CN103551562A - 唾液酸寡糖-金纳米粒子及其制备方法与应用 - Google Patents

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CN103551562A CN201310495249.XA CN201310495249A CN103551562A CN 103551562 A CN103551562 A CN 103551562A CN 201310495249 A CN201310495249 A CN 201310495249A CN 103551562 A CN103551562 A CN 103551562A
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Abstract

本发明公开了一种检测流感病毒宿主特异性的唾液酸寡糖-金纳米粒子及其制备方法与应用。本发明提供的所述唾液酸寡糖-金纳米粒子是表面通过S-Au键连接了唾液酸α2,3或α2,6寡糖-O(CH2CH2O)m(CO)n(CH2)k(CH)pSR和HO(CH2CH2O)m(CO)n(CH2)k(CH)pSR的金纳米粒子。使用所述唾液酸寡糖-金纳米粒子检测流感病毒毒株或其HA蛋白，通过肉眼观察即可快速得到待测流感病毒的受体特异性，检测流感病毒HA蛋白的灵敏度可达2.5nM。利用本发明方法可方便、快捷地得到流感病毒与宿主细胞之间的相互作用信息，对流感病毒的防控具有重要意义。

Description

唾液酸寡糖-金纳米粒子及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种唾液酸寡糖-金纳米粒子及其制备方法与在检测流感病毒宿主特异性中的应用。
背景技术
流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的人畜共患传染病，它的宿主累及人、猪、鸟、马和海豚等多种动物。一般来说，流感病毒在不同的宿主间存在着一定的屏障，禽类流感通常经猪（中间宿主）才能感染人。研究证实，流感病毒表面糖蛋白血凝素（hemagglutinin，HA）特异识别宿主细胞表面的糖链受体是流感病毒感染宿主、进而复制并继续传播的生物学基础。流感病毒对唾液酸的识别和结合有偏好型，禽流感病毒倾向于结合Siaα2,3Gal受体，而人流感病毒则主要结合Siaα2,6Gal受体。禽类的肠道主要含Siaα2,3Gal受体，人类的上呼吸道上皮细胞主要有Siaα2,6Gal受体。人流感病毒与人的气管上皮细胞结合紧密，而禽流感病毒与人气管上皮细胞结合很弱。猪既有Siaα2,3Gal受体也有Siaα2,6Gal受体，猪对人流感病毒和禽流感病毒都易感。人上呼吸道中Siaα2,3Gal受体较少，这很可能是造成禽流感病毒不易感染人的主要原因，禽流感病毒感染人需适应人的Siaα2,6Gal受体，克服跨种间屏障。但是，2004年爆发的禽流感及其人禽死亡的情况分析显示，禽H5N1毒株能突破宿主屏障直接感染人造成人员死亡，这给人类社会造成很大的考验。因此快速准确地掌握流感病毒与宿主细胞的相互作用信息（即流感病毒的宿主特异性）有助于人们进一步加强对流感病毒的防控，特别是在新型流感病毒出现时，对其能否在不同宿主之间传播做出及时、有效的预测。
传统的流感病毒宿主特异性诊断方法是血凝和血凝抑制实验，前者通过流感病毒和红细胞的凝集检测其受体特异性；后者通过抑制流感病毒对红细胞的凝集检测体系中病毒或HA的受体特异性。两者都受限于红细胞表面的糖链结构。红细胞吸附检测技术突破红细胞表面已有糖链结构的限制，先将细胞表面受体清除,再用特异的唾液酸转移酶分别将唾液酸寡糖链转移到红细胞表面,但该方法操作较为繁琐。固相酶联检测技术模仿传统ELISA形式，将流感病毒固定，待检测物质通过与表面带有唾液酸寡糖的标记胎球蛋白竞争来检测其受体特异性。此方法可以检测多种病毒，但是通量较低。近年来出现的糖链芯片技术由于其特异、敏感、高通量受到青睐，但是其成本极为昂贵，设备投入过高，无法在临床推广应用，而且世界上仅美国的一家研究机构有该检测平台。因此，如何快速、便捷地检测出流感病毒对流感的防控具有重要意义。
纳米科技是指在纳米尺度（1nm到100nm之间）上研究物质的特性和相互作用，以及利用这些特性的多学科交叉的科学和技术。当物质小至1-100nm（10-9-10-7m）时，其量子效应、物质的局域性及巨大的表面及界面效应使物质的很多性能发生质变，呈现出许多奇异的现象。金纳米颗粒由氯金酸通过化学还原制成，具有良好的光学性质，直径为13nm的金颗粒在520nm处有明显的吸收，人们可以通过肉眼观察到明显的红色，这一特性使其成为比色检测中优良的报告系统。金纳米颗粒在不同的聚集状态下呈现不同的颜色，肉眼可见，也可用分光光度计测定，其敏感性和特异性可与其它检测方法（如免疫荧光检测）匹敌。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测流感病毒宿主特异性的唾液酸寡糖-金纳米粒子，以及它的制备方法及应用。
本发明所提供的用于检测流感病毒宿主特异性的唾液酸寡糖-金纳米粒子，是表面通过S-Au共价键连接了如下化合物的金纳米粒子：
式Ⅹ-1所示化合物或式Ⅹ-2所示化合物，和式Ⅺ所示化合物；
Figure BDA0000398935120000021
式Ⅺ：HO(CH2CH2O)m(CO)n(CH2)k(CH)pSR；
所述式Ⅹ-1、式Ⅹ-2和式Ⅺ中，所述x为1-3的整数，所述m为0-6的整数，所述n为0-1的整数，所述k为0-11的整数，所述p为0或2，所述R为S或H；所述Ac为乙酰基，所述R1为羟基或乙酰胺基，所述R2为氢或L-岩藻糖，所述R3为氢或硫酸酯（硫酸与糖环上的羟基成酯，SO3H），所述R4为羟基或乙酰胺基。
优选的，所述m为3-6的整数；所述k为5-11的整数。更优选的，所述m为3或6，所述n为1或0，所述k为5或11，所述p为2或0。
一种制备上述唾液酸寡糖-金纳米粒子的方法，包括将式Ⅹ-1所示化合物或式Ⅹ-2所示化合物、和式Ⅺ所示化合物与含有金纳米粒子的溶液混合，获得所述用于检测流感病毒宿主特异性的唾液酸寡糖-金纳米粒子；所述式Ⅹ-1所示化合物或式Ⅹ-2所示化合物与所述金纳米粒子的摩尔比为（10000-80000）:1；所述式Ⅹ-1所示化合物或式Ⅹ-2所示化合物与所述式Ⅺ所示化合物的摩尔比为（2-10）:1。
含有金纳米粒子的溶液的溶剂为水，金纳米粒子的浓度为2－7.5nM。
上述化合物及其制备方法中，所述式Ⅹ-1所示化合物或式Ⅹ-2所示化合物与所述式Ⅺ所示化合物的摩尔比为（2-10）:1；具体可为：2:1、5:1或10:1。
上述化合物及其制备方法中，金纳米粒子的平均粒径为10—30nm，10—20nm，10—15nm，10—13nm或13nm；
上述化合物及其制备方法中，式Ⅹ-1所示化合物或式Ⅹ-2所示化合物与金纳米粒子的摩尔比为10000-80000:1，或20000-70000:1，或30000-60000:1，或30000-50000:1或40000:1。
上述化合物及其制备方法中，所述金纳米粒子的平均粒径为10—30nm，或13nm；
本发明还提供了一种检测流感病毒的宿主特异性的试剂或试剂盒，该试剂或试剂盒包括独立包装的A试剂和/或B试剂，所述A试剂为上述表面通过S-Au共价键连接了式Ⅹ-1所示和式Ⅺ所示化合物的金纳米粒子；所述B试剂为上述表面通过S-Au共价键连接了式Ⅹ-2所示和式Ⅺ所示化合物的金纳米粒子；所述流感病毒的宿主特异性为所述流感病毒特异识别宿主细胞表面糖链受体类型为唾液酸α2,3寡糖和唾液酸α2,6寡糖中的至少一种。
本发明还提供了一种检测流感病毒的宿主特异性的方法，包括如下步骤：将独立包装的A试剂和/或B试剂与待测流感病毒毒株或其HA蛋白在PBS缓冲液中孵育，获得反应液，检测所述反应液。所述反应的时间大于或等于5min。具体的时间可以是5-40min。
当所述反应液中所述待测流感病毒或其HA蛋白与A试剂相结合时，所述待测流感病毒候选为可侵染分泌唾液酸α2,3寡糖寄主细胞的流感病毒；
当所述反应液中所述待测流感病毒或其HA蛋白与B试剂相结合时，所述待测流感病毒候选为可侵染分泌唾液酸α2,6寡糖寄主细胞的流感病毒；
所述A试剂为上述表面通过S-Au共价键连接了式Ⅹ-1所示和式Ⅺ所示化合物的金纳米粒子；所述B试剂为上述表面通过S-Au共价键连接了式Ⅹ-2所示和式Ⅺ所示化合物的金纳米粒子。
本发明中用到的PBS缓冲液的溶剂为水，溶质为NaH2PO4、Na2HPO4、KCl和NaCl，所述溶质NaH2PO4、Na2HPO4、KCl和NaCl在所述PBS缓冲液中的浓度分别为0.24g/L、1.42g/L、0.2g/L及8.0g/L；所述PBS缓冲液的pH值为7.4；
上述被检测的流感病毒为A型流感病毒，具体可为H1（如H1N1）、H3（如H3N2）、H5（如H5N1）和H7（如H7N9）等亚型流感病毒。
上述的结合为通过可见光下肉眼观察所述反应液的颜色来判断；若所述反应液的颜色与空白对照的颜色相比变浅或变紫，则所述待测流感病毒毒株候选为与所述唾液酸寡糖-金纳米粒子相结合的毒株；所述空白对照为不含流感病毒毒株或其HA蛋白的所述PBS缓冲液。
所述反应液中的所述唾液酸寡糖-金纳米粒子与待测流感病毒毒株的比例为2pmol：105个；
所述唾液酸寡糖-金纳米粒子与待测流感病毒毒株HA蛋白的比例为2pmol：16.7ug。
本发明将与流感病毒HA蛋白特异性结合的α2,3唾液酸三糖和α2,6唾液酸三糖以一定的连接臂接到金纳米颗粒上获得唾液酸三糖-金纳米粒子，检测H1、H3、H5和H7等亚型的A型流感病毒的HA蛋白和毒株，通过肉眼观察即可快速得到待测流感病毒的受体特异性。通过UV-Vis光谱变化、DLS和TEM验证，检测流感病毒HA蛋白的灵敏度可达2.5nM，具有非常好的实用性。利用本发明的检测方法可方便、快捷地得到流感病毒与宿主细胞之间的相互作用信息，对流感病毒的防控具有重要意义。
附图说明
图1为本发明16种唾液酸寡糖-金纳米粒子的结构示意图。其中，第一行左图为α2,3唾液酸三糖-长连接链和长连接链固定于金纳米粒子表面形成的唾液酸寡糖-金纳米粒子；第一行右图为α2,6唾液酸三糖-长连接链和长连接链固定于金纳米粒子表面形成的唾液酸寡糖-金纳米粒子；第二行左图为α2,3唾液酸三糖-短连接链和短连接链固定于金纳米粒子表面形成的唾液酸寡糖-金纳米粒子；第二行右图为α2,6唾液酸三糖-短连接链和短连接链固定于金纳米粒子表面形成的唾液酸寡糖-金纳米粒子，每一个图根据α2,3或α2,6唾液酸三糖-长/短连接链与长/短连接链的比例不同又分为4种，共16种。
图2为本发明唾液酸寡糖-金纳米粒子（3’SLs-AuNP5:1或6’SLs-AuNP5:1）定性检测5种流感病毒HA蛋白的肉眼观察结果。
图3为本发明唾液酸寡糖-金纳米粒子（3’SLs-AuNP5:1）定性检测5种流感病毒HA蛋白的UV-Vis光谱变化。
图4为本发明唾液酸寡糖-金纳米粒子（6’SLs-AuNP5:1）定性检测5种流感病毒HA蛋白的UV-Vis光谱变化。
图5为本发明唾液酸寡糖-金纳米粒子（3’SLs-AuNP5:1）定性检测5种流感病毒HA蛋白的DLS变化。
图6为本发明唾液酸寡糖-金纳米粒子（6’SLs-AuNP5:1）定性检测5种流感病毒HA蛋白的DLS变化。
图7为本发明唾液酸寡糖-金纳米粒子（3’SLs-AuNP5:1或6’SLs-AuNP5:1）定性检测5种流感病毒HA蛋白的TEM图像部分结果。图中标尺代表200nm。
图8为本发明唾液酸寡糖-金纳米粒子（6’SLs/6’SLNs/Su-6’SLNs-AuNP5:1）定量评估9种流感病毒HA蛋白受体特异性。
图9为本发明唾液酸寡糖-金纳米粒子（3’SLs/3’SLNs/Su-3’SLNs/SLeX-AuNP5:1）定量评估9种流感病毒HA蛋白受体特异性。
图10为本发明唾液酸寡糖-金纳米粒子（6’SLs/6’SLNs/Su-6’SLNs/3’SLs/3’SLNs/Su-3’SLNs/SLeX-AuNP5:1）定量评估3种流感病毒毒株受体特异性。
图11为肉眼观察α2,3唾液酸三糖-长/短连接链与长/短连接链的摩尔比不同对检测结果的影响。
图12为唾液酸寡糖-金纳米粒子（3’SLs-AuNP5:1）检测不同浓度的流感病毒qinH5的HA蛋白的肉眼观察结果。
图13为唾液酸寡糖-金纳米粒子（3’SLs-AuNP5:1）检测不同浓度的流感病毒qinH5的HA蛋白的UV-Vis光谱变化结果。
图14为唾液酸寡糖-金纳米粒子（6’SLs-AuNP5:1）检测不同浓度的流感病毒68H3的HA蛋白的肉眼观察结果。
图15为唾液酸寡糖-金纳米粒子（6’SLs-AuNP5:1）检测不同浓度的流感病毒68H3的HA蛋白的UV-Vis光谱变化。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的Tris-HCl缓冲液（100mM，pH8.0）的溶剂为水，溶质为Tris，所述溶质Tris在所述Tris-HCl缓冲液中的浓度为12.1g/L；所述Tris-HCl缓冲液的pH值为8.0。
所用的PBS缓冲液（10mM，pH7.4）的溶剂为水，溶质为NaH2PO4、Na2HPO4、KCl和NaCl，所述溶质NaH2PO4、Na2HPO4、KCl和NaCl在所述PBS缓冲液中的浓度分别为0.24g/L、1.42g/L、0.2g/L和8.0g/L；所述PBS缓冲液的pH值为7.4。
实施例1、唾液酸三糖-短连接链的制备
Figure BDA0000398935120000051
1、短连接链的制备
取1.68克式Ⅲ所示化合物（4.96mmol，其合成方法见文献：K.Kim,H.Yang,S.Jon,E.Kim,J.Kwak,J.Am.Chem.Soc.2004,126,15368–15369.）溶于20毫升二氯甲烷（DCM）中，室温下加入1毫升三乙胺（Et3N，7.5mmol）和780微升甲磺酰氯（MsCl，10mmol）；将反应体系在室温下搅拌1小时。反应进程由TLC监测，原料消失后，将反应液通过硅藻土过滤，浓缩得橙黄色浆状物。将浓缩液置于20毫升乙腈（CH3CN）中，加入3.25克叠氮化钠（NaN3，50mmol），回流搅拌过夜。TLC检测反应完毕，将溶液在减压条件下浓缩蒸除溶剂后，用硅胶色谱柱分离纯化混合物（淋洗液为石油醚:乙酸乙酯=3:1）得到浅黄色糖浆状化合物（即式Ⅳ所示化合物，1.46克，产率81%）。
Figure BDA0000398935120000061
本实施例制备的式Ⅳ所示化合物的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.23(2H,t,J4.7Hz,COOCH2),3.71–3.66(8H,m,CH2OCH2),3.59–3.52(1H,m,S–SCH),3.38(2H,t,J5.0Hz,CH2N3),3.16–3.12(2H,m,S–SCH2),2.46–2.44(1H,m),2.35(2H,t,J7.4Hz,CH2COO),1.94–1.85(1H,m,),1.70–1.61(4H,m),1.47–1.45(2H,m);13C NMR(150MHz,CDCl3):δ173.5(CO),71.5,70.2,69.3,63.5,56.4,50.7,42.8,42.3,38.5,34.6,34.0,28.8,24.7;HRESIMS:m/z386.11726[M+Na]+(calcd for C14H25N3O4S2:386.11787[M+Na]+).
由上述表征数据可知，本实施例得到的化合物的结构正确，为目标化合物。
2、乳糖短连接链的制备
取76毫克式I-1所示的乳糖丙炔苷（0.2mmol，其合成方法见文献：F.Lutz,U.B.Tietze,Chem.Eur.J.1998,4,1179–1183.）与108.9毫克短连接链（如式Ⅳ所示，0.3mmol）溶于10毫升N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和甲醇（MeOH）（体积比为1:1）的混合溶液中，然后加入19毫克碘化亚铜（CuI，0.1mmol），氮气保护下过夜反应。TLC监测原料消失，将反应液过滤，冷冻干燥浓缩后以G-15凝胶柱纯化，最终得白色固体即为式II-1-1所示化合物（118.9毫克，产率80%）。
Figure BDA0000398935120000062
本实施例制备的式II-1-1所示化合物的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,D2O):δ8.13(1H,s,C=CHN3),5.01(1H,d,J12.6Hz,H1I),4.88(1H,d,J12.6Hz,H1II),4.65(2H,t,J5.0Hz),4.59(1H,d,J7.5Hz),4.45(1H,d,J7.8Hz),4.23(2H,t,J4.4Hz),3.98(3H,t,J5.1Hz),3.93(2H,d,J3.1Hz),3.85–3.54(14H,m),3.35(2H,t,J8.4Hz),3.26–3.17(2H,m),2.5–2.47(1H,m),2.41(2H,t,J7.2Hz),2.0–1.94(1H,m),1.79–1.57(4H,m),1.47–1.39(2H,m);13C NMR(150MHz,D2O):δ176.3(CO),143.6(C=CHN3),125.8(C=CHN3),103.1(C1II),101.5(C1I),78.5,75.5,74.9,74.5,72.8,72.7,71.1,69.8,69.7,68.9,68.6,63.9,62.1,61.1,60.2,56.6,50.2,40.4,38.3,33.9,33.7,28.1,24.2;HRESIMS:m/z766.24890[M+Na]+(calcdfor C29H49N3O15S2:766.24973[M+Na]+).
由上述表征数据可知，本实施例得到的化合物的结构正确，为目标化合物。
3、唾液酸三糖-短连接链的制备
取14.87毫克乳糖短连接链（式II-1-1，终浓度为10mM），和14.72毫克CMP-N-乙酰神经氨酸（CMP-Neu5Ac，终浓度为15mM）溶于2毫升的Tris-HCl（pH8.0）缓冲液中后，将反应体系温度升至37℃，然后加入100微升多杀巴斯德杆菌α2,3-唾液酸转移酶（Pasteurella multocidaα2,3-sialyltransferase，简称Pm2,3-ST，0.2U，购自天津尚德药缘科技有限公司），2-3小时后，薄层色谱（TLC）检测原料已完全消失，将反应液通过超滤膜除去酶蛋白，冷冻干燥浓缩后经凝胶柱G-15纯化后得白色固体即唾液酸三糖（式X-1-1所示，17.9毫克，产率86.9%）
本实施例制备的式Ⅹ-1-1所示化合物的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,D2O):δ8.15(1H,s,C=CHN3),5.02(1H,d,J12.6Hz,H1I),4.90(1H,d,J12.5Hz,H1II),4.67(2H,t,J4.8Hz),4.60(1H,d,J8.0Hz),4.55(1H,d,J7.7Hz),4.25(2H,t,J3.6Hz),4.16(1H,d,J9.7Hz),4.02–3.99(5H,m),3.91–3.85(6H,m),3.78–3.58(14H,m),3.36(1H,t,J8.1Hz),3.29–3.18(2H,m),2.77(1H,dd,J4.4,12.4Hz,H3eq-Sia),2.53–2.48(1H,m),2.42(2H,t,J7.1Hz),2.09–1.98(5H,m),1.87(1H,t,J7.1Hz,H3ax-Sia),1.83–1.65(5H,m),1.48–1.42(2H,m);13C NMR(150MHz,D2O):δ176.9,175.2,174.1,143.7(C=CHN3),125.9(C=CHN3),102.9(C1II),101.5(C1I),100.0(C1III),78.4,75.7,75.4,75.1,74.6,73.1,72.9,72.0,69.8,69.6,69.0,68.7,68.3,67.7,64.0,62.8,62.2,61.6,61.2,60.3,59.6,56.7,51.9,50.3,40.5,39.9,38.3,33.9,33.8,28.1,24.2,22.3;HRESIMS:m/z1057.34256[M+Na]+(calcd for C40H66N4O23S2:1057.34515[M+Na]+).
由上述表征数据可知，本实施例得到的化合物的结构正确，为目标化合物。
实施例2、唾液酸三糖-短连接链的制备
Figure BDA0000398935120000071
唾液酸三糖-短连接链的制备
取14.87毫克实施例1中乳糖短连接链（式II-1-1，终浓度为10mM），和14.72毫克CMP-N-乙酰神经氨酸（CMP-Neu5Ac，终浓度为15mM）溶于2毫升的Tris-HCl（pH8.0）缓冲液中后，将反应体系温度升至37℃，然后加入100微升美人鱼发光杆菌α2,6-唾液酸转移酶（Photobacterium damselaα2,6-sialyltransferase，简称Pd2,6-ST，0.2U，购自天津尚德药缘科技有限公司），2-3小时后，薄层色谱（TLC）检测原料已完全消失，将反应液通过超滤膜除去酶蛋白，冷冻干燥浓缩后经凝胶柱G-15纯化，最终得白色固体即为式Ⅹ-2-1所示唾液酸三糖-短连接链15.5毫克，产率74.8%。
本实施例制备的式Ⅹ-2-1所示化合物的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,D2O):δ8.16(1H,s,C=CHN3),5.03(1H,d,J12.5Hz,H1I),4.91(1H,d,J12.5Hz,H1II),4.67(2H,t,J4.9Hz),4.62(1H,d,J8.0Hz),4.45(1H,d,J7.7Hz),4.25(2H,t,J4.3Hz),4.01–3.95(6H,m),3.93–3.82(7H,m),3.76–3.54(12H,m),3.39(1H,t,J8.3Hz),3.29–3.18(2H,m),2.73(1H,dd,J4.5,12.4Hz,H3eq-Sia),2.55–2.49(1H,m),2.43(2H,t,J7.2Hz),2.14–1.98(5H,m),1.79–1.61(5H,m),1.48–1.41(2H,m);13C NMR(150MHz,D2O):δ176.8,175.1,173.7,143.7(C=CHN3),125.9(C=CHN3),103.4(C1II),101.4(C1I),100.5(C1III),79.8,74.9,74.8,73.9,72.8,72.7,72.5,72.0,71.0,69.9,69.7,68.9,68.7,68.7,68.5,64.0,63.7,62.8,62.1,60.4,59.5,56.7,52.0,50.3,40.5,40.3,38.2,33.8,33.8,28.0,24.2,22.2;HRESIMS:m/z1057.33547[M+Na]+(calcd for C40H66N4O23S2:1057.34515[M+Na]+).
由上述表征数据可知，本实施例得到的化合物的结构正确，为目标化合物。
实施例3、唾液酸三糖-短连接链的制备
Figure BDA0000398935120000081
1、乳糖胺短连接链的合成
取60毫克式I-2所示的乳糖胺丙炔苷（0.14mmol，其合成方法见文献：R.Daly,G.Vaz,A.M.Davies,M.O.Senge,E.M.Scanlan,Chem.Eur.J.2012,18,14671–14679.）与77.63毫克短连接链（如实施例1式Ⅳ所示，0.214mmol）溶于7毫升N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和甲醇（MeOH）（体积比为1:1）的混合溶液中，然后加入13.3毫克碘化亚铜（CuI，0.07mmol），氮气保护下过夜反应。TLC监测原料消失，将反应液过滤，冷冻干燥浓缩后以G-15凝胶柱纯化，最终得白色固体即为式II-1-2所示化合物（65.88毫克，产率60%）。具体反应式如下：
Figure BDA0000398935120000091
本实施例制备的式II-1-2所示化合物的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,D2O):δ8.05(1H,s,C=CHN3),4.91(1H,d,J12.6Hz,H1I),4.89–4.79(1H,overlapped by solvent peak,H1II),4.64–4.59(3H,m),4.44(1H,d,J8.0Hz),4.21–4.19(2H,m),3.98–3.94(3H,m),3.82(1H,dd,J3.6,12.2Hz),3.75–3.58(17H,m),3.51(1H,t,J9.2Hz),3.24–3.12(2H,m),2.49–2.41(1H,m),2.38(2H,t,J7.2Hz),1.99–1.86(4H,m),1.73–1.66(1H,m),1.64–1.53(3H,m),1.43–1.35(2H,m);13C NMR(150MHz,D2O):δ174.3,174.0,143.7(C=CHN3),125.7(C=CHN3),103.0(C1II),100.2(C1I),78.6,75.5,75.0,72.7,72.5,71.1,70.0,69.7,69.0,68.9,68.7,63.9,62.1,61.1,60.2,56.6,55.1,50.2,40.4,38.3,33.9,33.8,28.1,24.2,22.2;HRESIMS:m/z785.29652[M+H]+(calcd for C31H53N4O15S2:785.29433[M+H]+).
由上述表征数据可知，本实施例得到的化合物的结构正确，为目标化合物。
2、唾液酸三糖-短连接链的制备
取18毫克乳糖胺短连接链（式II-1-2，终浓度为10mM，和16.92毫克CMP-N-乙酰神经氨酸（CMP-Neu5Ac，终浓度为15mM）溶于2.3毫升的Tris-HCl（pH8.0）缓冲液中后，将反应体系温度升至37℃，然后加入115微升Pm2,3-ST（0.23U），2-3小时后，薄层色谱（TLC）检测原料已完全消失，将反应液通过超滤膜除去酶蛋白，冷冻干燥浓缩后经凝胶柱G-15纯化最终得白色固体即为式Ⅹ-1-2所示化合物17毫克，产率68.9%。
本实施例制备的式Ⅹ-1-2所示化合物的结构表征数据如下：
1H NMR(500MHz,D2O):δ8.06(1H,s,C=CHN3),4.92(1H,d,J12.8Hz,H1I),4.91-4.64(1H,overlapped by solvent peak,H1II),4.63(2H,t,J4.8Hz),4.59(1H,d,J8.1Hz),4.54(1H,d,J7.9Hz),4.21(2H,t,J4.2Hz),4.10(1H,dd,J2.8,9.9Hz),4.00–3.48(21H,m),3.25–3.14(2H,m),2.74(1H,dd,J4.4,12.4Hz,H3eq-Sia),2.50–2.43(1H,m),2.39(2H,t,J7.2Hz),2.02(3H,s,Ac-Sia),2.00–1.94(1H,m),1.91(3H,s,Ac-I),1.79(1H,t,J12.1Hz,H3ax-Sia),1.74–1.69(1H,m),1.67–1.57(3H,m),1.43–1.37(2H,m);13C NMR(125MHz,D2O):δ176.7,175.1,174.3,173.9,143.6(C=CHN3),125.7(C=CHN3),102.6(C1II),100.2(C1I),99.9(C1III),78.4,75.5,75.2,74.9,72.9,72.3,71.8,69.7,69.6,69.4,68.8,68.5,68.4,68.1,67.5,63.8,62.6,62.0,61.0,60.1,59.4,56.6,55.0,51.7,50.1,42.3,40.3,38.1,33.7,33.6,27.9,24.1,22.1;HRESIMS:m/z1076.39183[M+H]+(calcd for C42H70N5O23S2:1076.38975[M+H]+).
由上述表征数据可知，本实施例得到的化合物的结构正确，为目标化合物。
实施例4、唾液酸三糖-短连接链的制备
取18毫克实施例3乳糖胺短连接链（式II-1-2，终浓度为10mM），和16.92毫克CMP-N-乙酰神经氨酸（CMP-Neu5Ac，终浓度为15mM）溶于2.3毫升的Tris-HCl（pH8.0）缓冲液中后，将反应体系温度升至37℃，然后加入115微升Pd2,6-ST（0.23U），2-3小时后，薄层色谱（TLC）检测原料已完全消失，将反应液通过超滤膜除去酶蛋白，冷冻干燥浓缩后经凝胶柱G-15纯化最终得白色固体即为式Ⅹ-2-2所示化合物15.9毫克，产率64.4%。
本实施例制备的式Ⅹ-2-2所示化合物的结构表征数据如下：
1H NMR(500MHz,D2O):δ8.06(1H,s,C=CHN3),4.93(1H,d,J12.9Hz,H1I),4.80(1H,d,J11.0Hz,H1II),4.64–4.63(3H,m),4.43(1H,d,J7.9Hz),4.20(1H,d,J4.4Hz),4.00–3.49(29H,m),3.25–3.14(2H,m),2.64(1H,dd,J4.4,12.3Hz,H3eq-Sia),2.50–2.44(1H,m),2.39(2H,t,J7.1Hz),2.05–1.80(7H,m),1.76–1.55(5H,m),1.43–1.37(2H,m);13C NMR(150MHz,D2O):δ176.6,174.9,174.3,173.5,143.6(C=CHN3),125.6(C=CHN3),103.5(C1II),100.1(C1I),99.9(C1III),80.6,74.5,73.7,72.5,72.4,71.7,70.7,69.7,69.5,68.7,68.5,68.4,68.2,63.8,63.3,62.6,61.9,61.2,60.3,59.4,56.5,54.8,51.9,50.0,40.3,40.1,38.0,33.6,33.6,27.8,24.0,22.2,22.0;HRESIMS:m/z1076.38864[M+H]+(calcd for C42H70N5O23S2:1076.38975[M+H]+).
由上述表征数据可知，本实施例得到的化合物的结构正确，为目标化合物。
实施例5、唾液酸三糖-短连接链的制备
Figure BDA0000398935120000102
1、乳糖胺硫酸酯短连接链的合成
取50毫克式I-3所示的乳糖胺硫酸酯丙炔苷（0.1mmol）与54.37毫克实施例1中的短连接链（如式Ⅳ所示，0.15mmol）溶于5毫升N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和甲醇（MeOH）（体积比为1:1）的混合溶液中，然后加入9.5毫克碘化亚铜（CuI，0.05mmol），氮气保护下过夜反应。TLC监测原料消失，将反应液过滤，冷冻干燥浓缩后以G-15凝胶柱纯化，最终得白色固体即为式II-1-3所示化合物（60.47毫克，产率70%）。
Figure BDA0000398935120000111
本实施例制备的式II-1-3所示化合物的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,D2O):δ8.10(1H,s,C=CHN3),4.92(1H,d,J12.9Hz,H1I),4.84(1H,d,J12.9Hz,H1II),4.65(2H,t,J4.3Hz),4.53(1H,d,J7.8Hz),4.41(1H,d,J9.9Hz),4.31(1H,dd,J4.1,11.0Hz),4.24–4.22(2H,m),3.98(3H,t,J5.0Hz),3.93(1H,d,J3.8Hz),3.85–3.67(12H,m),3.53(1H,t,J8.9Hz),3.27–3.15(2H,m),2.52–2.45(1H,m),2.41(2H,t,J7.2Hz),2.10–1.97(1H,m),1.95(3H,s),1.78–1.68(1H,m),1.66–1.56(3H,m),1.46–1.38(2H,m);13C NMR(150MHz,D2O):δ176.8,174.6,143.9(C=CHN3),126.0(C=CHN3),102.8(C1II),100.6(C1I),77.8,75.6,72.8,72.5,71.3,70.0,69.8,68.9,68.7,66.6,64.1,62.5,61.3,59.6,56.8,55.3,50.3,40.5,38.4,34.0,33.9,28.1,24.3,22.4;HRESIMS:m/z909.21743[M+2Na]+(calcd for C31H51N4Na2O18S3:909.21599[M+2Na]+).
由上述表征数据可知，本实施例得到的化合物的结构正确，为目标化合物。
其中，式I-3所示的乳糖胺硫酸酯丙炔苷的合成过程如下：
Figure BDA0000398935120000112
取708毫克化合物13（1.0mmol，其合成方法见文献：R.Daly,G.Vaz,A.M.Davies,M.O.Senge,E.M.Scanlan,Chem.Eur.J.2012,18,14671–14679.）溶于10毫升吡啶/乙酸酐（Py/Ac2O，1:1）溶液中。反应液在室温下搅拌过夜然后浓缩，经硅胶柱分离（石油醚/乙酸乙酯1：1）得到化合物非晶固体14（730毫克，产率98%）。
本实施例制备的化合物14的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.62(1H,d,J2,N9.6Hz,NH),5.34(1H,d,J2.8Hz,H4II),5.08(1H,d,J3,48.0Hz,J2,310.4Hz,H3I),5.03(1H,t,J8.8Hz,H2II),4.95(1H,dd,J3,42.8Hz,J2,310.4Hz,H3II),4.63(1H,d,J1,28.0Hz,H1II),4.61(1H,d,J1,27.6Hz,H1I),4.32(2H,d,J2.4Hz,CH2C≡CH),4.00–4.12(3H,m),3.88–3.95(2H,m),3.80–3.88(2H,m),3.34–3.36(1H,m),2.43(1H,t,J2.4Hz,C≡CH),1.95–2.13(18H,m,6×Ac),0.91,0.09,0.08(15H,3s,5×CH3of TBS);13CNMR(125MHz,CDCl3):δ171.1,170.4,170.3,170.2,170.1,169.2,100.4,98.4,78.7,75.7,75.2,73.9,72.6,71.1,70.8,69.3,67.0,61.2,61.1,55.2,53.0,25.9,23.4,20.9,20.8,20.7,20.6,18.3,-5.0,-5.2;MALDI-TOF MS:m/z768.4[M+Na]+(calcd for C33H51NO16Si:745.3[M]+).
Figure BDA0000398935120000121
将746毫克化合物14（1.0mmol）溶于10毫升二氯甲烷（DCM）中，冷却至0℃再加入0.38毫升三氟化硼乙醚（BF3·Et2O，3.0mmol）。反应液搅拌1小时后加入碳酸氢钠（NaHCO3）溶液，以二氯甲烷（DCM）萃取三次，收集有机相并浓缩。将浓缩液溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF），加入954mg三氧化硫－吡啶络合物（SO3·Pycomplex，6.0mmol）。此反应液在室温下搅拌8小时，加入1毫升三乙胺（Et3N）中和后浓缩。混合物经硅胶柱分离（EtOAc）后得到非晶固体15（512毫克，产率72%).
本实施例制备的化合物15的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,MeOD):δ5.36(1H,d,J3.2Hz,H4II),5.09–5.13(2H,m,H2II,H3II),4.97–5.02(1H,dd,J3,48.0Hz,J2,310.4Hz,H3I),4.88(1H,d,J1,27.6Hz,H1I),4.73(1H,d,J1,28.4Hz,H1II),4.34(2H,d,J2.4Hz,CH2C≡CH),4.25–4.30(2H,m),4.09–4.17(3H,m),3.82–3.88(2H,m),3.62–3.65(1H,m),2.86(1H,t,J2.4Hz,C≡CH),1.91–2.12(18H,m,6×Ac);13C NMR(125MHz,MeOD):δ172.1,170.8,170.7,170.3,170.0,100.1,98.6,78.4,75.1,73.4,73.0,71.3,70.4,69.3,67.5,65.2,61.0,55.4,53.7,21.4,19.8,19.5,19.3,19.1;MALDI-TOF MS:m/z734.4[M+Na]+(calcd for C27H37NO19S:711.2[M]+).
Figure BDA0000398935120000122
将712毫克化合物15（1.0mmol）溶于10毫升甲醇/二氯甲烷（MeOH/DCM，1:1）溶液中，加入甲醇钠/甲醇（NaOMe/MeOH，1M）调其pH为9.反应液在室温下搅拌3小时加入离子交换树脂（Dowex-50(H+)）中和。经过滤后滤液浓缩。混合物经凝胶柱（Bio-GelP2）分离得到非晶固体3（705毫克，产率99%)。
本实施例制备的化合物3（式I-3）的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,MeOD):δ4.61(1H,d,J8.0Hz,H1I),4.34–4.39(3H,m,H1II,CH2C≡CH),3.90(1H,dd,J2.4Hz,12.0Hz),3.82–3.87(2H,m),3.59–3.78(7H,m),3.50–3.54(2H,m),3.40－3.42(1H,m),3.38–3.41(1H,m),2.87(1H,t,J2.4Hz,C≡CH),2.00(3H,s,Ac);13C NMR(125MHz,MeOD):δ172.5,103.8,99.1,79.6,78.6,75.8,75.3,75.0,73.5,72.9,71.3,69.1,61.2,60.6,55.3,55.1,21.6;ESIMS:m/z524.1[M+Na]+,540.1[M+K]+(calcd for C17H27NO14S:501.1[M]+).
由上述表征数据可知，本实施例得到的化合物的结构正确，为目标化合物。
2、唾液酸三糖短连接链的合成
取23毫克乳糖胺硫酸酯短连接链（式II-1-3，终浓度为10mM），和19.87毫克CMP-N-乙酰神经氨酸（CMP-Neu5Ac，终浓度为15mM）溶于2.7毫升的Tris-HCl（pH8.0）缓冲液中后，将反应体系温度升至37℃，然后加入135微升Pm2,3-ST（0.27U），2-3小时后，薄层色谱（TLC）检测原料已完全消失，将反应液通过超滤膜除去酶蛋白，冷冻干燥浓缩后经凝胶柱G-15纯化最终得白色固体即为式Ⅹ-1-3所示化合物19毫克，产率61.8%。
本实施例制备的式Ⅹ-1-3所示化合物的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,D2O):δ8.09(1H,s,C=CHN3),4.91(1H,d,J13.0Hz,H1I),4.83(1H,d,J12.7Hz,H1II),4.65–4.59(3H,m),4.41(1H,d,J10.4Hz),4.30(1H,dd,J3.8,10.7Hz),4.23–4.20(2H,m),4.11(1H,dd,J3.1,9.9Hz),3.98–3.58(25H,m),3.56–3.52(1H,m),3.26–3.14(2H,m),2.74(1H,dd,J4.6,12.3Hz,H3eq-Sia),2.51–2.43(1H,m),2.40(2H,t,J7.2Hz),2.02(3H,s,Ac-Sia),1.98(1H,t,J6.6Hz),1.93(3H,s,Ac-I),1.80(1H,t,J12.1Hz,H3ax-Sia),1.75–1.68(1H,m),1.66–1.55(3H,m),1.45–1.37(2H,m);13C NMR(100MHz,D2O):δ179.5,177.8,177.2,173.7,146.6(C=CHN3),128.7(C=CHN3),105.1(C1II),103.2(C1I),102.7(C1III),80.2,78.2,78.0,77.1,75.7,75.6,75.1,74.4,72.6,72.4,72.3,71.6,71.4,71.0,70.6,69.2,66.7,65.4,65.1,63.9,62.3,59.4,57.8,54.6,52.9,43.2,42.5,41.0,36.5,30.7,26.9,25.0,24.9;HRESIMS:m/z1178.32610[M+Na]+(calcd for C42H69N5NaO26S3:1178.32851[M+Na]+).
由上述表征数据可知，本实施例得到的化合物的结构正确，为目标化合物。
实施例6、唾液酸三糖-短连接链的制备
取23毫克实施例5乳糖胺硫酸酯短连接链（式II-1-3，终浓度为10mM，和19.87毫克CMP-N-乙酰神经氨酸（CMP-Neu5Ac，终浓度为15mM）溶于2.7毫升的Tris-HCl（pH8.0）缓冲液中后，将反应体系温度升至37℃，然后加入135微升Pd2,6-ST（0.27U），2-3小时后，薄层色谱（TLC）检测原料已完全消失，将反应液通过超滤膜除去酶蛋白，冷冻干燥浓缩后经凝胶柱G-15纯化最终得白色固体即为式Ⅹ-2-3所示化合物18.5毫克，产率60%。
本实施例制备的式Ⅹ-2-3所示化合物的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,D2O):δ8.10(1H,s,C=CHN3),4.91(1H,d,J13.4Hz,H1I),4.84(1H,d,J13.2Hz,H1II),4.67–4.63(3H,m),4.47–4.42(2H,m),4.27–4.23(1H,m),4.22–4.20(2H,m),4.00–3.49(20H,m),3.26–3.14(2H,m),2.65(1H,dd,J4.4,12.2Hz,H3eq-Sia),2.51–2.43(1H,m),2.39(2H,t,J7.3Hz),2.05–1.93(7H,m),1.77–1.55(5H,m),1.44–1.37(2H,m);13C NMR(100MHz,D2O):δ179.5,177.8,177.3,176.4,146.5(C=CHN3),128.7(C=CHN3),106.3(C1II),103.1(C1I),102.2(C1III),83.2,76.5,75.4,75.3,75.3,74.6,73.6,72.6,72.4,71.6,71.4,71.3,71.0,69.6,66.7,66.0,65.5,65.1,59.4,57.6,54.8,52.9,43.2,43.0,40.8,36.5,30.7,26.9,25.1,24.9;HRESIMS:m/z1178.32537[M+Na]+(calcd for C42H69N5NaO26S3:1178.32851[M+Na]+).
由上述表征数据可知，本实施例得到的化合物的结构正确，为目标化合物。
实施例7、唾液酸四糖-短连接链的制备
Figure BDA0000398935120000141
1、LeX短连接链的合成
取40毫克式I-4所示的LeX三糖丙炔苷（0.07mmol）与38.41毫克短连接链（如式Ⅳ所示，0.106mmol）溶于5毫升N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和甲醇（MeOH）（体积比为1:1）的混合溶液中，然后加入6.7毫克碘化亚铜（CuI，0.035mmol），氮气保护下过夜反应。TLC监测原料消失，将反应液过滤，冷冻干燥浓缩后以G-15凝胶柱纯化，最终得白色固体即为式II-1-4所示化合物（32.8毫克，产率50%）。
本实施例制备的式II-1-4所示化合物的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,D2O):δ8.09(1H,s,C=CHN3),5.09(1H,d,J4.0Hz,H1III),4.95(1H,d,J12.8Hz,H1I),4.83(1H,d,J12.9Hz,H1II),4.67(2H,t,J4.8Hz),4.48(1H,d,J7.8Hz),4.26–4.24(2H,m),4.01–3.99(3H,m),3.96–3.88(7H,m),3.81(1H,d,J2.8Hz),3.76–3.61(15H,m),3.54–3.50(1H,m),3.29–3.17(2H,m),2.54–2.46(1H,m),2.43(2H,t,J7.2Hz),2.05–1.96(1H,m),1.94(3H,s,Ac),1.80–1.72(1H,m),1.70–1.58(2H,m),1.48–1.40(2H,m),1.19(3H,d,J8.0Hz,H6III);13C NMR(125MHz,D2O):δ176.2,174.0,143.5(C=CHN3),125.6(C=CHN3),101.8(C1II),99.9(C1I),98.6(C1III)75.4,74.9,74.8,73.3,72.4,71.9,71.0,69.7,69.2,68.7,68.5,68.3,67.7,66.7,63.7,61.9,61.4,59.8,56.5,55.7,50.0,40.3,38.1,33.8,33.6,28.0,24.1,22.3,22.1,15.3;HRESIMS:m/z931.35143[M+H]+(calcd for C37H63N4O19S2:931.35224[M+H]+).
由上述表征数据可知，本实施例得到的化合物的结构正确，为目标化合物。
其中，式I-4所示的LeX三糖丙炔苷的合成过程如下：
将373毫克化合物17（1.0mmol，其合成见文献：R.Daly,G.Vaz,A.M.Davies,M.O.Senge,E.M.Scanlan,Chem.Eur.J.2012,18,14671–14679.）和分子筛
Figure BDA0000398935120000153
溶于20毫升无水二氯甲烷（DCM）中预冷至0℃，在氮气保护下加入20微升三氟甲磺酸三甲基硅脂（TMSOTf，0.11mmol）和383毫克N-碘代丁二酰亚胺（NIS，1.7mmol）。反应液搅拌10分钟后，将溶于20毫升二氯甲烷（DCM）的757毫克化合物16（1.1mmol，其合成见文献：A.Fekete,A.Borbás，S.Antus,A.Lipták，Carbohydr.Res.2009,344,1434–1441.）滴加其中。继续搅拌30分钟后，反应液以三乙胺中和，饱和硫代硫酸钠溶液清洗，有机相分离、收集、干燥后浓缩。混合物经硅胶柱层析分离（石油醚/乙酸乙酯2:1）后得到白色固体化合物18（685毫克，产率72%）。
本实施例制备化合物18的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.22–8.08(20H,m,PhH),5.98(1H,d,J3.2Hz,H4II),5.82(1H,dd,J1,28.0Hz,J2,310.4Hz,H2II),5.56(1H,dd,J3,43.6Hz,J2,310.8Hz,H3II),5.82(1H,d,J2,N8.4Hz,NH),5.01(1H,d,J1,28.0Hz,H1I),4.82(1H,d,J1,28.0Hz,H1II),4.59–4.63(1H,m,H6II),4.46–4.51(1H,m),4.38–4.38(2H,m),4.24–4.32(3H,m),4.06(1H,t,J9.6Hz),3.74(1H,t,J9.2Hz),3.50–3.60(1H,m),3.32–3.34(1H,m),2.76(1H,s,OH),2.39(1H,t,J2.4Hz,C≡CH),2.00(3H,s,Ac),0.84,0.07,0.06(15H,3s,5×CH3of TBS);13C NMR(125MHz,CDCl3):δ170.6,166.2,165.6,165.5,165.1,133.8,133.6,133.5,133.4,131.0,130.1,130.0,129.8,129.8,129.3,128.9,128.9,128.8,128.7,128.6,128.4,101.7,97.8,80.8,78.9,75.0,72.2,71.8,69.7,68.0,65.6,62.3,61.3,57.9,56.6,55.3,26.0,25.9,18.3,-5.1,-5.3;MALDI-TOF MS:m/z974.4[M+Na]+(calcd forC51H57NO15Si:951.4[M]+).
将952毫克化合物18（1.0mmol）和442毫克化合物19(1.2mmol，其合成见文献：A.Mukherjee,M.M.Palcic,O.Hindsgaul,Carbohydr.Res.2000,326,1–21.)溶于10毫升无水甲苯（PhCH3）中。在0℃通有氮气的条件下加入405毫克N-碘代丁二酰亚胺（NIS，1.8mmol)和22微升三氟甲磺酸三甲基硅脂（TMSOTf，0.12mmol）。当薄层层析（TLC，石油醚/乙酸乙酯1:1）显示所以起始原料消失时反应停止，反应液以三乙胺中和，饱和硫代硫酸钠清洗后，有机相干燥并浓缩。混合物经硅胶柱层析（石油醚/乙酸乙酯2:1）分离后得到油状化合物20（931毫克，产率74%）。
本实施例制备化合物20的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.82–8.09(24H,m,PhH),5.98(1H,d,J3.2Hz,H4II),5.95(1H,d,J2,N8.4Hz,NH),5.75(1H,dd,J1,28.0Hz,J2,310.4Hz,H2II),5.59(1H,dd,J3,43.6Hz,J2,310.4Hz,H3II),5.26(1H,d,J1,23.6Hz,H1III),5.12(1H,d,J1,28.0Hz,H1I),4.70–4.75(2H,m,H1II,H6II),4.52–4.63(3H,m),4.50(1H,dd,J7.6,11.6Hz),4.36(1H,dd,J5.6,8.0Hz),4.24(1H,t,J6.8Hz),4.14–4.17(4H,m),3.83(1H,dd,J2.8,11.6Hz),3.77(3H,s,OCH3),3.55–3.61(2H,m),3.18–3.20(1H,m),2.26(1H,t,J2.4Hz,C≡CH),1.95(3H,s,Ac),1.44(3H,d,J6.8Hz,H5III),1.40,1.26(3H,s,2×CH3),0.89,0.07,0.01(15H,3s,5×CH3of TBS);13C NMR(125MHz,CDCl3):δ170.2,166.0,165.8,165.5,165.4,133.8,133.6,133.4,133.3,130.7,130.0,130.0,129.8,129.7,129.5,129.1,129.0,128.9,128.8,128.7,128.6,128.5,128.4,113.9,108.6,100.0,98.1,96.3,79.0,77.3,76.7,76.5,75.7,74.7,74.4,74.3,72.3,71.8,71.6,70.1,68.4,63.7,61.8,61.4,63.7,61.8,61.4,55.3,55.2,28.4,26.2,25.9,23.6,18.3,16.5,-5.0,-5.3;MALDI-TOF MS:m/z1280.4[M+Na]+(calcd forC68H79NO20Si:1257.5[M]+).
Figure BDA0000398935120000161
将630毫克三糖化合物20（0.5mmol）溶于15毫升二氯甲烷/水（DCM/H2O，18:1）溶液中，加入227毫克2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌（DDQ，1.0mmol)。反应液在室温下搅拌7小时后加入10毫升硫代硫酸钠溶液（Na2S2O3，20%）。混合物以乙酸乙酯萃取三次，有机相收集、干燥并浓缩，然后悬于20毫升乙酸溶液中（AcOH，80%）。反应液在60℃反应30分钟后与甲苯共浓缩。浓缩液加入到吡啶/乙酸酐溶液中按照化合物14的方法进行乙酰化反应。经硅胶柱层析（石油醚/乙酸乙酯1:2）分离得到油状三糖化合物21（392毫克，产率68%）。
本实施例制备化合物21的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.22–8.06(20H,m,PhH),5.98(1H,d,J3.2Hz,H4II),5.77(1H,d,J2,N9.2Hz,NH),5.69(1H,dd,J1,28.0Hz,J2,310.4Hz,H2II),5.59(1H,dd,J3,43.6Hz,J2,310.4Hz,H3II),5.26(1H,d,J1,24.0Hz,H1III),5.34(1H,s,H4III),5.32(1H,dd,J3.2,9.2Hz,H3III),5.10(1H,dd,J4.0,9.6Hz,H2III),4.90(1H,dd,J7.2,11.6Hz),4.78(1H,d,J8.0Hz,H1I),4.72–4.76(1H,m),4.66(1H,dd,J9.6,11.6Hz),4.61(1H,d,J6.4Hz,H1II),4.44(1H,dd,J4.0,12.0Hz),4.27–4.32(2H,m,CH2C≡CH),4.09–4.19(3H,m),3.91–3.97(2H,m),3.51–3.54(1H,m),2.32(1H,t,J2.4Hz,C≡CH),1.91–2.17(15H,m,5×Ac),1.24(3H,d,J6.8Hz,H5III);13C NMR(125MHz,CDCl3):δ171.1,170.5,170.4,169.9,166.2,166.0,165.4,165.3,133.7,133.6,133.4,129.9,129.8,129.7,129.6,129.3,128.9,128.7,128.4,100.9,98.1,95.1,78.7,75.1,74.5,72.9,72.8,72.4,71.6,71.4,69.8,68.2,68.0,67.9,65.0,62.4,61.7,55.7,23.5,21.1,20.9,20.8,20.7,16.0;MALDI-TOFMS:m/z1174.4[M+Na]+(calcd for C59H61NO13:1151.4[M]+).
Figure BDA0000398935120000171
将115毫克化合物21（0.1mmol）溶于10毫升甲醇/二氯甲烷（MeOH/DCM，1:1）溶液中，加入甲醇钠/甲醇（NaOMe/MeOH，1M）调其pH为9.反应液在室温下搅拌3小时加入离子交换树脂（Dowex-50(H+)）中和。经过滤后滤液浓缩。混合物经凝胶柱（Bio-GelP2）分离得到非晶固体4（式I-4，57毫克，产率99%).
本实施例制备的化合物4（式I-4）的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,D2O):δ5.05(1H,d,J4.0Hz,H1III),4.77(1H,q,J7.8Hz,H5III),4.69(1H,d,J8.0Hz,H1I),4.39(1H,d,J7.6Hz,H1II),4.34(2H,d,2.8Hz,CH2C≡CH),3.94(1H,dd,J2.4Hz,12.4Hz),3.83–3.90(5H,m),3.80(1H,dd,J4.8Hz,12.4Hz),3.73(1H,d,J2.8Hz,H4II),3.64–3.69(2H,m),3.58–3.62(2H,m),3.52–3.56(2H,m),3.44(1H,dd,J8.0Hz,10.0Hz),2.86(1H,t,J2.4Hz,C≡CH),1.98(3H,s,Ac),1.12(3H,d,J6.8Hz,H6III);13C NMR(125MHz,D2O):δ174.6,102.0,99.4,98.7,76.3,75.6,75.0,75.0,73.5,72.6,72.1,71.2,69.4,68.5,67.9,66.9,61.6,59.9,56.9,55.7,22.4,15.4;MALDI-TOF MS:m/z590.2[M+Na]+,606.2[M+K]+(calcd forC59H61NO13:567.2[M]+).
由上述表征数据可知，本实施例得到的化合物的结构正确，为目标化合物。
2、唾液酸四糖短连接链的合成
取9毫克LeX三糖短连接链（式II-1-4，终浓度为10mM），和7.14毫克CMP-N-乙酰神经氨酸（CMP-Neu5Ac，终浓度为15mM）溶于1毫升的Tris-HCl（pH8.0）缓冲液中后，将反应体系温度升至37℃，然后加入50微升Pm2,3-ST（0.1U），2-3小时后，薄层色谱（TLC）检测原料已完全消失，将反应液通过超滤膜除去酶蛋白，冷冻干燥浓缩后经凝胶柱G-15纯化最终得白色固体即为式Ⅹ-1-4所示化合物2毫克，产率16.9%。
本实施例制备的式Ⅹ-1-3所示化合物的结构表征数据如下：
1H NMR(500MHz,D2O):δ8.06(1H,s,C=CHN3),5.04(1H,d,J3.9Hz,H1III),4.91(1H,d,J13.1Hz,H1I),4.79-4.73(1H,overlapped by solvent peak,H1II),4.62(2H,dd,J6.2,10.9Hz),4.51(1H,d,J7.8Hz),4.21–4.20(1H,m),4.10(1H,dd,J9.9Hz),4.01–3.85(16H,m),3.75–3.49(23H,m),3.22–3.16(1H,m),2.75(1H,dd,J4.2,12.4Hz,H3eq-Sia),2.48–2.44(1H,m),2.38(1H,t,J7.1Hz),2.02(3H,s,Ac-Sia),1.98–1.94(1H,m),1.89(3H,s,Ac-I),1.71–1.58(2H,m),1.43–1.38(1H,m),1.14(3H,d,J6.4Hz,H6III);13C NMR(150MHz,D2O):δ180.4,176.6,175.0,174.1,143.5(C=CHN3),125.6(C=CHN3),101.6(C1II),100.0(C1I),99.5(C1IV),98.5(C1III),75.6,75.3,74.8,73.3,72.9,71.9,71.6,70.3,70.2,69.7,69.2,68.7,68.5,68.2,68.1,67.7,67.3,67.0,66.6,63.8,63.2,62.6,61.9,61.4,60.3,56.5,55.7,52.1,51.7,50.0,40.3,39.7,39.1,33.6,27.8,24.0,22.0,15.2;HRESIMS:m/z1222.44473[M+H]+(calcd for C48H79N5O27S2:1222.44766[M+H]+).
由上述表征数据可知，本实施例得到的化合物的结构正确，为目标化合物。
实施例8、唾液酸三糖-长连接链的制备（式Ⅹ-1-5）
Figure BDA0000398935120000181
1、唾液酸三糖的制备
取76毫克乳糖丙炔苷（式Ⅰ-1，终浓度为10mM，其合成方法见文献：F.Lutz,U.B.Tietze,Chem.Eur.J.1998,4,1179–1183.）和197.5毫克CMP-N-乙酰神经氨酸（CMP-Neu5Ac，终浓度为15mM）溶于20毫升的Tris-HCl（pH8.0）缓冲液中后，将反应体系温度升至37℃，然后加入500微升Pm2,3-ST（1U），2-3小时后，薄层色谱（TLC）检测原料已完全消失，将反应液通过超滤膜除去酶蛋白，冷冻干燥浓缩后经凝胶柱G-15纯化后得白色固体即唾液酸三糖（式Ⅱ-1-5所示，127.5毫克，产率95%）。具体反应式如下：
2、唾液酸三糖长连接链的合成
取67毫克式Ⅱ-1-5所示的唾液酸三糖（0.1mmol）与80.4毫克式Ⅴ所示的长连接链（0.15mmol，其合成方法见文献：A.G.Barrientos,J.M.de la Fuente,T.C.Rojas,A.Fernandez,S.Penades,Chem.Eur.J.2003,9,1909–1921.）溶于5毫升N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和甲醇（MeOH）（体积比为1:1）的混合溶液中，然后加入9.5毫克碘化亚铜（CuI，0.05mmol），为了进一步脱除链上的乙酰基，再加入2毫升甲醇（MeOH）和适量甲醇钠（MeONa）固体使溶液pH值达到10-11，氮气保护下过夜反应。TLC监测原料消失，将反应液过滤，冷冻干燥浓缩后以G-15凝胶柱纯化，最终得白色固体即为式Ⅹ-1-5所示化合物83毫克，产率80%。
Figure BDA0000398935120000191
本实施例制备的式Ⅹ-1-5所示化合物的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,D2O):δ8.15(1H,s,C=CHN3),5.01(1H,d,J12.48Hz,H1I),4.87(1H,d,J12.68Hz,H1II),4.64(2H,t,J4.86Hz),4.59–4.53(1H,m),4.16(1H,d,J9.88Hz),3.98–3.62(41H,m),3.48(2H,t,J6.36Hz),3.36(1H,t,J8.12Hz),2.77–2.72(3H,m),2.05(3H,s),1.90(1H,t,J12.48Hz,H3ax-Sia),1.71–1.59(4H,m),1.43-1.34(13H,m);13C NMR(150MHz,D2O):δ175.1,174.9,143.6(C=CHN3),125.7(C=CHN3),103.1(C1II),101.5(C1I),95.5(C1III),78.5,75.6,75.5,75.1,74.9,74.5,73.2,72.9,72.7,71.2,70.5,70.3,70.0,69.8,69.7,68.9,68.7,68.4,67.9,67.7,66.8,63.3,63.0,62.0,61.1,61.0,60.2,52.2,51.8,51.9,50.2,39.0,30.4,29.8,29.6,29.5,29.3,29.0,28.9,26.1,22.2;HRESI-MS:m/z1164.54939[2M+H]2+(calcd for C98H176N8O50S2:1164.54529[2M+H]2+).
由上述表征数据可知，本实施例得到的化合物的结构正确，为目标化合物。
实施例9、唾液酸三糖-长连接链的制备
Figure BDA0000398935120000192
1、唾液酸三糖的制备
取76毫克乳糖丙炔苷（式Ⅰ-1，终浓度为10mM，其合成方法见文献：F.Lutz,U.B.Tietze,Chem.Eur.J.1998,4,1179–1183.）和197.5毫克CMP-N-乙酰神经氨酸（CMP-Neu5Ac，终浓度为15mM）溶于20毫升的Tris-HCl（pH8.0）缓冲液中后，将反应体系温度升至37℃，然后加入500微升Pd2,6-ST（1U），2-3小时后，薄层色谱（TLC）检测原料已完全消失，将反应液通过超滤膜除去酶蛋白，冷冻干燥浓缩后经凝胶柱G-15纯化后得白色固体即唾液酸三糖（式Ⅱ-1-6所示，124.8毫克，产率93%）。
Figure BDA0000398935120000201
2、唾液酸三糖长连接链的合成
取67毫克式Ⅱ-1-6所示的唾液酸三糖（0.1mmol）与80.4毫克式Ⅴ所示的长连接链（0.15mmol）溶于5毫升N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和甲醇（MeOH）（体积比为1:1）的混合溶液中，然后加入9.5毫克碘化亚铜（CuI，0.05mmol），为了进一步脱除链上的乙酰基，再加入2毫升甲醇（MeOH）和适量甲醇钠（MeONa）固体使溶液pH值达到10-11，氮气保护下过夜反应。TLC监测原料消失，将反应液过滤，冷冻干燥浓缩后以G-15凝胶柱纯化，最终得白色固体即为式Ⅹ-2-5所示化合物70毫克，产率60%。
本实施例制备的式Ⅹ-2-5所示化合物的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,D2O):δ8.17(1H,s,C=CHN3),5.02(1H,d,J12.96Hz,H1I),4.88(1H,d,J12.64Hz,H1II),4.66(2H,t,J4.28Hz),4.61(1H,d,J7.88Hz),4.44(1H,t,J7.54Hz),4.02–3.57(42H,m),3.50(2H,t,J6.14Hz),3.39(1H,t,J8.22Hz),2.73–2.71(3H,m),2.05(3H,s),1.85(1H,t,J12.26Hz,H3ax-Sia),1.73–1.60(4H,m),1.45–1.35(12H,m);13C NMR(150MHz,D2O):δ175.0,173.6,143.6(C=CHN3),125.8(C=CHN3),103.4(C1II),101.4(C1I),100.4(C1III),79.7,74.8,73.7,72.8,72.6,72.5,71.9,71.2,70.9,69.9,69.8,69.8,69.7,68.9,68.6,68.5,68.4,63.6,62.7,62.0,61.5,60.4,59.4,56.7,51.9,50.1,40.2,30.4,30.0,29.7,29.7,29.6,29.4,29.2,29.0,28.9,26.1,22.2;HRESI-MS:m/z1164.54939[2M+H]2+(calcd for C98H176N8O50S2:1164.54529[2M+H]2+).
由上述表征数据可知，本实施例得到的化合物的结构正确，为目标化合物。
实施例10、唾液酸三糖-金纳米粒子的制备
将1.5毫升金纳米粒子（平均粒径为13nm，终浓度为10nM）溶于9毫升超纯水中，再加入0.6-0.7毫克任一种实施例1—9制备的唾液酸三糖-长/短连接链（使唾液酸三糖-长/短连接链与金纳米粒子的摩尔比为40000:1），和不同比例的与唾液酸三糖-长/短连接链中的连接链相同的长/短连接链（使唾液酸三糖-长/短连接链与长/短连接链的摩尔比分别为2:1，5:1，10:1和1:0）混合物，室温搅拌24小时，得到36种唾液酸三糖-金纳米粒子。反应结束后，分别以超纯水洗两遍，PBS缓冲液（10mM,pH7.4）洗一遍（14000rpm，30min），最后溶于1毫升PBS缓冲液（10mM,pH7.4）中，获得36种含唾液酸三糖-金纳米粒子的溶液，4℃保存。
以实施例1—2和实施例8—9按照上一段描述得到的唾液酸三糖-长/短连接链（共16种，简称Sia-Lac-AuNPs，其结构式示意图如图1所示）为例进行说明，具体反应式如下：
Figure BDA0000398935120000211
实施例11、实施例10得到的唾液酸三糖-金纳米粒子检测流感病毒的宿主特异性
本实施例使用的流感病毒的毒株信息如下：
毒株A/California/04/2009（H1N1）：简称09H1，文献：W.Zhang,J.Qi,Y.Shi,Q.Li,F.Gao,Y.Sun,X.Lu,Q.Lu,C.J.Vavricka,D.Liu,J.Yan,G.F.Gao，Protein Cell2010,1,459–467.其HA蛋白的氨基酸序列的Genbank号为ACP41105.1；已知该病毒HA蛋白识别的受体为宿主细胞分泌的唾液酸α2,6寡糖。
毒株A/South Carolina/1/1918（H1N1）：简称18H1，文献：J.Stevens,O.Blixt,L.Glaser,J.K.Taubenberger,P.Palese,J.C.Paulson,I.A.Wilson,J.Mol.Biol.2006,355,1143–1155.其HA蛋白的氨基酸序列的Genbank号为AAD17229.1；已知该病毒HA蛋白识别的受体为宿主细胞分泌的唾液酸α2,6寡糖。
毒株A/South Carolina/1/1918（H1N1）（D225G的突变株）：简称18H1mut，文献：J.Stevens,O.Blixt,L.Glaser,J.K.Taubenberger,P.Palese,J.C.Paulson,I.A.Wilson,J.Mol.Biol.2006,355,1143–1155.其HA蛋白的氨基酸序列的Genbank号为AAD17229.1；已知该病毒HA蛋白识别的受体为宿主细胞分泌的唾液酸α2,3或α2,6寡糖。
毒株A/USSR/90/77（H1N1）：简称77H1，文献：A.S.Gambaryan,V.P.Marinina,A.B.Tuzikov,N.V.Bovin,I.A.Rudneva,B.V.Sinitsyn,A.A.Shilov,M.N.Matrosovich,Virology,1998,247,170–177.其HA蛋白的氨基酸序列的Genbank号为ABD95350.1；已知该病毒HA蛋白识别的受体为宿主细胞分泌的唾液酸α2,3或α2,6寡糖。
毒株A/WSN/1933（H1N1）：简称WSNH1，文献：W.-C.Liu,S.-C.Lin,Y.-L.Yu,C.-L.Chu,S.-C.Wu,J.Virol.2010,84,12011–12017.其HA蛋白的氨基酸序列的Genbank号为ACF54598.1；已知该病毒HA蛋白识别的受体为宿主细胞分泌的唾液酸α2,3或α2,6寡糖。
毒株A/PR8/8/34（H1N1）：简称PR8，文献：C-T.Guo et al.Glycobiology2007,17,713–724，已知本实验中所用毒株识别的受体为宿主细胞分泌的唾液酸α2,3寡糖。
毒株A/Aichi/2/1968（H3N2）：简称68H3，文献：N.K.Sauter,J.E.Hanson,G.D.Glick,J.H.Brown,R.L.Crowther,S.-J.Park,J.J.Skehel,D.C.Wiley,Biochemistry1992,31,9609–9621.其HA蛋白的氨基酸序列的Genbank号为BAF37221.1；已知该病毒HA蛋白识别的受体为宿主细胞分泌的唾液酸α2,6寡糖。
毒株A/Bar-headed Goose/Qinghai/1/2005（H5N1）：简称qinH5，文献：Z.Li,Z.Liu,C.Ma,L.Zhang,Y.Su,G.F.Gao,Z.Li,L.Cui,W.He,Arch.Virol.2011,156,1803–1812.其HA蛋白的氨基酸序列的Genbank号为ABA29447.1；已知该病毒HA蛋白及其毒株识别的受体为宿主细胞分泌的唾液酸α2,3寡糖。
毒株A/VietNam/1203/2004（H5N1）：简称vieH5，文献：J.Stevens,O.Blixt,T.M.Tumpey,J.K.Taubenberger,J.C.Paulson,I.A.Wilson，Science2006,312,404–410.其HA蛋白的氨基酸序列的Genbank号为ABW90135.1；已知该病毒HA蛋白识别的受体为宿主细胞分泌的唾液酸α2,3寡糖。
毒株A/Shenzhen/1/2011（H5N1）：简称SheH5，文献：C.Wu,X.Lu,X.Wang,T.Jin,X.Cheng,S.Fang,X.Wang,H.Ma,R.Zhang,J.Cheng,J.Med.Virol.2013,85,760–768.其HA蛋白氨基酸序列如序列表序列1所示。已知该病毒HA蛋白识别的受体为宿主细胞分泌的唾液酸α2,3寡糖。
毒株A/Anhui/1/2013（H7N9）：简称AnhH7，文献：D.Liu,W.Shi,Y.Shi,D.Wang,H.Xiao,W.Li,Y.Bi,Y.Wu,X.Li,J.Yan,W.Liu,G.Zhao,W.Yang,Y.Wang,J.Ma,Y.Shu,F.Lei,G.F.Gao,The Lancet,2013,381,1926–1932.其HA蛋白的氨基酸序列的如序列表序列2所示。已知该病毒HA蛋白及其毒株识别的受体为宿主细胞分泌的唾液酸α2,3或α2,6寡糖。
毒株A/Shanghai/1/2013（H7N9）：简称ShaH7，文献：D.Liu,W.Shi,Y.Shi,D.Wang,H.Xiao,W.Li,Y.Bi,Y.Wu,X.Li,J.Yan,W.Liu,G.Zhao,W.Yang,Y.Wang,J.Ma,Y.Shu,F.Lei,G.F.Gao,The Lancet,2013,381,1926–1932.其HA蛋白的氨基酸序列的如序列表序列3所示。已知该病毒HA蛋白识别的受体为宿主细胞分泌的唾液酸α2,3寡糖，毒株识别的受体为宿主细胞分泌的唾液酸α2,3或α2,6寡糖。
以下，将实施例1获得的α2,3唾液酸三糖-短连接链与短连接链以摩尔比为5:1固定于金纳米粒子表面形成的唾液酸三糖-金纳米粒子简称为3’SLs-AuNP5:1；
将实施例2获得的α2,6唾液酸三糖-短连接链与短连接链以摩尔比为5:1固定于金纳米粒子表面形成的唾液酸三糖-金纳米粒子简称为6’SLs-AuNP5:1；
将实施例3获得的α2,3唾液酸三糖-短连接链与短连接链以摩尔比为5:1固定于金纳米粒子表面形成的唾液酸三糖-金纳米粒子简称为3’SLNs-AuNP5:1；
将实施例4获得的α2,6唾液酸三糖-短连接链与短连接链以摩尔比为5:1固定于金纳米粒子表面形成的唾液酸三糖-金纳米粒子简称为6’SLNs-AuNP5:1；
将实施例5获得的α2,3唾液酸三糖-短连接链与短连接链以摩尔比为5:1固定于金纳米粒子表面形成的唾液酸三糖-金纳米粒子简称为Su-3’SLNs-AuNP5:1；
将实施例6获得的α2,6唾液酸三糖-短连接链与短连接链以摩尔比为5:1固定于金纳米粒子表面形成的唾液酸三糖-金纳米粒子简称为Su-6’SLNs-AuNP5:1；
将实施例7获得的α2,3唾液酸三糖-短连接链与短连接链以摩尔比为5:1固定于金纳米粒子表面形成的唾液酸三糖-金纳米粒子简称为SLeXs-AuNP5:1；
将实施例8获得的α2,3唾液酸三糖-长连接链与长连接链以摩尔比为5:1固定于金纳米粒子表面形成的唾液酸三糖-金纳米粒子简称为3’SLl-AuNP5:1；
将实施例9获得的α2,6唾液酸三糖-长连接链与长连接链以摩尔比为5:1固定于金纳米粒子表面形成的唾液酸三糖-金纳米粒子简称为6’SLl-AuNP5:1。
一、宿主特异性定性检测
1、HA蛋白水平
在1.5mL离心管中分别将3’SLs-AuNP5:1和6’SLs-AuNP5:1用PBS缓冲液（10mM,pH7.4）稀释至2.5nM（即OD522nm的值为0.2）获得稀释液，于96孔板或者8连PCR管中每孔中加入150uL上述稀释液，再加入2.5uL一种流感病毒毒株HA蛋白使其在反应体系中的终浓度为16.7ug/mL（所述唾液酸寡糖-金纳米粒子与待测流感病毒毒株HA蛋白的比例为2.8pmol：16.7ug），以加入PBS缓冲液（10mM,pH7.4）为空白对照，室温下孵育，40min内肉眼观察颜色变化，并对反应液用UV-Vis光谱、动态光散射（DLS）和TEM图像进行检测以验证结果。
肉眼观察的结果如图2所示：
与不含HA蛋白的空白对照相比，3’SLs-AuNP5:1中加入各种病毒的HA蛋白后，qinH5、18H1mut和SheH5样品均发生了明显的变化（即由红变紫），说明3’SLs-AuNP5:1与qinH5、18H1mut和SheH5的HA蛋白发生了较大程度的结合；77H1变化幅度相比较小（即由红变浅红），说明3’SLs-AuNP5:1和77H1的HA蛋白结合较弱；68H3颜色没有变化（仍为红色），说明3’SLs-AuNP5:1和68H3的HA蛋白无结合；
与不含HA蛋白的空白对照相比，6’SLs-AuNP5:1中加入各种病毒的HA蛋白后，68H3和77H1样品均发生了明显的变化（即由红变紫），说明6’SLs-AuNP5:1与68H3和77H1的HA蛋白结合强；其它毒株的颜色没有变化（仍为红色），说明6’SLs-AuNP5:1与qinH5、18H1mut和SheH5的HA蛋白无结合。
紫外可见吸收光谱（UV-Vis光谱）变化如图3和图4所示。样品的颜色变化与光谱变化相对应。当发生较强结合时，样品在522nm左右的最大吸收峰不但会降低，而且最大吸收波长也会发生移动，如图3中的qinH5、SheH5和18H1mut和图4中的68H3；结合较弱时仅有最大吸收峰的降低，如图3中的77H1和图4中的77H1；没有结合时，吸收峰基本不变，如图3中的PBS（空白对照）、68H3和图4中的PBS（空白对照）、qinH5、SheH5和18H1mut。
动态光散射（DLS）变化如图5和图6所示。DLS测的是样品粒径大小，当唾液酸三糖-金纳米粒子与HA蛋白有很强结合时，粒子聚集在一起形成较大的集团，测出的粒径较大，如图5中的qinH5、SheH5和18H1mut和图6中的68H3；结合较弱时，粒子聚集度较低，测出的粒径较小，如图5中的77H1和图6中的77H1；没有结合时，无聚集，粒径不变，如图5中的PBS和68H3以及图6中的PBS、qinH5、SheH5和18H1mut。
TEM图像如图7所示。与DLS变化相对应，可以直观地观察粒子的聚集程度，结果也与DLS结果一致。
另外，按照上述方法检测以下毒株HA蛋白结果如下：
AnhH7：识别α2,3和α2,6两种唾液酸寡糖。与3’SLs-AuNP5:1结合程度与SZH5相似；与6’SLs-AuNP5:1的结合程度与77H1相似。
ShaH7：只识别α2,3唾液酸寡糖，且ShaH7与3’SLs-AuNP5:1结合程度相似于77H1与6’SLs-AuNP5:1的结合程度。
WSNH1：识别α2,3和α2,6两种唾液酸寡糖。与3’SLs-AuNP5:1结合程度较77H1稍强；与6’SLs-AuNP5:1的结合程度与77H1相似。
09H1：只识别α2,6唾液酸寡糖。与6’SLs-AuNP5:1的结合程度与68H3相似。
18H1：只识别α2,6唾液酸寡糖。与6’SLs-AuNP5:1的结合程度较68H3稍弱。
vieH5：只识别α23唾液酸寡糖。与3’SLs-AuNP5:1结合程度与qinH5相似。
2、流感病毒水平
在1.5mL离心管中分别将3’SLs-AuNP5:1和6’SLs-AuNP5:1用PBS缓冲液（10mM,pH7.4）稀释至2nM（即OD522nm的值为0.16）获得稀释液，于96孔板或者8连PCR管中每孔中加入88uL上述稀释液，再加入12uL一种流感病毒毒株，使其在反应体系中的终浓度为108个/mL（所述唾液酸寡糖-金纳米粒子与待测流感病毒毒株的比例为2.5pmol：108个），以加入PBS缓冲液（10mM,pH7.4）为空白对照，4℃孵育，30min内肉眼观察颜色变化，并对反应液用UV-Vis光谱、动态光散射（DLS）和TEM图像进行检测以验证结果。结果与步骤1中的结果无显著差异。
步骤一中实验1和2的结果表明，通过反应体系的颜色变化可直观地判断出多种流感病毒毒株及其HA蛋白的受体特异性，UV-Vis、DLS和TEM图像进一步证实了肉眼观察到的实验结果，且该结果与病毒相应的已知识别受体类型相一致。整个体系在室温或4℃低温下进行，无需任何仪器，肉眼即可读出实验结果，简单快捷。
二、宿主特异性定量检测
1、HA蛋白水平
在1.5mL离心管中分别将实施例10制备的唾液酸寡糖短连接链/短连接链5：1比例的金纳米粒子用PBS缓冲液（10mM,pH7.4）稀释至3.75nM（即OD522nm的值为0.3）获得稀释液，于96孔板每孔中加入150uL上述稀释液，再加入2.5uL一种流感病毒毒株HA蛋白使其在反应体系中的终浓度为16.7ug/mL（所述唾液酸寡糖-金纳米粒子与待测流感病毒毒株HA蛋白的比例为2.8pmol：16.7ug），以加入PBS缓冲液（10mM,pH7.4）为空白对照，室温下孵育，以40min时UV-Vis光谱A680/A522比值定量评估HA蛋白与糖链结合的强弱。
由图8，9可以看出，09H1，18H1，68H3只结合α2,6唾液酸寡糖，vieH5，qinH5，SheH5，ShaH7只结合α2,3唾液酸寡糖，而18H1mut和AnhH7结合两种糖链，这与之前的定性检测完全吻合。除此之外，对于内部结构不同的糖链，各种HA蛋白也有不同的亲和力。如内部糖链为乳糖胺（LN）会增加对人源性HA蛋白的结合力；而对于SheH5来说，内部糖链为LeX之后，其亲和力大大提高。这些类似于指纹图谱的定量评估结果与文献报导基本一致。
2、流感病毒水平
在1.5mL离心管中分别将实施例10制备的唾液酸寡糖短连接链/短连接链5：1比例的金纳米粒子用PBS缓冲液（10mM,pH7.4）稀释至6.25nM（即OD522nm的值为0.5）获得稀释液，于96孔板中每孔中加入88uL上述稀释液，再加入12uL一种流感病毒毒株，使其在反应体系中的终浓度为108个/mL（所述唾液酸寡糖-金纳米粒子与待测流感病毒毒株的比例为2.5pmol：108个），以加入PBS缓冲液（10mM,pH7.4）为空白对照，4℃孵育，以30min时UV-Vis光谱A680/A522比值定量评估流感病毒与糖链结合的强弱。
如图10所示，毒株PR8只结合α2,3唾液酸寡糖，毒株Ah-H7N9和Sh-H7N9结合两种类型的唾液酸寡糖，这与文献报导基本一致。与蛋白类似，流感病毒毒株对于不同的内部糖链也有其特异的识别活性。
步骤二中实验1和2的结果表明，此反应体系不仅可以定性地判定流感病毒蛋白或者毒株能否与某种糖链结合，还可以定量地评估这种结合的相对强弱，并且对于精细结构如内部糖链的衍生化其结合力强弱也可以区分出来。通过该体系可方便、快捷地得到流感病毒与宿主细胞之间的相互作用信息，特别是在新型流感爆发时，可对其能否在不同宿主之间传播做出及时、有效的预测，因此对流感的防控具有重要意义。
使用实施例8获得的唾液酸三糖-长连接链分别与长连接链以摩尔比为5:1固定于金纳米粒子表面形成的唾液酸三糖-金纳米粒子分别按照上述步骤1和2的方法流感病毒毒株HA蛋白和毒株的结果与使用实施例1获得的唾液酸三糖-短连接链与短连接链以摩尔比为5:1固定于金纳米粒子表面形成的唾液酸三糖-金纳米粒子检测上述流感病毒毒株HA蛋白和毒株的结果无显著差异。
使用实施例9获得的唾液酸三糖-长连接链分别与长连接链以摩尔比为5:1固定于金纳米粒子表面形成的唾液酸三糖-金纳米粒子分别按照上述步骤1和2的方法流感病毒毒株HA蛋白和毒株的结果与使用实施例2获得的唾液酸三糖-短连接链与短连接链以摩尔比为5:1固定于金纳米粒子表面形成的唾液酸三糖-金纳米粒子检测上述流感病毒毒株HA蛋白和毒株的结果无显著差异。
三、灵敏度检测
1、唾液酸三糖-短连接链与短连接链的摩尔比不同
实施例10制备得到的36种唾液酸寡糖-金纳米粒子中，连接链的长短对灵敏度的影响不大，唾液酸三糖-长/短连接链与长/短连接链的摩尔比以5:1时的灵敏度最高，而短链合成简便，因此使用唾液酸三糖-短连接链与短连接链的摩尔比为5:1进行实验效果较好。下面以实施例1获得的α2,3唾液酸三糖-短连接链与短连接链以不同摩尔比固定于金纳米粒子表面形成的唾液酸三糖-金纳米粒子（简称为3’SLs-AuNP，不同摩尔比分别为3’SLs-AuNP2:1、3’SLs-AuNP5:1、3’SLs-AuNP10:1、3’SLs-AuNP1:0）和实施例8获得的α2,3唾液酸三糖-长连接链与长连接链以不同摩尔比固定于金纳米粒子表面形成的唾液酸三糖-金纳米粒子（简称为3’SLl-AuNP，不同摩尔比分别为3’SLl-AuNP2:1、3’SLl-AuNP5:1、3’SLl-AuNP10:1、3’SLl-AuNP1:0）为例进行说明：
在1.5mL离心管中将3’SLs-AuNP2:1、3’SLs-AuNP5:1、3’SLs-AuNP10:1、3’SLs-AuNP1:0、3’SLl-AuNP2:1、3’SLl-AuNP5:1、3’SLl-AuNP10:1或3’SLl-AuNP1:0用PBS缓冲液（10mM,pH7.4）稀释至7.5nM（即OD522nm的值为0.6）获得稀释液，于96孔板或者8连PCR管中每孔中加入150uL上述稀释液，再加入2.5uL流感病毒毒株qinH5的HA蛋白使其在反应体系中的终浓度为16.7ug/mL,以加入PBS缓冲液（10mM,pH7.4）为空白对照，以加入相同浓度的凝集素RCA120为阴性对照，室温下孵育，40min内肉眼观察颜色变化，结果如图11所示，并在测定522nm下的吸光值，计算百分吸光值，结果如表1所示。
百分吸光值=（Ad-Aa）/Ad；Ad为空白对照在522nm下的吸光值；Aa为反应液在522nm下的吸光值。
表1、不同唾液酸三糖链与长/短连接链的摩尔比对检测结果（百分吸光值）的影响
Figure BDA0000398935120000271
图11中，相对于空白对照，颜色变浅程度由大到小依次为：5:1、10:1、2:1、1:0，阴性对照与空白对照颜色相同，均为红色。“－”表示未进行。
由表1可以看出，百分吸光值由大到小依次为：5:1、10:1、2:1、1:0。
2、病毒毒株的HA蛋白含量不同
1）在1.5mL离心管中将3’SLs-AuNP5:1用PBS缓冲液（10mM,pH7.4）稀释至2.25nM（即OD522nm的值为0.18）获得稀释液，于96孔板或者8连PCR管中每孔中加入150uL上述稀释液，再加入2.5uL梯度稀释的流感病毒毒株qinH5的HA蛋白，以加入PBS缓冲液（10mM,pH7.4）为空白对照，室温下孵育，40min内肉眼观察颜色变化（结果如图12所示），并对反应液用UV-Vis光谱检测（结果如图13所示）以验证结果，检测限以肉眼观察颜色变化为界。
图12肉眼观察的结果表明：qinH5的HA蛋白浓度小于2.5nM时颜色变浅的程度不明显；图13的UV-Vis的结果表明：qinH5的HA蛋白浓度小于2.5nM时光谱的变化也不显著。即检测限为2.5nM。
2）在1.5mL离心管中将6’SLs-AuNP5:1用PBS缓冲液（10mM,pH7.4）稀释至2nM（即OD522nm的值为0.16）获得稀释液，于96孔板或者8连PCR管中每孔中加入150uL上述稀释液，再加入2.5uL梯度稀释的流感病毒毒株68H3的HA蛋白，以加入PBS缓冲液（10mM,pH7.4）为空白对照，室温下孵育，40min内肉眼观察颜色变化（结果如图14所示），并对反应液用UV-Vis光谱检测（结果如图15所示）以验证结果，检测限以肉眼观察颜色变化为界。
图14肉眼观察的结果表明：68H3的HA蛋白浓度小于2.5nM时颜色变浅的程度不明显；图15的UV-Vis的结果表明：68H3的HA蛋白浓度小于2.5nM时光谱变化也不显著。即检测限为2.5nM。

Claims (10)

1.用于检测流感病毒宿主特异性的唾液酸寡糖-金纳米粒子，是表面通过S-Au共价键连接了如下化合物的金纳米粒子：
式Ⅹ-1所示化合物或式Ⅹ-2所示化合物，和式Ⅺ所示化合物；
式Ⅺ：HO(CH2CH2O)m(CO)n(CH2)k(CH)pSR；
所述式Ⅹ-1、式Ⅹ-2和式Ⅺ中，所述x为1-3的整数，所述m为0-6的整数，所述n为0-1的整数，所述k为0-11的整数，所述p为0或2，所述R为S或H；所述Ac为乙酰基，所述R1为羟基或乙酰胺基，所述R2为氢或L-岩藻糖，所述R3为氢或硫酸酯，所述R4为羟基或乙酰胺基。
2.根据权利要求1所述的唾液酸寡糖-金纳米粒子，其特征在于：所述m为3-6的整数；所述k为5-11的整数；所述式Ⅹ-1所示化合物或式Ⅹ-2所示化合物与所述式Ⅺ所示化合物的摩尔比为（2-10）:1。
3.根据权利要求2所述的唾液酸寡糖-金纳米粒子，其特征在于：所述m为3或6，所述n为1或0，所述k为5或11，所述p为2或0；
所述式Ⅹ-1所示化合物或式Ⅹ-2所示化合物与所述式Ⅺ所示化合物的摩尔比为2:1、5:1或10:1。
4.根据权利要求1-3任意所述的唾液酸寡糖-金纳米粒子，其特征在于：所述金纳米粒子的平均粒径为10—30nm，或13nm；
所述式Ⅹ-1所示化合物或式Ⅹ-2所示化合物与所述金纳米粒子的摩尔比为10000-80000:1，或20000-70000:1，或30000-60000:1，或30000-50000:1或40000:1。
5.一种制备权利要求1-4中任一所述唾液酸寡糖-金纳米粒子的方法，包括将式Ⅹ-1所示化合物或式Ⅹ-2所示化合物、和式Ⅺ所示化合物与含有金纳米粒子的溶液混合，获得所述用于检测流感病毒宿主特异性的唾液酸寡糖-金纳米粒子；所述式Ⅹ-1所示化合物或式Ⅹ-2所示化合物与所述金纳米粒子的摩尔比为（10000-80000）:1；所述式Ⅹ-1所示化合物或式Ⅹ-2所示化合物与所述式Ⅺ所示化合物的摩尔比为（2-10）:1。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：含有金纳米粒子的溶液的溶剂为水，金纳米粒子的浓度为2－7.5nM。
所述金纳米粒子的平均粒径为10—30nm，或13nm；
其中所述式Ⅹ-1所示化合物或式Ⅹ-2所示化合物与所述金纳米粒子的摩尔比为40000:1
7.一种检测流感病毒的宿主特异性的试剂或试剂盒，其特征在于：包括独立包装的A试剂和/或B试剂，所述A试剂为权利要求1-3中任一所述的表面通过S-Au共价键连接了式Ⅹ-1所示和式Ⅺ所示化合物的金纳米粒子；所述B试剂为权利要求1-3中任一所述的表面通过S-Au共价键连接了式Ⅹ-2所示和式Ⅺ所示化合物的金纳米粒子；所述流感病毒的宿主特异性为所述流感病毒特异识别宿主细胞表面糖链受体类型为唾液酸α2,3寡糖和唾液酸α2,6寡糖中的至少一种。
8.一种检测流感病毒的宿主特异性的方法，包括如下步骤：将独立包装的A试剂和/或B试剂与待测流感病毒毒株或其HA蛋白在PBS缓冲液中孵育，获得反应液，检测所述反应液；
当所述反应液中所述待测流感病毒或其HA蛋白与A试剂相结合时，所述待测流感病毒候选为可侵染分泌唾液酸α2,3寡糖寄主细胞的流感病毒；
当所述反应液中所述待测流感病毒或其HA蛋白与B试剂相结合时，所述待测流感病毒候选为可侵染分泌唾液酸α2,6寡糖寄主细胞的流感病毒；
所述A试剂为权利要求1-3中任一所述的表面通过S-Au共价键连接了式Ⅹ-1所示和式Ⅺ所示化合物的金纳米粒子；所述B试剂为权利要求1-3中任一所述的表面通过S-Au共价键连接了式Ⅹ-2所示和式Ⅺ所示化合物的金纳米粒子。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述PBS缓冲液的溶剂为水，溶质为NaH2PO4、Na2HPO4、KCl和NaCl，所述溶质NaH2PO4、Na2HPO4、KCl和NaCl在所述PBS缓冲液中的浓度分别为0.24g/L、1.42g/L、0.2g/L及8.0g/L；所述PBS缓冲液的pH值为7.4；
所述流感病毒为A型流感病毒；
所述结合为通过可见光下肉眼观察所述反应液的颜色来判断；若所述反应液的颜色与空白对照的颜色相比变浅或变紫，则所述待测流感病毒毒株候选为与所述唾液酸寡糖-金纳米粒子相结合的毒株；所述空白对照为不含流感病毒毒株或其HA蛋白的所述PBS缓冲液。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述反应液中的所述唾液酸寡糖-金纳米粒子与待测流感病毒毒株的比例为2pmol：105个；
所述唾液酸寡糖-金纳米粒子与待测流感病毒毒株HA蛋白的比例为2pmol：16.7ug。
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