CN109985043A - 白桦醇及其衍生物在具有抗肝纤维化作用药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一类白桦醇衍生物或其药学上可成的盐及其制备抗肝纤维化药物中的应用。本发明利用微生物转化技术，对白桦醇成功地进行了结构修饰，获得了多个新型化合物，通过体外抗肝纤维化细胞试验证实，这些化合物具有较好的抗肝纤维化活性，可以作为抗肝纤维化药物的活性成分，具有广泛的用途。

Description

白桦醇及其衍生物在具有抗肝纤维化作用药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及白桦醇衍生物在制备具有抗肝纤维化作用药物中的应用，更具体的涉及白桦醇衍生物在制备预防和治疗肝纤维化药物中的应用。
背景技术
肝纤维化是各种致病因素导致肝损伤后，肝星状细胞被激活成为具有很强的生成细胞外基质能力的肌成纤维样细胞，继而胶原酶抑制物生成增多，胶原酶活性也下降，使肝脏细胞外基质的生成与降解间比例失衡，最终导致肝脏胶原的过度沉积成为肝纤维化。肝纤维化继续恶化导致肝硬化甚至肝癌，所以“肝炎-肝纤维化-肝硬化-肝癌”这一链条被公认为是各种慢性肝病导致严重后果的共同途径。研究表明肝纤维化经过适当的治疗是可以逆转的，只要能够减缓或阻止肝纤维化的发生，就可以减轻或治愈肝脏损伤病理进程。因此，抗肝纤维化的治疗是切断这一链条的有效手段，对肝病领域的研究具有深远意义。肝星状细胞目前被公认为是细胞外基质的主要来源细胞，肝星状细胞的激活是肝纤维化形成初始的中心环节。所以，抑制肝星状细胞的活化是治疗肝纤维化的最有效途径。
白桦醇是一类结构比较特殊的五环三萜类成分。其结构特点是E环为五元碳环，且在E环19位有异丙基以α-构型取代，五个环间均为反式排列。该类成分主要分布于桦树皮、酸枣仁、天门冬、白头翁等中药材中，是上述中药的主要有效成分。现代药理研究发现，白桦醇类化合物具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降脂、保肝和肾保护作用。但是，五环三萜类化合物结构特殊，母核缺乏活泼基团，反应位点少，采用常规化学反应方法难以制备出满足要求的衍生物。
微生物转化是利用生物体自身特异性的酶体系进行的酶催化反应，反应的类型多，并具有高度立体及区域选择性，成为了有机合成中的一个重要工具。将其用于白桦醇的衍生物制备，能为该类型化合物的后续研究提供大量样本。
发明内容
本发明的目的是提供白桦醇衍生物或其药学上可成的盐在在制备治疗肝病药物中的应用，所述肝病为与肝纤维化有关的疾病，如慢性肝炎、肝硬化或肝癌。所述药物为抗肝纤维化药物。所述白桦醇衍生物为结构式为1-9的化合物：
化合物2、3、4、5、6、7、8和9为本发明首次公开的白桦醇新衍生物。
本发明还提供了上述白桦醇衍生物的制备方法，包括如下步骤：
(1)发酵培养微生物，向培养基中加入白桦醇，接着进行转化培养，除去菌丝体后得到发酵液，所述微生物为毛霉(Mucor)属的菌株；
(2)将所述发酵液经萃取后，蒸干萃取液，得到转化粗提物；
(3)将所述转化粗提物以硅胶柱层析，采用二氯甲烷–甲醇系统，收集合并组分；
(4)将所述组分用反相高效液相色谱纯化，得到产物。
上述方法步骤(1)中培养基中白桦醇的浓度为2-5000μg/mL。
上述方法步骤(2)中萃取溶剂为常规机型有机溶剂，优选乙酸乙酯。
上述方法步骤(3)优选反相高效液相色谱制备条件为半制备用色谱柱YMC ODS-A，10.0I.D×250mm，乙腈-水(55:45，V/V)，流速2.0mL/min，示差检测器进行检测。
其中，微生物优选为毛霉(Mucor)属菌株，更优选总状毛霉。
文献Bioorganic&Medicinal Chemistry 2010,18,2549公开了制备化合物1的方法。
本发明通过实验证实，本发明所述白桦醇衍生物具有良好的抗肝纤维化活性，可以作为抗肝纤维化药物的活性成分。
这些抗肝纤维化药物的活性成分可以是选自白桦醇及结构式1-9的化合物中的一种或几种。
在以上述化合物为活性成分的药物中，需要的时候还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明利用微生物转化技术，对白桦醇成功地进行了结构修饰，获得了一类新的白桦醇衍生物，通过体内动物实验和体外抗肝纤维化细胞试验证实，这些化合物具有较好的抗肝纤维化活性，可以作为抗肝纤维化药物的活性成分，具有广泛的用途。
附图说明
图1为本发明所述化合物1-9的HPLC图谱。
具体实施方式
实施例1结构式为1-9的化合物的制备
本发明采用微生物转化方法，以白桦醇为原料，经过发酵、提取、分离等步骤，来制备本发明化合物。毛霉(Mucor)属的菌株可以购自中国科学院微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，选用马铃薯培养基，于固体斜面培养基上置4℃冰箱内保存。
以总状毛霉Mucor racemosus AS 3.205为例，制备结构式为1-9的化合物的过程如下：
(1)发酵、转化以及萃取
将总状毛霉Mucor racemosus AS 3.205接入2个250mL三角瓶(装有100mL马铃薯培养基)中，作为种子液。于摇床上160rpm、26℃下振荡培养1天后，待菌丝生长处于旺盛期，用无菌移液管吸取1mL的种子液，加入到20个1000mL摇瓶(装有400mL马铃薯培养基)中。振荡培养1天后，每个摇瓶中加入25mg白桦醇(0.2mL，125mg/mL无水乙醇溶液)，共用500mg底物。相同条件下继续转化7天，将发酵液过滤，滤除菌丝体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，萃取液减压浓缩至干，得到转化物粗提物约0.8g。
(2)硅胶柱纯化
将所得粗提物溶于少量甲醇，与1.0g柱色谱硅胶(200–300目)混合拌样，自然干燥，加至装有40g硅胶(200–300目)的色谱柱顶，用二氯甲烷–加醇系统梯度洗脱(100:1-1:1)，收集洗脱组分，采用TLC分析方法(硅胶G薄层板，二氯甲烷–甲醇(35:1)展开，10％硫酸乙醇溶液喷雾，加热显色)将所得到的相似洗脱组分合并。
(3)反相高效液相色谱纯化
合并组分用反相高效液相色谱纯化。制备条件为半制备用色谱柱YMC ODS A-5μm，10.0×250mm，乙腈-水(55:45，V/V)，流速2.0mL/min，示差检测。得到结构式为1-6的化合物6个转化产物，如图1所示。其13C-NMR数据如表1所示。
表1.化合物1-9的碳谱数据(CDCl3)
No. 化合物1 化合物2 化合物3 化合物4 化合物5 化合物6 化合物7 化合物8 化合物9
1 38.7 40.0 39.9 39.6 39.6 28.3 28.1 28.5 28.4
2 27.3 28.1 28.1 38.9 39.0 49.1 30.9 49.3 27.8
3 78.9 79.5 79.4 79.0 79.0 80.3 79.4 81.0 79.2
4 38.8 39.7 39.7 40.0 40.0 43.4 39.7 43.4 39.5
5 55.2 54.1 53.5 54.7 54.7 55.0 54.1 54.4 53.3
6 18.2 31.3 28.7 27.8 27.9 39.6 39.9 30.5 39.9
7 34.2 75.4 74.0 217.6 217.7 217.0 75.4 75.6 73.7
8 40.9 45.1 49.3 58.3 58.4 44.1 44.9 48.1 78.7
9 50.3 51.9 51.8 55.2 55.3 55.1 51.9 51.9 51.6
10 37.1 38.3 38.5 39.3 39.4 39.1 38.3 38.1 79.0
11 20.8 26.7 21.7 67.6 67.7 67.7 21.9 26.7 26.3
12 25.2 21.9 26.5 36.4 36.5 36.5 26.8 22.2 21.6
13 37.2 39.6 49.8 34.2 33.8 33.8 39.2 50.0 37.9
14 42.7 48.0 50.2 44.2 44.3 58.4 48.0 45.0 79.3
15 27.0 31.8 68.1 28.7 28.7 28.8 31.7 31.7 67.9
16 29.1 35.7 35.7 30.8 30.6 35.4 35.2 35.2 39.5
17 47.8 50.0 47.3 47.3 48.9 49.0 48.7 49.0 38.3
18 48.7 47.4 38.6 49.5 49.2 49.2 50.0 39.2 49.5
19 47.7 49.3 48.7 49.4 49.0 49.5 49.4 49.4 48.6
20 150.4 151.7 151.2 151.5 152.0 152.0 151.9 152.0 151.3
21 29.7 30.3 31.1 31.0 31.0 31.0 30.3 39.7 31.0
22 33.9 30.7 40.1 35.7 35.3 30.7 30.9 30.9 35.0
23 27.9 28.6 28.5 28.0 28.1 64.5 28.5 65.1 28.4
24 15.3 16.1 16.1 15.7 15.7 22.7 16.1 23.1 16.0
25 16.1 16.5 16.3 17.5 17.6 15.7 16.5 16.8 16.2
26 15.9 10.9 11.3 19.3 19.4 17.8 10.9 10.7 11.2
27 14.7 15.5 9.0 15.4 15.4 31.0 15.5 15.4 8.9
28 60.4 63.9 64.6 63.9 60.6 60.6 60.4 60.4 61.4
29 109.6 173.4 173.3 173.4 110.3 110.3 110.1 110.1 110.4
30 19.0 20.9 20.8 20.8 19.6 19.3 19.5 19.5 19.5
31 172.9 110.5 110.8 110.6
32 22.6 19.5 19.5 19.6
以上结果表明，所得化合物结构正确。
实施例2本发明化合物1-9的抗肝纤维化活性
(1)实验材料
仪器与试剂：CO2培养箱(Jouan IGO150)；酶标仪(Bio-TEK ELx800)；荧光倒置显微镜(Olympus IX51)；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)、RPMI 1640培养基(Gibcol BRL)，RnaseA、胎牛血清、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶(上海生物工程有限公司)。
测试用细胞株：HSC-T6细胞株，为SV40转染的SD大鼠肝星状细胞，购于中国医学科学院肿瘤研究所。
测试样品：化合物1-9，纯度在95％以上，阳性对照品秋水仙碱，各化合物均以DMSO溶解后稀释。
(2)实验方法
采用MTT法测定各受试化合物对HSC-T6细胞株的半数抑制率IC50值：取对数生长期的HSC-T6细胞，用含1％DMEM培养液调整细胞浓度为5×105/mL，接种于96孔培养板，药物处理组和细胞对照组加入每孔100μL细胞悬液，每组设3个复孔，空白对照组只加入全培养基，每孔100μL，设3个复孔。将96孔培养板置于37℃、5％CO2培养箱培养24h后，加入不同浓度的受试样品，使终浓度为0.1-100μM，继续培养72 h。按MTT法于酶标仪，测定450 nm的吸光度(A)值，计算抑制率[抑制率＝(1-实验组A值/对照组A值)×100％]。实验重复3次。应用SPSS11.5软件作回归方程，计算各受试样品对HSC-T6细胞作用72 h的半数抑制浓度(IC50)。
(3)实验结果
根据MTT法测试结果，计算本发明化合物1-9对上述细胞的IC50值，结果如表2所示。
表2.测试样品对HSC细胞增殖的抑制作用
Compound HSC-T6IC<sub>50</sub>value(μM)
秋水仙碱 0.22
化合物1 1.39
化合物2 2.73
化合物3 0.98
化合物4 5.41
化合物5 1.94
化合物6 2.85
化合物7 10.08
化合物8 9.92
化合物9 11.57
白桦醇 31.46
结果表明，本发明的白桦醇及本发明化合物1-9具有良好的抗肝纤维化活性，可以作为抗肝纤维化药物的活性成分。

Claims (5)

1.具有下列结构式的白桦醇衍生物或其药学上可成的盐在制备治疗肝病药物中的应用，
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝病为与肝纤维化有关的疾病。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肝病为慢性肝炎、肝硬化或肝癌。
4.如权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述药物为抗肝纤维化药物。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物含有如权利要求1所述白桦醇衍生物、或其药学上可成的盐中的一种或几种以及药学上可以接受的载体。
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