CN112022857B - 白桦脂酸衍生物在制备抗肝病变药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，公开了一类白桦脂酸衍生物或其药学上可成的盐及其制备抗肝病变药物中的应用。本发明利用微生物转化技术，对白桦脂酸成功地进行了结构修饰，获得了多个新型化合物，通过体外抗肝纤维化细胞试验证实，这些化合物具有较好的抗肝纤维化活性，可以作为抗肝病变药物的活性成分，具有广泛的用途。

Description

白桦脂酸衍生物在制备抗肝病变药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及白桦脂酸衍生物在制备抗肝病变药物中的应用。

背景技术

肝纤维化是各种致病因素导致肝损伤后，肝星状细胞被激活成为具有很强的生成细胞外基质能力的肌成纤维样细胞，继而胶原酶抑制物生成增多，胶原酶活性也下降，使肝脏细胞外基质的生成与降解间比例失衡，最终导致肝脏胶原的过度沉积成为肝纤维化。肝纤维化继续恶化导致肝硬化甚至肝癌，所以“肝炎-肝纤维化-肝硬化-肝癌”这一链条被公认为是各种慢性肝病导致严重后果的共同途径。研究表明肝纤维化经过适当的治疗是可以逆转的，只要能够减缓或阻止肝纤维化的发生，就可以减轻或治愈肝脏损伤病理进程。因此，抗肝纤维化的治疗是切断这一链条的有效手段，对肝病领域的研究具有深远意义。肝星状细胞目前被公认为是细胞外基质的主要来源细胞，肝星状细胞的激活是肝纤维化形成初始的中心环节。所以，抑制肝星状细胞的活化是治疗肝纤维化的最有效途径。

白桦脂酸是一类结构比较特殊的五环三萜类成分。其结构特点是E环为五元碳环，且在E环19位有异丙基以α-构型取代，五个环间均为反式排列。该类成分主要分布于桦树皮、酸枣仁、天门冬、白头翁等中药材中，是上述中药的主要有效成分。现代药理研究发现，白桦脂酸具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗糖尿病和抗高血脂等作用。目前，有关白桦脂酸及其衍生物的抗肝纤维化作用报道较少，而且五环三萜类化合物结构特殊，母核缺乏活泼基团，反应位点少，采用常规化学反应方法难以制备出满足要求的衍生物。

微生物转化是利用生物体自身特异性的酶体系进行的酶催化反应，反应的类型多，并具有高度立体及区域选择性，成为了有机合成中的一个重要工具。将其用于白桦脂酸的衍生物制备，能为该类型化合物的后续研究提供大量样本。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供白桦脂酸衍生物在制备抗肝病变药物中的应用，这些白桦脂酸衍生物或其药学上可接受的盐具有较好的抗肝纤维化活性。

本发明提供了下列任一结构式所示的白桦脂酸衍生物或其药学上可成的盐在制备抗肝病变药物中的应用，

所述肝病变选自肝纤维化、慢性肝炎、肝硬化或肝癌。其中，慢性肝炎、肝硬化和肝癌均为与肝纤维化有关的疾病。

本发明还提供了上述白桦脂酸衍生物的制备方法，包括如下步骤：

1)发酵培养微生物，向培养基中加入白桦脂酸，接着进行转化培养，除去菌丝体后得到发酵液，所述微生物为卷霉(Circinella)属的菌株；优选采用蝇卷霉Circinellamuscae CGMCC 3.2695。

2)将所述发酵液经萃取后，蒸干萃取液，得到转化粗提物；

3)将所述转化粗提物用反相高效液相色谱纯化，得到产物。

上述方法步骤1)中培养基中白桦脂酸的浓度为2-5000μg/mL。

上述方法步骤2)中萃取溶剂为常规机型有机溶剂，优选乙酸乙酯。

上述方法步骤3)优选反相高效液相色谱制备条件为半制备用色谱柱YMC ODS-A，10.0I.D×250mm，乙腈-水(30:70，V/V)，流速2.5mL/min，检测波长203nm。

本发明通过实验证实，本发明所述白桦脂酸衍生物具有良好的抗肝纤维化活性，可以作为抗肝病变药物的活性成分。

这些抗肝病变药物的活性成分可以是选自结构式为式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ、式Ⅳ、式Ⅴ和式Ⅵ的化合物中的一种或几种。

在以上述化合物为活性成分的药物中，需要的时候还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明利用微生物转化技术，对白桦脂酸成功地进行了结构修饰，获得了一类新的白桦脂酸衍生物，通过体内动物实验和体外抗肝纤维化细胞试验证实，这些化合物具有较好的抗肝纤维化活性，可以作为抗肝病变药物的活性成分，具有广泛的用途。

附图说明

图1为本发明所述白桦脂酸衍生物的HPLC液相色谱图。

具体实施方式

实施例1、结构式为式Ⅰ-式Ⅵ的化合物的制备

本发明采用微生物转化方法，以白桦脂酸为原料，经过发酵、提取、分离等步骤，来制备本发明化合物。卷霉(Circinella)属的菌株可以购自中国科学院微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，选用马铃薯培养基，于固体斜面培养基上置4℃冰箱内保存。

以蝇卷霉Circinella muscae CGMCC 3.2695为例，制备结构式为式Ⅰ-式Ⅵ的化合物的过程如下：

1)发酵、转化以及萃取

将蝇卷霉Circinella muscae CGMCC 3.2695接入2个250mL三角瓶(装有100mL马铃薯培养基)中，作为种子液。于摇床上160rpm、26℃下振荡培养1天后，待菌丝生长处于旺盛期，用无菌移液管吸取1mL的种子液，加入到20个1000mL摇瓶(装有400mL马铃薯培养基)中。振荡培养1天后，每个摇瓶中加入20mg白桦脂酸(0.2mL，100mg/mLDMSO溶液)，共用400mg底物。相同条件下继续转化7天，将发酵液过滤，滤除菌丝体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，萃取液减压浓缩至干，得到转化物粗提物约0.56g。

2)反相高效液相色谱纯化

合并组分用反相高效液相色谱纯化。制备条件为半制备用色谱柱YMC ODS A-5μm，10.0×250mm，乙腈-水(30:70，V/V)，流速2.5mL/min，检测波长203nm。得到结构式为式Ⅰ-式Ⅵ的化合物6个转化产物，液相色谱图如图1所示，其¹³C-NMR数据如表1所示。

表1.化合物Ⅰ、化合物Ⅱ、化合物Ⅲ、化合物Ⅳ、化合物Ⅴ和化合物Ⅵ的碳谱数据(氘代吡啶)

以上结果表明，所得化合物结构正确。

实施例2本发明化合物Ⅰ、化合物Ⅱ、化合物Ⅲ、化合物Ⅳ、化合物Ⅴ和化合物Ⅵ的抗肝纤维化活性

1)实验材料

仪器与试剂：CO₂培养箱(Jouan IGO150)；酶标仪(Bio-TEK ELx800)；荧光倒置显微镜(Olympus IX51)；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)、RPMI 1640培养基(Gibcol BRL)，Rnase A、胎牛血清、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶(上海生物工程有限公司)。

测试用细胞株：HSC-T6细胞株，为SV40转染的SD大鼠肝星状细胞，购于中国医学科学院肿瘤研究所。

测试样品：化合物Ⅰ–Ⅵ，纯度在95％以上，阳性对照品秋水仙碱，各化合物均以DMSO溶解后稀释。

2)实验方法

采用MTT法测定各受试化合物对HSC-T6细胞株的半数抑制率IC₅₀值：取对数生长期的HSC-T6细胞，用含1％DMEM培养液调整细胞浓度为5×10⁵/mL，接种于96孔培养板，药物处理组和细胞对照组加入每孔100μL细胞悬液，每组设3个复孔，空白对照组只加入全培养基，每孔100μL，设3个复孔。将96孔培养板置于37℃、5％CO₂培养箱培养24h后，加入不同浓度的受试样品，使终浓度为0.1-100μM，继续培养72h。按MTT法于酶标仪，测定450nm的吸光度(A)值，计算抑制率[抑制率＝(1-实验组A值/对照组A值)×100％]。实验重复3次。应用SPSS11.5软件作回归方程，计算各受试样品对HSC-T6细胞作用72h的半数抑制浓度(IC₅₀)。

3)实验结果

根据MTT法测试结果，计算本发明化合物Ⅰ–Ⅵ对上述细胞的IC₅₀值，结果如表2所示。

表2.测试样品对HSC-T6细胞增殖的抑制作用

结果表明，本发明的化合物Ⅰ–Ⅵ具有良好的抗肝纤维化活性，可以作为抗肝病变药物的活性成分。

本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (3)

1.下列任一结构式所示的白桦脂酸衍生物或其药学上可成的盐在制备抗肝病变药物中的应用，

所述肝病变选自肝纤维化、慢性肝炎或肝硬化。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包括活性成分和药学上可以接受的载体，所述活性成分选自结构式为式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ、式Ⅳ、式Ⅴ和式Ⅵ的白桦脂酸衍生物或其药学上可成的盐中的一种或几种，

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的载体选自稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂中的一种或多种。

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