CN116693592A - 具有甲氧基取代的熊果酮酸衍生物、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，公开了一种具有甲氧基取代的熊果酮酸衍生物、制备方法及应用。本发明利用微生物的方法，以熊果酮酸为底物，特异性的在熊果酮酸母核11位引入甲氧基，同时在21β位引入羟基，得到3‑羰基‑21‑羟基‑11‑甲氧基‑12‑烯‑乌苏烷‑28‑羧酸。特异性的使得熊果酮酸3位羰基开裂形成甲氧基，同时形成2(3)位的双键，形成3‑甲氧基‑2(3),12(13)‑二双键‑乌苏烷‑28‑羧酸。通过体外抗炎实验证实，化合物式Ⅰ和式Ⅱ具有较好的抗炎活性，可以作为抗炎药物的活性成分，具有广泛的用途。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种具有甲氧基取代的熊果酮酸衍生物、制备方法及应用。
背景技术
炎症是机体对有害刺激所发生的复杂的防御反应，但过度的炎症反应会对机体造成损伤，与多种疾病相关。目前，临床上常用的抗炎药物主要分为甾体类抗炎药和非甾体类抗炎药。甾体类抗炎药是由肾上腺皮质所分泌的糖皮质激素氢化可的松及其人工合成的衍生物，但长期使用糖皮质激素会产生多种严重的不良反应。因此，甾体类抗炎药通常不用于轻型炎症反应的常规治疗，主要用于治疗严重的炎症反应性疾病。非甾体类抗炎药即临床上广泛应用的解热镇痛抗炎药主要用于发热，疼痛及类风湿关节炎的治疗，具有快速减轻炎症反应、缓解疼痛及改善机体机能的作用，但通常不适用于疾病及并发症的预防治疗。长期服用此类药物会产生胃肠道不适、肾脏损伤等副作用，其中胃肠道粘膜损伤最为常见。近年来，天然药物以其多靶点作用的特点吸引了国内、外研究者的注意。研究发现，多种天然药物活性成分通过作用机制显示出不同程度的抗炎效果。其中，三萜类化合物的抗炎活性以其多靶点作用的特点吸引了国内、外研究者的注意。三萜及其苷类是广泛存在于自然界中的一类重要的天然有机化合物，据报道此类化合物大多具有良好的抗炎活性。该类化合物对急、慢性炎症均有良好的抑制作用，可通过抑制炎症因子的产生发挥抗炎作用，另外该类化合物的抗炎作用还与其能影响免疫系统有关。
但是，由于三萜分子结构复杂，化合物普遍亲水性差、生物利用度低等问题严重限制了它们作为药物在临床的有效使用。目前，提高三萜类化合物生物利用度的最常见方法主要有两种，一种是利用化学合成的方法对其进行结构修饰与改造从而提高化合物的生物活性和亲水性。然而，由于五环三萜类化合物结构的特殊性，其母核本身缺乏化学反应的活性基团。因此，严重限制了三萜类化合物化学结构修饰的反应位点与衍生物制备的多样性。另一种方法是生物转化，应用条件温和且具有高度区域和立体选择性的微生物的催化活性来进行。因而成为了复杂天然产物结构修饰与改造的有力工具。微生物转化产物一方面可以获得更强生物活性的衍生物直接用于药物研发，另一方面经微生物转化后母核上新引进的化学活性基团增加了进行化学修饰与改造的位点，解决了三萜类化合物有机化学制备衍生物反应位点少的难题。但是，微生物转化的方法具有很强的随机性，并不能像化学合成法一样能对产物进行设计和预测。因此，筛选到合适的微生物菌株对于转化产物的结构具有决定性作用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种具有甲氧基取代的熊果酮酸衍生物或其药学上可成的盐及其制备方法，该熊果酮酸衍生物可用于制备抗炎的药物。
本发明提供的甲氧基取代的熊果酮酸衍生物为结构式为式Ⅰ的化合物3-羰基-21β-羟基-11α-甲氧基-12-烯-乌苏烷-28-羧酸和式Ⅱ化合物3-甲氧基-2(3),12(13)-二双键-乌苏烷-28-羧酸：
结构式为式Ⅰ和式Ⅱ的化合物均为本发明首次公开的熊果酮酸衍生物。
本发明还提供了上述熊果酮酸衍生物的制备方法，包括如下步骤：
1)发酵培养微生物，向培养基中加入熊果酮酸，接着进行转化培养，除去菌丝体后得到发酵液，所述微生物为曲霉属的菌株；
2)将所述发酵液经萃取后，蒸干萃取液，得到转化粗提物；
3)转化粗提物经硅胶柱色谱，以二氯甲烷：甲醇作为流动相进行梯度洗脱，收集流份后经HPLC分析合并得5个组分。
4)将所述组分用反相高效液相色谱纯化，得到结构式为式Ⅰ和式Ⅱ的化合物。
本发明还提供了一种上述熊果酮酸衍生物或上述制备方法制备得到的熊果酮酸衍生物在制备抗炎药物中的应用。
与现有技术相比，本发明利用微生物转化技术，能特异性的在熊果酮酸母核11α位引入甲氧基，同时在21β位引入羟基形成结构式为式Ⅰ的转化产物。特异性的使得熊果酮酸3位羰基开裂形成甲氧基，同时形成2(3)位的双键，形成结构式为式Ⅱ的转化产物。通过体外抗炎实验证实，化合物式Ⅰ和式Ⅱ具有较好的抗炎活性，可以作为抗炎药物的活性成分，具有广泛的用途。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的具有甲氧基取代的熊果酮酸衍生物及其制备方法进行详细描述。
实施例1：结构式为式Ⅰ和式Ⅱ的化合物的制备
本发明采用微生物转化方法，以熊果酮酸为原料，经过发酵、提取、分离等步骤制备本发明化合物。曲霉属(Aspergillus)的菌株可以购自中国科学院微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，选用马铃薯培养基，于固体斜面培养基上置4℃冰箱内保存。
以米曲霉AspergillusoryzaeCGMCC3.2073为例，制备结构式为式Ⅰ和式Ⅱ的化合物的过程如下：
1)发酵、转化以及萃取
将米曲霉AspergillusoryzaeCGMCC3.2073接入2个250mL三角瓶(装有100mL马铃薯培养基)中，作为种子液。于摇床上160rpm、26℃下振荡培养12小时后，待菌丝生长处于旺盛期，用无菌移液管吸取1mL的种子液，加入到20个1000mL摇瓶(装有400mL马铃薯培养基)中。振荡培养24小时后，每个摇瓶中加入20mg熊果酮酸(0.2mL，100mg/mL乙醇溶液)，共用400mg底物。相同条件下继续转化3天，将发酵液过滤，滤除菌丝体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，萃取液减压浓缩至干，得到转化物粗提物约0.85g。
2)硅胶柱色谱分离
转化粗提物经硅胶柱色谱进行分离。二氯甲烷：甲醇梯度洗脱(100:1,50:1,20:1,5:1)。收集流份，经HPLC分析后合并，得合并组分A和B。
3)反相高效液相色谱纯化
组分A经反相高效液相色谱纯化。制备条件为半制备用色谱柱YMCODSA-5μm，10.0×250mm，甲醇/水(92:8，3.0mL/min)，检测波长203nm，得到结构式为式Ⅰ的转化产物。组分B经反相高效液相色谱纯化，选用流动相甲醇/水(73:27，3.0mL/min)，检测波长203nm，得到结构式为式式Ⅱ的转化产物。化合物式Ⅰ和式Ⅱ的质谱和波谱学数据如下所示。
化合物Ⅰ：3-羰基-21β-羟基-11α-甲氧基-12-烯-乌苏烷-28-羧酸；红外光谱主要的吸收峰(KBr):νmax3594,3048,2981,1761,1713,1386,1235,1052cm-1；高分辨质谱[M-H]-m/z为499.3433(cal.499.3423，C31H47O5)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表1。
化合物Ⅱ：3-甲氧基-2(3),12(13)-二双键-乌苏烷-28-羧酸；红外光谱主要的吸收峰(KBr):νmax3673,3027,2952,1715,1386,1257,1063cm-1；高分辨质谱m/z[M-H]-m/z为467.3534(cal.467.3525，C31H47O3)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表1。
表1.化合物Ⅰ和Ⅱ的核磁氢谱和碳谱数据
以上结果表明，所得化合物式Ⅰ—式Ⅶ结构正确。
实施例2本发明化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的抗炎活性
1)实验材料
仪器与试剂：CO2培养箱(JouanIGO150)；酶标仪(Bio-TEKELx800)；荧光倒置显微镜(OlympusIX51)；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)、RPMI1640培养基(GibcolBRL)，小鼠单核巨噬细胞RAW264.7、RnaseA、胎牛血清、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶(上海生物工程有限公司)。
测试样品：熊果酮酸及实施例1所获得的化合物Ⅰ和化合物Ⅱ，纯度在95％以上；同时，选取槲皮素为阳性对照药物，各化合物均以DMSO溶解后稀释。
2)实验方法
采用MTT法测定各受试化合物对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞活力的影响：取对数生长期的RAW264.7细胞，用含10％小牛血清及1％青霉素-链霉素双抗液的DMEM培养液，调整细胞浓度为5×104个/mL，接种于96孔培养板，药物处理组和细胞对照组加入每孔100μL细胞悬液，每组设3个复孔，空白对照组只加入DMEM全培养基，每孔100μL，设3个复孔。将96孔培养板置于37℃、5％CO2培养箱培养24h后，加入不同浓度的受试样品，使终浓度为0.1-100μM，继续培养72h。按MTT法于酶标仪，测定490nm的吸光度(A)值，计算抑制率[抑制率＝(1-实验组A值/对照组A值)×100％]。
采用Griess法测定各受试化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞NO释放的影响：调整细胞浓度为2×105个/mL，接种于96孔培养板，每孔1mL细胞悬液，每组设3个复孔，空白对照组只加入DMEM全培养基，设3个复孔。将96孔培养板置于37℃、5％CO2培养箱培养24h后，加入不同浓度的受试样品，使终浓度为0.1-100μM，继续培养12h后，取上清液，按试剂盒说明书操作，测定培养液中NO的水平。数据采用SPSSStatistics25软件进行分析处理。
3)实验结果
根据MTT法和Griess法测试结果，计算熊果酮酸及本发明化合物Ⅰ和化合物Ⅱ对LPS诱导的RAW264.7细胞NO释放的影响，结果如表2所示。
表2.测试样品抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NO释放的结果
结果表明，本发明的化合物Ⅰ和化合物Ⅱ对RAW264.7细胞均未见明显的细胞毒活性，同时可显著降低由LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子NO的释放水平，抑制活性明显优于阳性对照品槲皮素，具有显著的抗炎活性，可以作为抗炎药物的活性成分。
本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (4)
1.一种具有21β位-羟基，11α位-甲氧基取代的熊果酮酸衍生物，所述熊果酮酸衍生物为3-羰基-21β-羟基-11α-甲氧基-12-烯-乌苏烷-28-羧酸，具有式Ⅰ结构：
2.一种具有3位-甲氧基，2(3)位-双键取代的熊果酮酸衍生物，所述熊果酮酸衍生物为3-甲氧基-2(3),12(13)-二双键-乌苏烷-28-羧酸，具有式Ⅱ结构：
3.一种熊果酮酸衍生物的微生物转化制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)发酵培养微生物，向培养基中加入熊果酮酸，接着进行转化培养，除去菌丝体后得到发酵液，所述微生物为米曲霉AspergillusoryzaeCGMCC 3.2073；
2)将所述发酵液经萃取，得到转化物；
3)将所述转化物经过硅胶柱色谱纯化，所述硅胶柱纯化采用二氯甲烷-甲醇两相系统梯度洗脱，收集合并组分；
4)将所述组分用反相高效液相色谱纯化，得到熊果酮酸衍生物，所述熊果酮酸衍生物为3-羰基-21β-羟基-11α-甲氧基-12-烯-乌苏烷-28-羧酸和3-甲氧基-2(3),12(13)-二双键-乌苏烷-28-羧酸。
4.权利要求1或2所述熊果酮酸衍生物或权利要求3所述的制备方法制备得到的熊果酮酸衍生物在制备抗炎药物中的应用。
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