CN112904007A - 一种基于蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点双重信号放大呕吐毒素免疫层析试纸条的制备 - Google Patents

一种基于蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点双重信号放大呕吐毒素免疫层析试纸条的制备 Download PDF

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Abstract

本发明涉及了一种基于蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点双重信号放大呕吐毒素免疫层析试纸条的制备，包括以下步骤：以水热合成法制备蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点纳米复合材料为信号标签，将其与抗呕吐毒素单克隆抗体连接作为信号探针，利用纳米酶可将其原始颜色产生的视觉比色信号与其优异的模拟过氧化物酶催化活性产生的催化信号集成在一起，实现信号放大，进行定性检测；利用量子点其荧光特性，进行定量检测，即可实现双重信号放大免疫层析试纸条对样品中呕吐毒素的检测。基于蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点双重信号放大呕吐毒素免疫层析试纸条在检测前，利用外加磁场可高效快速分离富集目标物。本发明与传统的胶体金免疫层析试纸条相比，具有信号强，检测范围宽，稳定性好，灵敏度高，不受基质干扰的优点，能够实现对样本的快速定性和定量检测，且操作步骤简便，可控性强，具有良好的应用前景。

Description

一种基于蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点双重信号放大呕吐 毒素免疫层析试纸条的制备
技术领域
本发明涉及一种基于蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点双重信号放大呕吐毒素免疫层析试纸条的制备，尤其涉及一种蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点-抗呕吐毒素单克隆抗体纳米探针的制备方法。
背景技术
呕吐毒素，又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇，属单端孢霉烯B族化合物，主要由镰刀菌产生，因会引起猪的呕吐反应而得名，是小麦中普遍污染的真菌毒素，严重影响小麦的品质和安全。呕吐毒素具有很强的毒性，易对人类健康造成极大的威胁，已被联合国粮农组织和世界卫生组织定为最危险的自然发生的食品污染物，也已被国际癌症研究机构公布为三类致癌物。呕吐毒素理化性质稳定，对高压、高热和弱酸条件具有较强的耐受性，因此谷物磨粉、日常食物烹调和加工很难破坏呕吐毒素，并且呕吐毒素能抑制蛋白质、DNA 和 RNA 的合成，人畜如果长期食用被呕吐毒素污染的食物，会引起胃肠道和免疫系统功能损伤，也会引起内分泌系统和神经系统的病变。考虑到呕吐毒素的这些危害，目前世界上至少有37个国家和组织制定了呕吐毒素的限量标准，例如，美国的食品及药物管理局规定食品中的呕吐毒素的安全标准是1 mg/kg，同时，美国也制定了饲料用小麦及小麦制品中呕吐毒素的允许限量不得超过4 mg/kg；而欧盟对未加工的小麦等谷物中呕吐毒素的限量值为1250~1750 µg/kg，但对以小麦、玉米等为原料制成的供人直接食用的面粉、粗粉或麦片中呕吐毒素的允许限量值为750 µg/kg；我国规定粮食谷物及其制品中呕吐毒素最高限量要小于1000 µg/kg。目前检测谷物和食品中呕吐毒素的方法主要有高效液相色谱、液相色谱-串联质谱、气相色谱等，这些方法虽然具有很高的灵敏度和准确度、且可以一次测定多种成分，但需要大型昂贵的仪器设备及复杂的样品纯化制备程序，分析程序复杂，检测周期长，需要专业的技术人员，不适合基层单位的推广和使用。因此，发展简便、快速、经济、适用于现场检测的方法将是检测当前食品中呕吐毒素含量超标问题的有效途径之一。免疫层析试纸条操作简单、响应速度快、成本低、仪器设备简单便携、对操作人员技术要求不高，因而被广泛用于环境监测，食品检测，医学监控等方面。为提高检测性能，纳米酶作为信号标签和信号放大器的引入为免疫层析试纸条检测系统提供了一条新的途径。基于纳米酶的比色法具有稳定性高、肉眼容易判读、仪器要求少等优点。采用纳米酶作为信号标签，可以将其原始颜色产生的视觉比色信号与纳米酶优异的模拟过氧化物酶催化活性产生的催化信号集成在一起。同时，酶催化放大产生的信号通常比比色信号更灵敏，可以显著提高灵敏度，拓宽检测范围。因此设计合成蓝色磁性双纳米酶/量子点纳米材料成为此高效免疫层析方法的关键，目前设计合成蓝色磁性双纳米酶/量子点-抗呕吐毒素单克隆抗体作为信号探针，同时构建双信号放大免疫层析试纸条用于呕吐毒素的检测尚未见报道。
发明内容
发明本发明涉及一种基于蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点双重信号放大呕吐毒素免疫层析试纸条的制备。
一种基于蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点双重信号放大呕吐毒素免疫层析试纸条的制备，其步骤如下：
所述蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点纳米复合材料的制备：蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点纳米复合材料的制备：采用水热合成方法制备蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点纳米复合材料，首先将5.0~10.0 g水合磁性金属氯化物溶于50~100 mL去离子水中，加热至70~90 ℃，然后将5~20 mL NH3·H2O(30% v/v)加入到混合溶液中，在70~90 ℃下剧烈搅拌1.0~3.0 h。待合成的悬浮液冷却到室温后，用磁铁将固相分离，并用10~50 mL的去离子水清洗。合成的磁性金属氧化物纳米粒子在50~80 ℃下干燥3~8 h。将1.0~5.0 g 磁性金属氧化物分散至含有1.0~5.0 mL NH3·H2O (30% v/v)、100~500 mL无水乙醇和50~200 mL去离子水的溶液中，超声波处理10~30 min后，加入1.0~5.0 mL正硅酸酯溶液，在20~50 ℃下搅拌6~24 h，用磁铁收集固形物，用50~200 mL去离子水清洗并在50~150 ℃下干燥5~12 h即得到的磁性多孔纳米酶。再将0.05~0.30 g磁性多孔纳米酶粒子分散在pH为7.0~9.0的磷酸盐缓冲溶液中，超声处理15~30 min。然后，加入交联剂和10~50 mL量子点溶液。在20~40 ℃下在往复振荡器中反应12~48小时后，获得了磁性多孔纳米酶/量子点纳米复合材料。将2~10 mL0.4 mmol金属氰化物和2~10 mL0.4 mmoL的金属氯化物溶液混合，逐滴加入到磁性多孔纳米酶/量子点纳米复合材料中，在室温下搅拌1~5 h，静置5~12 h，最后用离心机将沉淀从溶液中分离出来，并用去离子水洗涤2~5次，在50~80℃下真空干燥6~24 h，即得到蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点纳米复合材料。
所述蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点-抗呕吐毒素单克隆抗体纳米探针的制备：将0.5~1.0mL的蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点纳米复合材料溶液与1~3 μL的抗呕吐毒素单克隆抗体（0.5~2.0 mg/mL）溶液混合，在室温下孵育15~60 min，随后，加入载体蛋白溶液，在2~8 ℃下孵育1~5 h，磁纯化后，即得到蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点-抗呕吐毒素单克隆抗体纳米探针。
所述双重信号放大免疫层析试纸条用于呕吐毒素的检测：首先进行免疫层析试纸条的制备，用缓冲液对样品垫进行预处理，并在20~40 ℃下干燥过夜。将0.5~1.5 mg/ mL呕吐毒素半抗原-载体蛋白偶联物以0.6~01.2 μL /cm的速度铺在硝化纤维素膜上，形成检测区。0.3~0.8 mg/mL山羊抗小鼠IgG抗体以0.5~1.5 μL/cm的速度涂抹于硝酸纤维素膜上，形成质检区，其中检测区与质检区之间的距离为3~8 mm。然后，将待检测样品与蓝色磁性双纳米酶/量子点-抗呕吐毒素单克隆抗体混合于试管中，孵育5~20 min，磁选富集后，将其滴在样品垫上。当T线不显色，C线显蓝色时，即结果为阳性；当T、C线都为蓝色时，即结果为阴性；待显色结束，向T线上滴加显色液和H2O2溶液，再观察其显色变化情况，进行定性检测。待试纸条完全干燥后用特定波长紫外光照射T线2~4 min，来定量检测样品中呕吐毒素的含量。
所述的水合磁性金属氯化物为FeCl3·6H2O、CoCl2·6H2O、NiCl2·6H2O、FeCl2·4H2O中的一种或者多种。
所述的磁性金属氧化物为Co2O3、Fe2O3、Ni2O3、Co3O4、Fe3O4、Ni3O4中的一种或多种。
所述的正硅酸酯溶液为正硅酸甲酯（TMOS）、正硅酸乙酯（TEOS）、正硅酸丙酯（TPOS）、正硅酸丁酯（TBOS）中的一种或多种。
所述的金属氰化合物为亚铁氰化钾、铁氰酸钾、亚铁氰化钠、高铁氰化钾中的一种或者多种。
所述的金属氯化物为氯化钾、氯化铁、氯化亚铁、氯化钠中的一种或多种。
所述的载体蛋白为牛血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白中的一种或多种。
所述的显色液为TMB、DAB、OPD中的一种或多种。
本发明涉及的免疫层析试纸条中，以蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点纳米复合材料标记抗呕吐毒素单克隆抗体为探针，同其它基于胶体金等标记载体用于食品中呕吐毒素残留检测的免疫层析试纸条相比，所制备的新型免疫层析试纸条具有信号放大、检测范围宽、灵敏度高、响应速度快、重复性好、准确度高的优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行描述：
实施例1
具体步骤如下：
（1）采用水热合成方法制备蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点纳米复合材料，首先将5.0 g FeCl3·6H2O溶于50 mL去离子水中，加热至70 ℃，然后将5 mL NH3·H2O(30% v/v)加入到混合溶液中，在70 ℃下剧烈搅拌1.0 h。待合成的悬浮液冷却到室温后，用磁铁将固相分离，并用30 mL的去离子水清洗。合成的Fe2O3纳米粒子在60 ℃下干燥3 h。将1.0 gFe2O3分散至含有3.0 mL NH3·H2O (30% v/v)、100 mL无水乙醇和100 mL去离子水的溶液中，超声波处理10 min后，加入1.0 mL正硅酸甲酯溶液，在20 ℃下搅拌8 h，用磁铁收集固形物，用50 mL去离子水清洗并在50 ℃下干燥5 h即得到的磁性多孔纳米酶。再将0.05 g磁性多孔纳米酶粒子分散在pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，超声波处理15 min。然后，加入交联剂和10 mL量子点溶液。在25 ℃下在往复振荡器中反应12小时后，获得了磁性多孔纳米酶/量子点纳米复合材料。将2 mL 0.4 mmol亚铁氰化钾和2 mL0.4 mmoL的氯化亚铁溶液混合，逐滴加入到磁性多孔纳米酶/量子点纳米复合材料中，在室温下搅拌1 h，静置5 h，最后用离心机将沉淀从溶液中分离出来，并用去离子水洗涤2次，在50 ℃下真空干燥6 h，即得到蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点纳米复合材料。
（2）将0.5 mL的蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点纳米复合材料溶液与1 μL的抗呕吐毒素单克隆抗体（0.5 mg/mL）溶液混合，在室温下孵育40 min，随后，加入牛血清蛋白溶液，在2 ℃下孵育3 h，磁纯化后，即得到蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点-抗呕吐毒素单克隆抗体纳米探针。
（3）双重信号放大免疫层析试纸条用于呕吐毒素的检测：首先进行免疫层析试纸条的制备，用缓冲液对样品垫进行预处理，并在20 ℃下干燥过夜。将0.5 mg/ mL呕吐毒素半抗原-牛血清蛋白偶联物以0.6 μL /cm的速度铺在硝化纤维素膜上，形成检测区。0.3mg/mL山羊抗小鼠IgG抗体以0.5 μL/cm的速度涂抹于硝酸纤维素膜上，形成质检区，其中检测区与质检区之间的距离为3 mm。然后，将待检测样品与蓝色磁性双纳米酶/量子点-抗呕吐毒素单克隆抗体混合于试管中，孵育15 min，磁选富集后，将其滴在样品垫上。当T线不显色，C线显蓝色时，即结果为阳性；当T、C线都为蓝色时，即结果为阴性；待显色结束，向T线上滴加显色液和H2O2溶液，再观察其显色变化情况，进行定性检测。待试纸条完全干燥后用特定波长紫外光照射T线2 min，来定量检测样品中呕吐毒素的含量。
实施例2
具体步骤如下：
（1）采用水热合成方法制备蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点纳米复合材料，首先将8.5 gCoCl2·6H2O溶于80 mL去离子水中，加热至80 ℃，然后将15 mL NH3·H2O(30% v/v)加入到混合溶液中，在80 ℃下剧烈搅拌2 h。待合成的悬浮液冷却到室温后，用磁铁将固相分离，并用45 mL的去离子水清洗。合成的Co2O3纳米粒子在60 ℃下干燥5 h。将2.5 g Co2O3分散至含有4.5 mL NH3·H2O (30% v/v)、250 mL无水乙醇和150 mL去离子水的溶液中，超声波处理20 min后，加入3.0 mL正硅酸乙酯溶液，在40 ℃下搅拌10 h，用磁铁收集固形物，用150 mL去离子水清洗并在80 ℃下干燥6 h即得到的磁性多孔纳米酶。再将0.1 g磁性多孔纳米酶粒子分散在pH为8.0的磷酸盐缓冲溶液中，超声处理25 min。然后，加入交联剂和45 mL量子点溶液。在35 ℃下在往复振荡器中反应20小时后，获得了磁性多孔纳米酶/量子点纳米复合材料。将8 mL 0.4 mmol亚铁氰化钠和8 mL0.4 mmoL的氯化钠溶液混合，逐滴加入到磁性多孔纳米酶/量子点纳米复合材料中，在室温下搅拌3 h，静置10 h，最后用离心机将沉淀从溶液中分离出来，并用去离子水洗涤3次，在60 ℃下真空干燥12 h，即得到蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点纳米复合材料。
（2）将0.8 mL的蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点纳米复合材料溶液与2 μL的抗呕吐毒素单克隆抗体（1.0 mg/mL）溶液混合，在室温下孵育30 min，随后，加入卵清蛋白溶液，在4 ℃下孵育4 h，磁纯化后，即得到蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点-抗呕吐毒素单克隆抗体纳米探针。
（3）首先进行免疫层析试纸条的制备，用缓冲液对样品垫进行预处理，并在30 ℃下干燥过夜。将1.0 mg/ mL呕吐毒素半抗原-卵清蛋白偶联物以0.1 μL /cm的速度铺在硝化纤维素膜上，形成检测区。0.5 mg/mL山羊抗小鼠IgG抗体以1.0 μL/cm的速度涂抹于硝酸纤维素膜上，形成质检区，其中检测区与质检区之间的距离为5 mm。然后，将待检测样品与蓝色磁性双纳米酶/量子点-抗呕吐毒素单克隆抗体混合于试管中，孵育20 min，磁选富集后，将其滴在样品垫上。当T线不显色，C线显蓝色时，即结果为阳性；当T、C线都为蓝色时，即结果为阴性；待显色结束，向T线上滴加显色液和H2O2溶液，再观察其显色变化情况，进行定性检测。待试纸条完全干燥后用特定波长紫外光照射T线4 min，来定量检测样品中呕吐毒素的含量。
所制备的免疫层析试纸条对呕吐毒素的检测具有准确度高，线性范围宽，检测下限低的特点。同时，对实际样品(如小麦、玉米中的呕吐毒素)的检测结果表明所制备的免疫层析试纸条具有非常好的实际应用价值。
以上实施例只是为了说明本发明，而不是对本发明的限制。在上述说明的基础上，可以对本发明作许多改进和改变。在所附权利要求书的范围内，本发明可以有不同于上述的其它实现方式，选用其它试剂材料、调整分散时间等方法均在本发明专利要求范围之内。

Claims (4)

1.一种基于蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点双重信号放大呕吐毒素免疫层析试纸条的制备，其特征在于，包括以下步骤：
（1）蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点纳米复合材料的制备：采用水热合成方法制备蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点纳米复合材料，首先将5.0~10.0 g水合磁性金属氯化物溶于50~100 mL去离子水中，加热至70~90 ℃，然后将5~20 mL NH3·H2O(30% v/v)加入到混合溶液中，在70~90 ℃下剧烈搅拌1.0~3.0 h；待合成的悬浮液冷却到室温后，用磁铁将固相分离，并用10~50 mL的去离子水清洗；
合成的磁性金属氧化物纳米粒子在50~80 ℃下干燥3~8 h；将1.0~5.0 g磁性金属氧化物分散至含有1.0~5.0 mL NH3·H2O (30% v/v)、100~500 mL无水乙醇和50~200 mL去离子水的溶液中，超声波处理10~30 min后，加入1.0~5.0 mL正硅酸酯溶液，在20~50 ℃下搅拌6~24 h，用磁铁收集固形物，用50~200 mL去离子水清洗并在50~150 ℃下干燥5~12 h即得到的磁性多孔纳米酶；再将0.05~0.30 g磁性多孔纳米酶粒子分散在pH为7.0~9.0的磷酸盐缓冲溶液中，超声波处理15~30 min；然后，加入交联剂和10~50 mL量子点溶液；在20~40 ℃下在往复振荡器中反应12~48小时后，获得了磁性多孔纳米酶/量子点纳米复合材料；将2~10mL 0.4 mmol金属氰化物和2~10 mL 0.4 mmoL的金属氯化物溶液混合，逐滴加入到磁性多孔纳米酶/量子点纳米复合材料中，在室温下搅拌1~5 h，静置5~12 h，最后用离心机将沉淀从溶液中分离出来，并用去离子水洗涤2~5次，在50~80℃下真空干燥6~24 h，即得到蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点纳米复合材料；
（2）蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点-抗呕吐毒素单克隆抗体纳米探针的制备：将0.5~1.0 mL的蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点纳米复合材料溶液与1~3 μL的抗呕吐毒素单克隆抗体（0.5~2.0 mg/mL）溶液混合，在室温下孵育15~60 min，随后，加入载体蛋白溶液，在2~8℃下孵育1~5 h，磁纯化后，即得到蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点-抗呕吐毒素单克隆抗体纳米探针；
（3）双重信号放大免疫层析试纸条用于呕吐毒素的检测：首先进行免疫层析试纸条的制备，用缓冲液对样品垫进行预处理，并在20~40 ℃下干燥过夜；
将0.5~1.5 mg/ mL呕吐毒素半抗原-载体蛋白偶联物以0.6~0.12 μL /cm的速度铺在硝化纤维素膜上，形成检测区；0.3~0.8 mg/mL山羊抗小鼠IgG抗体以0.5~1.5 μL/cm的速度涂抹于硝酸纤维素膜上，形成质检区，其中检测区与质检区之间的距离为3~8 mm；然后，将待检测样品与蓝色磁性双纳米酶/量子点-抗呕吐毒素单克隆抗体混合于试管中，孵育5~20min，磁选富集后，将其滴在样品垫上；当T线不显色，C线显蓝色时，即结果为阳性；当T、C线都为蓝色时，即结果为阴性；待显色结束，向T线上滴加显色液和H2O2溶液，再观察其显色变化情况，进行定性检测；待试纸条完全干燥后用特定波长紫外光照射T线2~4 min，来定量检测样品中呕吐毒素的含量。
2.根据权利要求1所述的一种基于蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点双重信号放大呕吐毒素免疫层析试纸条的制备，其特征在于，步骤（1）中，所述的水合磁性金属氯化物为FeCl3·6H2O、CoCl2·6H2O、NiCl2·6H2O、FeCl2·4H2O中的一种或者多种；所述的磁性金属氧化物为Co2O3、Fe2O3、Ni2O3、Co3O4、Fe3O4、Ni3O4中的一种或多种；所述的正硅酸酯溶液为正硅酸甲酯（TMOS）、正硅酸乙酯（TEOS）、正硅酸丙酯（TPOS）、正硅酸丁酯（TBOS）中的一种或多种；所述的金属氰化合物为亚铁氰化钾、铁氰酸钾、亚铁氰化钠、高铁氰化钾中的一种或者多种；所述的金属氯化物为氯化钾、氯化铁、氯化亚铁、氯化钠中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种基于蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点双重信号放大呕吐毒素免疫层析试纸条的制备，其特征在于，步骤（2）中所述的载体蛋白为牛血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的一种基于蓝色磁性多孔双纳米酶/量子点双重信号放大呕吐毒素免疫层析试纸条的制备，其特征在于，步骤（3）中所述的载体蛋白为牛血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白中的一种或多种；所述的显色液为TMB、DAB、OPD中的一种或多种。
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