CN113588523B - 一种用于质谱流式细胞技术的基于框架结构的纳米颗粒及其制备方法 - Google Patents

一种用于质谱流式细胞技术的基于框架结构的纳米颗粒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于质谱流式细胞技术的基于框架结构的纳米颗粒及其制备方法，所述纳米颗粒包含金属离子、抗体和通过连接子将有机配体相互连接形成的配位网络框架，其中，金属离子结合于有机配体上。连接子是官能度为n的有机连接子或者配位数为n的金属簇，n大于等于2。抗体通过接枝剂与有机配体或者连接子连接。本发明能够负载多种金属同位素，并且负载量高，能够在流式质谱检测中提供高灵敏度、可用金属同位素通道数多的金属检测信号，实现更多细胞参数同时测量的单细胞蛋白分析检测，为基因层面的疾病精确诊断、生物医学的研发检测提供重要的分析工具。

Description

一种用于质谱流式细胞技术的基于框架结构的纳米颗粒及其 制备方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种基于流式结合ICP-MS的单细胞蛋白检测技术的标记抗体的结合金属的框架结构的纳米颗粒材料。
背景技术
质谱流式技术(Mass Cytometry)集成了质谱和流式细胞仪的原理，通过金属标记的抗体对细胞表面抗原蛋白进行特异性识别，实现对每一个细胞表达的抗原蛋白种类和数量进行多参数、高通量的定性分析，进而为基因层面的疾病精确诊断、生物医学的研发检测提供重要的分析工具。它继承了传统流式细胞仪的高速分析的特点，又具有质谱检测的高分辨能力以及多样化数据处理等技术优势，由于质谱细胞仪较传统荧光流式细胞仪测量的参数更多且通道之间没有干扰，并且不需要进行荧光补偿计算，因此大幅拓展了单样本的数据产出量和检测范围，使数据更全面，结果更可靠，已成为单细胞蛋白表达分析的一个新方向，在临床医学与生物研究领域里得到了越来越广泛的应用。
然而目前的流式质谱技术还存在可用的金属同位素通道数少、灵敏度不够高的问题，主要原因一方面在于现有商用的金属抗体标签能够负载的金属种类数仅有不到40种镧系金属同位素，而一种金属同位素对应一种标记抗体和抗原的组合，因此对于特征蛋白种类数更多的细胞无法满足更高水平的多参数检测；另一方面，由于现有单个的金属抗体标签的金属原子个数仅有100左右，一个抗体结合2-4个金属标签，而流式质谱仪的检测需要达到上万个金属原子数才会有较好的灵敏度，意味着现有的金属标记只对蛋白含量高表达(一个细胞表面的某种蛋白抗原数量达到上百个)的细胞有很好的检测效果，对于低表达的抗原蛋白的标记检测还存在限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于质谱流式细胞技术的新型金属抗体标记纳米颗粒及其制备方法，是表面接枝抗体、结合金属元素的框架结构的纳米颗粒，目前能够结合非镧系的金属元素、同时单个纳米颗粒的金属离子负载量可达到103-104个，解决现有商用金属抗体标签可用金属通道数少、单个金属标签灵敏度不够高的问题，将检测通道数扩展至原子量75-210的135种通道。
本发明采用的技术方案具体如下：
一种用于质谱流式细胞技术的能够连接抗体的基于框架结构的纳米颗粒，所述纳米颗粒包含金属离子、抗体和通过连接子将有机配体相互连接形成的配位网络框架，其中，金属离子结合于有机配体上。所述连接子是官能度为n的有机连接子或者配位数为n的金属簇，n大于等于2。所述抗体通过接枝剂与有机配体或者连接子连接。
本发明的纳米颗粒的配位网络框架是有机配体与连接子通过共价键或者配位键自组装形成的多孔网络，每一个结构单元都有可以结合金属的功能基团，并且其结构单元的数量可以保证金属原子的高负载量，其结构单元的可变性可适用于各种不同类型的金属元素在框架中的负载；此外，框架表面通过化学修饰接枝官能团，能够与抗体上的相应基团成键实现接枝。
进一步地，所述有机配体由如下中的一种或几种结构混合组成：
Figure BDA0003180119210000021
上述有机配体依次为邻苯二巯基、联吡啶、2，2’-二酚羟基-联苯、双水杨醛缩二胺、卟啉、脱六氢三苯环烯等结构，其中，A取代基参与连接形成配位网络，R1～R8为其它取代基。
进一步地，所述连接子为金属簇时，有机配体的A取代基末端为羧基、位于邻苯二酚上的羟基、吡啶基、吡嗪基、咪唑基、三唑基、四唑基、吡唑基等。
具体地，优选为如下所示结构：
Figure BDA0003180119210000031
进一步地，所述有机配体的A取代基末端与有机连接子末端的配对反应基团组合包括氨基+醛基、邻苯二酚羟基+硼酸基、氨基+硝基、醛基+邻苯二氨基、酰氯基(-COCl)+氨基、邻苯二酸酐基+氨基、氰基+醛基、邻苯醌基+邻苯二氨基、邻苯二酚羟基+邻二氟苯基等。
其中，邻苯二酸酐基、邻苯醌基、邻苯二氨基、邻二氟苯基结构如下所示：
Figure BDA0003180119210000032
具体的基团组合及成键连接形式如表1所示，表1所示组合形式能够形成稳固的纳米框架结构。
表1有机配体的A取代基末端与连接子末端的反应基团配对组合
Figure BDA0003180119210000033
Figure BDA0003180119210000041
进一步地，所述金属离子的原子量为75-210。
进一步地，所述接枝剂是双官能度的线性结构分子，头部一端与有机配体或者连接子上的相应取代基团通过点击反应成键结合，末尾一端与抗体上的氨基或者二硫键还原的巯基通过点击反应成键结合。点击反应是一类反应条件温和、在较短时间内有高反应效率的反应，
进一步地，所述接枝剂末尾一端的基团为N-羟基琥珀酰亚胺基，五氟苯酚酯基、羧基、醛基、马来酰亚胺基，乙烯基砜基等。其中，N-羟基琥珀酰亚胺基、五氟苯酚酯基、马来酰亚胺基，乙烯基砜基结构如下所示：
Figure BDA0003180119210000042
进一步地，所述接枝剂头部与有机配体或者连接子的基团组合如表2所示。
表2 接枝剂头部与框架表面点击反应的基团组合
有机配体或者连接子的取代基 接枝剂头部
氨基 N-羟基琥珀酰亚胺基，五氟苯酚酯基、羧基、醛基
巯基 马来酰亚胺基，乙烯基砜基
羧基 氨基
叠氮基 炔基
炔基 叠氮基
羟基 氯代硅氧烷基Cl-Si(CH<sub>3</sub>)<sub>2</sub>-
所述接枝剂头部与抗体点击反应的基团组合如表3所示
表3 接枝剂尾部与抗体点击反应的基团组合
抗体基团 接枝剂尾部基团
氨基 N-羟基琥珀酰亚胺基，五氟苯酚酯基、羧基、醛基
巯基 马来酰亚胺基，乙烯基砜基
进一步地，所述配位网络框架直径为20-200nm。
本发明通过理性设计合成制备出能够结合金属的框架结构纳米颗粒材料，作为抗体的金属标记物，用于流式质谱的单细胞蛋白检测的标记材料。
本发明还提供了一种上述纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成纳米框架结构：将1-30重量份的有机配体和0.5-10重量份的连接子、500-3000重量份的有机溶剂混合，加热到35-150℃，搅拌反应0.5-24小时，得到含有纳米框架结构的分散液，再往合成好的纳米框架分散液中加入0.1-1重量份的金属盐，加热到35-120℃，搅拌反应0.5-24小时，得到含有金属的纳米框架材料分散液；
或直接将1-30重量份的含有金属离子的有机配体和0.5-10重量份的连接子、500-3000重量份的有机溶剂混合，加热到35-150℃，搅拌反应0.5-24小时，得到含有金属的纳米框架材料分散液。其中，有机溶剂为可以溶解参与反应的有机配体和连接子的试剂。
(2)连接抗体：将含有金属的纳米框架材料分散液离心分离去除有机溶剂，加20-100重量份的去离子水重分散，再往含有金属的纳米框架材料的水分散液中加入0.2-5重量份的接枝剂，室温下反应0.5-12小时，透析分离游离的接枝剂，再加入0.01-0.1重量份的抗体，室温下反应0.5-2小时，再透析分离游离的抗体，得到所述纳米颗粒。
本发明的创新点及有益效果：
1.高负载量：通过纳米框架负载金属，相比现有的聚合物线性链的金属载体能够极大提高金属负载量，进而提高检测灵敏度。目前商用的聚合物抗体标签，一条链上最多仅能负载100个左右金属离子，而一个抗体平均连接3条链，根据流式质谱的检测限，一个细胞上至少需要上万个金属离子的信号，对应一个细胞至少结合上百个抗体才能有标记效果，意味着对于低表达蛋白的检测有着很大限制；而本发明的三维框架结构极大提高金属负载量后，单个标签的金属负载量至少提高一个数量级，对于一个细胞结合十几个甚至更少的框架结构抗体标签就能得到同等的灵敏度，为低丰度蛋白表达的检测提供了便利。
2.方便更多种类金属的负载：本发明制备的框架材料，首先框架结构的类型组合灵活多变，可以针对不同的金属设计采用含有合适功能基团的结构单元，从而适应多种金属元素；其次，由于金属是在框架结构内部结合，不可能在纳米颗粒之间形成交联点，从而避免了现有的聚合物线性链的金属载体结合某些金属离子造成的交联聚集问题。
综上所述，本发明的框架结构纳米颗粒，内部有机配体的结构对于多种金属元素都有很强的结合能力，一方面能够极大增加金属负载量提高信号灵敏度，另一方面能够方便的以一种框架结构负载不同的金属同位素，尤其是镧系以外的金属元素，极大拓展现有可用的金属同位素的检测通道，为流式质谱单细胞蛋白的多通道高精度检测提供关键新材料。
附图说明
图1为本发明能够结合金属的框架结构的金属抗体标签的制备过程示意图；
图2为邻苯二巯基结构的有机配体结合金属示意图；
图3为联吡啶结构的有机配体结合金属示意图；
图4为2，2’-二酚羟基-联苯结构的有机配体结合金属示意图；
图5为双水杨醛缩二胺结构的有机配体结合金属示意图；
图6为卟啉结构的有机配体结合金属示意图；
图7为脱六氢三苯环烯结构的有机配体结合金属示意图；
图8为实施例1的有机配体、接枝剂、框架纳米颗粒的重复结构单元的化学结构示意图；
图9为实施例2的有机配体、接枝剂、框架纳米颗粒的重复结构单元的化学结构示意图；
图10为实施例3的有机配体、接枝剂、框架纳米颗粒的重复结构单元的化学结构示意图；
图11为实施例4的有机配体、连接子、接枝剂、框架纳米颗粒的重复结构单元的化学结构示意图；
图12为实施例5的有机配体、连接子、接枝剂、框架纳米颗粒的重复结构单元的化学结构示意图；
图13为实施例6的有机配体、连接子、接枝剂、框架纳米颗粒的重复结构单元的化学结构示意图；
图14为实施例1，Pt-195标记的抗体PD-1对阴阳细胞的染色分群效果图；
图15为实施例2，Sn-120标记的抗体CD-4对阴阳细胞的染色分群效果图；
图16为实施例3，Zr-90标记的抗体lgD对阴阳细胞的染色分群效果图；
图17为实施例4，Tm-169标记的抗体ICOS对阴阳细胞的染色分群效果图；
图18为实施例5，Pd-104标记的抗体TCR Va7.2对阴阳细胞的染色分群效果图；
图19为实施例6，Yb-171标记的抗体CCR7对阴阳细胞的染色分群效果图。
具体实施方式
本发明提供的含有金属元素的框架结构纳米颗粒材料，首先能够通过灵活的变换框架纳米颗粒的结构单元的功能基团，实现多种金属同位素的有效负载，使得可用的检测通道扩展到质谱可检测范围，即分子量75-210的一百多种同位素通道，实现更高水平的多参数同步标记检测。同时通过表面化学修饰偶联抗体，能够高效牢固的接枝抗体，并且不影响抗体特异性识别目标细胞群。此外，可以通过控制纳米颗粒的尺寸来调节结构单元数，从而调节金属离子负载的数量，使得一个纳米颗粒可以负载的金属离子数量能够达到103-104个，极大提高单个金属标签的金属信号强度，有利于实现细胞上低表达的抗原蛋白标记结合后的灵敏检测。
具体地，本发明提供的纳米框架材料通过两步法合成得到，如图1所示，第一步是有机配体与连接子配位自组装形成框架结构，再负载金属，或者第一步直接用含有金属的有机配体与连接子自组装得到框架结构；第二步是在框架结构表面引入接枝剂，再在接枝剂末端接枝抗体，得到作为金属抗体标签的纳米颗粒。
其中第一步中的有机配体，其主要结合金属的部分如图2-7所示，其A取代基末端与连接子的末端基团的键合有很多种组合形式，如表1所示，从而得到多种自组装的框架结构；而金属离子可以是原子量75-210的所有金属。
第二步中在框架表面引入接枝剂，是通过接枝剂的头基与框架上的有机配体取代基或者连接子的取代基之间的点击反应键合实现的，然后再利用接枝剂尾基与抗体上的基团通过点击反应键合，最终得到结合金属并且连接抗体的纳米框架材料。其中两步的点击反应的基团也有很多组合形式，如表2所示，能够提供很多种连接策略。
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明：
实施例1
基于邻苯二巯基结合金属的框架材料(1)，由2，3-二巯基-6-叠氮基-1，4-对苯二甲酸的有机配体与锆金属簇的连接子配位自组装形成框架结构纳米颗粒，使用PtCl4作为金属试剂将Pt负载到框架中，使用CH≡C-CH2-CH2-O-CH2-MAH作为接枝剂，通过头基碳碳三键与有机配体取代基上的叠氮基键合连接，通过尾基的-MAH与抗体上经还原二硫键得到的巯基键合连接。所用的有机配体、接枝剂、得到框架纳米颗粒的重复结构单元如图8所示。具体制备方法如下：
1)将50mg的2，3-二巯基-6-叠氮基-1，4-对苯二甲酸与150mg的八水合氯氧化锆一起加入到50g的DMF溶液中充分搅拌溶解，加热至90℃，反应2小时后，再将混合液在15000xg下离心30min，吸取去掉上清液后得到框架结构的纳米颗粒。
2)加5g DMF重悬分散离心后收取的纳米颗粒，再加入500μL浓度为20mg/ml的PtCl4的DMF溶液，加热至120℃，反应24小时后，再将混合液在15000xg下离心20min，吸取去掉上清液后得到负载了金属Pt的框架结构纳米颗粒。
3)加入2g去离子水重悬分散收取的负载了Pt的框架结构纳米颗粒，用截留分子量300KD的透析袋，在400ml的去离子水中透析3次，每次至少2小时，彻底分离游离的有机溶剂分子和金属离子；然后加入10mg接枝剂CH≡C-CH2-CH2-O-CH2-MAH，充分混合溶解后室温反应1小时；用截留分子量300KD的透析袋，在400ml的去离子水中透析3次，每次至少2小时；在透析的同时准备好抗体二硫键的还原：对100μg的抗体，加入100μL的4mM的TCEP在PBSbuffer中反应0.5小时，再用3KD的截留管12000xg离心30min分离TCEP，再加入300μL的PBSbuffer重悬。
4)将透析除去多余接枝剂的框架结构纳米颗粒和还原了二硫键的抗体混合，室温下反应1小时，最后再用截留分子量300KD的透析袋，在400ml的去离子水中透析3次，每次至少2小时，分离游离抗体，最终得到连接了抗体的负载Pt的框架结构纳米颗粒。
实施例2
基于联吡啶结合金属的框架材料(2)，由2,2'-联吡啶-5,5'-对二苯甲酸与锆金属簇的连接子配位自组装形成框架结构纳米颗粒，使用SnCl2·2H2O作为金属试剂将Sn负载到框架中，使用Cl-Si(CH3)2-CH2-CH2-O-CH2-NHS作为接枝剂，通过头基Cl-Si(CH3)2-与锆金属簇上的羟基键合连接，通过尾基的-NHS基团与抗体上的氨基键合连接。所用的有机配体、接枝剂、得到框架纳米颗粒的重复结构单元如图9所示。具体制备方法如下：
1)将30mg的2,2'-联吡啶-5,5'-对二苯甲酸与150mg的八水合氯氧化锆一起加入到50g的DMF溶液中充分搅拌溶解，加热至90℃，反应5小时后，再将混合液在15000xg下离心30min，吸取去掉上清液后得到框架结构的纳米颗粒。
2)加5g DMF重悬分散离心后收取的纳米颗粒，再加入500μL浓度为20mg/ml的SnCl2.2H2O的DMF溶液，加热至35℃，反应0.5小时后，再将混合液在15000xg下离心20min，吸取去掉上清液后得到负载了金属Sn的框架结构纳米颗粒。
3)加入2g去离子水重悬分散收取的负载了Sn的框架结构纳米颗粒，用截留分子量300KD的透析袋，在400ml的去离子水中透析3次，每次至少2小时，彻底分离游离的有机溶剂分子和金属离子；然后加入10mg接枝剂Cl-Si(CH3)2-CH2-CH2-O-CH2-NHS，充分混合溶解后室温反应12小时；然后再用截留分子量300KD的透析袋，在400ml的去离子水中透析3次，每次至少2小时；。
4)将透析除去多余接枝剂的框架结构纳米颗粒和100μg抗体在100μL PBS buffer中混合，室温下反应1小时，最后再用截留分子量300KD的透析袋，在400ml的去离子水中透析3次，每次至少2小时，分离游离抗体，最终得到连接了抗体的负载Sn的框架结构纳米颗粒。
实施例3
基于2，2’-二酚羟基-联苯结合金属的框架材料(3)，由2,2-二酚羟基-5,5-二炔基-1,1’-联苯-4,4’-联吡啶与锌离子配位自组装形成框架结构的纳米颗粒，使用ZrCl4作为金属试剂将Zr负载到框架中，使用N3-CH2-CH2-O-CH2-NHS作为接枝剂，通过头基叠氮基与有机配体取代基上的碳碳三键进行键合连接，通过尾基的N-羟基琥珀酰亚胺基与抗体上的氨基键合连接。所用的有机配体、接枝剂、得到框架纳米颗粒的重复结构单元如图10所示。具体制备方法如下：
1)将50mg的2,2-二酚羟基-5,5-二炔基-1,1’-联苯-4,4’-联吡啶与150mg的硝酸锌一起加入到50ml的甲醇溶液中充分搅拌溶解，加热至35℃，反应0.5小时后，再将混合液在15000xg下离心30min，吸取去掉上清液后得到框架结构的纳米颗粒。
2)加5g DMSO重悬分散离心后收取的纳米颗粒，再加入500μL浓度为20mg/ml的ZrCl4的DMF溶液，加热至45℃，反应12小时后，再将混合液在15000xg下离心20min，吸取去掉上清液后得到负载了金属Zr的框架结构纳米颗粒。
3)加入2g去离子水重悬分散收取的负载了Zr的框架结构纳米颗粒，用截留分子量300KD的透析袋，在400ml的去离子水中透析3次，每次至少2小时，彻底分离游离的有机溶剂分子和金属离子；然后加入10mg接枝剂N3-CH2-CH2-O-CH2-NHS，充分混合溶解后室温反应2小时；然后再用截留分子量300KD的透析袋，在400ml的去离子水中透析3次，每次至少2小时；
将透析除去多余接枝剂的框架结构纳米颗粒和100μg抗体在100μL PBS buffer中混合，室温下反应1小时，最后再用截留分子量300KD的透析袋，在400ml的去离子水中透析3次，每次至少2小时，分离游离抗体，最终得到连接了抗体的负载Zr的框架结构纳米颗粒。
实施例4
基于双水杨醛缩二胺结合金属的框架材料(4)，由四(3-醛基-4-酚羟基苯基)甲烷和4-巯基-1,2二苯胺通过醛基与氨基的缩合反应自组装得到框架结构的纳米颗粒，使用TmCl3作为金属试剂将Tm负载到框架中，使用MAH-CH2-CH2-O-CH2-COOH作为接枝剂，通过头基-MAH与连接子取代基上的巯基进行键合连接，通过尾基的羧基在N,N'-二异丙基碳二亚胺催化下与抗体的氨基键合连接。所用的有机配体、连接子、接枝剂、得到框架纳米颗粒的重复结构单元如图11所示。具体制备方法如下：
1)将50mg的四(3-醛基-4-酚羟基苯基)甲烷与120mg的4-巯基-1,2二苯胺一起加入到100g的DMF溶液中充分搅拌溶解，加热至120℃，反应12小时后，再将混合液在15000xg下离心30min，吸取去掉上清液后得到框架结构的纳米颗粒。
2)加5g水重悬分散离心后收取的纳米颗粒，再加入500μL浓度为20mg/ml的TmCl3的水溶液，加热至60℃，反应6小时后，再将混合液在15000xg下离心20min，吸取去掉上清液后得到负载了金属Tm的框架结构纳米颗粒。
3)加入2g去离子水重悬分散收取的负载了Tm的框架结构纳米颗粒，用截留分子量300KD的透析袋，在400ml的去离子水中透析3次，每次至少2小时，彻底分离游离的有机溶剂分子和金属离子；然后加入10mg接枝剂MAH-CH2-CH2-O-CH2-COOH，充分混合溶解后室温反应1小时；然后再用截留分子量300KD的透析袋，在400ml的去离子水中透析3次，每次至少2小时。
将透析除去多余接枝剂的框架结构纳米颗粒和100μg抗体在100μL PBS buffer中混合，并加入2μL 0.2M的N,N'-二异丙基碳二亚胺的DMSO溶液，混匀后在室温下反应2小时，最后再用截留分子量300KD的透析袋，在400ml的去离子水中透析3次，每次至少2小时，分离游离抗体，最终得到连接了抗体的负载Tm的框架结构纳米颗粒。
实施例5
基于卟啉结合金属的框架材料(5)，由钯负载的5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉和四(3-炔基-4-醛基苯基)甲烷自组装得到框架结构的纳米颗粒，使用Pd(NO3)3作为金属试剂将Pd负载到框架中，使用N3-CH2-CH2-O-CH2-MAH作为接枝剂，通过头基叠氮基与连接子取代基上的碳碳三键进行键合连接，通过尾基的-MAH与抗体上经还原二硫键得到的巯基键合连接。所用的有机配体、连接子、接枝剂、得到框架纳米颗粒的重复结构单元如图12所示。具体制备方法如下：
1)将50mg的钯负载的5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉与120mg的四(3-炔基-4-醛基苯基)甲烷一起加入到100ml的DMF溶液中充分搅拌溶解，加热至150℃，反应24小时后，再将混合液在15000xg下离心30min，吸取去掉上清液后得到负载了金属Pd的框架结构的纳米颗粒。
2)加入2g去离子水重悬分散收取的负载了Pd的框架结构纳米颗粒，用截留分子量300KD的透析袋，在400ml的去离子水中透析3次，每次至少2小时，彻底分离游离的有机溶剂分子和金属离子；然后加入10mg的接枝剂N3-CH2-CH2-O-CH2-MAH，充分混合溶解后室温反应1小时；然后再用截留分子量300KD的透析袋，在400ml的去离子水中透析3次，每次至少2小时；在透析的同时准备好抗体二硫键的还原，对100μg的抗体，加入100μL的4mM的TCEP在PBSbuffer中反应半小时，再用3KD的截留管12000xg离心30min分离TCEP，再加入300μL的PBSbuffer重悬。
将透析除去多余接枝剂的框架结构纳米颗粒和还原了二硫键的抗体混合，室温下反应1小时，最后再用截留分子量300KD的透析袋，在400ml的去离子水中透析3次，每次至少2小时，分离游离抗体，最终得到连接了抗体的负载Tm的框架结构纳米颗粒。
实施例6
基于脱六氢三苯环烯结合金属的框架材料(6)，由脱氢苯并环戊烯(DBA)与四-(3-巯基-4-二羟基硼基苯基)甲烷(TBPM)通过酚羟基与硼酸基缩合反应自组装得到框架结构的纳米颗粒，使用YbCl3作为金属试剂将Yb负载到框架中，使用MAH-CH2-CH2-O-CH2-NHS作为接枝剂，通过头基的-MAH基团与连接子上的取代基巯基键合连接，通过尾基的环氧基与抗体上的氨基键合连接。所用的有机配体、连接子、接枝剂、得到框架纳米颗粒的重复结构单元如图13所示。具体制备方法如下：
1)将50mg的脱氢苯并环戊烯(DBA)与100mg的四-(2-巯基-4-二羟基硼基苯基)甲烷(TBPM)一起加入到150g的DMF溶液中充分搅拌溶解，加热至150℃，反应24小时后，再将混合液在15000xg下离心30min，吸取去掉上清液后得到框架结构的纳米颗粒。
2)加5g水重悬分散离心后收取的纳米颗粒，再加入500μL浓度为20mg/ml的YbCl3的水溶液，加热至60℃，反应6小时后，再将混合液在15000xg下离心20min，吸取去掉上清液后得到负载了金属Yb的框架结构纳米颗粒。
3)加入2g去离子水重悬分散收取的负载了Yb的框架结构纳米颗粒，用截留分子量300KD的透析袋，在400ml的去离子水中透析3次，每次至少2小时，彻底分离游离的有机溶剂分子和金属离子；然后加入10mg接枝剂MAH-CH2-CH2-O-CH2-NHS，充分混合溶解后室温反应1小时；然后再用截留分子量300KD的透析袋，在400ml的去离子水中透析3次，每次至少2小时。
4)将透析除去多余接枝剂的框架结构纳米颗粒和100μg抗体在100μL PBS buffer中混合，室温下反应1小时，最后再用截留分子量300KD的透析袋，在400ml的去离子水中透析3次，每次至少2小时，分离游离抗体，最终得到连接了抗体的负载Yb的框架结构纳米颗粒。
利用纳米粒度电位分析仪Zetasizer Nano-ZS测实施例1-6得到的纳米颗粒的粒径和粒径分布，并将实施例1-6得到的纳米颗粒的水分散液静置六个月后观察其有无聚集和沉降判断稳定性好坏，结果如表4所示，表明：各个粒径下的纳米颗粒都具有较窄的尺寸分布和良好的分散稳定性。
表4 框架结构的纳米颗粒的粒径、分布和分散稳定性
实施例 平均粒径/nm 粒径分布(Cv/％) 分散稳定性
1 100 6％ 好
2 40 8％ 好
3 60 7％ 好
4 80 6％ 好
5 20 10％ 好
6 200 8％ 好
利用ICP-MS测试样品液中的金属离子浓度，进而计算得到单个纳米颗粒的金属负载量，结果如表5所示，表明纳米颗粒能够成功负载目标金属离子并且能够通过增加粒径将负载数量提高到103-104个。
表5 框架结构的纳米颗粒金属抗体标签的金属负载量
Figure BDA0003180119210000121
利用表6中的6种胞外抗体使用6个同位素检测通道，通过对1：1混合的细胞进行标记染色检测分群效果。
表6 金属抗体标签标记结合细胞染色的实验组
实施例 抗体 克隆号 标记金属同位素
1 PD-1 EH12.2H7 Pt-195
2 CD4 RPA-T4 Sn-120
3 lgD lA6-2 Zr-90
4 TCR Va7.2 3C10 Tm-169
5 ICOS C398.4A Pd-104
6 CCR7 G043H7 Yb-171
标记细胞染色方法如下：
1、准备新鲜的正常人外周血，提取免疫细胞。
2、将免疫细胞平均分成对照组和实验组两组，每组约2×10^6个细胞，其中对照组是2×10^6个未表达目标蛋白的阴性细胞，实验组是1×10^6个表达目标蛋白的阳性细胞与1×10^6个不表达目标蛋白的阴性细胞混合。分别用PBS重悬，调节体积至1mL，加入Rh-103，室温染色5min，区分细胞死活。
3、每组加入2mL 0.5-5mg/ml牛血清白蛋白溶液，500xg离心5min，吸除上清，加入50μL封闭液(0.5μL 0.5-1.5mg/ml人免疫球蛋白溶液、0.5μL 0.5-1.5mg/ml小鼠免疫球蛋白溶液、0.5μL0.5-1.5mg/ml大鼠免疫球蛋白溶液、0.5μL 0.5-1.5mg/ml仓鼠免疫球蛋白溶液、48μL 0.5-5mg/ml牛血清蛋白溶液)，冰上封闭20min。
4、对照组加入50μL0.5-5mg/ml牛血清蛋白溶液作为空白对照，实验组加入50μL胞外抗体混合液(本发明的纳米粒子，抗体浓度为0.1-1mg/ml)，重悬细胞，冰上染色30min。
5、加入2mL0.5-5mg/ml牛血清白蛋白溶液，500xg离心5min，吸除上清，加入含有0.5v/v‰单细胞指示剂191/193Ir(201192B，fluidigm)的固定-破膜混合液(fix and permbuffer，fluidigm，201067)1ml，重悬细胞，4℃过夜。
6、加入2mL0.5-5mg/ml牛血清白蛋白溶液，800xg离心5min，吸除上清，重复2次。
7、加入2mL去离子水，800xg离心5min，吸除上清，重复2次。
8、样品过滤，细胞计数，调整体积，准备上机，进行质谱流式检测。
6种抗体染色效果结果如图14-19所示，横坐标Ir191表示染色DNA的情况，证明是细胞信号；纵坐标是对应的同位素信号强度，根据对照组得到背景信号的纵坐标值强弱，由此得到阴阳细胞的分界线，即框中圈出来的是每一类抗体的阳性细胞群占细胞总数的百分比。与对照组相比，加入抗体的免疫细胞分成了阴性和阳性两个群，证明抗体标记效果好，可将目的细胞与非目的细胞分开，抗体可用于后续实验。
以上实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。

Claims (9)

1.一种用于质谱流式细胞技术的基于框架结构的纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒包含金属离子、抗体和通过连接子将有机配体相互连接形成的配位网络框架，其中，金属离子结合于有机配体上；所述连接子是官能度为n的有机连接子或者配位数为n的金属簇，n大于等于2；所述抗体通过接枝剂与有机配体或者连接子连接；所述有机配体由如下中的一种或几种结构混合组成：
Figure FDA0003497002050000011
其中，A取代基为参与连接形成配位网络的官能团，R1～R8为其它取代基。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述连接子为金属簇时，有机配体的A取代基末端为羧基、邻苯二酚羟基、吡啶基、吡嗪基、咪唑基、三唑基、四唑基或吡唑基。
3.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述有机配体通过A取代基末端与有机连接子末端的配对反应基团组合包括氨基+醛基、邻苯二酚羟基+硼酸基、氨基+硝基、醛基+邻苯二氨基、酰氯基+氨基、邻苯二酸酐基+氨基、氰基+醛基、邻苯醌基+邻苯二氨基、邻苯二酚羟基+邻二氟苯基。
4.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述金属离子的原子量为75-210。
5.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述接枝剂是双官能度的线性结构分子，头部一端与有机配体或者连接子上的相应取代基团通过点击反应成键结合，末尾一端与抗体上的氨基或者二硫键还原的巯基通过点击反应成键结合。
6.根据权利要求5所述的纳米颗粒，其特征在于，所述接枝剂末尾一端的基团为N-羟基琥珀酰亚胺基，五氟苯酚酯基、羧基、醛基、马来酰亚胺基，乙烯基砜基或氯代硅氧烷基。
7.根据权利要求6所述的纳米颗粒，其特征在于，所述接枝剂头部与有机配体或者连接子的基团组合为
有机配体或者连接子的取代基 接枝剂头部 氨基 N-羟基琥珀酰亚胺基，五氟苯酚酯基、羧基、醛基 巯基 马来酰亚胺基，乙烯基砜基 羧基 氨基 叠氮基 炔基 炔基 叠氮基 羟基 氯代硅氧烷基Cl-Si(CH<sub>3</sub>)<sub>2</sub>-
。
8.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述配位网络框架直径为20-200nm。
9.一种权利要求1-8任一项所述纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成纳米框架结构：将1-30重量份的有机配体和0.5-10重量份的连接子、500-3000重量份的有机溶剂混合，加热到35-150℃，搅拌反应0.5-24小时，得到含有纳米框架结构的分散液，再往合成好的纳米框架分散液中加入0.1-1重量份的金属盐，加热到35-120℃，搅拌反应0.5-24小时，得到含有金属的纳米框架材料分散液；
或直接将1-30重量份的含有金属离子的有机配体和0.5-10重量份的连接子、500-3000重量份的有机溶剂混合，加热到35-150℃，搅拌反应0.5-24小时，得到含有金属的纳米框架材料分散液；
(2)连接抗体：将含有金属的纳米框架材料分散液离心分离去除有机溶剂，加20-100重量份的去离子水重分散，再往含有金属的纳米框架材料的水分散液中加入0.2-5重量份的接枝剂，室温下反应0.5-12小时，透析分离游离的接枝剂，再加入0.01-0.1重量份的抗体，室温下反应0.5-2小时，再透析分离游离的抗体，得到所述纳米颗粒。
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