RU2714246C1 - Моноклональные антитела, специфичные к различным штаммам вируса гриппа в - Google Patents
Моноклональные антитела, специфичные к различным штаммам вируса гриппа в Download PDFInfo
- Publication number
- RU2714246C1 RU2714246C1 RU2018147432A RU2018147432A RU2714246C1 RU 2714246 C1 RU2714246 C1 RU 2714246C1 RU 2018147432 A RU2018147432 A RU 2018147432A RU 2018147432 A RU2018147432 A RU 2018147432A RU 2714246 C1 RU2714246 C1 RU 2714246C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- influenza
- virus
- producing
- monoclonal antibodies
- protein
- Prior art date
Links
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 title abstract description 37
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 45
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 33
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims abstract description 16
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims abstract description 10
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 8
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims abstract description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 7
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 claims abstract description 4
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 24
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 11
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 claims description 9
- 235000001630 Pyrus pyrifolia var culta Nutrition 0.000 claims description 4
- 240000002609 Pyrus pyrifolia var. culta Species 0.000 claims description 4
- 241000845082 Panama Species 0.000 claims description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 3
- 241001500350 Influenzavirus B Species 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 28
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 20
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 18
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 10
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 7
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 6
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 230000036541 health Effects 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 4
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 4
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 4
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 4
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 4
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 4
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 4
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 4
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 108010046023 influenza B virus nucleoprotein Proteins 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 3
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005508 8-azaguanine Drugs 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010062106 Respiratory tract infection viral Diseases 0.000 description 2
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 2
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- FXAGBTBXSJBNMD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound CC(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O FXAGBTBXSJBNMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001269 glycine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000135033 Branchus Species 0.000 description 1
- 206010006448 Bronchiolitis Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 241000134304 Influenza A virus H3N2 Species 0.000 description 1
- 241001542907 Influenza B virus (B/Singapore/222/79) Species 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 210000003815 abdominal wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000012774 diagnostic algorithm Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000002134 immunopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000037801 influenza A (H1N1) Diseases 0.000 description 1
- 208000037802 influenza A (H3N2) Diseases 0.000 description 1
- 108700010900 influenza virus proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000010197 meta-analysis Methods 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 206010041232 sneezing Diseases 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/02—Recovery or purification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ получения мышиных моноклональных антител, специфичных к различным штаммам вируса гриппа В Ямагатской и Викторианской эволюционных линий и имеющих высокую специфичность к NP-белку, включающий стадии получения антитело-продуцирующих спленоцитов; накопления клеток мышиной миеломы; слияния антитело-продуцирующих спленоцитов с миеломными клетками; отбора гибридом; инокуляции клеток гибридомы в брюшную полость праймированных пристаном мышей; накопления моноклональных антител в асцитах; очистки полученных моноклональных антител. В указанном способе для получения антител использована гибридома-продуцент моноклональных антител, направленных к NP-белку вируса гриппа В, депонированная как 6G1/B под номером РККК(П) 785Д, или гибридома-продуцент моноклональных антител, направленных к NP-белку вируса гриппа В, депонированная как 10А5/В под номером РККК(П) 787Д в Специализированную коллекцию культур клеток ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных» ФГБУН Института цитологии РАН. Изобретение расширяет арсенал способов для получения мышиных моноклональных антител, специфичных к вирусу гриппа В Ямагатской и Викторианской эволюционных линий и имеющих высокую специфичность к NP-белку. 2 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл., 5 пр.
Description
Изобретение относится к моноклональным антителам, специфичным к различным штаммам вируса гриппа В, в частности, полученным с помощью гибридомы, и могут быть использованы в диагностике, в частности, в диагностических тест-системах.
По оценкам ВОЗ ежегодные эпидемии сезонного гриппа приводят к 3–5 миллионам случаев тяжелой болезни и 250 000–500 000 случаев смерти во всем мире. Вирус гриппа легко передаётся от человека человеку воздушно-капельным путём при выделении инфицированными людьми мельчайших частиц во время кашля или чихания. Грипп имеет тенденцию быстро распространяться, вызывая сезонные эпидемии. Большинство инфицированных людей выздоравливает за одну-две недели без какого-либо лечения. Однако, для детей, пожилых людей и людей, страдающих серьёзными заболеваниями, грипп представляет опасность — он может привести к осложнениям основных заболеваний, развитию пневмонии и смерти (WHO, 2017).
Клинические симптомы гриппа часто неспецифичны, таким образом, болезнь может быть диагностирована с определённой точностью только лабораторными молекулярно-биологическими методами. Диагностические методы и подходы, которые могут быстро и точно обнаружить новые появляющиеся вирусные варианты, необходимы для быстрого начала антивирусной терапии во время сезонных и пандемических вспышек.
Основными причинами ОРВИ у детей и взрослых являются вирусы гриппа типов A, B и C; вирус парагриппа (ВПГ) типов 1, 2 и 3; респираторно-синцитиальный вирус (РСВ); аденовирус (АВ) и риновирус. Все упомянутые вирусы могут вызвать как инфекцию верхних, так и нижних дыхательных путей, кроме того имеют сходные клинические проявления и зачастую не могут быть различены без специальной лабораторной диагностики (Mahony et al., 2011).
Острые респираторные заболевания занимают ведущее место в структуре инфекционных болезней человека и обуславливают 20–50% временных потерь трудоспособности. Экономический ущерб от ОРЗ можно сравнить лишь с затратами на профилактику и лечение длительно текущих сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний.
Наиболее важное место в развитии патологии дыхательных путей занимают вирусы гриппа и парагриппа, респираторно-синцитиальный вирус, аденовирусы.
В России ежегодно регистрируется около 50 миллионов случаев инфекционных заболеваний. До 95% из них приходится на острые респираторные вирусные инфекции, включая грипп (Карпова и др., 2012). Помимо вирусов гриппа в структуре заболеваемости ОРВИ достаточно высока роль возбудителей иной этиологии, среди которых более чем в 20% случаев выявляются РСВ, ВПГ и АВ (Соминина и др., 2012; Walter & Wunderink, 2017).
В большинстве случаев заболевания, вызванные этими патогенами, имеют благоприятное течение в виде заболеваний верхних дыхательных путей. Однако у части пациентов, особенно при наличии иммуносупрессии, а также у детей младшего возраста, эти вирусы вызывают осложнённое течение заболевания.
Так, по данным метаанализа исследований, проведённых в различных странах за 16 лет, среди детей в возрасте до 5 лет, госпитализированных с острыми заболеваниями нижних дыхательных путей (пневмониями, бронхитами и бронхиолитами), вирусы гриппа и парагриппа были выявлены в среднем в 7% и 6% случаев, соответственно. Аденовирусы детектировали у 9% пациентов. В дополнение к этому в 22% случаев были обнаружены смешанные инфекции с детекцией нескольких вышеназванных вирусов (Lukšić et al., 2013).
Дифференциальная диагностика респираторных инфекций необходима для осуществления надзора за заболеваемостью и назначения своевременной терапии, поскольку многие препараты эффективны только на ранних стадиях инфекции. Понимание истинной причины заболевания помогает избежать ненужного использования антибиотиков, которые часто назначают пациентам, инфицированным респираторными вирусами. Быстрое и достоверное обнаружение респираторных патогенов позволяет врачам избежать возникновения внутрибольничных заболеваний, а также прогнозировать возможные осложнения и иммунопатологические явления, которые могут возникнуть при этих инфекциях. Использование точных диагностических тестов даёт возможность клиницистам своевременно поставить диагноз и выявить группы риска. В диагностическом алгоритме должны быть использованы маркеры-индикаторы присоединения бактериальной инфекции. Своевременная дифференциальная диагностика вирусной и бактериальной инфекций особенно актуальна для детей при схожести симптоматики заболеваний, что может привести к неблагоприятному исходу, особенно в группах риска.
Использование при конструировании диагностических тест-систем моноклональных антител (МКА), специфичных к вирусам ОРЗ и гриппа, обеспечивает высокую чувствительность и специфичность анализа, а также необходимый уровень стандартизации препаратов.
Выбор мишеней, к которым должны быть направлены МКА, определяется представительством антигенных детерминант в составе самого вируса и в исследуемых клинических материалах, а также степенью консервативности/вариабельности сайтов-мишеней.
Вирусы гриппа и грипп
Вирусы гриппа относятся к семейству Ortomyxoviridae, геном которых представлен сегментированной однонитевой минус-РНК. Антигенные свойства внутренних белков вириона (мембранный белок M1 и нуклеопротеин NP) определяют принадлежность вирусов гриппа к роду А, В или С. Вирусы гриппа А подразделяются на субтипы в соответствии со структурой поверхностных гликопротеинов гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA). В настоящее время известно 18 типов НА (НА1–НА18) и 11 типов NA (NA1–NA11). Вирусы гриппа В делятся на 2 антигенно отличные эволюционные линии — Ямагатскую и Викторианскую (Shaw & Palese, 2013).
Грипп является одним из наиболее распространённых инфекционных заболеваний со сложным патогенезом. По данным ВОЗ в мире ежегодно регистрируется около 500 млн случаев этого заболевания. В прошлом столетии от гриппа погибло более 100 млн человек. Смертность от гриппа составляет 2 млн человек, главным образом среди детей до 5 лет и людей старше 65 лет. Основными особенностями вирусов гриппа А являются их многообразие и изменчивость, которая реализуется путём мутаций, рекомбинаций и реассортации генов, что сопровождается изменением биологических свойств возбудителя. Следствием этого является отсутствие популяционного иммунитета к новому варианту вируса, что обуславливает его быстрое распространение в человеческой популяции, приводящее к эпидемиям и пандемиям.
В настоящее время наиболее эпидемиологически значимыми является грипп А(H3N2) и A(H1N1), а также грипп В, вызываемый вирусами обеих эволюционных линий. В большинстве случаев заболевание, вызванное эпидемическими вирусами гриппа, проходит без осложнений. Однако при возникновении антигенно отличных вирусов, к которым у большинства людей отсутствует иммунитет, резко увеличивается частота регистрации осложнённого течения инфекции, как это наблюдалось для вируса А(H1N1)pdm09, появившегося в человеческой популяции в 2009 г. и вызвавшего пандемию.
В связи со всем вышеизложенным существует необходимость создания чувствительных и быстрых методов, позволяющих диагностировать грипп А всех субтипов, а также грипп В вне зависимости от эволюционной линии.
Поверхностные гликопротеины вируса гриппа (НА и NA) характеризуются высокой вариабельностью. В этой связи полученные к ним МКА обладают субтиповой, а часто и штаммовой специфичностью, что делает их непригодными для использования при создании тест-систем с широким диагностическим диапазоном. NP (Nuclear Protein, нуклеопротеин) — структурный РНК-связанный белок кора вирусной частицы, является высококонсервативным и индуцирует образование кросс-протективного иммунитета к вирусам гриппа А различных субтипов (Ng et al., 2009; Hu et al., 2010). Это делает его идеальной мишенью для получения МКА широкого спектра реагирования. МКА, полученные к NP вируса гриппа В, также реагируют с вирусами обеих эволюционных линий.
Из предшествующего уровня техники известны моноклональные антитела против вируса гриппа В. Например, международная публикация WO2013114885A раскрывает человеческие антитела против вируса гриппа В, при этом моноклональное антитело содержит человеческое моноклональное антитело или гуманизированное антитело. Антитела направлены против штаммов B/Florida/4/2006, B/Shanghai/361/2002, B/Johannesburg/5/1999, B/Yamanashi/166/1998, B/Mie/1/1993, B/Malaysia/2506/04, B/Shandong/7/1997 и B/Victoria/2/1987. Данные антитела не имеют высокой специфичности именно к вирусу гриппа В и не имеют такой широкой специфичности к штаммам вируса гриппа В по сравнению с антителами согласно изобретению.
Таким образом, проблема получения антител, которые имели бы высокую специфичность именно к гриппу В, в частности, к максимальному количеству его различных штаммов, и не имели бы специфичности к каким-либо штаммам гриппа А, является крайне актуальной.
На Фиг. 1 представлена схема получения гибридом — продуцентов МКА в общем виде.
На Фиг. 2А и 2Б показаны результаты ИФА МКА к NP-белку вируса гриппа В.
На Фиг. 3 показаны результаты взаимодействия МКА согласно изобретению с вирусом гриппа B/Brisbane/46/15 в нередуцирующих условиях (по данным иммуноблоттинга).
На Фиг. 4 приведена сенсограмма взаимодействия моноклональных антител 6G1 с анализируемым штаммом вируса гриппа В.
На Фиг. 5 показана диаграмма аффинности моноклональных антител 6G1 к вирусу гриппа В.
На Фиг. 6 показана сенсограмма взаимодействия моноклональных антител 10A5 с анализируемым штаммом вируса гриппа B.
На Фиг. 7 приведена диаграмма аффинности моноклональных антител 10A5 к вирусу гриппа В.
Описание изобретения
Данное изобретение предлагает моноклональные антитела, специфичные к различным штаммам вирусов гриппа В Ямагатской и Викторианской линий и имеющие высокую специфичность к NP-белку. При этом данные антитела представляют собой IgG антитела, в частности, мышиные моноклональные IgG антитела. Данные антитела имеют высокую специфичность к штаммам вируса гриппа В Викторианской линии, в частности, к B/Victoria/2/87 (E); B/Shandong/7/97 (E); B/Shiga/51/98 (E); B/Tokyo/53/99 (E); B/Hong Kong/330/01 (E); B/Malaysia/2506/04 (E); B/Brisbane/60/08 (E); B/Texas/2/13 (E); B/Brisbane/46/15 (E); B/Maryland/15/16 (C), Δ162-163; B/Maryland/15/16 (E), Δ162-163; B/Colorado/6/17 (C), Δ162-163; B/Colorado/6/17 (E), Δ162-163, и не имеют специфичности к штаммам вируса гриппа А. Также данные моноклональные антитела имеют высокую специфичность к штаммам вируса гриппа В Ямагатской эволюционной линии, в частности, к B/Yamagata/16/88 (E), B/Panama/45/90(E), B/Yamanashi/166/98 (E), B/Shanhai/361/02 (E), B/Florida/07/04 (E), B/Florida/04/06 (E), B/Massachusetts/2/12 (E), B/Phuket/3073/13 (E), и не имеют специфичности к штаммам вируса гриппа А. Данные антитела, ввиду своей высокой специфичности, могут быть использованы для диагностики гриппа В, в частности, штаммов Ямагатской и Викторианской эволюционных линий вируса гриппа типа В, например, для диагностики посредством тест-систем.
Способ получения указанных МКА включает:
- получение антитело-продуцирующих спленоцитов;
- накопление клеток мышиной миеломы;
- слияние антитело-продуцирующих спленоцитов с миеломными клетками;
- отбор гибридом;
- инокуляция клеток гибридомы в брюшную полость праймированных пристаном мышей;
- накопление МКА в асцитах;
- очистка полученных МКА.
Для накопления МКА в асцитах были использованы специально полученные гибридомы-продуценты МКА, направленных к NP-белку вируса гриппа В.
Гибридомы — продуценты показательных МКА 6G1 и 10A5 были депонированы как 6G1/В под номером РККК(П) 785Д и 10А5/В под номером РККК(П) 787Д в Специализированную коллекцию культур клеток ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных» ФГБУН Института цитологии РАН, соответственно.
Антитела согласно изобретению ввиду своей специфичности могут быть использованы для диагностики вируса гриппа В, в частности, в тест-системах.
Более подробно получение и анализ указанных МКА иллюстрируют примеры, приведённые ниже.
Примеры
Пример 1
Получение МКА к белкам вируса гриппа типа В
Процесс получения гибридом-продуцентов МКА к консервативным эпитопам в составе вируса гриппа типа В состоял из нескольких стадий.
Стадия 1. Очистка вируса гриппа В, предназначенного для использования в качестве иммуногена.
Очищенный до 99% вирусный концентрат получали в результате дифференциального ультрацентрифугирования вируссодержащей аллантоисной жидкости в градиенте плотности сахарозы. Специфичность полученного вирусного концентрата до начала этапа иммунизации подтверждали в реакции торможения гемагглютинации с референс-сыворотками к различным возбудителям гриппа и других ОРВИ, а также методом ИФА.
Культивирование вируса гриппа B проводили в аллантоисной полости развивающихся куриных эмбрионов. Для получения вируссодержащей аллантоисной жидкости 11–12-дневные куриные эмбрионы стерильно заражали посевным вирусом в дозе от 10 до 100 ЭИД50/0,2 мл. После герметизации парафином эмбрионы помещали в термостат на 72 часа при температуре (32 ± 0,5)°С. Далее эмбрионы охлаждали при температуре 4°С, вируссодержащую аллантоисную жидкость стерильно собирали и проводили контроль гемагглютинирующей активности в реакции гемагглютинации. После накопления вирусные частицы из аллантоисной жидкости осаждали ультрацентрифугированием при 50 000 g в течение 2 ч, суспендировали в малом количестве 10 мМ трис-ЭДТА буфера, рН 7,2 (STE) и проводили очистку вируса через градиент 20–60% сахарозы ультрацентрифугированием при 100 000 g в течение 2,5 ч с последующим осаждением вируса из зоны 36–40% сахарозы на дно при 120 000 g в течение 1 ч. Осадок ресуспендировали в STE. Для измерения концентрации белка в очищенном вирусном концентрате использовали набор “BCATM Protein Assay Kit” (“Pierce”, США). Полученные цельновирионные суспензии хранили до исследования в замороженном состоянии при температуре –80°С.
Стадия 2. Получение антитело-продуцирующих спленоцитов в результате иммунизации мышей соответствующим антигеном под контролем образования специфических сывороточных антител в ИФА.
Мышей линии BALB/c иммунизировали очищенным антигеном, полученным на стадии 1, смешанным с неполным адъювантом Фрейнда, путём внутрибрюшинного введения (иммунизации) очищенного ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы антигена вируса гриппа типа В в концентрации 50–100 мкг/мл (по 1 мл на мышь). Затем проводили мониторинг иммунизированных животных на образование специфических антител. Животных с достаточно высоким титром антител отбирали в качестве источника антитело-продуцирующих клеток.
Инъекции антигена проводили двукратно с интервалом в 5 недель. Спустя 7 дней после каждой иммунизации из ретробульбарного синуса мышей брали пробы крови для определения титра сывороточных антител против гомологичного вируса гриппа или рекомбинантного белка в ИФА. Через две недели после последней иммунизации мышей, имевших по данным ИФА антитела в титре 1:10000, бустировали антигеном, полученным на стадии 1, или рекомбинантным белком.
Стадия 3. Определение титра сывороточных антител в ИФА.
Очищенный концентрат вируса гриппа сорбировали на твёрдой поверхности (96-луночный планшет для ИФА) в концентрации 1–5 мкг/мл. После промывания планшета в лунки с сорбированным антигеном вносили серийные двукратные разведения сыворотки от иммунизированной мыши (от 1:10 до 1:20480) и инкубировали в течение часа при температуре 37°C. Для выявления сформированного комплекса антигена с антителом добавляли антитела против IgG мыши, меченные пероксидазой хрена (HRP). После промывания в планшет добавляли субстратную смесь для фермента. В качестве субстрата на стадии детекции использовали раствор ТМБ (3,3’,5,5’-тетраметилбензидин) в концентрации 100 мкг/мл с 0,03% Н2О2. Титр антител оценивали по изменению оптической плотности раствора, регистрируемой спектрофотометрически на фотометре Multiscan FC при длине волны 450 нм.
Стадия 4. Накопление клеток мышиной миеломы.
Через 3 дня после бустер-иммунизации мышь использовали в качестве донора лимфоцитов селезёнки для слияния с клетками мышиной миеломы в целях получения гибридом (Новохатский и др., 1985; Новиков и др., 1988). Для этого проводили гибридизацию спленоцитов иммунизированных мышей с клетками мышиной миеломы в присутствии 50% ПЭГ-2000. В качестве партнёра для слияния при получении гибридом использовали культуру клеток мышиной миеломы линии Х63Аg8.653, адаптированную к росту в среде с добавлением сыворотки крови крупного рогатого скота (СКРС), полученную из коллекции ФГБУ «РНЦРХТ». Данный штамм является устойчивым к 8-азагуанину, то есть дефектным по гену гипоксантин-гуанин-фосфорибозил трансферазы.
Выбранную клеточную линию культивировали на среде RPMI-1640 c добавлением глутамина, 2-меркаптоэтанола (МЭ), гентамицина и СКРС для обеспечения в день слияния со спленоцитами плотности популяции не менее 2×107 клеток/мл. Культивирование миеломы осуществляли в пластиковых культуральных планшетах или во флаконах производства “Sarstedt” (Германия) или “Nunc” (США). Клетки размножали при температуре 36–37°С и 100% влажности в атмосфере воздуха с 5–7% СО2. Базовая культуральная среда содержала 90% RPMI-1640 и 10% СКРС («БиолоT», Санкт-Петербург).
Стадия 5. Слияние антитело-продуцирующих спленоцитов с миеломными клетками.
Для получения антитело-продуцирующих клеток у мышей с высокими титрами специфических антител через 3–4 дня после последней бустер-иммунизации удаляли селезёнку и вымывали из неё спленоциты бессывороточной средой (такой как RPMI-1640) или забуференным физиологическим раствором, после чего их смешивали с миеломными клетками в соотношении от 5:1 до 10:1. Затем клетки центрифугировали (10 мин, 1000 об/мин), осадок разрыхляли, после чего, перемешивая, по каплям добавляли 1 мл бессывороточной среды, содержащей 50% (масс/об) ПЭГ (молекулярный вес 1000–4000 Да). Затем медленно добавляли 10 мл бессывороточной среды, после чего смесь центрифугировали.
Осаждённые клетки суспендировали в соответствующем количестве селективной НАТ-среды. Затем клетки переносили в селективную НАТ-среду, приготовленную на основе RPMI-1640 и 20% СКРС с добавлением гипоксантина (10–4 М), аминоптерина (4×10–7 М) и тимидина (1,6×10–5 М) производства “Sigma-Aldrich” (США), а также 2 мМ глутамина, 1 мМ пирувата натрия (“Sigma-Aldrich”, США), 1 мг/л амфотерицина В и 50 мг/л гентамицина. Суспензию распределяли по ячейкам 96-луночных планшетов для культивирования, содержащих трёхсуточную культуру мышиных макрофагов, и инкубировали в атмосфере 5–7% СО2 при температуре 37°С в течение 3 недель. После 10 суток культивирования НАТ-среду заменяли на более щадящую НТ-среду, а после 20 суток культуры поддерживали на среде RPMI-1640 с СКРС. Для удаления Ig, секретированных неслившимися спленоцитами мышей, культуральную жидкость из ячеек с растущими гибридами отбирали на 5–6, затем 10–12 и на 16–17 дни после слияния.
Стадия 6. Отбор гибридом.
Поскольку используемый штамм миеломы резистентен к 8-азагуанину, он является дефектным по ферменту гипоксантин-гуанин-фосфорибозил трансферазе, и любые не слитые с лимфоцитами миеломные клетки и любые гибриды миелома-миелома не способны выживать в среде НАТ. С другой стороны, гибриды антитело-образующих клеток друг с другом, а также гибридомы, образованные антитело-продуцирующими и миеломными клетками, могут выживать в этой среде, причём гибриды спленоцитов друг с другом имеют ограниченное время жизни (на протяжении 3–4 пассажей) и отмирают в ходе культивирования, тогда как гибридомы спленоцитов с миеломными клетками (СМ) способны к неограниченному размножению.
Стадия 7. Реклонирование и криоконсервирование гибридом.
Скрининг гибридом проводили методом твердофазного ИФА. Из большого числа активно размножающихся гибридом отбирали гибридомы, активно продуцирующие противовирусные антитела. Для этого в супернатантах гибридом определяли титры специфических антител к вирусу-иммуногену в ИФА. Вирусным материалом (очищенные концентраты), разведённым карбонатно-бикарбонатным буфером (КББ) до концентрации 2–5 мкг/мл, сенсибилизировали планшеты в течение 18 часов при температуре 4°С. После отмывания несвязавшегося антигенного материала 0,01 М фосфатно-солевым буфером (PBS) с добавлением 0,05% Tween 20 (PBS-T), рН 7,2 вносили культуральную жидкость в PBS-T в разведении 1:10 (при тестировании субклонов в 2-х повторах) и инкубировали 1 час при 37°С. Связавшиеся с антигеном антитела детектировали с помощью пероксидазных конъюгатов АТ к IgG мыши (“Sigma-Aldrich”, США) в PBS-T в течение 1 часа при температуре 37°С. Пероксидазную реакцию проявляли добавлением субстратной смеси, содержащей 0,1 мг/мл 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина (ТМБ) и 0,02% Н2О2 в ацетат-цитратном буфере, рН 5,0. После остановки реакции 2N H2SO4 оптическую плотность измеряли на фотометре Multiscan FC при длине волны 450 нм.
Для последующего клонирования отобранных гибридом СМ использовали метод предельных разведений. Клетки гибридомы разводили из расчёта, чтобы на одну лунку планшета приходилось 1–2 клетки, и затем культивировали их, как выше описано, в ростовой среде в инкубаторе с подачей 5–7% СО2 при температуре 36–37°С. Процедуру клонирования повторяли 3–4 раза для каждого избранного клона, продуцирующего специфические антитела. Клоны — стабильные продуценты антител — отбирали для последующего накопления культивированием в ростовой среде с целью накопления клеток в количестве, достаточном для последующего пассажа на сингенных мышах и криоконсервирования.
Стадия 8. Криоконсервирование гибридом.
Криоконсервированию подвергали культуры гибридомных клеток, находящиеся в логарифмической фазе роста, или клетки, выращенные в перитонеальной полости мышей сингенной линии (при получении асцитных жидкостей). Перед замораживанием клетки подвергали микроскопическому анализу на жизнеспособность и бактериологическому исследованию на отсутствие контаминации микрофлорой. Количество живых клеток оценивали по эксклюзии трипанового синего. После центрифугирования при 1000 об/мин концентрацию клеток доводили до 1–2 млн в мл. Для криоконсервирования клеток использовали среду, состоящую из 90% СКРС и 10% ДМСО (“Sigma-Aldrich”, США). Предварительно охлаждённые до температуры –80°С в парах азота криопробирки с клетками помещали в жидкий азот (для многолетнего хранения при температуре –196°С) и хранили в Криобанке гибридом ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России.
Стадия 9. Накопление МКА в асцитах.
Асцитные жидкости мышей линии BALB/c, содержащие МКА, секретируемые гибридомой, получали следующим образом. Для этого мышам-реципиентам за 12–14 дней до инокуляции гибридомы вводили внутрибрюшинно 0,5 мл пристана (“Sigma-Aldrich”, США) (Hoogenraad et al., 1983). Восстановленные клетки гибридомы в количестве 5–10 млн инокулировали в брюшную полость праймированных мышей. Спустя 2–3 недели после образования асцита, контролируемого визуально, делали прокол брюшной стенки и собирали оттекающую жидкость. После центрифугирования асцитов надосадочная жидкость служила источником МКА, а клетки гибридом, прошедшие пассирование на мышах, криоконсервировали. Исследования выполнялись согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 266 МЗ РФ от 19.06.2003).
Концентрации МКА после очистки составили:
Клон 6G1 — 2,03 мг/мл, клон 10A5 — 3,07 мг/мл.
Пример 2
Очистка накопленных моноклональных антител к вирусу гриппа В
Препараты мышиных МКА перед очисткой представляли собой асцитные жидкости мышей, содержащие МКА, секретируемые клетками отобранной гибридомы. Очистку фракции МКА проводили методами аффинной хроматографии и гель-фильтрации. Первый этап очистки МКА методом гидрофобной хроматографии предусматривает удаление большей части белковых примесей из исходных препаратов и получение промежуточных препаратов, содержащих как нативную форму IgG, так и продукты их олигомеризации и деградации. Второй этап очистки предусматривает удаление остаточных белковых примесей, а также агрегатов, димеров и фрагментов IgG из промежуточных препаратов методом гель-фильтрации на колонке с сорбентом высокого разрешения.
Концентрацию IgG определяли при помощи спектрофотометра NanoDrop ND-1000 (“Thermo Fisher Scientific”, США) в режиме IgG (коэффициент молярной экстинции E 1% = 13,70). Результат анализа очищенных препаратов МКА подтверждали методом денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле по методу Лэммли. Гель окрашивали коллоидным кумасси и документировали при помощи системы ChemiDoc MP Imaging System (“Bio-Rad”, США) с последующим денситометрическим анализом. При качественной очистке препарат должен представлять собой две мажорных дорожки — тяжёлая цепь антител представлена на уровне ~ 50 кДа, а лёгкая цепь на уровне ~ 25–30 кДа.
Пример 3
Получение МКА к вирусу гриппа В
Была получена панель из 14 МКА к вирусу гриппа В и проанализированы их диагностические характеристики. Данные о МКА приведены в таблице 1.
Все МКА специфически взаимодействовали в непрямом варианте ИФА с очищенными концентратами современных вирусов гриппа В Ямагатской (B/Massachusetts/2/12 (В/М/2/12)) и Викторианской (B/Brisbane/46/15 (В/Br/46/15)) эволюционных линий при отсутствии перекрёстного реагирования с гетерологичными вирусами гриппа А (результаты представлены на Фиг. 2).
Для характеристики направленности полученных МКА был проведён вестерн-блоттинг с использованием в качестве антигена очищенного концентрата вируса гриппа B/Brisbane/46/15. В случае проведения электрофореза как в нередуцирующих, так и в редуцирующих условиях, на блоте выявлялась полоса с молекулярной массой примерно 64 кДа, что соответствует нуклеопротеину вируса гриппа В (Фиг. 3).
Для оценки способности полученных новых МКА взаимодействовать со штаммами вируса гриппа В различных эволюционных линий и разных лет выделения был проведён мк-ИФА (микрокультуральный ИФА, cell-ELISA) с использованием монослойных культур клеток MDCK, инфицированных вирусами гриппа В. В эксперименте были использованы 3 штамма Ямагатской эволюционной линии, 5 штаммов Викторианской линии и 4 изолята ранних лет выделения (1940–1969 гг.).
По данным мк-ИФА было установлено, что МКА 6G1, 6G4, 8A2, 9D6, 10A5, 10C5 и 11E1 взаимодействуют с вирусами обеих эволюционных линий, но слабо реагируют или не взаимодействуют со штаммами ранних лет выделения. Исключение составляли МКА 6G4, которые связывались с вирусом B/Russia/69, но не со штаммами более ранних лет. МКА 6G2 не взаимодействовали с рядом штаммов Викторианской линии 1985–1997 гг. (B/Minnesota/1/85, B/Victoria/2/87 и B/Shandong/7/97), но выявляли современные штаммы этой ветви и вирусы гриппа В Ямагатской линии.
По результатам мк-ИФА было также установлено, что МКА 1F2, 2/3, 8G1, 9D1, 9E7 и 11D4 взаимодействуют со всеми протестированными штаммами обеих современных эволюционных линий и с «реликтовыми» вирусами гриппа В. Можно предполагать, что данная группа МКА специфична к высококонсервативному эпитопу (эпитопам) нуклеопротеина вируса гриппа В. Во всех случаях не было отмечено неспецифического реагирования разработанных МКА с незаражённой культурой клеток MDCK.
Таким образом, все включённые в исследование МКА направлены к нуклеопротеину вируса гриппа В, взаимодействуют с широким спектром штаммов и могут быть использованы для детекции вирусов гриппа В в разрабатываемой тест-системе.
Как было показано по данным иммуноблоттинга, МКА 6G1 и 10A5 специфически взаимодействуют с NP-белком вируса гриппа В, не взаимодействуя при этом со штаммами гриппа А. Спектр взаимодействия данных МКА был проанализирован методом мк-ИФА. Для этого в лунки планшетов с монослойными культурами клеток MDCK вносили вируссодержащий материал, содержащий 50–100 ТЦД50 гриппа В. После инкубации в СО2-инкубаторе в течение 3 суток при 34°С среду удаляли, клетки в лунках фиксировали 80% холодным ацетоном. На фиксированный клеточный монослой наносили по 100 мкл вирусспецифичных МКА в рабочем разведении (5–10 мкг/мл) и инкубировали 1 ч при 37°С. На следующем этапе в лунки добавляли по 100 мкл козьих антител против IgG мыши (1/10000), меченных пероксидазой (“Sigma-Aldrich”, США), и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Пероксидазную реакцию проявляли добавлением субстратной смеси, содержащей 0,1 мг/мл 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина (ТМБ) и 0,03% Н2О2 в ацетат-цитратном буфере, рН 5,0. После остановки реакции с помощью 2N H2SO4 измеряли оптическую плотность на фотометре при длине волны 450 нм (ОD450).
По результатам мк-ИФА МКА 6G1 и 10A5 показали широкий спектр специфического взаимодействия с референс-штаммами вирусов гриппа В ранних лет выделения, а также со штаммами Ямагатской и Викторианской эволюционных линий, в том числе с вирусами новой генетической подгруппы, подобными B/Colorado/6/17. МКА специфически реагировали со штаммами, выделенными как на куриных эмбрионах, так и в культуре клеток MDCK.
Помимо этого, данные МКА эффективно взаимодействовали с современными штаммами вирусов гриппа В обеих линий, выделенных в ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России. Согласно методу мк-ИФА, МКА 6G1 и 10A5 взаимодействуют со штаммами гриппа В:
Референс-штаммы гриппа В до разделения на линии:
B/Hong Kong/5/72 (E), B/Singapore/222/79 (E), B/Minnesota/1/85 (E).
Референс-штаммы гриппа В Викторианской эволюционной линии:
B/Victoria/2/87 (E); B/Shandong/7/97 (E); B/Shiga/51/98 (E); B/Tokyo/53/99 (E); B/Hong Kong/330/01 (E); B/Malaysia/2506/04 (E); B/Brisbane/60/08 (E); B/Texas/2/13 (E); B/Brisbane/46/15 (E); B/Maryland/15/16 (C), Δ162-163; B/Maryland/15/16 (E), Δ162-163; B/Colorado/6/17 (C), Δ162-163; B/Colorado/6/17 (E), Δ162-163.
Референс-штаммы гриппа В Ямагатской эволюционной линии:
B/Yamagata/16/88 (E), B/Panama/45/90(E), B/Yamanashi/166/98 (E), B/Shanhai/361/02 (E), B/Florida/07/04 (E), B/Florida/04/06 (E), B/Massachusetts/2/12 (E), B/Phuket/3073/13 (E).
Штаммы гриппа В Викторианской эволюционной линии, выделенные из клинических материалов в ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России:
B/Иркутск/4/16 (C), В/СПб/44/17 (E), В/СПб/100/17 (E), В/СПб/124/17 (E), В/СПб/156/17 (E), В/СПб/257/17 (E), В/СПб/120/17 (E), В/СПб/201/17 (E), В/СПб/210/17 (E), В/СПб/225/17 (E), В/СПб/203/17 (E), В/СПб/204/17 (E), В/СПб/104/17 (E), В/СПб/174/17 (E), В/СПб/79/17 (E), В/СПб/80/17 (E), В/СПб/89/17 (E), B/СПб/127/17 (E), B/СПб/238/17 (E), B/СПб/234/17 (E), B/СПб/236/17 (C), B/СПб/200/17 (E), B/СПб/106/17 (E), B/СПб/209/17 (E), В/Астрахань/2/17 (C).
Штаммы гриппа В Ямагатской эволюционной линии, выделенные из клинических материалов в ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России:
B/СПб/115/13 (E), B/СПб/154/15 (E), B/СПб/180/15 (E)
Е – вирусы выделены на куриных эмбрионах, С – вирусы выделены в культуре клеток MDCK.
Пример 4
Определение константы диссоциации МКА 6G1 к белку NP вируса гриппа В (штамм B/Phuket/3073/13 (Yamagata))
Активацию сенсорного чипа СМ5 и иммобилизацию на его поверхность антител 6G1 к белку NP вируса гриппа В (штамм B/Phuket/3073/13 (Yamagata)) проводили в соответствии с инструкцией производителя (“GE Healthcare”, США). Раствор лиганда (моноклональное антитело 6G1) готовили в 10 мМ растворе CH3COONa pH 5,0. Поверхность чипа предварительно активировали обработкой 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлоридом (EDC) и N- гидроксисукцинимидом (NHS) в соотношении 1:1. Далее, в первую ячейку прибора вносили раствор лиганда (50 мкг/мл при скорости потока 10 мкл/мин, время контакта 420 с), иммобилизация которого проходила путём образования ковалентных связей между аминогруппами в полипептидной цепи лиганда и NHS-активированной поверхностью чипа. Затем в первую ячейку вносили 1М раствор этаноламин гидрохлорида-NaOH pH 8,5 для инактивации участков поверхности чипа, не занятых лигандом. Во вторую ячейку прибора вносили только 1М раствор этаноламин гидрохлорида-NaOH pH 8,5 для инактивации поверхности чипа. Таким образом, первая (рабочая) ячейка служила для снятия сигнала взаимодействия лиганд-аналит, вторая (референсная) ячейка служила для снятия фонового сигнала. Увеличение сигнала на 1 RU (Response Unit, единица ответа) соответствовало иммобилизации ≈ 1 пг/мм2 лиганда на поверхность чипа CM5.
Инжектирование аналита (вирус гриппа В, штамм B/Phuket/3073/13 (Yamagata)) проводили в серии двукратных разведений (400; 200; 100; 50; 25; 12.5 нМ). Для регенерации поверхности чипа использовали 10 мМ глицин гидрохлорид pH 2,5.
Связывание антител с анализируемым штаммом вируса гриппа В было изучено путём мониторинга изменения значений RU в ходе построения сенсограммы взаимодействия во времени. Полученные кривые взаимодействия были обработаны с использованием программного обеспечения Biacore X100 Evaluation Software. Сенсограмма взаимодействия МКА 6G1 с анализируемым штаммом вируса гриппа В представлена на Фиг. 4. Диаграмма аффинности моноклональных антител 6G1 к вирусу гриппа В при помощи программного обеспечения Biacore X100 Evaluation Software представлена на Фиг. 5.
Данное взаимодействие было описано кинетикой Лэнгмюра. Так, рассчитанная по данному приближению равновесная константа диссоциации составила KD = 4,33×10–8 М, что свидетельствует о высокоаффинном взаимодействии МКА 6G1 c вирусом гриппа В.
Пример 5
Определение константы диссоциации МКА 10A5 к белку NP вируса гриппа В (штамм B/Phuket/3073/13 (Yamagata))
Активацию сенсорного чипа СМ5 и иммобилизацию на его поверхность антител 10A5 к белку NP вируса гриппа В (штамм B/Phuket/3073/13 (Yamagata)) проводили в соответствии с инструкцией производителя (“GE Healthcare”, США). Раствор лиганда (моноклональное антитело 10A5) готовили в 10 мМ растворе CH3COONa pH 5,0. Поверхность чипа предварительно активировали обработкой 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлоридом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соотношении 1:1. Далее, в первую ячейку прибора вносили раствор лиганда (50 мкг/мл при скорости потока 10 мкл/мин, время контакта 420 с), иммобилизация которого проходила путём образования ковалентных связей между аминогруппами в полипептидной цепи лиганда и NHS-активированной поверхностью чипа. Затем в первую ячейку вносили 1М раствор этаноламин гидрохлорида-NaOH pH 8,5 для инактивации участков поверхности чипа, не занятых лигандом. Во вторую ячейку прибора вносили только 1М раствор этаноламин гидрохлорида-NaOH pH 8,5 для инактивации поверхности чипа. Таким образом, первая (рабочая) ячейка служила для снятия сигнала взаимодействия лиганд-аналит, вторая (референсная) ячейка служила для снятия фонового сигнала. Увеличение сигнала на 1 RU соответствовало иммобилизации ≈ 1 пг/мм2 лиганда на поверхность чипа CM5.
Инжектирование аналита (вирус гриппа В, штамм B/Phuket/3073/13 (Yamagata)) проводили в серии двукратных разведений (400; 200; 100; 50; 25; 12.5 нМ). Для регенерации поверхности чипа использовали 10 мМ глицин гидрохлорид pH 2,5.
Связывание антител с анализируемым штаммом вируса гриппа В было изучено путём мониторинга изменения значений RU в ходе построения сенсограммы взаимодействия во времени. Полученные кривые взаимодействия были обработаны с использованием программного обеспечения Biacore X100 Evaluation Software. Сенсограмма взаимодействия МКА 10A5 с анализируемым штаммом вируса гриппа В представлена на Фиг. 6. Диаграмма аффинности МКА 10A5 к вирусу гриппа В при помощи программного обеспечения Biacore X100 Evaluation Software представлена на Фиг. 7.
Данное взаимодействие было описано кинетикой Лэнгмюра. Так, рассчитанная по данному приближению равновесная константа диссоциации составила KD = 1,51×10–7 М, что свидетельствует о высокоаффинном взаимодействии моноклональных антител 10A5 c вирусом гриппа В.
Описанные МКА могут быть использованы для диагностики, в частности, в диагностических тест-системах, например, в тест-системах по типу «сэндвич»-ИФА или иных тест-системах.
Claims (11)
1. Способ получения мышиных моноклональных антител, специфичных к различным штаммам вируса гриппа В Ямагатской и Викторианской эволюционных линий и имеющих высокую специфичность к NP-белку, включающий:
- получение антитело-продуцирующих спленоцитов;
- накопление клеток мышиной миеломы;
- слияние антитело-продуцирующих спленоцитов с миеломными клетками;
- отбор гибридом;
- инокуляцию клеток гибридомы в брюшную полость праймированных пристаном мышей;
- накопление моноклональных антител в асцитах;
- очистку полученных моноклональных антител,
причем для получения указанных антител использована гибридома-продуцент моноклональных антител, направленных к NP-белку вируса гриппа В, депонированная как 6G1/B под номером РККК(П) 785Д, или гибридома-продуцент моноклональных антител, направленных к NP-белку вируса гриппа В, депонированная как 10А5/В под номером РККК(П) 787Д в Специализированную коллекцию культур клеток ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных» ФГБУН Института цитологии РАН.
2. Способ получения антител по п. 1, специфичных к штаммам вируса гриппа Викторианской эволюционной линии, в частности к B/Victoria/2/87 (Е); B/Shandong/7/97 (Е); B/Shiga/51/98 (Е); B/Tokyo/53/99 (Е); B/Hong Kong/330/01 (Е); B/Malaysia/2506/04 (Е); B/Brisbane/60/08 (Е); B/Texas/2/13 (Е); B/Brisbane/46/15 (Е); B/Maryland/15/16 (С), Δ162-163; B/Maryland/15/16 (Е), Δ162-163; B/Colorado/6/17 (С), Δ162-163; B/Colorado/6/17 (Е), Δ162-163.
3. Способ получения антител по п. 1, специфичных к штаммам вируса гриппа В Ямагатской эволюционной линии, в частности к B/Yamagata/16/88 (Е), B/Panama/45/90(E), B/Yamanashi/166/98 (Е), B/Shanhai/361/02 (Е), B/Florida/07/04 (E), B/Florida/04/06 (E), B/Massachusetts/2/12 (E), B/Phuket/3073/13 (E).
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2018147432A RU2714246C1 (ru) | 2018-12-28 | 2018-12-28 | Моноклональные антитела, специфичные к различным штаммам вируса гриппа в |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2018147432A RU2714246C1 (ru) | 2018-12-28 | 2018-12-28 | Моноклональные антитела, специфичные к различным штаммам вируса гриппа в |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2714246C1 true RU2714246C1 (ru) | 2020-02-13 |
Family
ID=69625985
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018147432A RU2714246C1 (ru) | 2018-12-28 | 2018-12-28 | Моноклональные антитела, специфичные к различным штаммам вируса гриппа в |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2714246C1 (ru) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015120097A2 (en) * | 2014-02-04 | 2015-08-13 | Contrafect Corporation | Antibodies useful in passive influenza immunization, and compositions, combinations and methods for use thereof |
US9745365B2 (en) * | 2014-03-27 | 2017-08-29 | Genentech, Inc. | Anti-influenza B virus hemagglutinin antibodies and methods of use |
-
2018
- 2018-12-28 RU RU2018147432A patent/RU2714246C1/ru active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015120097A2 (en) * | 2014-02-04 | 2015-08-13 | Contrafect Corporation | Antibodies useful in passive influenza immunization, and compositions, combinations and methods for use thereof |
US9745365B2 (en) * | 2014-03-27 | 2017-08-29 | Genentech, Inc. | Anti-influenza B virus hemagglutinin antibodies and methods of use |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
РЫБАЛЬСКИЙ Н.Г., СЕРОВА М.А., ИГНАТЬЕВА Г.А., СТАРЧЕУС А.П. "Моноклональные антитела и гибридомы", Москва: ВАСХНИЛ, 1989, стр.23-44. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6018916B2 (ja) | 抗インフルエンザウイルス中和抗体およびそのスクリーニング方法 | |
US8603467B2 (en) | Monoclonal antibodies binding to avian influenza virus subtype H5 haemagglutinin and uses thereof | |
US9856312B2 (en) | Binding molecule having influenza A virus-neutralizing activity produced from human B cell | |
CA2790949C (en) | Human monoclonal antibodies derived from human b cells and having neutralizing activity against influenza a viruses | |
JP5305427B2 (ja) | インフルエンザウイルスに対する抗体の産生方法 | |
JP5849065B2 (ja) | A型インフルエンザウイルスh5亜型の検出法 | |
JPH09501316A (ja) | 呼吸器合胞体ウイルスに対するモノクローナルIgA抗体 | |
US20100267006A1 (en) | Method for detection of cirulent strain of influenza type-a virus | |
JP5575377B2 (ja) | 抗rsウイルスモノクローナル抗体を用いたrsウイルス検出用キット及びイムノクロマトグラフィー用試験具、並びに新規な抗rsウイルスモノクローナル抗体 | |
CA2856258A1 (en) | Monoclonal antibodies specific for the m2-1 antigen of respiratory syncytial virus (rsv) | |
Gangappa et al. | Kinetics of antibody response to influenza vaccination in renal transplant recipients | |
WO2021183556A1 (en) | Immunotherapeutic compositions and methods of production for coronavirus | |
JP2011069800A (ja) | ヒトインフルエンザウイルスh1亜型の免疫学的鑑別検出法 | |
RU2714246C1 (ru) | Моноклональные антитела, специфичные к различным штаммам вируса гриппа в | |
EP2161576B1 (en) | Method of predicting risk of acquiring influenza | |
Nikkari et al. | One-incubation time-resolved fluoroimmunoassay based on monoclonal antibodies in detection of influenza A and B viruses directly in clinical | |
JP2013049645A (ja) | 口蹄疫ウイルスと反応する抗体、当該抗体を用いて口蹄疫ウイルスを検出する方法、および当該抗体を含んでいるストリップ | |
RU2733379C1 (ru) | Тест-система для диагностики возбудителей острых респираторных вирусных инфекций | |
RU2713340C1 (ru) | Моноклональные антитела, специфичные к различным штаммам респираторно-синцитиального вируса | |
RU2491338C2 (ru) | Применение моноклональных антител для идентификации ямагатской или викторианской эволюционных линий вируса гриппа типа в, штамм гибридомы 4н7 для получения моноклональных антител, предназначенных для определения вирусов гриппа в ямагатской ветви, штамм гибридомы в/4н1 для получения моноклональных антител, предназначенных для определения вирусов гриппа в викторианской ветви | |
CN112912394B (zh) | 针对hrsv的n抗原的单抗,可用于治疗感染、其检测和诊断 | |
RU2726797C1 (ru) | Способ диагностики возбудителей острых респираторных вирусных инфекций | |
US9834594B2 (en) | Human monoclonal antibodies derived from human B cells and having neutralizing activity against influenza A viruses | |
RU2771288C1 (ru) | Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 2E1B5 - продуцент моноклонального антитела к рецептор-связывающему домену белка S вируса SARS-CoV-2 | |
RU2348691C1 (ru) | Штамм вируса паротита драгун для получения антигена-компонента тест-системы и иммуноферментная тест-система для диагностики антител к вирусу паротита |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20200721 Effective date: 20200721 |