CN105745542B - 甲型流感病毒的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了甲型流感病毒的测定方法，该方法是通过使用与广泛的亚型反应性高的抗甲型流感病毒单克隆抗体进行免疫测定。该方法包括通过利用下述抗原抗体反应的免疫测定来测定甲型流感病毒：与甲型流感病毒的基质蛋白(M1)特异性反应的单克隆抗体或其抗原结合性片段与检样中的甲型流感病毒的抗原抗体反应。

Description

甲型流感病毒的测定方法
技术领域
本发明涉及甲型流感病毒的测定方法以及其中所使用的免疫测定器具和单克隆抗体。
背景技术
流感是在冬季流行的传染病，呈现高烧、上呼吸道感染、倦怠感等临床症状，但仅凭这些症状并不容易与腺病毒、RS病毒、副流感病毒、人偏肺病毒(humanmetapneumovirus)等其它病毒引起的传染病区别。
流感的确诊方法有病毒分离、血清学诊断、核酸检测(PCR法)等，但这些方法并不能在诊疗室等日常的医疗现场简便进行，因此人们需求更简便的诊断方法。近年来，人们开发了兼具简便性和迅速性、以免疫层析法为原理的抗原检测试剂，广泛应用于辅助诊断。
流感病毒是以节段状的负链RNA作为基因组基因的病毒，由HA、NA、PA、PB1、PB2、M、NP、NS的8个节段构成。根据所构成的蛋白质中的基质蛋白(M1)和核蛋白(NP)的抗原性的不同，流感病毒被分类为甲型、乙型和丙型。该蛋白质的抗原性各有不同，因此不会在不同的型之间显示交叉反应。
甲型流感病毒的M节段中有M1和M2两种不同的基因被编码，分别由它们合成结构蛋白。这些蛋白质相当于乙型流感病毒的M1和BM2，但甲型的M2与乙型的BM2结构有很大不同。M1是以增强病毒包膜的内侧的形式局部存在，可以认为这实质上起到了壳的作用。
作为流感的治疗药物，使用磷酸奥塞米韦(Oseltamivir Phosphate)、扎那米韦水合物(Zanamivir Hydrate)、培拉米韦水合物(Peramivir Hydrate)、辛酸拉尼米韦水合物(Laninamivir octanoate Hydrate)、盐酸金刚烷胺(Amantadine Hydrochloride)，而作为M2抑制剂的盐酸金刚烷胺并不抑制乙型流感病毒的感染增殖，因此只用于甲型流感的治疗。并且有人指出：前4者是作为神经氨酸酶(NA)抑制剂显示同一作用点的治疗药物，但根据流感类型的不同，解热时间或病毒残留率等的有效性有差异(非专利文献2)。因此，为了之后的适当的治疗药物选择，流感类型的鉴别是很重要的。
即使是甲型流感病毒之间，根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性的不同，也被分类为多种亚型。目前报告有16种HA、9种NA，它们的组合成为宿主动物种类受到限定的原因，作为人的流感病因而已知的除H1N1、H3N2、H1N2、H2N2四种之外，如H5N1或H7N9这样，自其它动物宿主对人传染偶有发生。在以往的免疫测定器具中确认了对各亚型的反应，但是其反应性并不一致，也存在低反应性的亚型。
以往的流感的检测特别使用了抗NP抗体(专利文献1-3)、抗M2抗体(专利文献4)等。还有将与M1发生抗原抗体反应的抗M1抗体用于研究的报告(非专利文献3和4)等，但未应用于以辅助诊断为目的的免疫测定器具。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2007-285749
专利文献2：日本特许4936428号公报
专利文献3：WO2005/007698
专利文献4：日本特许4932940号公报
非专利文献
非专利文献1：ウイルス第56卷 第1号，pp.109-116，2006
非专利文献2：J Infect. 2008 Jan;56(1):51-7. Epub 2007 Oct 15.(Acomparison of the effectiveness of zanamivir and oseltamivir for thetreatment of influenza A and B.(扎那米韦和奥塞米韦对治疗甲型和乙型流感的效果比较))
非专利文献3：Journal of Immunological Methods 第387卷, 第1-2期, 2013年1月31日, 43-50页(Preparation of monoclonal antibodies against poorimmunogenic avian influenza virus proteins(低免疫原性禽流感病毒蛋白的单克隆抗体的制备))
非专利文献4： Virus Genes. 1989 Nov;3(2):111-26.(Monoclonal antibodyanalysis of influenza virus matrix protein epitopes involved in transcriptioninhibition.(流感病毒基质蛋白的转录抑制相关表位的单克隆抗体分析))。
发明内容
发明所要解决的课题
以往的免疫测定方法中使用抗NP单克隆抗体等，但根据甲型流感病毒的亚型不同，反应性较低。
本发明的目的是提供甲型流感病毒的测定方法，该方法通过使用对广范围的亚型反应性高的抗甲型流感病毒单克隆抗体的免疫测定进行。本发明的目的还提供上述本发明的方法中使用的免疫测定器具和单克隆抗体。
解决课题的方案
本发明人进行了深入的研究，结果成功地制作了：以甲型流感病毒的M1为抗原且与甲型流感病毒特异性反应的抗甲型流感病毒单克隆抗体，并进一步发现，通过使用该单克隆抗体来免疫测定甲型流感病毒，也可以测定在以往的使用抗NP单克隆抗体的免疫测定中难以检出的甲型流感病毒亚型，从而完成了本发明。
即，本发明提供甲型流感病毒的测定方法，该测定方法包括通过利用下述抗原抗体反应的免疫测定来测定甲型流感病毒：与甲型流感病毒的基质蛋白(M1)特异性反应的单克隆抗体或其抗原结合性片段与检样中的甲型流感病毒的抗原抗体反应。
本发明还提供免疫测定器具，该免疫测定器具具备：第1抗体或其抗原结合性片段固定于支撑物上的检测区域、将第2抗体或其抗原结合性片段与检样一起供给的标记物区域和检样移动区域，其中，所述第1抗体和第2抗体的至少一方是与甲型流感病毒的基质蛋白(M1)特异性反应的单克隆抗体。本发明进一步提供与甲型流感病毒的基质蛋白(M1)特异性反应的单克隆抗体或其抗原结合性片段。
发明效果
根据本发明的方法，可以免疫测定广范围的亚型的甲型流感病毒。根据本发明，还提供用于上述本发明的方法的新的免疫测定器具和单克隆抗体。
附图简述
图1是示意性表示本发明的免疫层析免疫测定器具的1个优选方案的图。
图2是表示通过蛋白质印迹法研究下述实施例中制备的本发明的单克隆抗体反应性的结果的图。
图3是表示研究下述实施例中制备的本发明的单克隆抗体的反应性的肽阵列分析结果的图。
图4是表示甲型流感病毒各亚型的M1的C末端一侧的氨基酸序列、和下述实施例中制备的本发明的单克隆抗体所结合的区域的图。
实施方明的方案
本发明的单克隆抗体与甲型流感病毒M1(以下简称为A-M1)发生抗原抗体反应。A-M1是由252个氨基酸残基构成的蛋白质，通过在蛋白质印迹法的检测中使用该抗体，可以探测与分子量20-35kD发生抗原抗体反应而产生的特异性信号。本说明书中“特异性”是指在蛋白质与该抗体混合的液体系统中，该抗体不会以可检出的水平与A-M1以外的蛋白质成分发生抗原抗体反应，或者即使发生任何结合反应或缔合反应，也只会发生比该抗体与A-M1的抗原抗体反应明显弱的反应。
优选的方案中，本发明的单克隆抗体与A-M1氨基酸序列的第127-252号的氨基酸区域反应。A-M1氨基酸序列是公知的，例如记载于GenBank：ACD37490等(SEQ ID NO: 1)。图4示出各亚型A-M1氨基酸序列中的第127-252号的氨基酸序列的并列比较。
更优选本发明的单克隆抗体与A-M1氨基酸序列的第173-186号氨基酸区域或第232-241号氨基酸区域结合(参照后述实施例)。
可以以本发明的单克隆抗体为基础，只分离抗原结合位点用于反应。即，按照公知的方法制备的Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体(scFv)等具有特异性的抗原结合性的片段(抗原结合性片段)也包含在本发明的范围内。另外，单克隆抗体的类别并不限于IgG，可以是IgM或IgY。
本发明的单克隆抗体与甲型流感病毒的下述各亚型病毒M1特异性反应：H1N1、H1N2、H2N2、H2N3、H3N2、H3N8、H4N6、H5N1、H5N2、H6N2、H7N1、H7N7、H7N9、H8N4、H9N2、H10N7、H11N6、H12N5、H13N6、H14N5、H15N8和H16N3。更优选与公知的所有甲型流感病毒株的M1特异性反应(参照后述实施例)。
在优选的方案中，本发明中使用的单克隆抗体不与其它传染病的病原体发生特异性的抗原抗体反应。例如不与下述病原体发生抗原抗体反应：乙型流感病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、艾可病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、RS病毒、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、嗜肺性军团病杆菌(Legionella pneumophila)、李斯特菌、绿脓杆菌、沙雷菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、肺炎球菌、化脓性链球菌、B族链球菌、C族链球菌、G族链球菌。
本发明中使用的单克隆抗体可如下获得：采用公知的免疫学方法，用A-M1或其部分肽(包含第127-252号氨基酸区域的多肽或其部分肽)对被免疫动物进行免疫，使用被免疫动物的细胞制作杂交瘤。免疫所使用的肽的长度没有特别限定，优选使用5个氨基酸以上、更优选10个氨基酸以上的肽作为免疫原。
作为免疫原的A-M1可由培养病毒液获得，也可以将编码A-M1的DNA掺入质粒载体，将其导入宿主细胞，使其表达而获得。
作为免疫原的A-M1或其部分肽可以与以下所例举的蛋白质以融合蛋白的形式表达，纯化后或者直接以未纯化的状态用作免疫原。融合蛋白的制备可以利用本领域技术人员作为“蛋白质表达、纯化标签”而常用的谷胱甘肽S转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白(TRX)、Nus标签、S标签、HSV标签、FRAG标签、多聚组氨酸标签等。对于与它们融合的融合蛋白，优选使用消化酶将M1或其部分肽与除此之外的标签部分切断，分离纯化之后用作免疫原。
从免疫的动物制备单克隆抗体可通过周知的Kohler等人的方法(Kohler 等.,Nature, vol, 256, p495-497(1975))容易地进行。即，从免疫的动物回收脾细胞或淋巴细胞等抗体生成细胞，按照常规方法将其与小鼠骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤，将所得杂交瘤通过极限稀释法等进行克隆，从被克隆的各杂交瘤所生产的单克隆抗体中选择与A-M1发生抗原抗体反应的单克隆抗体。
来自腹水或培养上清的单克隆抗体的纯化可以采用公知的免疫球蛋白纯化法。例如可举出：使用硫酸铵或硫酸钠的盐析的分级法、PEG分级法、乙醇分级法、DEAE离子交换色谱法、凝胶过滤法等。还可根据免疫动物种类和单克隆抗体的类别，通过亲和层析法纯化，该方法使用结合了A蛋白、G蛋白、L蛋白的任意一种的载体。
本发明的甲型流感病毒的测定方法中，通过利用下述抗原抗体反应的免疫测定来测定甲型流感病毒：如上所述制备的抗甲型流感病毒M1抗体(以下可简称为“抗A-M1抗体”)或其抗原结合性片段与检样中的甲型流感病毒的抗原抗体反应。作为用于此目的的免疫测定方法，可以采用竞争法、凝集法、蛋白质印迹法、免疫染色法、夹层法等本领域技术人员所周知的任何方法。本发明中，“测定”包括定量、半定量、检出的任意一种。
在以夹层法作为检测原理的免疫测定中，优选抗体1或抗体2中任意一方使用与A-M1氨基酸序列的第127-252号氨基酸区域反应的抗A-M1抗体，其中，所谓的夹层法包括形成含有固定于固相的抗体(抗体1)(以下在实施例之前的记述中，除了根据上下文明显非该含义的情况之外，“抗体”是指“抗体或其抗原结合性片段”)、被标记的抗体(抗体2)和A-M1的复合物的工序。更进一步优选抗体1和抗体2中任意一方使用与A-M1氨基酸序列的第173-186号的氨基酸区域或第232-241号氨基酸区域结合的抗A-M1抗体。还进一步优选抗体1和抗体2中任意一方使用与A-M1氨基酸序列的第173-186号氨基酸区域结合的抗体，另一方使用与A-M1氨基酸序列的第232-241号氨基酸区域结合的抗A-M1抗体。这些抗体当然可同时与A-M1结合。
本发明的单克隆抗体与甲型流感病毒的广范围的亚型以高亲和性结合，但是以往所使用的抗甲型流感病毒的核蛋白(NP)的抗体与一些亚型也可以以高亲和性结合，根据亚型的不同，亦有公知的抗A-NP抗体比本发明的单克隆抗体以更高的亲和性结合。因此，作为免疫测定所使用的抗体，通过制成本发明的单克隆抗体与公知的抗A-NP抗体的混合物，可以进一步提高广范围的亚型的测定灵敏度(参照后述实施例5)。
作为免疫测定，优选夹层法。夹层法本身在免疫测定领域中周知，例如可通过免疫层析法或ELISA法进行。这些夹层法本身均为周知的，除了使用上述本发明的抗A-M1抗体之外，本发明的方法还可通过周知的夹层法进行。
在以夹层法作为检测原理的免疫测定中，固定有抗体的固相只要是可通过公知技术固定抗体的固定相均可使用，例如可任意选择具有毛细管作用的多孔性薄膜(膜)、颗粒状物质、试管、树脂平板等公知的材料。另外，标记抗体的物质可以使用酶、放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色颗粒、胶体颗粒等。
在利用上述各种材料的免疫测定方法中，从临床检查的简便性和迅速性的角度考虑，特别优选使用膜的横流(Lateral Flow)式的免疫测定方法。
本发明也提供可使用抗A-M1抗体以横流式进行免疫测定的免疫测定器具。本发明所提供的免疫测定器具包括：支撑物，该支撑物具有检测区域，该检测区域固定有用于捕获测定对象物(抗原)的抗体(抗体1)；标记物区域，具有可移动的标记抗体(抗体2)；样品垫，用于滴加检样；吸收带，吸收所展开的检样液；背板，用于将这些部件贴合在一起；抗体1和抗体2的至少一方是本发明的抗A-M1抗体。
检测区域的数目和标记物区域所含的标记抗体的种类并不限于1种，通过使用与多个测定对象物对应的抗体，可以通过同一免疫测定器具检测2种以上的抗原。
图1是表示本发明的免疫测定器具的一个优选的方案的图。イ是指支撑物，ロ是指标记物区域，ハ是指检测区域，ニ是指样品垫，ホ是指吸收带，ヘ是指背板。
图1的上图为俯视图，下图为截面图。图例中，在背板上分别层合：形成有2个检测区域的支撑物、吸收带、标记物区域、样品垫。而且如图所示，吸收带的一个端部与支撑物的一个端部、支撑物的另一端部与标记物区域的一个端部、标记物区域的另一端部与样品垫的一个端部分别重叠，由此形成连续的横流的流路。
支撑物是具有将用于捕获抗原的抗体进行固定的性能的材料，且具有不妨碍液体沿水平方向通行的性能。优选为具有毛细管作用的多孔性薄膜，是可通过吸收来运送液体以及其中所分散的成分的材料。形成支撑物的材质没有特别限定，例如可举出：纤维素、硝酸纤维素、醋酸纤维素、聚偏二氟乙烯(PVDF)、玻璃纤维、尼龙、聚酮等。其中更优选使用硝酸纤维素制成薄膜的支撑物。
标记物区域由含有标记抗体的多孔性基材形成，基材的材质可使用通常所使用的玻璃纤维或非织造布等。为了含浸大量的标记抗体，该基材优选为厚度0.3mm-0.6mm左右的垫状。
检测区域是指固定有用于捕获抗原的抗体的支撑物的一部分区域。检测区域设置至少1个固定有用于捕获A-M1抗原的抗A-M1抗体的区域，进一步设有用于检测乙型流感病毒的检测区域，这优选用于实际的辅助诊断。
样品垫是用于滴加检样或使用检样制备的试样的部位，是具有吸水性的多孔性材料。该材料可以使用通常所使用的纤维素、玻璃纤维、非织造布等。为了将大量的检样用于免疫测定，优选为厚度0.3mm-1mm左右的垫状。样品垫和上述的标记物区域不过是功能性的区分，无需采用分别不同的材料。即，设置为样品垫的材料的一部分区域可以具有标记物区域的功能。
吸收带是用于吸收在支撑物上供给而未在检测区域参与反应的成分的材料。该材料可使用由常规的天然高分子化合物、合成高分子化合物等构成的保水性高的滤纸、海绵等，为了促进检样的展开，优选吸水性高的材料。
背板是用于将上述的所有材料(即支撑物、样品垫、标记物区域、吸收带等)部分重叠地贴合·固定的材料。对于背板，只要这些材料以最佳的间隔配置·固定即可，并不是必需，但从制造上或使用上的便利性考虑，通常优选使用。
图1中说明的方案的免疫测定器具中，检样流过由样品垫、标记物区域、支撑物、检测区域、吸收带等一系列的连接形成的多孔性流路。由此在本方案中，所有这些形成检样移动区域。根据各构成材料的材质或形态的不同，检样也可以采取不浸透到材料内部而通行于界面的形态，但是本说明书中所定义的检样移动区域无关材料的内部或界面，因此该方案的免疫测定器具也包括在本说明书的范围内。
根据图1的方案，对本发明的免疫测定器具的使用方法进行叙述。
通过将检样或使用检样制备的试样滴加到样品垫上，开始测定。优选所滴加的检样试样预先用含有表面活性剂的缓冲液稀释为2-20倍左右。
滴加到样品垫上的检样试样通过毛细管作用沿水平方向在标记物区域、支撑物、吸收带上依次展开。在标记物区域，在检样试样展开的同时，标记抗体被释放到液体中，在支撑物上展开。检样试样中存在抗原时，在支撑物的检测区域，抗原被捕获抗体特异性捕获，且抗原通过与标记抗体的特异性反应形成复合物。由此在检测区域，抗体介由抗原形成夹层，可以在检测区域探测标记抗体-抗原复合物。
实施例
以下根据实施例更具体地说明本发明。不过本发明并不限定为下述实施例。
(实施例1)抗甲型流感病毒M1单克隆抗体的制备
1. 甲型流感病毒M1抗原的制备
以通过反转录反应由A/布里斯班/59/2007株病毒RNA构建的cDNA文库为基础，将编码M1的DNA亚克隆到质粒载体上。透气搅拌培养导入了该质粒载体的大肠杆菌株，使M1表达。破碎菌体并离心回收，然后进行层析，由此纯化M1。本说明书中，将该纯化品称为纯化M1抗原。
2. 抗甲型流感病毒M1单克隆抗体的制备
用纯化M1抗原免疫BALB/c小鼠，自饲养了一定时间的小鼠摘出脾脏，通过Kohler等人的方法(Kohler等人, Nature, vol, 256, p495-497(1975))，与小鼠骨髓瘤细胞(P3×63)融合。将所得的融合细胞(杂交瘤)维持在37℃的培养箱中，通过使用固化有纯化M1抗原的板的ELISA来确认上清的抗体活性，同时进行细胞的纯化(单克隆化)。将取得的该细胞株腹腔给予经降植烷处理的BALB/c小鼠，约2周后采集含抗体的腹水。
通过使用A蛋白柱的亲和层析法，从所得腹水中纯化IgG，得到纯化抗甲型流感病毒M1抗体。
(参考例1)
1. 抗甲型流感病毒NP单克隆抗体的制备
用甲型流感病毒抗原免疫BALB/c小鼠，自饲养了一定时间的小鼠摘出脾脏，通过Kohler等人的方法(Kohler等人, Nature, vol, 256, p495-497(1975))，与小鼠骨髓瘤细胞(P3×63)融合。将所得的融合细胞(杂交瘤)维持在37℃的培养箱中，通过使用固化有甲型流感病毒NP抗原的板的ELISA来确认上清的抗体活性，同时进行细胞的纯化(单克隆化)。将取得的该细胞株腹腔给予经降植烷处理的BALB/c小鼠，约2周后采集含抗体的腹水。
通过使用A蛋白柱的亲和层析法，从所得腹水中分别纯化IgG，得到纯化抗甲型流感病毒NP抗体。本说明书中，将该纯化抗体称作抗A-NP抗体。
(实施例2)使用着色聚苯乙烯颗粒的流感病毒抗原检测试剂
1. 抗甲型流感病毒M1抗体在硝酸纤维素膜上的固定
将实施例1中制备的抗A-M1抗体用纯化水稀释至1.0mg/mL，将所得液体以线状涂布于用PET薄膜增强的硝酸纤维素膜的规定位置，在45℃干燥30分钟，得到固定有抗甲型流感病毒M1抗体的膜。本说明书中称为固定有抗M1抗体的膜。
2. 抗甲型流感病毒NP抗体在硝酸纤维素膜上的固定
使用参考例1中制备的抗NP抗体，按照与上述实施例2-1同样的方法得到固定有抗甲型流感病毒NP抗体的膜。本说明书中称为固定有抗NP抗体的膜。
3. 抗甲型流感病毒M1抗体和抗甲型流感病毒NP抗体在硝酸纤维素膜上的固定
将实施例1中制备的抗A-M1抗体和参考例1中制备的抗A-NP抗体按规定比例混合，用纯化水稀释至1.0mg/mL，将所得液体以线状涂布于用PET薄膜增强的硝酸纤维素膜的规定位置，在45℃干燥30分钟，得到固定有抗甲型流感病毒M1抗体+抗甲型流感病毒NP抗体的膜。本说明书中称为固定有抗M1+NP抗体的膜。
4. 抗甲型流感病毒M1抗体在着色聚苯乙烯颗粒上的固定
将实施例1中制备的抗A-M1抗体用纯化水稀释至1.0mg/mL，向其中加入着色聚苯乙烯颗粒，使浓度为0.1%，搅拌后加入碳二亚胺，使浓度为1%，进一步搅拌。通过离心操作除去上清，再悬浮于50mM Tris(pH9.0)、3%BSA中，得到结合有抗甲型流感病毒M1抗体的着色聚苯乙烯颗粒。本说明书中称为固定有抗M1抗体的颗粒。
5. 抗甲型流感病毒NP抗体在着色聚苯乙烯颗粒上的固定
使用参考例1中制备的抗A-NP抗体，按照与上述实施例2-3同样的方法，得到结合有抗甲型流感病毒NP抗体的着色聚苯乙烯颗粒。本说明书中称为固定有抗NP抗体的颗粒。
6. 抗甲型流感病毒M1抗体和抗甲型流感病毒NP抗体在着色聚苯乙烯颗粒上的固定
将实施例1中制备的抗A-M1抗体和参考例1中制备的抗A-NP抗体按规定比例混合，用纯化水稀释至1.0mg/mL，向其中加入着色聚苯乙烯颗粒，使浓度为0.1%，搅拌后加入碳二亚胺，使浓度为1%，进一步搅拌。通过离心操作除去上清，再悬浮于50mM Tris(pH9.0)、3%BSA中，得到结合有抗甲型流感病毒M1抗体+抗甲型流感病毒NP抗体的着色聚苯乙烯颗粒。本说明书中称为固定有抗M1+NP抗体的颗粒。
7. 结合有抗甲型流感病毒抗体的着色聚苯乙烯颗粒的涂布·干燥
将4和5中制备的固定有抗体的颗粒以规定量1.0μg涂布在玻璃纤维非织造布上，在45℃干燥30分钟。本说明书中称为干燥垫。
另外，与上述分开，将6中制备的固定有抗M1+NP抗体的颗粒以规定量1.0μg涂布在玻璃纤维非织造布上，在45℃干燥30分钟。本说明书中称为M1+NP干燥垫。
8 . 甲型流感病毒试验片的制备
将1和2中制备的固定有抗体的膜和7中制备的干燥垫与其它材料(背板、吸收带、样品垫)贴合，切裁成5mm宽，制成甲型流感病毒试验片。本说明书中称为M1试验片。在贴合时，形成固定有抗体的膜和干燥垫的至少一方含有抗A-M1抗体的组合，由此制备M1试验片。
另外，与上述分开，将3中制备的固定有抗M1+NP抗体的膜和7中制备的M1+NP干燥垫与其它材料(背板、吸收带、样品垫)贴合，切裁成5mm宽，制成甲型流感病毒M1+NP试验片。本说明书中称为M1+NP试验片。
9. 甲型流感病毒抗原的检测
在8中制备的M1试验片和M1+NP试验片的样品垫上滴加60μL含有甲型流感病毒抗原的检样悬浮液(10mM ADA)(pH6.0)、2%聚氧乙烯鲸蜡基醚、1%聚氧乙烯辛基苯基醚、0.25M氯化钾和0.25M氯化锂、3%BSA)，静置8分钟。与抗原反应的固定有抗体的颗粒在固定有抗体的膜的抗体涂布位置被捕获，可目视确认由此产生的显色时则判定为＋。无法目视确认显色时判定为－。本试验中，在所有组合的试验片、即固定有抗体的膜和干燥垫的一方或两方含有抗A-M1抗体时均为＋。
(实施例3)抗A-M1抗体的抗原识别区域(表位)的分析
1. 甲型流感病毒重组M1的制备
以实施例1-1中构建的cDNA文库为基础，将编码M1氨基酸序列第1-126号的DNA和编码第127-252号的DNA分别亚克隆到质粒载体上。通过透气搅拌培养，使导入了该质粒载体的大肠杆菌表达重组M1。将菌体破碎，通过离心回收，然后进行层析，由此纯化重组M1。本说明书中，将包含前者的氨基酸序列的重组M1称为M1-N，将包含后者的氨基酸序列的重组M1称为M1-C。
2. 通过蛋白质印迹法确认反应性
使用A/新喀里多尼亚/20/99株、M1-N、M1-C，确认了实施例1所得的抗体的反应性。SDS-PAGE是使用10%丙烯酰胺凝胶，按照常规方法进行。电泳后转印PVDF膜。用脱脂乳进行封闭，然后用PBS-Tween充分洗涤。将用PBS-Tween调节为1μg/mL的抗A-M1抗体在室温下反应1小时。用PBS-Tween充分洗涤，然后将稀释为3000倍的HRP标记抗小鼠抗体在室温下反应1小时。用PBS-Tween充分洗涤后，使用化学发光检测试剂检测信号。经确认，所试验的抗体与A/新喀里多尼亚/20/99株反应，不与M1-N反应，与M1-C反应。结果如图2所示。
3. 通过肽阵列分析表位
为了更详细地明确表位，使用了由M1-C进一步细分化的肽。该肽包含M1-C序列中的10或11个连续的氨基酸序列，以一定间隔固定在纤维素膜上。该肽的序列和规定的位置编号如表1所示。膜用脱脂乳进行封闭，然后用TBS-Tween充分洗涤。将用TBS-Tween调节为1μg/mL的抗A-M1抗体在室温下反应1小时。用TBS-Tween充分洗涤，然后将稀释为3000倍的HRP标记抗小鼠抗体在室温下反应1小时。用TBS-Tween洗涤后用TBS充分洗涤，用化学发光检测试剂检测信号。结果如图3所示。抗体a与位置编号10和11的肽反应，抗体b与位置编号22的肽反应。推定为抗体a和抗体b的表位的氨基酸序列如图4所示。
(实施例4)使用免疫测定器具的甲型流感病毒各亚型株的免疫测定
1. 包含抗A-M1抗体的免疫测定器具的制备
按照与实施例2所述的方法同样地制备在固定有抗体的膜和干燥垫上使用实施例3-3的抗体a和抗体b的试验片(本发明器具1)。
2. 包含抗NP抗体的免疫测定器具的制备
作为对照，按照与实施例2-6同样的方法制备使用固定有抗NP的膜和固定有抗NP的颗粒的试验片(以往器具)。
3. 甲型流感病毒各亚型株的免疫测定
在1中制备的免疫测定器具的样品垫上滴加50μL含有甲型流感病毒抗原的检样悬浮液，静置8分钟。与抗原反应的固定有抗体的颗粒在固定有抗体的膜的抗体涂布位置被捕获，可目视确认由此产生的显色时则判定为＋。无法目视确认显色时则判定为－。本发明的单克隆抗体在甲型流感病毒的下述各亚型病毒测定中均为＋：H1N1、H2N2、H2N3、H3N2、H3N8、H4N6、H5N1、H5N2、H6N2、H7N1、H7N7、H7N9、H8N4、H9N2、H10N7、H11N6、H12N5、H13N6、H14N5、H15N8和H16N3。
4. 与甲型流感病毒各亚型株的反应性比较
使用1和2中制备的免疫测定器具，按照与3同样的方法进行免疫测定，比较本发明器具1和以往器具的反应性。对于以往器具无法检出的7个亚型(12病毒株)，确认本发明器具1全部检出，与以往器具相比显示高检测灵敏度。结果如表2所示。
(实施例5)甲型流感病毒M1试验片和甲型流感病毒NP试验片以及甲型流感病毒M1+NP试验片对甲型流感病毒的检测灵敏度的比较
1. 包含抗A-M1抗体和抗A-NP抗体的免疫测定器具的制备
直接使用实施例2-8中制备的M1+NP试验片(本发明器具2)。
2. 包含抗A-M1抗体的免疫测定器具和包含抗A-NP抗体的免疫测定器具的制备
作为对照，直接使用实施例4-1、2中制备的本发明器具1和以往器具。
3. 使用各测定器具的甲型流感病毒的检测灵敏度比较
在1和2中制备的各免疫测定器具的样品垫上分别滴加50μL将甲型流感病毒(A/新喀里多尼亚/20/99)适当稀释而含有的检样悬浮液，静置8分钟。与抗原反应的固定有抗体的颗粒在固定有抗体的膜的抗体涂布位置被捕获，可目视确认由此产生的显色时判定为＋。无法目视确认显色时则判定为－。结果，本发明器具1比以往器具的检测灵敏度低，但本发明器具2可获得接近于以往器具的性能。由此表明，根据甲型流感病毒株的不同，检测NP时有时可以以高灵敏度检测，但是通过将M1检测和NP检测结合，显示可以缓和菌株带来的不同。结果如表3所示。
[表3]
标记说明
イ 支撑物
ロ 标记物区域
ハ 检测区域
ニ 样品垫
ホ 吸收带
ヘ 背板

Claims (8)

1.甲型流感病毒的测定方法，该方法包括通过利用下述抗原抗体反应的免疫测定来测定甲型流感病毒：与甲型流感病毒的基质蛋白M1的第173-186号氨基酸区域特异性反应的单克隆抗体或其抗原结合性片段、和与甲型流感病毒的基质蛋白M1的第232-241号氨基酸区域特异性反应的第2单克隆抗体或其抗原结合性片段，与检样中的甲型流感病毒的抗原抗体反应。
2.权利要求1所述的方法，其中，所述单克隆抗体与甲型流感病毒的下述各亚型病毒发生抗原抗体反应：H1N1、H1N2、H2N2、H2N3、H3N2、H3N8、H4N6、H5N1、H5N2、H6N2、H7N1、H7N7、H7N9、H8N4、H9N2、H10N7、H11N6、H12N5、H13N6、H14N5、H15N8和H16N3。
3.权利要求1或2所述的方法，其中，所述免疫测定是夹层法。
4.权利要求3所述的方法，其中，所述免疫测定是免疫层析法。
5.权利要求1所述的方法，其中，该方法使用下述两者的混合物：与甲型流感病毒的基质蛋白M1特异性反应的单克隆抗体或其抗原结合性片段，以及与甲型流感病毒的核蛋白特异性反应的单克隆抗体或其抗原结合性片段。
6.免疫测定器具，其具备：第1抗体或其抗原结合性片段固定于支撑物上的检测区域，将第2抗体或其抗原结合性片段与检样一起供给的标记物区域，以及检样移动区域；其中，所述第1抗体和第2抗体是与甲型流感病毒的基质蛋白M1的第173-186号氨基酸区域特异性反应的单克隆抗体、和与甲型流感病毒的基质蛋白M1的第232-241号氨基酸区域特异性反应的单克隆抗体。
7.单克隆抗体或其抗原结合性片段，其包含：与甲型流感病毒的基质蛋白M1的第173-186号氨基酸区域特异性反应的单克隆抗体或其抗原结合性片段，和与甲型流感病毒的基质蛋白M1的第232-241号氨基酸区域特异性反应的单克隆抗体或其抗原结合性片段。
8.权利要求7所述的单克隆抗体或其抗原结合性片段，其与甲型流感病毒的下述各亚型病毒发生抗原抗体反应：H1N1、H1N2、H2N2、H2N3、H3N2、H3N8、H4N6、H5N1、H5N2、H6N2、H7N1、H7N7、H7N9、H8N4、H9N2、H10N7、H11N6、H12N5、H13N6、H14N5、H15N8和H16N3。
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