胶微球,糖链聚合物为具有式I所示结构的化合物且Z为(对应生物素)时,或者糖链聚合物为具有式II所示结构的化合物时,即当所述糖链聚合物与改性微球的连接方式为不可逆连接方式时,实际应用过程中的洗脱方式优选为采用PBS缓冲液进行洗脱,以通过减小糖链与病毒或病毒样颗粒表面特征蛋白的亲和力实现对吸附的病毒或病毒样颗粒的释放。在本发明中,针对病毒培养液中病毒而言,优选先采用pH值为7.4的PBS缓冲液淋洗4个柱体积,除去病毒培养液中的杂质,随后采用pH值为5.5~6.5的PBS缓冲液洗脱,洗脱温度优选为37℃。
本发明提供了上述技术方案所述糖链聚合物修饰微球材料或上述技术方案所述制备方法制备得到的糖链聚合物修饰微球材料作为病毒亲和色谱柱填料的应用,其中,所述糖链聚合物修饰微球材料中微球为琼脂糖凝胶微球或硅胶微球。
具体的,本发明提供的糖链聚合物修饰微球材料可以用于对病毒进行快速富集,以提高其检测灵敏度和准确率;例如针对病毒而言,具体可以为流感病毒,为了检测临床病原微生物样本、病毒培养液或环境样本中的微量病毒,可以采用微球为磁珠的糖链聚合物修饰微球材料(简称为糖基磁珠)对样本中的病毒进行富集,之后通过外加磁场分离,经浓缩可提高病毒的可检浓度,改善后续病毒检测的准确性和灵敏性,满足快速检测需要;对于病毒培养液中的病毒,还可以采用微球为琼脂糖凝胶微球的糖链聚合物修饰微球材料(简称为糖基琼脂微球)或微球为硅胶微球的糖链聚合物修饰微球材料(简称为糖基硅胶微球),作为病毒亲和色谱柱填料,制备成病毒亲和色谱柱,之后通过洗脱实现病毒培养液中病毒的连续性、封闭性、大量分离纯化操作,以满足后续工艺要求,如进行疫苗生产。类似的,针对病毒样颗粒或亚单位(重组蛋白)疫苗而言,也可以采用上述方式实现其富集或分离纯化,在此不再赘述。
下面将结合本发明中的实施例,对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
在本发明的实施例中,两种天然型唾液酸寡糖6'-sialyllactose(6-SL,即对应表2中编号为No.1的化合物)和3'-sialyllactose(3-SL,即对应表2中编号为No.5的化合物)直接购买。
实施例1
非天然型唾液酸寡糖S-6'-sialyllactose(即对应表2中编号为No.3的化合物)按照图1所示合成路线图制备得到,包括以下步骤:
在唾液酸(化合物1)的甲醇溶液(3g/100mL)中加入酸性树脂,使体系pH值控制在3~5,室温(25℃)条件下搅拌至全部溶解,继续搅拌过夜,过滤除去酸性树脂,将所得滤液进行浓缩,得到化合物2;
在冰水浴(0℃)条件下,向压力容器中加入化合物2(2.0g)、乙酰氯(20mL)、甲醇(3mL)和乙酸(10mL),室温条件下密封搅拌反应36h;将所得产物体系进行浓缩,得到化合物3;
用干燥的二氯甲烷(30mL)溶解得到的化合物3,随后加入硫代乙酸钾(4g),室温条件下搅拌过夜;将所得产物体系进行浓缩,得到粗产物,用二氯甲烷将所述粗产物溶解,之后经水洗,再通过硅胶色谱柱纯化,得到化合物4;
冰水浴(0℃)条件下,向化合物4(560mg)的甲醇(12mL)溶液中加入甲醇钠的甲醇溶液(所述甲醇钠的甲醇溶液的体积为320μL,甲醇钠浓度为5.4mol/L),撤去冰水浴,室温条件下搅拌反应1h;随后加入酸性树脂,使溶液的pH值降到6.0,过滤,将所得滤液浓缩,得到化合物5;
向乳糖(4g)中加入苯甲醇30mL和三甲基氯硅烷(7mL),60℃条件下搅拌反应6h,将所得产物体系进行浓缩,将所得浓缩物倒入冷二氯甲烷中,过滤,收集沉淀物;采用N,N-二甲基甲酰胺(40mL)溶解所述沉淀物,随后加入苯甲醛二甲缩醛(3.0mL)和樟脑磺酸(180mg),在60℃条件下搅拌反应过夜,将所得产物体系冷却至室温,加入三乙胺(1.0mL)中和所得产物体系,之后进行浓缩,将所得浓缩物倒入冷二氯甲烷中,过滤,收集沉淀物;向所述沉淀物中加入吡啶(25mL)和醋酸酐(30mL),室温条件下进行乙酰化反应24h,将所得产物体系进行浓缩,所得浓缩物中加入乙酸乙酯溶解,水洗,收集有机相,浓缩后经硅胶色谱柱纯化,得到化合物6;
将化合物6(1.5g)溶于甲醇(25mL)中,加入钯碳(150mg)和三乙基硅烷(1.5mL),在室温条件下反应4h;将所得产物体系进行过滤,滤液浓缩后经硅胶色谱柱纯化,得到化合物7;
向化合物7(1.0g)中加入甲苯(10mL)和乙腈(5mL)混合溶剂,之后加入三苯基磷(675mg)、咪唑(348mg)和碘(510mg),在80℃条件下反应3h;将所得产物体系冷却至室温,加入饱和硫代硫酸钠水溶液淬灭,用乙酸乙酯萃取,浓缩后经硅胶柱纯化,得到化合物8;
将化合物5(280mg)溶于乙腈(1.5mL)和N,N-二甲基甲酰胺(1.0mL)混合溶剂中,加入化合物8(加入量为化合物5物质的量的1.5倍)和二异丙基乙胺(加入量为化合物5物质的量的3倍),50℃条件下搅拌反应2h;将所得产物体系浓缩后进行硅胶色谱柱纯化,得到化合物9;
将化合物9(300mg)溶于甲醇(15mL)和水(5mL)混合溶剂中,加入氢氧化锂(80mg),室温搅拌条件下进行脱保护反应3h;向所得产物体系中加入酸性树脂,使溶液的pH值为7,过滤,将所得滤液浓缩后进行C18反相柱纯化,得到化合物10,即非天然6'-型唾液酸寡糖(质谱图如图2所示)。
实施例2
基于唾液酸乳糖(具体可以为表2中编号为No.1的化合物、编号为No.5的化合物或实施例1制备的编号为No.3的化合物)制备还原末端叠氮化唾液酸寡糖,包括以下步骤:
将唾液酸乳糖(0.65g)、2-氯-1,3-二甲基氯化咪唑啉鎓(DMC,0.52g)、三乙胺(2.0mL)和叠氮化钠(0.67g)混合,在冰水浴(0℃)条件下进行水相端基叠氮化反应1.5h,以在唾液酸乳糖的还原末端引入叠氮基团;将所得产物体系浓缩,将所得残余物与N,N-二甲基甲酰胺(20mL)混合,过滤除去未反应的叠氮化钠;将滤液浓缩,将所得残余物溶于水(20mL)中,采用二氯甲烷将所得体系进行洗涤,收集水相,用阳离子交换树脂(IR-120)色谱柱纯化,冷冻干燥得到还原末端叠氮化唾液酸寡糖。
采用本实施例方法具体可以制备得到还原末端叠氮化天然6'-型唾液酸寡糖、还原末端叠氮化天然3'-型唾液酸寡糖或还原末端叠氮化非天然6'-型唾液酸寡糖。
实施例3
还原末端叠氮化非天然3'-型唾液酸寡糖(即非天然3'-型唾液酸寡糖的叠氮化物,所述非天然3'-型唾液酸寡糖英文名称为S-3'-sialyllactose,即对应表2中编号为No.7的化合物)按照图3所示合成路线图制备得到,包括以下步骤:
将乳糖(2g)溶于水(20mL)和乙腈(5mL)的混合溶剂中,冰水浴(0℃)条件下依次加入氮-二异丙基乙基氨(DIPEA,9mL)、2-氯-1,3-二甲基氯化咪唑啉鎓(DMC,2.6g溶于水2.5mL)、叠氮化钠(NaN3,3.4g溶于水2.5mL),将所得反应混合物在0℃条件下搅拌反应6h;将所得产物体系浓缩,向所得浓缩物中加入N,N-二甲基甲酰胺(20mL),过滤除去杂质,将滤液浓缩,向所得浓缩物中加入二氯甲烷(50mL),过滤,收集沉淀物;向所述沉淀物中加入甲苯(40mL)和二丁基氧化锡(Bu2SnO,1.8g),将得到的悬浊液加热,在110℃回流条件下反应5h;将所得反应体系的温度降低至90℃,再加入对甲氧基氯化苄(PMBCl,1.93mL)和四丁基碘化铵(TBAI,1.74g),在90℃条件下继续搅拌反应6h;将所得反应产物体系冷却至室温,过滤,滤液浓缩,向所得浓缩物中加入二氯甲烷(50mL),过滤,收集沉淀物;向所述沉淀物中加入吡啶(12mL)和醋酸酐(15mL),室温条件下进行乙酰化反应24h;将所得产物体系进行浓缩,向所得浓缩物中加入乙酸乙酯溶解,水洗,收集有机相,将所述有机相浓缩后经硅胶色谱柱纯化,得到化合物11;
将化合物11(1.66g)溶于二氯甲烷(30mL)和水(1mL)混合溶剂中,随后加入2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌(DDQ,0.6g),室温条件下搅拌反应2h;反应完成后,加入三乙胺(1.0mL)淬灭反应,将所得产物体系浓缩后经硅胶色谱柱纯化,得到化合物12;
将化合物12(0.8g)溶于超干二氯甲烷(30mL)中,降温至-40℃,随后加入超干吡啶(0.6mL)和三氟甲磺酸酐(0.84mL),-40℃条件下搅拌反应10min;将所得产物体系依次用冷盐酸(1mol/L,30mL,0℃)、饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)和水(30mL)洗涤,最后加入无水硫酸钠干燥,过滤,将滤液浓缩,所得浓缩物溶于二甲基亚砜(15mL),随后加入亚硝酸钾(KNO2,0.53g),将所得悬浮液在50℃条件下搅拌反应过夜;将所得产物体系浓缩,浓缩物溶于二氯甲烷(50mL),水洗,收集有机相,将所述有机相浓缩后经硅胶色谱柱纯化,得到化合物13;
将化合物13(150mg)溶于超干二氯甲烷(6mL)中,降温至-35℃,加入吡啶(0.22mL)和三氟甲磺酸酐(0.30mL),-35℃条件下搅拌反应30min,随后升温至室温,继续搅拌反应2h;反应完成后,加水(5mL)淬灭反应,分离有机相,用饱和碳酸氢钠水溶液(5mL)洗,收集有机相,加入无水硫酸钠干燥,过滤,将滤液浓缩,得到化合物14;
将化合物5(100mg)溶于乙腈(1.0mL)和N,N-二甲基甲酰胺(0.75mL)混合溶剂中,加入上述化合物14和二异丙基乙胺(0.16mL),50℃条件下搅拌反应2h;将所得产物体系浓缩后进行硅胶色谱柱纯化,得到化合物15;
将化合物15(300mg)溶于甲醇(15mL)和水(5mL)混合溶剂中,加入氢氧化锂(80mg),在室温搅拌条件下进行脱保护反应3h;向所得产物体系中加入酸性树脂,使溶液的pH值为7,过滤,将所得滤液浓缩后进行C18反相柱纯化,得到化合物16,即还原末端叠氮化非天然3'-型唾液酸寡糖(质谱图如图4所示)。
实施例4
端基生物素功能化三硫酯类链转移剂按照图5所示反应路线图制备,包括以下步骤:
用N,N-二甲基甲酰胺(3.5mL)溶解生物素(biotin,183mg),降温至0℃,随后依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl,180mg)、1-羟基苯并三唑(HOBt,126mg)和N,N-二异丙基乙胺(0.32mL),0℃条件下搅拌10min,随后加入叠氮聚乙二醇胺(具体为N3-PEG3-NH2,186μL)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(0.5mL),将反应混合物室温条件下搅拌反应过夜;将所得产物体系浓缩,浓缩物加入二氯甲烷(50mL)溶解,依次用饱和硫酸氢钾水溶液(20mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)以及饱和氯化钠水溶液洗,收集有机相,加入无水硫酸钠干燥,过滤,滤液浓缩后进行硅胶色谱柱纯化,得到化合物17;
将化合物17(0.45g)溶于四氢呋喃(4mL)和甲醇(1mL)混合溶剂中,加入活性炭负载氢氧化钯(50%wt,135mg),将所得反应混合液于氢气气氛中室温反应过夜;反应完成后,将所得产物体系过滤,将滤液浓缩,得到化合物18;
将3-巯基丙酸(0.5mL)溶于四氢呋喃(30mL)中,加入磷酸钾(1.34g),搅拌10min,将反应体系降温至0℃,滴加二硫化碳(1.035mL),升温至室温,继续反应2h;随后加入2-溴丙酸甲酯(0.883mL),室温条件下搅拌反应过夜;反应完成后,将所得产物体系过滤,加入二氯甲烷(150mL)稀释滤液,依次进行水洗以及饱和氯化钠水溶液洗,收集有机相,加入无水硫酸钠干燥,过滤,滤液浓缩后进行硅胶色谱柱纯化,得到化合物19;
将化合物18(0.39g)溶于N,N-二甲基甲酰胺(3.0mL)中,加入化合物19(0.2g)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU,0.36g)和N,N-二异丙基乙胺(0.175mL),将所得反应混合物在室温条件下搅拌反应24h;反应完成后,向所得产物体系中加入二氯甲烷(100mL)稀释,依次用饱和硫酸氢钾水溶液(40mL)以及饱和氯化钠水溶液(40mL)洗,收集有机相,加入无水硫酸钠干燥,过滤,滤液浓缩后进行硅胶色谱柱纯化,得到化合物20,即端基生物素功能化三硫酯类链转移剂。
实施例5
利用实施例4所得端基生物素功能化三硫酯类链转移剂制备端基生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物,包括以下步骤:
将端基生物素功能化三硫酯类链转移剂(8mg)、丙烯酰胺(30mg)、氮-(4-三甲基硅基-3-丁炔)丙烯酰胺(210mg)、偶氮二异丁腈(AIBN,1mg)和二甲基亚砜(DMSO,1.5mL)混合,得到混合反应液,其中,丙烯酰胺和4-三甲基硅基-3-丁炔基丙烯酰胺作为单体;将所述混合反应液在70℃条件下进行可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合反应20h;将所得产物体系进行透析48h(所用透析袋的截留分子量3500,透析液为甲醇和丙酮混合物,所述甲醇和丙酮的体积比为1:1),真空干燥,得到端基生物素功能化的硅烷保护侧链炔基的丙烯酰胺共聚物;
将所述端基生物素功能化的硅烷保护侧链炔基的丙烯酰胺共聚物(75mg)、四丁基氟化铵(TBAF)的四氢呋喃溶液(1.0mL,1mol/L)和四氢呋喃(THF,3mL)混合,在室温条件下反应过夜,以脱去共聚物中侧链三甲基硅烷保护基;将所得产物体系进行透析48h(所用透析袋的截留分子量1000,透析液为甲醇和丙酮混合物,所述甲醇和丙酮的体积比为1:1),真空干燥,得到端基生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物;
其中,氮-(4-三甲基硅基-3-丁炔)丙烯酰胺、端基生物素功能化的硅烷保护侧链炔基的丙烯酰胺共聚物和端基生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物的结构式依次如下所示:
其中,R2为甲基,R3为甲基,m=60,n=25,m1=3。
实施例6
按照实施例4的方法制备端基脱硫生物素功能化三硫酯类链转移剂,不同之处仅在于,将实施例4中“生物素”替换为“脱硫生物素”;其中,所述端基脱硫生物素功能化三硫酯类链转移剂的结构式如下所示:
其中,R2为甲基,R3为甲基,m1=3;
之后按照实施例5的方法制备端基脱硫生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物,不同之处仅在于将实施例5中“端基生物素功能化三硫酯类链转移剂”替换为“端基脱硫生物素功能化三硫酯类链转移剂”。
实施例7
利用实施例5所得端基生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物以及实施例2所得叠氮化非天然6'-型唾液酸寡糖制备具有式I所示结构的糖链聚合物,包括以下步骤:
将端基生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物(10mg)、叠氮化非天然6'-型唾液酸寡糖(120mg)、五水硫酸铜(7.0mg)、L-抗坏血酸钠(L-Asc·Na,30mg)以及三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA,14mg)溶于水(2.0mL)和乙腈(1.0mL)混合溶剂中,在60℃条件下反应6h,随后在室温条件下搅拌反应过夜;将所得产物体系进行透析48h(所用透析袋的截留分子量3500,具体是先用pH值为4.0的盐酸透析24h,再更换为去离子水透析24h),冷冻干燥,得到糖链聚合物,结构式如下所示:
其中,R2为甲基,R3为甲基,m=60,n=25,m1=3。
实施例8
按照实施例7的方法制备具有式I所示结构的糖链聚合物,不同之处仅在于,将实施例7中“端基生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物”替换为实施例6所得“端基脱硫生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物”;最终所得糖链聚合物(质均分子量Mw为43KD)的结构式如下所示:
其中,R2为甲基,R3为甲基,m=60,n=25,m1=3。
实施例9
制备具有式II所示结构的糖链聚合物,包括以下步骤:
将侧基含炔基官能团的丙烯酰胺共聚物(10mg)、实施例2中叠氮化非天然6'-型唾液酸寡糖(100mg)、叠氮聚乙二醇胺(具体为N3-PEG3-NH2,3mg)、五水硫酸铜(7mg)、L-抗坏血酸钠(L-Asc·Na,30mg)、三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA,15mg)溶于水(2mL)和乙腈(2mL)混合溶剂中,在60℃条件下进行点击反应6h;将所得产物体系在去离子水中进行透析48h(所用透析袋的截留分子量3500),冷冻干燥,得到具有式II所示结构的糖链聚合物,结构式如下所示:
其中,a=40,b=20,c=15,m2=3,R4为-NH2。
实施例10
利用实施例8所得具有式I所示结构的糖链聚合物制备糖链聚合物修饰微球材料,即利用脱硫生物素-链霉亲和素相互作用,在微球表面修饰糖链聚合物,包括以下步骤:
将表面修饰有链霉亲和素的微球(购买自厦门普睿迈格生物科技有限公司,微球种类为磁珠,粒径为0.2~1μm)、糖链聚合物和PBS缓冲液(pH值为7.4)混合,得到混合体系,其中,所述混合体系中表面修饰有链霉亲和素的微球的浓度为10mg/mL,糖链聚合物的浓度为1.0mg/mL;将所述混合体系在室温条件下进行改性处理30min,之后通过外加磁场分离,得到糖链聚合物修饰微珠材料,记为糖基磁珠。
实施例11
利用实施例7所得具有式I所示结构的糖链聚合物制备糖链聚合物修饰微球材料,即利用生物素-链霉亲和素相互作用,在微球表面修饰糖链聚合物,包括以下步骤:
将表面修饰有链霉亲和素的微球(购买自翌圣生物科技(上海)有限公司,微球种类为琼脂糖凝胶微球,粒径为45~150μm)、糖链聚合物和PBS缓冲液(pH值为7.4)混合,得到混合体系,其中,所述混合体系中表面修饰有链霉亲和素的微球的浓度为10mg/mL,糖链聚合物的浓度为1.0mg/mL;将所述混合体系在室温条件下进行改性处理30min,之后将所得体系装入色谱柱,用PBS缓冲液冲洗色谱柱(PBS缓冲液的pH值为7.4,流速为2mL/min,冲洗时间为20min),得到储存于色谱柱中的糖链聚合物修饰微珠材料,记为糖基琼脂微球,4℃保存备用。
实施例12
利用实施例9所得具有式II所示结构的糖链聚合物制备糖链聚合物修饰微球材料,即利用化学键合方式(具体为伯胺基与N-羟基琥珀酰亚胺酯的化学反应),在微球表面修饰糖链聚合物,包括以下步骤:
糖链聚合物(10mg)溶于碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH值为9.0,10mL)中,加入表面修饰有N-羟基琥珀酰亚胺酯的微球(10g,购买自北京奇松生物科技有限公司,微球种类为琼脂糖凝胶微球,粒径为45~150μm),避光、室温条件下震荡6h;之后用超纯水将所得体系抽滤清洗,将所得固体物料与乙醇胺(10mM)、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH值为8.0,20mL)混合,室温条件下震荡过夜;之后用超纯水将所得体系抽滤清洗,得到糖链聚合物修饰琼脂糖凝胶微球,记为糖基琼脂糖凝胶微球。
应用例1H1N1型流感病毒的糖基磁珠富集与胶体金快速检测
采用日本富士甲乙流胶体金快检试剂盒作为检测手段,HEK293T细胞培养的H1N1(A/WSN/33)流感病毒作为待检样本,厦门普睿迈格生物科技有限公司购买的链霉亲和素磁珠(PuriMag G-streptavidin,即表面修饰有链霉亲和素的磁珠)作为固定相微球材料。
实验条件:向1mL稀释病毒液中加入50μL浓度为5mg/mL的糖基磁珠分散液(所述糖基磁珠为实施例10制备的糖基磁珠,所述分散液的溶剂为样本处理液,具体为日本富士试剂盒自带,成分是:表面活性剂和牛血清蛋白,含叠氮化钠0.0095%),室温条件下混合10min,磁性分离,移除上清,加入50μL样本处理液重悬(相当于20倍浓缩),取20μL加入试剂盒样品环内,静置15min,观察结果,并与试剂盒直接检测结果进行比较,具体如表3所示。
表3不同病毒浓度下利用试剂盒直接检测与糖基磁珠富集后检测的结果
稀释病毒液浓度 | 试剂盒直接检测 | 糖基磁珠富集后检测 |
1×10<sup>5</sup>pfu/mL | + | + |
1×10<sup>4</sup>pfu/mL | - | + |
3.3×10<sup>3</sup>pfu/mL | - | + |
1.6×10<sup>3</sup>pfu/mL | - | - |
注:表3中“+”代表阳性,“-”代表阴性。
由表3可知,试剂盒对该型流感病毒的检测限为1×105pfu/mL;采用糖基磁珠进行富集浓缩前处理操作,可以将该试剂盒的检测灵敏度提高到3.3×103pfu/mL。对于1.0mL规模的样本,通过采用糖基磁珠可以快速进行富集浓缩前处理操作,进而可以提高甲乙流胶体金快检试剂盒30倍的灵敏度。
应用例2生物素/脱硫生物素竞争洗脱-磁珠吸附流感病毒的温和释放
HEK293T细胞培养的H1N1(A/WSN/33)流感病毒作为待分离样本,厦门普睿迈格生物科技有限公司购买的链霉亲和素磁珠(PuriMag G-streptavidin,即表面修饰有链霉亲和素的磁珠)作为固定相微球材料。
实验条件:将20μL浓度为5mg/mL的糖基磁珠分散液(所述糖基磁珠为实施例10制备的糖基磁珠,所述分散液的溶剂为PBS缓冲液)和病毒液(1×107pfu/mL,200μL)混合,在室温条件下吸附20min,弃去液体,糖基磁珠用PBS缓冲液洗涤2次,再加入200μL生物素洗脱液(所述生物素洗脱液中溶剂为pH值为8.5的PBS缓冲液,所述生物素洗脱液中生物素的浓度为8mmol/L),37℃下孵育5min,将糖基磁珠和生物素洗脱液磁性分离,去除糖基磁珠,向所得液体物料中加入HEK293T细胞,根据HEK293T细胞出现病变的时间判断液体物料中病毒活性和病毒量,以此反映洗脱效果。
图6为洗脱病毒的细胞侵染活性评价空斑实验图,图6中白色物质为病毒侵染后凋亡的细胞,表明洗脱后的病毒依然保持活性。图6中“Mw”为磁珠上修饰的糖链聚合物的分子量,结果显示48小时可见明显细胞感染性凋亡;且受空间位阻影响,分子量为25KD和18KD的糖链聚合物洗脱效果要好于分子量为30KD的糖链聚合物(其中分子量为18KD、25KD和30KD的糖链聚合物参照实施例8中糖链聚合物制备即可)。
应用例3流感病毒亲和色谱
采用YEASEA生物技术公司购买的生物素分子纯化预装柱(固定相为表面修饰有链霉亲和素的琼脂糖凝胶微球),规格:5mL;HEK293T细胞培养的H1N1(A/WSN/33,1×107pfu/mL)流感病毒作为待分离样本。
实验条件:将糖链聚合物的PBS溶液(500nM,15mL)内循环20min(2mL/min)对预装柱进行修饰,得到流感病毒亲和色谱柱;其中,所述糖链聚合物参照实施例7制备得到,不同之处在于所用还原末端叠氮化唾液酸寡糖具体为实施例2制备的还原末端叠氮化天然6'-型唾液酸寡糖。
将得到的流感病毒亲和色谱柱加入Waters HPLC色谱系统,对流感病毒进行分离;其中,H1N1流感病毒进样量:200μL;流动相:PBS缓冲液;流速:2.0mL/min;柱温:37℃;双波长紫外检测器(230/260nm);洗脱程序为:首先采用pH=7.4的PBS缓冲液洗脱(0~10min),除去培养基中的杂质蛋白和DNA等遗传物质;随后,改为pH=5.9的PBS缓冲液洗脱(10~30min),收集保留时间为16~22min的含流感病毒组分;其中,病毒分离纯化流程示意图如图7所示,流感病毒分离色谱图如图8所示。
将收集的含流感病毒组分进行病毒侵染活性测性,结果显示病毒回收率超过60%,说明该病毒亲和色谱柱能有效纯化流感病毒,且洗脱条件温和,纯化后的病毒依然保持良好的生物活性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和结构修饰,这些改进和结构修饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种糖链聚合物修饰微球材料,其特征在于,包括改性微球以及修饰于所述改性微球表面的糖链聚合物;
所述糖链聚合物具有式I或式II所示结构:
式I中R2和R3独立地选自碳原子个数为1~5的烷基;
式I中m=5~200,n=0~95,m1=1~20;
式II中R4为-NH2、-OH或-SH;
式II中a=5~200,b=0~50,c=1~50,m2=1~20;
当糖链聚合物为具有式I所示结构的化合物,所述改性微球为表面修饰有链霉亲和素的微球;
当糖链聚合物为具有式II所示结构的化合物,所述改性微球为表面修饰有N-羟基琥珀酰亚胺酯、环氧基团、醛基、碘乙酰基、羧基、酰氯基团与不饱和烃基中至少一种的微球。
2.根据权利要求1所述的糖链聚合物修饰微球材料,其特征在于,所述微球包括磁珠、琼脂糖凝胶微球或硅胶微球。
3.根据权利要求2所述的糖链聚合物修饰微球材料,其特征在于,所述磁珠的粒径为0.2~5μm,所述琼脂糖凝胶微球和硅胶微球的粒度独立地为30~165μm。
4.权利要求1~3任一项所述糖链聚合物修饰微球材料的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
将丙烯酰胺、氮-(4-三甲基硅基-3-丁炔)丙烯酰胺和链转移剂混合,在引发剂作用下进行RAFT聚合反应,得到硅烷保护侧链炔基的丙烯酰胺共聚物;所述链转移剂为端基生物素功能化三硫酯类链转移剂或端基脱硫生物素功能化三硫酯类链转移剂;
将所述硅烷保护侧链炔基的丙烯酰胺共聚物进行脱保护反应,得到端基生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物或端基脱硫生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物;
将所述端基生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物或端基脱硫生物素化侧链炔基的丙烯酰胺共聚物分别与还原末端叠氮化唾液酸寡糖进行第一点击化学反应,得到具有式I所示结构的糖链聚合物;将具有式I所示结构的糖链聚合物与第一改性微球混合,通过生物素-亲和素相互作用进行第一改性处理,得到糖链聚合物修饰微球材料;
或者,将侧基含炔基官能团的丙烯酰胺共聚物、还原末端叠氮化唾液酸寡糖和端基叠氮化聚丙烯醇衍生物进行第二点击化学反应,得到具有式II所示结构的糖链聚合物;将具有式II所示结构的糖链聚合物与第二改性微球混合,通过化学偶联进行第二改性处理,得到糖链聚合物修饰微球材料;
其中,所述第一改性微球为表面修饰有链霉亲和素的微球;
所述第二改性微球为表面修饰有N-羟基琥珀酰亚胺酯、环氧基团、醛基、碘乙酰基、羧基、酰氯基团与不饱和烃基中至少一种的微球;
所述端基生物素功能化三硫酯类链转移剂的结构式如式III所示:
所述端基脱硫生物素功能化三硫酯类链转移剂的结构式如式IV所示:
所述还原末端叠氮化唾液酸寡糖的结构式为Y-N3;
所述侧基含炔基官能团的丙烯酰胺共聚物的结构式如式V所示:
所述端基叠氮化聚丙烯醇衍生物的结构式如式VI所示:
5.权利要求1~3任一项所述糖链聚合物修饰微球材料或权利要求4所述制备方法制备得到的糖链聚合物修饰微球材料在富集或分离纯化病毒或病毒样颗粒中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述病毒包括流感病毒、腺病毒或腺相关病毒;当富集或分离纯化所述病毒时,富集或分离纯化的样本为临床病原微生物样本、病毒培养液样本或环境样本。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述临床病原微生物样本包括咽拭子样本、肺泡灌洗液样本或肛拭子样本,所述病毒培养液样本包括实验室病毒培养液样本、疫苗/mRNA病毒载体生产过程中的病毒培养液样本或亚单位疫苗生产过程中的病毒培养液裂解样本,所述环境样本包括水样本、土壤样本或食品样本。
8.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述病毒样颗粒为表面含有以唾液酸糖链作为特征结合位点的突刺蛋白的病毒样颗粒;当富集或分离纯化所述病毒样颗粒时,富集或分离纯化的样本为内部遗传物质改造后的流感病毒载体疫苗、腺病毒载体疫苗、腺相关病毒载体疫苗或基因治疗载体。
9.根据权利要求5~8任一项所述的应用,其特征在于,当所述糖链聚合物修饰微球材料中微球为磁珠时,所述应用过程中的分离方式为在外加磁场条件下磁性吸附后洗脱分离;当所述糖链聚合物修饰微球材料中微球为琼脂糖凝胶微球或硅胶微球时,所述应用过程中的分离方式为色谱柱洗脱分离。
10.权利要求1~3任一项所述糖链聚合物修饰微球材料或权利要求4所述制备方法制备得到的糖链聚合物修饰微球材料作为病毒亲和色谱柱填料的应用,其中,所述糖链聚合物修饰微球材料中微球为琼脂糖凝胶微球或硅胶微球。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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