CN1320974C - 水溶性纳米粒子的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备水溶性纳米粒子的方法。它是将亲水性的大分子(如蛋白质、抗体、抗原、淀粉、环糊精、亲和素、链酶亲和素、聚乙二醇、聚乙烯醇、杯芳烃等)与非极性或弱极性有机溶剂中具有特殊荧光性能或磁性的纳米颗粒直接混合，采用机械研磨的方法使包覆剂吸附在被包覆的纳米粒子上，待有机试剂完全挥发后，加入水或缓冲溶液溶解，此时，包覆剂与纳米粒子将进一步发生作用，再经过两次离心分离，便可制成纯的水溶性的纳米颗粒。该方法快速简便，成本低，可操作性强，修饰后的粒子可作为探针应用于化学、物理、生物、医学等领域。

Description

水溶性纳米粒子的制备方法
所属技术领域
本发明涉及一种制备水溶性纳米粒子的方法，所属技术领域为材料、生物、物理、化学等学科的交叉学科领域。
背景技术
近年来，纳米粒子作为探针在生物、物理、化学、医学等领域得到了越来越广泛的应用。这些体系绝大多数都是在水溶液中。然而，在水溶液中直接合成的纳米探针通常尺寸分布都很宽，探针的某些性质(如：荧光、磁性等)也不理想。为了解决这些问题，人们发展了有机相合成的方法。Peng等人[文献Peng Z A，PengX G J Am Chem Soc 2001，123：183～184]以CdO，Cd(Ac)2等镉的弱酸盐为原料，采用以TOPO等物质为溶剂，合成了尺寸均一、量子产率高的CdSe半导体纳米量子点；我们在此基础上对其方法进行改进，合成了性能优良的CdSe/ZnS核壳型半导体纳米量子点。Sun等人[文献Sun S H.Zeng H.J.Am.Chem Soc.2002，124：8204～8205]最近报道以乙酰丙酮铁为前体，在有机相中合成了尺寸均一的磁性纳米Fe3O4由于采用这类方法得到的产物，他们改变条件后可使纳米粒子的粒径在3～20nm范围内变化，而且很好的解决了纳米粒子的团聚问题。这些有机相中合成的纳米粒子外面包覆有大量的疏水性有机分子，不能直接与生物物质作用制成探针，所以要先将其表面进行修饰，制备成水溶性的纳米粒子。已有一些文献报道了将纳米粒子从有机相转移到水相的方法，如：Alivisatos等人[文献Bruchez M Jr.；Moronne M.；Gin P.；Weiss S.；Alivisatos A P.Science.1998，281，2013～2015]报道了硅烷化试剂将半导体纳米量子点包覆后，可将这些半导体纳米量子点分散在水溶液中，且稳定性很好，这一方法的缺点是：操作十分复杂，所需时间长，成本高；Chan等人[文献Chan W C W.；Nie S M.Science.1998，281，2016～2018]采用十分简单的方法将半导体纳米量子点用巯基乙酸包覆后，制得了水溶性的半导体纳米量子点，然而，这种方法制备得到的水溶性纳米量子点稳定性差，容易发生团聚。
发明内容
本发明的目的是，提出一种新的制备水溶性的纳米颗粒方法，将制备出的水溶性纳米粒子作为探针进一步应用于化学、物理、生物、医学等领域，将使这些领域相关技术取得重大进展。
本发明所涉及的纳米粒子，指粒径在1～100纳米的微小粒子，可以是具有特殊荧光性质的半导体纳米量子点，磁性纳米粒子、金属纳米粒子等，进一步是指应用于化学、物理、生物、医学等领域的高灵敏度的纳米探针。纳米颗粒分散所用的溶剂，可以是正己烷、苯等一些非极性的有机溶剂，也可以是甲苯、氯仿、二甲亚砜、吡啶等一些弱极性的有机溶剂。
具体的技术方案如下：
一种制备水溶性纳米粒子的方法(1)将纳米粒子分散于有机溶剂中，按纳米粒子和包覆剂的质量比为1∶5～100的比例加入包覆剂，机械研磨使之充分混合，使包覆剂吸附在纳米粒子上。(2)待溶剂挥发后(可吹入Ar气加速其挥发)，加入水或缓冲溶液，溶解。(3)在不低于18000转/分高速下离心，将大分子包覆的纳米粒子与多余的大分子分离。(4)洗涤沉淀数次，重新溶解于水或缓冲溶液中。(5)在3000-5000转/分速度下离心，将水溶性纳米粒子与团聚的纳米粒子分离。
根据本发明的技术方案，所述的包覆剂为一些亲水性大分子，这些亲水性的大分子可以是蛋白质、抗体、抗原、淀粉、环糊精、亲和素、链酶亲和素、聚乙二醇、聚乙烯醇或杯芳烃等。
用蛋白质包覆的水溶性纳米粒子，有些对化学或生物物质具有识别作用(如：酶、抗原、抗体等)，并能保持一定的功能活性；表面活性基团如：-NH2、-SH、-COOH等，还可以用于偶连细胞、蛋白质、核酸等生物大分子及一些药物小分子、有机分子、无机分子等。
本发明所采用的方法简单、成本低，可操作性强，无须特殊的仪器和设备，所制备的水溶性纳米粒子应用广泛，有着广阔的发展前景。制备出的水溶性纳米粒子作为探针进一步应用于化学、物理、生物、医学等领域，将使这些领域相关技术(如：编码研究、高通量分析、分离提纯等技术)取得重大进展。
附图说明
图1为CdSe/ZnS量子点的TEM图象
图2为BSA包覆前后量子点的发射光谱
图3为BSA包覆量子点荧光显微图象
图4为BSA及BSA包覆量子点的AFM图象(左为BSA，右为BSA包覆的量子点)
图5为BSA包覆量子点与BSA的葡聚糖凝胶过滤分离结果(line-dot为BSA包覆量子点的出峰情况，line-square为BSA的出峰情况)
图6为不同生理离子对BSA包覆量子点的荧光强度的影响1为control，2为Fe3+，3为Ca2+，4为K+，5为Na+，6为Mg2+，7为Mn2+，8为Zn2+，9为Cu2+，Cu2+的浓度为1×10-5M，其它离子的浓度为5×10-4M(注：三价铁离子干扰可通过加入F+ -消除)
图7为不同浓度的铜离子对BSA包覆量子点的荧光强度的影响(从上至下依次为control，1×10-7M，2×10-7M，4×10-7M，8×10-7M，1.6×10-6M的Cu2+)
图8为不同浓度铜离子+对BSA包覆量子点荧光的影响(单位为10-8M)
图9为10-5M的Cu2+对BSA包覆量子点淬灭的动力学曲线
图10是所制备的水溶性纳米Fe3O4的紫外-可见吸收光谱。
具体实施方式
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明
实施例1：水溶性半导体纳米量子点作为铜离子选择性探针
(1)ZnS包覆CdSe核壳型量子点的制备
以CdO和Se粉为原料，采用文献中的方法制备CdSe量子点。ZnS包覆CdSe核壳型量子点采用我们自己探索的新方法合成(该法已申请专利)。透射电子显微镜(TEM)图象表明，合成的核壳型量子点粒径分布均匀，直径在5nm左右。不同批次合成的量子点量子产率在60％-85％之间。
(2)牛血清白蛋白(BSA)包覆水溶性量子点的制备
将分散于正己烷中的ZnS包覆CdSe核壳型量子点用甲醇沉淀，并用甲醇洗涤2-3次，去掉表面多余的有机分子，在Ar保护下将其干燥后，取约1mg重新分散于0.5mL的正己烷溶液中，然后将约50mg牛血清白蛋白(BSA)与量子点的正己烷溶液一起放入研钵，适度研磨使之混合均匀，待正己烷完全挥发后加入4mL的PBS(pH7.4)缓冲溶液，使之溶解，将溶液在18000转/分速度下离心后，弃去上清液，除去多余的BSA，再用少量PBS缓冲溶液洗涤沉淀，然后重新溶解于PBS缓冲溶液，在5000转/分速度下离心，除去团聚的量子点。上层即为BSA包覆的水溶性的CdSe/ZnS溶液。
(3)包覆量子点的表征
采用原子力显微镜(AFM)、荧光显微镜、荧光光谱等对制备的水溶性量子点进行了表征，结合葡聚糖凝胶过滤方法对包覆机理进行了探讨。结果表明，所制备的水溶性量子点稳定性好，三周内荧光强度下降不超过30％。从AFM图象、荧光显微图象、荧光发射光谱表征结果可知，包覆后的量子点粒径分布仍然很均匀。综合分析几个表征结果，我们认为一个量子点被2-4个BSA分子包覆。
(4)水溶性量子点作为铜离子选择性探针
所制备的水溶性量子点可选择性检测铜离子。铜离子的检测限达1×10-8M，比文献报道的类似检测方法的检测限低一个数量级。
实施例2：水溶性纳米Fe3O4的制备
分散于正己烷中的纳米Fe3O4参照文献的方法合成[Sun S H.ZengH.J.Am.Chem Soc.2002，124：8204～8205]。将分散于分散于正己烷中的纳米Fe3O4用乙醇沉淀，并用乙醇洗涤2-3次，去掉表面多余的有机分子，取约2mg纳米Fe3O4重新分散于0.5mL的正己烷溶液中，然后将约50mg牛血清白蛋白(BSA)与的正己烷溶液一起放入研钵，适度研磨使之混合均匀，待正己烷完全挥发后加入4mL的PBS(pH7.4)缓冲溶液，使之溶解，将溶液18000转/分速度下离心，弃去上清液，除去多余的BSA，再用少量PBS缓冲溶液洗涤沉淀，然后重新溶解于PBS缓冲溶液，在5000转/分速度下离心，除去已团聚纳米Fe3O4。上层即为BSA包覆的水溶性的纳米Fe3O4溶液。图10是所制备的水溶性纳米Fe3O4的紫外-可见吸收光谱。
实施例3
将分散于甲苯中的CdSe/ZnS核-壳型量子点用甲醇沉淀，并用甲醇洗涤2-3次，去掉表面多余的有机分子，在Ar保护下将其干燥后，取约1mg重新分散于0.5mL的甲苯溶液中，然后将5mg免疫球蛋白(IgG)与量子点的甲苯溶液一起放入研钵，适度研磨使之混合均匀，待甲苯完全挥发后加入2mL的PBS(pH7.4)缓冲溶液，使之溶解，将溶液以18000转/分离心，弃去上清液，除去多余的免疫球蛋白，再用少量PBS缓冲溶液洗涤沉淀，然后重新溶解于PBS缓冲溶液，用较低转数离心，除去团聚的量子点。上层清液即为免疫球蛋白(IgG)包覆的水溶性的CdSe/ZnS溶液。
实施例4
将分散于氯仿中的CdSe量子点用甲醇沉淀，并用甲醇洗涤2-3次，去掉表面多余的有机分子，在Ar保护下将其干燥后，取约1mg重新分散于0.5mL的氯仿溶液中，然后将约100mg淀粉与量子点的氯仿溶液一起放入研钵，适度研磨使之混合均匀，待氯仿完全挥发后加入100mL的水溶液，Ar保护下加热使之溶解，将溶液以3000转/分速度离心，上清液即为淀粉包覆的水溶性的CdSe溶液，此溶液中有多余的淀粉未除去。

Claims (1)

1、一种制备水溶性纳米粒子的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：(1)将纳米粒子分散于正己烷、苯、氯仿、甲苯、二甲亚砜或吡啶中，按纳米粒子和包覆剂的质量比为：1∶5-100的比例加入包覆剂，机械研磨使之充分混合，使包覆剂吸附在纳米粒子上；(2)待溶剂挥发后，加入水或磷酸缓冲溶液，溶解；(3)在不低于18000转/分高速下离心，将包覆剂包覆的纳米粒子与多余的包覆剂分离；(4)沉淀洗涤后，重新溶解于水或磷酸缓冲溶液液中；(5)在3000-5000转/分速度下离心，将水溶性纳米粒子与团聚的纳米粒子分离，上清液即为水溶性纳米粒子；
所述的包覆剂为亲水性大分子，这些亲水性的大分子是蛋白质、抗体、抗原、淀粉、环糊精、亲和素、链霉亲和素、聚乙二醇、聚乙烯醇或杯芳烃中的一种。
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