CN103265606B - 一种常春藤皂苷元酰胺衍生物及其制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种常春藤皂苷元酰胺衍生物，该常春藤皂苷元酰胺衍生物为N-(3-二甲氨基丙基)-常春藤皂苷元-17-甲酰胺。本发明的一种常春藤皂苷元酰胺衍生物，在常春藤皂苷元的28位引入3-二甲氨基丙胺，因为氨基的存在与靶标形成氢键提高了其生物活性，使其抗抑郁的效果更佳，同时，通过大量实验，证明N-(3-二甲氨基丙基)-常春藤皂苷元-17-甲酰胺还在神经保护以及抗肿瘤方面有着很好的作用。本发明得出神经可塑性与抑郁密切相关，而BDNF与抑郁具有一定的相关性，且BDNF 有利于神经可塑性的恢复，本发明还公开了从BDNF和神经可塑性的角度研究了HGA神经保护作用的机制。

Description

一种常春藤皂苷元酰胺衍生物及其制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及医药的技术领域，特别涉及一种常春藤皂苷元酰胺衍生物及其制备方法及其应用。
背景技术
预知子是木通科植物木通、三叶木通或白木通的干燥近成熟的果实。中医认为其味苦，性平，具有舒肝理气，活血止痛，软坚散结的功效。常春藤皂营元(Hederagenin)是预知子主要成分三萜皂苷成分水解后的主要产物。Fructus Akebiae extracts (FAE)和常春藤皂苷元均具有一定的抗抑郁活性，然而其水溶性较差，抗抑郁生物活性不高。
常春藤皂苷元的抗抑郁作用机制与靶点尚不明确，在总结前人对常春藤皂苷元及其类似物结构改造经验的基础上，我们希望通过氨基的存在与靶标形成氢键以提高其生物活性，从而制造出一种抗抑郁生物活性高的常春藤皂苷元酰胺衍生物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供种常春藤皂苷元酰胺衍生物，这种衍生物用于神经保护、抗抑郁以及抗肿瘤效果明显。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
一种常春藤皂苷元酰胺衍生物，其中：该常春藤皂苷元酰胺衍生物为N-(3-二甲氨基丙基)-常春藤皂苷元-17-甲酰胺，通式为                                                。
采取的措施还包括：
上述的N-(3-二甲氨基丙基)-常春藤皂苷元-17-甲酰胺内的3-二甲氨基丙基为在常春藤皂苷元的28位引入3-二甲氨基丙胺形成。
一种常春藤皂苷元酰胺衍生物的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将常春藤皂苷元0.4mmol以及N-羟基琥珀酰亚胺0.6mmol加入10ml四氢呋喃中，室温下搅拌反应，直至溶液变得澄清；
步骤二、在溶液中加入1.2mmol的N,N’-二环己基碳二亚胺，封闭状态下继续室温搅拌，采用薄层色谱法跟踪反应情况，直至反应完毕；
步骤三、停止搅拌，用滤纸过滤除去溶液中的白色沉淀物，得中间体活化酯的澄清溶液；
步骤四、将中间体活化酯的澄清溶液在搅拌状态下逐滴加入至1.44mmol的3-二甲氨基-1-丙胺中，然后，再加入3mmol三乙胺在常温下搅拌反应；
步骤五、用薄板色谱跟踪步骤四的反应情况，待反应完毕，经柱层析色谱分离得N-(3-二甲氨基丙基)-常春藤皂苷元-17-甲酰胺。
步骤三与步骤四之间设有检测步骤，所述的检测步骤为：对中间体活化酯的澄清溶液进行减压蒸馏，进行柱色谱分离后得白色粉末，经质谱检测，确认得到了白色粉末为活化酯粉末。
步骤三中白色沉淀物采用四氢呋喃冲洗，并将冲洗后的溶液并入中间体活化酯的澄清溶液中。
一种常春藤皂苷元酰胺衍生物的应用，特征是应用于神经保护的药物。
一种常春藤皂苷元酰胺衍生物的应用，特征是应用于抗抑郁的药物。
一种常春藤皂苷元酰胺衍生物的应用，特征是应用于抗肿瘤的药物。
与现有技术相比，本发明的一种常春藤皂苷元酰胺衍生物，在常春藤皂苷元的28位引入3-二甲氨基丙胺，因为氨基的存在与靶标形成氢键提高了其生物活性，使其抗抑郁的效果更佳，同时，通过大量实验，证明N-(3-二甲氨基丙基)-常春藤皂苷元-17-甲酰胺还在神经保护以及抗肿瘤方面有着很好的作用。海马与抑郁密切相关，抑郁病人的海马萎缩，突触数量减少，神经元受到损伤。抑郁症患者HPA轴受损，常伴有皮质醇浓度的升高。而应用慢性皮质酮暴露可以在动物水平造成抑郁模型，并可用于细胞水平造模。以原代培养的SD大鼠1d龄乳鼠的海马神经元为研究对象，筛选出皮质酮造成神经元损伤的合适浓度，然后探讨了HGA对皮质酮所造成神经元损伤的保护作用，并与其母体化合物HG做了对比。在动物水平，应用急性给药的方式研究了HGA的抗抑郁效果。得出神经可塑性与抑郁密切相关，而BDNF与抑郁具有一定的相关性，且BDNF 有利于神经可塑性的恢复，本研究了从BDNF和神经可塑性的角度研究了HGA神经保护作用的机制。
附图说明
图1是本发明的常春藤皂苷元酰胺衍生物合成路线图；
图2是中间体活化酯的质谱分析图；
图3是通过本发明制备方法制备出的化合物的质谱分析图；
图4是通过本发明制备方法制备出的化合物的核磁氢谱图一；
图5是通过本发明制备方法制备出的化合物的核磁氢谱图二；
图6是通过本发明制备方法制备出的化合物的核磁碳谱图一；
图7是通过本发明制备方法制备出的化合物的核磁碳谱图二；
图8是HGA的高效液相色谱图；
图9是皮质酮(10μmol·L-1)对原代培养的海马神经元的损伤图；
图10是HGA对BDNF的表达的影响图；
图11是HGA对突触素的表达的影响图；
图12是24h的HGA处理对鼻咽癌细胞5-8F抑制作用示意图；
图13是48h的HGA处理对鼻咽癌细胞5-8F抑制作用示意图；
图14是72h的HGA处理对鼻咽癌细胞5-8F抑制作用示意图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
一种常春藤皂苷元酰胺衍生物，其中：该常春藤皂苷元酰胺衍生物为N-(3-二甲氨基丙基)-常春藤皂苷元-17-甲酰胺，简写为HGA，通式为。
N-(3-二甲氨基丙基)-常春藤皂苷元-17-甲酰胺内的3-二甲氨基丙基为在常春藤皂苷元的28位引入3-二甲氨基丙胺形成。
在制备本发明的N-(3-二甲氨基丙基)-常春藤皂苷元-17-甲酰胺时，需要用到的实验仪器与试剂有：
核磁共振仪测定(TMS为内标，CD3OD为溶剂)；旋转蒸发仪，电子天平，循环水式真空泵，液相色谱仪，四元低压梯度泵，自动进样器，二极管阵列检测器，色谱工作站，4.6mm×250mm Agela18C色谱柱电热真空干燥箱，电磁搅拌器，柱层析用硅胶(200-300目)，常春藤皂苷元，N,N’-二环己基碳二亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺，3-二甲氨基-1-丙胺，其它溶剂均为国产分析纯或化学纯试剂。
合成路线如图1所示，在常春藤皂苷元酰胺衍生物N-(3-二甲氨基丙基)-常春藤皂苷元-17-甲酰胺(HGA)的合成过程中，在综合前期文献的基础上本研究采用了两步法。首先用DCC/NHS形成活化酯，然后再加入3-二甲氨基丙胺进行反应，合成目标化合物。
常春藤皂苷元酰胺衍生物(HGA)中间体的合成及结构表征：
在25ml的干净的小烧瓶中放入常春藤皂苷元0.1890g(0.4mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.0690g(0.6mmol)，四氢呋喃(THF)10ml，室温下搅拌反应，大约反应6min以后溶液变得澄清。加入N,N’-二环己基碳二亚胺(dicyclohexyl-carbodiimide，DCC)0.2475g(1.2mmol)，(化学计量摩尔比1：1.5：3)，封闭状态下继续室温搅拌，薄层色谱法(TLC，二氯甲烷：甲醇=100：8)跟踪反应情况，24h后TLC检测显示反应基本进行完毕。停止搅拌，然后，用滤纸过滤除去二环己基尿(DCU)白色沉淀，并用四氢呋喃冲洗一次(洗掉白色沉淀中残留的活化酯)，得中间体活化酯的澄清溶液。经减压蒸馏以后，进行柱色谱分离可得白色粉末状活化酯。经质谱检测，初步确认得到了活化酯以后，由于本合成实验步骤较少，本实验没有对中间产物活化酯进行进一步的结构表征。由于活化酯不稳定，室温下容易变质，故在反应时，通常在得到活化酯的溶液以后，不经纯化直接开始下一步反应。并在反应完毕以后，对最终的目标化合物HGA进行较详细的结构表征和纯度检测。
常春藤皂苷元酰胺衍生物(HGA)的合成：
取50ml的三口烧瓶，放入3-二甲氨基-1-丙胺0.18ml(1.44mmol)，搅拌状态下，将上一步中得到的，未经纯化的，活化酯溶液慢慢滴加到小烧瓶中，然后，缓慢加入三乙胺0.42ml(3mmol)，在常温下搅拌反应，用TLC跟踪反应情况，24h后TLC检测显示已基本反应完毕。经柱层析色谱分离得目标产物。总收率51.0%。
中间体活化酯的质谱分析：
中间体活化酯的相对分子质量是569.79，在图2质谱图上显示了其加钠峰[M+Na]+=592.9。利用质谱初步确定得到了中间体活化酯。
的质谱分析：
计算可知HGA的相对分子质量是556.86，图3质谱图所显示的的分子离子峰是558.0([M+H]+)。因此通过相对分子质量可以初步确定成功合成出了目标化合物HGA。
目标化合物HGA的核磁氢谱图：
利用核磁氢谱，如图4至图5所示，对化合物HGA进行了结构表征如下，1H-NMR(CD3OD):δ5.26(t,J=3.4Hz,1H,C=C-H)，3.99(dd,J 1 =14Hz,J 2 =7.2Hz,1H),3.48–3.52(m,1H),3.41(d,J=10.8,1H),3.05-3.11(m,1H),2.91(t,J=7.2Hz,2H),2.71(s,6H,NMe2),1.91(s,1H),1.05–1.43(m,22H),0.78–0.95(m,18H),0.686(3H,s,CH3),0.596(3H,s,CH3)。
目标化合物HGA的核磁碳谱图：
13C-NMR(CD3OD)谱，如图6至图7所示。图中显示了35个碳原子，而HGA具有分子式为C35H60N2O3，因而所得到的化合物的碳原子个数与HGA相吻合，并且与化合物HGA的结构特点相一致的是，含有化学位移在180.02的羰基碳信号峰，和化学位移在143.67，122.65的双键碳信号峰，与HGA的结构相吻合。δ180.02(C=O),143.67(C=C),122.65(C=C),72.30,65.76,60.07,55.38,46.20,46.10,42.22,41.82,41.51,40.99,39.20,37.97,36.43,35.90,33.58,33.20,33.02,31.81,30.14,27.06,25.93,25.03,24.87,23.06,22.57,22.44,19.38,17.62,16.56,14.78,12.98,11.24。
综上所述，结合质谱，核磁氢谱和核磁碳谱，确认成功得到了目标产物HGA。
高效液相检测化合物的纯度检测：
精密称取6mg的常春藤皂苷元酰胺衍生物HGA，用色谱甲醇稀释至6ml，配成1g·L-1的溶液，经微孔滤膜过滤，然后稀释成0.2g·L-1的溶液。
以十八烷基键合硅胶为填充剂；进样量为20μl；流动相为甲醇-水-冰醋酸-乙二胺(87：13：0.04：0.02)；运行时间为70min；检测波长为210nm；流速为0.8ml·min-1；柱温为25℃。结果如图8所示，图8是浓度为0.2g·L-1HGA的高效液相色谱图(HPLC)，HGA的出峰时间tR=59.09min，峰面积为5447.66，23.48min所出的杂质峰的峰面积为342.95。
常春藤皂苷元含量测定：
通过面积归一化法，算得N-(3-二甲氨基丙基)-常春藤皂苷元-17-甲酰胺(HGA)的纯度为：5447.66/(5447.66+342.95)=94.08%。
的神经保护作用研究：
实验材料：
SD大鼠1d龄的乳鼠、Neurobasal A、B27、Glutamax、胰酶、DNA酶、MTT、皮质酮、胎牛血清、阿糖胞苷，草酸艾司西酞普兰、Hoechst33342、PI、anti-NeuN(1:100)、DyLight 594-AffiniPure donkey anti-Mouse IgG、多聚赖氨酸、双抗、PBS。
仪器设备和材料：
超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、离心机、酶标仪、电子天平、超声波清洗器、恒温水浴锅、平板震荡仪、纯水系统、鼓风电热恒温箱、pH计、移液器、细胞培养皿、Triton X-100、叠氮钠、mouse anti-NeuN(1:100)、DyLight 594-AffiniPure donkey anti-Mouse IgG。
实验溶液的配置：
双抗的配制：
用10ml的Hanks液或三蒸水溶解100万单位的硫酸链霉素(相当于1g)，取8ml以上所配制的硫酸链霉素溶液溶解80万单位(相当于0.48g)的青霉素粉(青霉素G，1国际单位(IU)=0.6微克青霉素G钠洁净纯粉，或0.625微克的钾盐)。最终配成每毫升青链霉素10万单位的母液。
表1：使用时1ml培养基中加10微升，则青链霉素各位105U·L-1。
水 硫酸链霉素 硫酸链霉素溶液 青霉素G钠 母液
10ml 1g 8ml 0.48g 108U·L-1
Phosphate buffer solution(PBS)的配制：
NaCl，8g；KCl，0.2g，Na2HPO4·12H2O，2.89g；KH2PO4，0.2g用三蒸水定容至1升，高压灭菌后，4℃保存。
MTT的配制：称MTT粉末0.5g，溶于100ml的0.01m的PBS中制成浓度为5.0g/L的溶液，室温条件下，避光搅拌至完全溶解，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后分装。避光保存于-20℃。
0.25%胰酶的配制：称胰蛋白酶0.25g，溶解于30ml的0.01m的PBS中，室温磁力搅拌3h后定容至100ml，过滤分装，放-20℃长期保存，平时使用时，置4℃保存。
DNA酶的配制，用冰冷的PBS配置DNA酶，使终浓度为107U·L-1，配制好以后分装，储存在-20℃。
细胞处理方案：
将1d龄SD大鼠乳鼠海马神经元，以1×109~1×1010·L-1每孔100μL接种于预先用多聚赖氨酸包被好的96孔板上(只接种中间的60个孔)，在原代培养的第8d，按预先设计的给药方案以半换液的方式给药(因为是半换液，注意在配药时，要使所配置药物的浓度翻倍)。
皮质酮对海马神经元的损伤：
在细胞培养箱中培养8d后的神经元中加入药物后，按照MTT进行检测皮质酮对原代神经元造成的损伤情况，筛选出适合造模的皮质酮浓度。
在参考前期参考文献的基础上本研究设定了0.1μmol·L-1，1μmol·L-1，10μmol·L-1，25μmol·L-1，50μmol·L-1，100μmol·L-1，200μmol·L-16个浓度去筛选在本模型中皮质酮对神经元造成损伤的适宜浓度。加入皮质酮作用24h后，用MTT法检测皮质酮对海马神经元造成损伤的情况。
对皮质酮造成的海马神经元损伤的保护作用：
在预实验的基础上，对HGA本研究选取了1μmol·L-1，0.1μmol·L-1，0.01μmol·L-1，4个浓度，对HG本研究选取了20μmol·L-1，1μmol·L-1，和ESC(西酞普兰)5μmol·L-1，作为阳性对照，检测HGA对皮质酮造成的海马神经元损伤的保护作用，并与其母体化合物以及阳性对照药物ESC作对照，并且在加药时，采取同时加入皮质酮和治疗药物(ESC，HG，HGA)的加药方法，作用24h后，采用MTT法检测细胞活力。
细胞活力检测(MTT法)：
采用MTT法测定细胞相对活力。MTT法检测细胞活力的原理是：活细胞的线粒体脱氢酶(如琥珀酸脱氢酶和心肌黄酶)可以将MTT还原成蓝紫色的甲瓒(Formazan)，而死细胞或活力低下的细胞不能，因而可用比色法检测细胞浓度。甲瓒产生的量与细胞数成正比，活化的细胞比静止的细胞产生更多甲瓒，MTT法操作简单，价格便宜，其最大优点是不需要任何洗涤步骤，可以完成样品的批量检测，并且灵敏度较高。
细胞处理完毕后，在每个孔中加入10μlMTT液(5.0g·L-1)然后放回孵养箱中，继续孵育(加MTT时按照每组一个依次添加的方式进行添加)，4h后，轻轻吸走上清，每个孔中加入150μl(按照每组一个的方式依次添加)的二甲基亚砜(DMSO)，然后拿到细胞室外的摇床上，震摇10-15min至结晶完全溶解。用酶标仪检测570nm处的吸光度值。细胞存活率=A570(处理组)/A570(空白对照组)×100%。
统计学处理：
实验数据用±s表示，本实验全部使用SPSS13.0统计软件对神经元相对活力进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)。首先，进行方差齐性检验，若方差齐，则组间比较采用LSD法；若方差不齐，则采用Welch法，多重比较采用Dunnett’s T3法。P<0.05为差异具有统计学意义。
不同浓度皮质酮对原代培养SD大鼠的乳鼠神经元的损伤结果：
One-way ANOVA的结果显示200μmol·L-1~10μmol·L-1的皮质酮在作用原代海马神经元24h后，均能使神经元细胞活力明显下降(F=41.285，P=0.000)，形态学的观察也得到了相似的结论。与正常对照组相比，10μmol·L-1(如图9、表2所示)的皮质酮处理原代神经元24h以后，倒置显微镜观察到CORT模型组有出现大量细胞死亡后的细胞碎片，存活的细胞和轴突变细、甚至消失，细胞活力显著下降(P=0.001)。
据此，10μM的皮质酮损伤海马神经元24h可以作为本实验中皮质酮造成海马神经元损伤的适宜浓度。在接下来的验证HGA对神经元的保护作用实验中，采用10μmol·L-1的皮质酮作用于神经元24h作为损伤神经元的造模方法。
表2不同浓度的皮质酮对原代培养的海马神经元的影响：
Group n Cell survival(%)
VEH 3 100.000±4.386
CORT 0.1μM 3 95.754±5.521
CORT 1μM 3 93.539±3.918
CORT 10μM 3 85.071±5.284**
CORT 25μM 3 81.108±4.154**
CORT 50μM 3 68.308±5.264**
CORT 100μM 3 62.769±4.480**
CORT 200μM 3 48.677±4.819**
F   42.947
P   0.000
**P<0.01versus VEH group(One-way ANOVA)。
对皮质酮造成的原代海马神经元损伤的保护作用：
One-way ANOVA的结果分析显示(表3)，10μmol·L-1(P=0.002)的皮质酮对体外培养8d的SD乳鼠海马神经元进行损伤24h后，海马原代神经元的细胞活力显著下降，1μmol·L-1的HG(P=0.866)不能对神经元产生显著的保护作用，而经结构改造以后的化合物HGA则可以在1μmol·L-1(P=0.001)的浓度下对神经元产生显著的保护作用。此外，0.1μmol·L-1(P=0.042)的HGA也可以对皮质酮造成的损伤产生显著的逆转作用。
表3：不同浓度的HGA对皮质酮造成的原代海马神经元损伤的影响：
Group n Cell survival(%)
VEH 3 100.000±6.317
CORT 10μM 3 83.601±5.459**
CORT 10μM+ESC5μM 3 98.089±6.292##
CORT 10μM+HG20μM 3 98.397±6.137##
CORT 10μM+HG1μM 3 82.861±3.978**
CORT 10μM+HGA1μM 3 101.295±5.991##
CORT 10μM+HGA0.1μM 3 93.157±3.146#
CORT 10μM+HGA0.01μM 3 82.244±4.584**
F   7.331
P   0.001
*P<0.05,**P<0.01versus VEH group;# P<0.05,## P<0.01 versus CORT group(One-way ANOVA)。
对小鼠抗抑郁作用初筛
在细胞水平上得到HGA具有较好的神经元保护作用以后，提示HGA也可能在整体动物身上发挥较好的抗抑郁作用，为了进一步验证HGA在动物整体水平上是否具有抗抑郁作用，本研究采用了急性给药的方法，对其抗抑郁活性进行检测。
实验材料
（1）实验动物
开始试验时8-10周龄的雄性C57BL/6小鼠， 购自南方医科大学实验动物中心。实验前先适应饲养环境l 周，所有动物在鼠笼内可自由获得食物和水，所有的实验操作遵循NIH实验动物使用指南（NIH publications No. 80-23, 1996），实验方案获得南方医科大学实验动物伦理委员会的批准。
（2）实验仪器与试剂
小鼠悬尾实验系统（上海移数信息科技有限公司），羧甲基纤维素钠（广东光华化学厂有限公司），草酸艾司西酞普兰（大连美仑生物技术有限公司），常春藤皂苷元（ 南京春秋生物工程有限公司），HGA（自备）。
（3）药物配置
羧甲基纤维素钠：取0.5 g羧甲基纤维素钠，放到100 ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，放冷后，储存在4℃冰箱中备用。
草酸艾司西酞普兰：取10 mg草酸艾司西酞普兰，溶解到10 ml的0.5%羧甲基纤维素钠溶液中。
HG：取20 mg常春藤皂苷元，放到研钵中，加入3 ml的0.5%的羧甲基纤维素钠，充分研磨至没有大的颗粒沉淀或悬浮物存在，然后再加入3 ml的羧甲基纤维素钠溶液，充分研磨后，再加入4 ml的羧甲基纤维素钠溶液充分研磨至形成均一的混悬液。
HGA：取10 mgHGA，放入研钵中，加入3 ml的0.5%的羧甲基纤维素钠，充分研磨至无大的颗粒沉淀或悬浮物存在，然后，再加入3 ml的羧甲基纤维素钠溶液，充分研磨后再加入4 ml的羧甲基纤维素钠溶液充分研磨至形成均一的混悬液。取1 ml上一步中制备的1 g·L-1的HGA混悬液，加入9 ml的0.5%的羧甲基纤维素钠溶液，混匀，制成浓度为0.1 g·L-1的HGA混悬液。取1 ml上一步中制备的0.1 g·L-1的HGA混悬液，加入9 ml的0.5%的羧甲基纤维素钠溶液，混匀，制成浓度为0.01 g·L-1的HGA混悬液。
实验方法
（1）动物分组与处理
将C57BL/6小鼠随机分为6组。每组9-11只，依次标记为VEH组，ESC组，HG 20组，HGA 10组，HGA 1组，HGA 0.1组。按照预先设定的给药方式给药1 h后，迅速进行悬尾实验。
（2）小鼠悬尾实验
小鼠适应行为学测试环境半天后，将其距尾端2 cm的部位贴在水平铝合金横杆悬挂的挂钩上，使小鼠呈倒挂状态，其头部离台面约50 cm，悬挂两侧用黑色不透明挡板隔开动物视线，避免其相互干扰。然后开始摄录6分钟，并对整个过程中小鼠的不动时间计数，小鼠放弃挣扎，呈不动状态，记作小鼠不动，仅有轻微的前腿的摇摆计作小鼠不动。每只小鼠观测结束后，用纸巾清除干净动物粪便，使用75%酒精擦拭小鼠悬挂正下方的地面，然后清水擦拭，并用风扇快速吹干，用以去除小鼠留下的气味等，避免对下一只小鼠高架迷宫实验产生影响
（3）统计学处理
运用SPSS13.0统计软件对实验数据进行统计学分析。结果用±s x 表示，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）对数据进行分析。经方差齐性检验，若方差齐性则组间两两比较采用LSD法；若方差不齐则分别采用Welch和Dunnett’s T3法。以P<0.05定为差异具有统计学意义。
实验结果
One-way ANOVA的结果分析显示（表4），阳性对照药ESC显示具有较强的抗抑郁作用，本实验室的前期研究中发现HG在C57小鼠上，急性给药时最佳给药剂量是20 mg·kg-1，在本实验中，将HG给药剂量定为20 mg·kg-1，发现HG在20 mg·kg-1时可以起到显著的抗抑郁作用（P=0.026）。而基于HGA在细胞实验中对神经元的保护作用的生物活性要强于HG的生物活性，本实验设定了HGA的最高剂量为10 mg·kg-1，结果发现，在HGA的给药剂量为10 mg·kg-1时HGA可以明显（P=0.010）减少C57小鼠的不动时间。但是当HGA的给药剂量将为1 mg·kg-1 （P=0.100）或0.1 mg·kg-1 （P=0.786）时则对小鼠的不动时间没有显著影响。
表4 HGA对小鼠在悬尾实验中不动时间的影响
Group n Immobility duration (s)
VEH 11 199.545±9.289
ESC 10 9 148.222±9.174**
HG 20 10 166.600±13.262*
HGA 10 11 162.000±10.184*
HGA 1 9 174.667±10.725
HGA 0.1 10 195.600±9.357
F   3.644
P   0.007
*P<0.05, **P<0.01 versus VEH group, (One-way ANOVA)
HGA抗抑郁作用机制研究：
实验材料：
SD大鼠1d龄的乳鼠、Neurobasal A、B27、Glutamax、胰酶、DNA酶、MTT、皮质酮、胎牛血清、阿糖胞苷，草酸艾司西酞普兰、Hoechst33342、PI、anti-NeuN(1:100)、DyLight 594-AffiniPure donkey anti-Mouse IgG、多聚赖氨酸、双抗、PBS。
实验试剂与仪器：
垂直凝胶电泳装置、蛋白印记转膜仪、Rabbit anti-BDNF、Rabbit anti-Synaptophysin，，Mouse anti-GAPDH。
溶液与试剂配制：
1.88Tris/HCl(PH8.8)：取11.387gTris加入50ml蒸馏水，调节PH到8.8。
0.625Tris/HCl(PH6.8)：取3.7856gTris加入50ml蒸馏水，调节PH到6.8。
0.5%SDS：取SDS0.5g加蒸馏水至100ml。
10%过二硫酸铵(AP)：0.1g过二硫酸铵加水至1ml。
电泳缓冲液：Tris-Base，15.1g；甘氨酸，72.0g；SDS，5.0g，定容至5L，调节PH=8.3。
半干转转膜缓冲液：Tris-Base，3.0285g；甘氨酸，11.2605g；甲醇，100ml定容至1L，调节PH=8.3。
TBST：Tris，1.2114g；NaCl，8.775g；Tween20，1ml，加水至1L调节PH=7.4。
分离胶的配置(6ml)：取干净的小烧杯或离心管，依次加入30%丙烯酰胺，0.8%甲叉双丙烯酰胺，1.88Tris/HCl，PH8.8，0.5%SDS，蒸馏水，混匀，然后加入依次加入TEMED，10%过二硫酸铵。
分离胶各组分的比例如表5所示：
成分 体积
30%丙烯酰胺，0.8%甲叉双丙烯酰胺(ml) 2.5
1.88Tris/HCl，PH8.8(ml) 1.2
0.5%SDS(ml) 1.2
蒸馏水(ml) 1.2
TEMED(μl) 5
10%过二硫酸铵(μl) 30
压缩胶的配置(2ml)：取干净的小烧杯或离心管，依次加入30%丙烯酰胺，0.8%甲叉双丙烯酰胺，0625Tris/HCl，PH6.8；0.5%SDS；蒸馏水，混匀，然后加入依次加入TEMED，10%过二硫酸铵(AP)。
压缩胶各组分的比例如表6所示：
成分 体积
30%丙烯酰胺，0.8%甲叉双丙烯酰胺(ml) 0.33
0.625Tris/HCl，PH6.8(ml) 0.4
0.5%SDS(ml) 0.4
蒸馏水(ml) 0.87
TEMED(μl) 2
10%过二硫酸铵 10
HGA对原代海马神经元BDNF的表达的影响：
利用10μM的皮质酮或10μM的皮质酮+1μM的HGA对体外培养8d的SD乳鼠海马神经元处理24h后，采用Western blotting检测海马原代神经元的BDNF的表达量，用Image J测量蛋白条带灰度值，所得数据用One-way ANOVA进行分析，结果显示，处理24h以后，CORT处理组海马原代培养神经元的BDNF的表达量显著(P=0.000)减少。而与CORT组相比，给予HGA处理后，CORT+HGA组的BDNF显著(P=0.000)升高(如图10、表7所示)。
表7：HGA对BDNF的表达的影响：
Group n BDNF/GAPDH
VEH 3 1.000±0.031
CORT 3 0.600±0.045**
CORT+HGA 3 0.898±0.064*##
F   54.800
P   0.000
*P<0.05,**P<0.01versus VEH group versus CORT group(One-way ANOVA)。
对原代海马神经元的突触素(synaptophysin)的表达的影响：
利用10μmol·L-1的皮质酮或10μmol·L-1的皮质酮+1μmol·L-1的HGA对体外培养8d的SD乳鼠海马神经元处理24h后，采用Western blotting法检测海马原代神经元的BDNF的表达量，用Image J测量蛋白条带灰度值，所得数据用One-way ANOVA进行分析，结果显示，10μM的皮质酮对体外培养8d的SD乳鼠海马神经元进行损伤24h后，CORT组海马原代神经元的突触素(synaptophysin)的表达量显著(P=0.000)减少，而与CORT组相比，给予了HGA的CORT+HGA组突触素的表达显著(P=0.000)升高(图11，表8)。
表8：HGA对突触素(synaptophysin)的表达的影响
Group n Synaptophysin/GAPDH
VEH 3 1.000±0.034
CORT 3 0.588±0.068**
CORT+HGA 3 0.871±0.044*##
F   51.340
P   0.000
*P<0.05,**P<0.01versus VEH group,## P<0.01versus CORT group (One-way ANOVA)。
结论
通过对常春藤皂苷元28位的结构改造，成功得到了目标化合物HGA。HGA具有较好的抗抑郁效果和神经保护作用，且其神经保护作用和抗抑郁作用的生物活性，较其母化合物HG均有所提高。HGA在小鼠急性给药后的悬尾实验中，在给药剂量为10mg·kg-1时可以显著缩短小鼠的不动时间。
抗肿瘤活性：
经过我们多次实验，发现HGA作用于多种肿瘤有很好的活性，在本实施例中以鼻咽癌细胞作为实验体，其他未述肿瘤细胞也在保护之内。
实验溶液的配置：
HG的配置，首先称取适量的HG用DMSO溶解以后，作为储存液，避光放在4℃冰箱中保存。再将溶解后的HG加到培养基中，配成所需浓度的溶液。HGA的配置，首先称取适量的HGA用DMSO溶解以后，作为储存液，避光放4℃冰箱中保存。配制溶液时，首先配制高浓度的溶液，然后根据需要，用含有DMSO的培养基逐级稀释以各个所需药物浓度的溶液。
仪器设备和材料：
超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、离心机、酶标仪、电子天平、超声波清洗器、恒温水浴锅、平板震荡仪、纯水系统、鼓风电热恒温箱、pH计、移液器、细胞培养皿、-80℃低温冰箱、摇床。
细胞复苏：
将鼻咽癌细胞5-8F的冻存管从液氮中后，立即投入37℃的恒温水浴锅中，迅速晃动冻存管，使冻存管内的液体迅速融化；拧开打开冻存管的瓶盖，将冻存管内的液体用1ml枪头轻轻吸到5ml的离心管中，用1ml培养基清洗一次冻存管并将洗后的液体并入5ml的离心管中，在200g离心力条件下离心10min；离心结束后，吸走上清，加入2ml的1640培养基，轻轻吹打，使细胞散开，然后再次在200g条件下离心10min。然后吸走上请，加入含有胎牛血清(10%)的1640培养基4ml，轻轻吹打，使细胞均匀的分布在培养基中，用1ml枪头将液体吸到培养皿中置离心管中，吹打25次，将细胞吹打均匀。最后将离心管中溶液转移到培养皿中。放到温度为37℃、5%CO2，湿度饱和的培养箱中孵育。
细胞处理方案：
实验分为6组，分别为VEH组，阿糖胞苷组(ARA)，HG60组，HG10组，HGA10组，HGA1组，HGA0.1组，HGA0.01组。其中VEH组为空白对照组，不做任何处理，只加入正常的含有10%胎牛血清的1640培养基；阿糖胞苷(ARA)组为阳性对照组，实验开始后，加入含有10μM的阿糖胞苷的培养基进行处理；HG60组在实验开始后，加入含有60μM的HG的培养基进行处理；HGA10组在实验开始后，加入含有10μM的HG的培养基进行处理；HGA10组加入含有10μM的HGA的培养基进行处理；HGA10组加入含有10μM的HGA的培养基进行处理；HGA1组加入含有1μM的HGA的培养基进行处理；HGA0.1组加入含有0.1μM的HGA的培养基进行处理；HGA0.01组加入含有0.01μM的HGA的培养基进行处理。为了深入了解HGA对鼻咽癌细胞5-8F的抑制作用，在前期与实验的基础上，我们设定了浓度梯度，并设定了时间梯度(24h，48h，72h)来检测HGA对5-8F的抑制作用并与其母化合物常春藤皂苷元(HG)及阿糖胞苷(ARA)做了对照。
细胞活力检测(MTT法)：
此处MTT实验方法上与以前在在原代神经元中的MTT的方法略有不同，具体方法如下：将5-8F细胞悬液接种于细胞接种于96孔板的中间的60个孔中，每孔体积200μl，每个孔中种植5-8F细胞3000左右，在细胞处理阶段结束后，96孔板的所用的试验孔的每个孔中加入20μl的MTT溶液(5mg/ml)，然后放回孵养箱中继续孵育(加MTT时按照每组一个依次添加的方式进行添加)，4h后，将培养板尽量倾斜放置，并迅速吸走上清，然后再每个实验孔中加入150μl(按照每组一个的方式依次添加，添加顺序与添加MTT溶液的顺序一致)的二甲基亚砜(DMSO)，然后在摇床上，震摇15min至结晶完全溶解。用酶标仪检测570nm处的吸光度值。
统计学处理：
实验数据采用SPSS13.0统计软件进行处理，结果用mean±SEM表示，对神经元相对活力的分析采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行统计学分析。首先，进行方差齐性检验，若方差齐，则组间比较采用LSD法；若方差不齐，则采用Welch法，多重比较采用Dunnett’s T3法。P<0.05为差异具有统计学意义。
结果：
(1)24h的HGA处理对鼻咽癌细胞5-8F抑制作用：
经HGA处理24h以后，形态学的结果表明浓度为10μM的HGA对5-8F的作用明显，鼻咽癌细胞5-8F的核膜边缘不完整，界线模糊，细胞胞体缩小，折光率减弱，部分细胞缩小为正常细胞的十分之一，one-way ANOVA的分析结果显示，经过24h处理以后阳性对照药ARA(10μM)可以显著(P<0.05)抑制5-8F的细胞活力；10μM的HGA可以显著(P<0.01)降低5-8F的细胞活力，但HGA在浓度为1μM，0.1μM，0.01μM均没(P>0.05)显示出明显的抑制作用。HGA的母体化合物HG在60μM时经过24h处理也可以显著(P<0.01)抑制5-8F的细胞活力，但是10μM(P>0.05)的HG经过处理24没有对5-8F产生显著影响(如图12，表9)。
表9：24h的HGA处理对鼻咽癌细胞5-8F抑制作用：
Group n Cell survival(%)
VEH 4 100.000±5.612
ARA10 4 85.161±3.161*
HG60 4 61.290±2.660**
HG10 4 94.194±3.247
HGA10 4 75.484±2.660**
HGA1 4 92.258±3.706
HGA0.1 4 94.194±6.189
HGA0.01 4 96.774±5.624
F   9.086
P   0.000
*P<0.05,**P<0.01 versus VEH group (one-way ANOVA)。
的HGA处理对鼻咽癌细胞5-8F抑制作用：
经过48h的处理以后，10μM(P<0.01)，1μM(P<0.01)，0.1μM(P<0.01)，0.001μM(P<0.01)的HGA均可以对5-8F产生显著的抑制作用，并且，此时其母化合物HG在和60μM(P<0.01)和10μM(P<0.05)也都显示了显著的抑制作用，说明随着作用时间的进一步延长，HGA对5-8F的抑制作用增强(如图13，表10)。
表10：48h的HGA处理对鼻咽癌细胞5-8F抑制作用：
Group n Cell survival(%)
VEH 4 100.000±1.815
ARA10 4 43.567±1.307**
HG60 4 45.663±1.972**
HG10 4 90.351±3.056*
HGA10 4 62.559±4.305**
HGA1 4 83.954±4.714**
HGA0.1 4 79.599±2.513**
HGA0.01 4 79.653±3.771**
F   42.543
P   0.000
*P<0.05,**P<0.01 versus VEH group (one-way ANOVA)。
的HGA处理对鼻咽癌细胞5-8F抑制作用：
经过72h的处理以后(如图14，表11)，ARA继续对鼻咽癌细胞5-8F显示了较强(P<0.01)的抑制作用，60μM的HG也继续对5-8F细胞产生显著(P<0.01)的抑制作用，且10μM的HG也对5-8F产生显著(P<0.05)的抑制作用。10μM的HGA仍然对5-8F产生显著(P<0.01)的抑制作用，但是，本来经过48h可以对5-8F产生较强的抑制作用的1μM，0.1μM，0.001μM的HGA在72h时间点上没有(P>0.05)显示出对5-8-F的抑制作用，原因可能是长时间在培养基中药物变为变质为无活性物质或药物经细胞代谢转化为无活性物质。
表11：72h的HGA处理对鼻咽癌细胞5-8F抑制作用：
Group n Cell survival(%)
VEH 4 100.000±4.007
ARA10 4 45.457±0.325**
HG60 4 28.202±0.536**
HG10 4 84.534±4.637*
HGA10 4 45.410±1.722**
HGA1 4 97.693±10.058
HGA0.1 4 95.080±4.900
HGA0.01 4 91.125±3.466
F   37.299
P   0.000
*P<0.05,**P<0.01 versus VEH group (one-way ANOVA)。

Claims (3)

1.一种常春藤皂苷元酰胺衍生物的制备方法，其特征是：该常春藤皂苷元酰胺衍生物为N-(3-二甲氨基丙基)-常春藤皂苷元-17-甲酰胺，通式为：
；
所述的N-(3-二甲氨基丙基)-常春藤皂苷元-17-甲酰胺内的3-二甲氨基丙基为在常春藤皂苷元的28位引入3-二甲氨基丙胺形成；所述的常春藤皂苷元酰胺衍生物适应于神经保护药物、抗抑郁药物和抗肿瘤药物的制药；
常春藤皂苷元酰胺衍生物的制备方法包括以下步骤：
步骤一、将常春藤皂苷元0.4mmol以及N-羟基琥珀酰亚胺0.6mmol加入10ml四氢呋喃中，室温下搅拌反应，直至溶液变得澄清；
步骤二、在溶液中加入1.2mmol的N,N’-二环己基碳二亚胺，封闭状态下继续室温搅拌，采用薄层色谱法跟踪反应情况，直至反应完毕；
步骤三、停止搅拌，用滤纸过滤除去溶液中的白色沉淀物，得中间体活化酯的澄清溶液；
步骤四、将中间体活化酯的澄清溶液在搅拌状态下逐滴加入至1.44mmol的3-二甲氨基-1-丙胺中，然后，再加入3mmol三乙胺在常温下搅拌反应；
步骤五、用薄板色谱跟踪步骤四的反应情况，待反应完毕，经柱层析色谱分离得N-(3-二甲氨基丙基)-常春藤皂苷元-17-甲酰胺。
2.根据权利要求1所述的一种常春藤皂苷元酰胺衍生物的制备方法，其特征是：所述的步骤三与步骤四之间设有检测步骤，所述的检测步骤为：对中间体活化酯的澄清溶液进行减压蒸馏，进行柱色谱分离后得白色粉末，经质谱检测，确认得到了白色粉末为活化酯粉末。
3.根据权利要求2所述的一种常春藤皂苷元酰胺衍生物的制备方法，其特征是：所述的步骤三中白色沉淀物采用四氢呋喃冲洗，并将冲洗后的溶液并入中间体活化酯的澄清溶液中。
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