CN110237048B - 具有过氧化物酶活性的peg修饰的磁性/季铵化壳聚糖纳米粒子及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于复合材料领域，具体涉及一种具有过氧化物酶活性的PEG修饰的磁性/季铵化壳聚糖磁性纳米粒子及其制备方法和应用。具有过氧化物酶活性的PEG修饰的磁性/季铵化壳聚糖磁性纳米粒子以高磁性Fe3O4为磁芯，交联的聚酰胺/壳聚糖聚电解质复合物的中层，季铵化壳聚糖和亲水性聚乙二醇链为外壳。中间的聚合物层充分的保护了Fe3O4的高磁性和过氧化物酶活性，季铵化壳聚糖和亲水性聚乙二醇链为外壳使得纳米粒子提供了长期的水稳定性和分散性。纳米粒子对于细菌病原体具有快速、高效的“围剿”作用，该策略使用了细菌捕获纳米复合材料，该纳米复合材料包含有在痕量H2O2下具有过氧化物酶样活性的磁性纳米粒子。

Description

具有过氧化物酶活性的PEG修饰的磁性/季铵化壳聚糖纳米粒 子及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于复合材料领域，具体涉及一种具有过氧化物酶活性的PEG修饰 的磁性/季铵化壳聚糖磁性纳米粒子及其制备方法和应用。
背景技术
细菌感染性疾病可显著影响人类健康，并导致显著的发病率、死亡率和高 昂医疗费用。几十年来挽救了数百万人生命的传统抗生素疗法，目前仍是治疗 细菌感染的首选疗法。然而，除了高成本、潜在健康和生态系统风险等缺点之 外，抗生素的广泛过度使用还会导致多药耐药菌株，从而导致细菌感染性疾病， 这些疾病很难再用现有药物治愈。目前，得益于纳米技术的发展，各种纳米材 料在对抗细菌感染方面发挥了重要作用，如金属纳米结构、金属硫化物/氧化物、 或其他纳米复合物、功能化聚合物和碳纳米材料等。然而，研究表明，单一模 式的抗菌策略难以高效根除耐药菌，因此有必要探索具有多重抗菌能力的新型生物相容性纳米材料来对抗细菌感染。
为了克服这些问题，研究人员提出了各种纳米材料，例如金基纳米材料、 银基纳米材料、石墨烯基纳米复合材料和二硫化钼(MoS2)，因为它们具有很 强的过氧化物酶样活性或光热活性。其中，功能化磁性纳米复合材料在过去几 年中得到深入研究。抗菌活性功能纳米结构与磁分离技术相结合，大大提高了 细菌分离效率。已经广泛报道了用生物分子如抗体、碳水化合物、适体、万古 霉素和庆大霉素功能化的磁性纳米粒子，用于选择性捕获细菌和去除细菌病原 体。例如，磁性石墨烯基复合抗菌纳米材料用于在近红外辐射下以分散状态杀 死细菌，随后通过外部磁场从去除环境中恢复，因而病原体根除和磁分离是两个分离、连续的步骤。2007年高利增等曾报道了Fe3O4纳米粒子本身对于细菌具 有非常好的过氧化物酶样活性，因其能在低浓度过氧化氢作用下，产生对细菌 有强大杀伤力的羟氧自由基，对于口腔细菌生物膜具有很好的穿透力和杀伤性。 从而引发了纳米模拟酶在抗菌及抗肿瘤细胞的研究热潮。然而，在实际应用中， 例如在生物科学、医学科学中，已报道的磁性纳米粒子的进一步应用仍然受到 以下限制:(1)许多磁性纳米粒子缺乏良好的生物相容性，特别是复合了Au、Ag等金属纳米粒子在生物科学、医学领域应用可能导致环境(土壤、水、人体等) 中重金属的泄漏和积累；(2)很难根除细菌超低浓度细菌；(3)用生物分子 功能化的磁性纳米材料显示出特定的细菌捕获，并且在涉及多微生物感染时， 与所有细菌病原体的相互作用率低；(4)与磁性纳米材料浓度相比，使用磁性 纳米材料的细菌去除效率仍然相当低；(5)由于范德华力，这些纯磁性纳米材 料通常容易团聚而缺乏水稳定性。另外，尽管这些功能性磁性纳米复合材料具 有良好的抗菌活性，但是在这些基于磁性分离技术的磁性纳米复合材料抗菌剂 中，磁性粒子的纳米酶活性，这一功能却被忽略了。因此，寻找具有超顺磁性、 高催化活性以及良好水分散性的新型功能化磁性纳米粒子，以用于快速有效杀 灭细菌的抗菌活性具有很强的应用需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有过氧化物酶活性的PEG修饰的磁性/季铵化 壳聚糖磁性纳米粒子及其制备方法和应用。
本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：
一种具有过氧化物酶活性的PEG修饰的磁性/季铵化壳聚糖纳米粒子，以高 磁性Fe3O4为磁芯，交联的聚酰胺/PEG/壳聚糖聚电解质复合物的中层，季铵化壳 聚糖和亲水性聚乙二醇链为外壳。
一种具有过氧化物酶活性的PEG修饰的磁性/季铵化壳聚糖磁性纳米粒子的 制备方法，包括下述步骤：
1)制备富含羧基的高磁性四氧化三铁Fe3O4纳米结晶粒子；
2)将步骤1)的富含羧基的高磁性四氧化三铁Fe3O4分散到CS/AA滤液中，含 羧基的高磁性四氧化三铁Fe3O4被完全分散在该溶液中进行自组装得到混合物； 之后加入聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯进行聚合，得到水分散型的磁性壳聚糖复 合纳米粒子Fe3O4@PAA/PEG/CS；Fe3O4粒子上生成的聚合物壳由交联的聚酰胺/ PEG/壳聚糖聚电解质复合物的中层和质子化的壳聚糖和亲水性聚乙二醇链的外 壳组成；
3)将步骤2)得到的Fe3O4@PAA/PEG/CS的壳聚糖层进行季铵化改性。磁性壳 聚糖纳米粒子的外壳聚糖链在水溶液中与缩水甘油三甲基氯化铵反应，接枝带 正电荷的季铵离子(表示为Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +)。
具体的，步骤1)具体包括下述步骤：将水合氯化铁、柠檬酸三钠二水合物、 乙酸钠溶于乙二醇中置于反应釜中200℃反应，反应结束后洗涤干燥得到富含羧 基的高磁性四氧化三铁Fe3O4纳米结晶粒子；其中，氯化铁、柠檬酸三钠二水合 物、乙酸钠的质量比为65:18:72。
步骤2)具体包括下述步骤：
2.1)CS/AA的制备：将丙烯酸(AA)、N，N′-亚甲基双(丙烯酰胺)(MBA) 以及壳聚糖CS加入双蒸水，室温搅拌过夜后，抽滤去除杂质，得到CS/AA滤液；
2.2)将步骤1)制备的富含羧基的高磁性四氧化三铁Fe3O4纳米结晶粒子，加 入双蒸水超声分散后加入步骤2.1)得到的CS/AA滤液，室温超声自组装后加入聚 乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯，通氩气除去体系中空气后，升温至70℃，加入引发 剂引发聚合，并在氩气气氛保护充分反应，反应结束后，通过磁铁分离出产物 后，依次用1wt％醋酸和乙醇分散洗涤三次，真空干燥至恒重，即制得水分散型 的磁性壳聚糖复合纳米粒子Fe3O4@PAA/PEG/CS。其中，AA、MBA、壳聚糖CS、聚 乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯以及富含羧基的高磁性四氧化三铁Fe3O4纳米结晶粒子 的质量比220:22:500:33:400。
步骤3)具体包括下述步骤：将Fe3O4@PAA/PEG/CS纳米粒子分散在0.1g/mL 缩水甘油三甲基氯化铵的水溶液中，反应在60℃下反应，反应结束后产物 Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +)通过磁分离收集，用水洗涤，最后冷冻干燥至恒重。 具体的，步骤3)中Fe3O4@PAA/PEG/CS纳米粒子与缩水甘油三甲基氯化铵的水溶液 的质量比为50:5000。
本发明还包括一种所述的制备方法得到的具有过氧化物酶活性的PEG修饰 的磁性/季铵化壳聚糖磁性纳米粒子。
本发明还包括一种具有过氧化物酶活性的PEG修饰的磁性/季铵化壳聚糖磁 性纳米粒子的应用，具体的应用于消除细菌病原体
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)聚乙二醇/壳聚糖基基质具有良好的生物降解性、生物相容性，易于 分散在水中和与水分离；(2)纳米粒子界面上的官能化季铵离子为超低浓度的 大肠杆菌和金色葡萄球菌提供了100％结合的比表面积；(3)细菌暴露在磁性 纳米粒子中可以快速地被收集；(4)磁性纳米粒子不仅能大幅降低H2O2浓度， 而且能有效催化H2O2分解生成羟基，其杀菌能力强于双氧水，可以大大降低双氧 水的使用浓度；以及(5)模拟酶催化作用和季铵离子的组合，因此导致对大肠 杆菌和金色葡萄球菌的抗菌效率的潜在增加。
总之，本申请开发了一种简单的高磁性、分散好、稳定性强的聚乙二醇/聚 酰胺/季铵化壳聚糖纳米模拟酶,最终纳米结构为：高磁性四氧化三铁Fe3O4为磁 芯，交联的聚酰胺/PEG/壳聚糖聚电解质复合物的中层，季铵化壳聚糖和亲水性 聚乙二醇链为外壳。中间的聚合物层充分的保护了Fe3O4的高磁性和过氧化物酶 活性，季铵化壳聚糖和亲水性聚乙二醇链为外壳使得纳米粒子提供了长期的水 稳定性和分散性。在阳性季铵离子、高磁性和催化活性三重作用下，纳米粒子 对于细菌病原体具有快速、高效的“围剿”作用，该策略使用了细菌捕获纳米 复合材料，该纳米复合材料包含有在痕量H2O2下具有过氧化物酶样活性的磁性纳 米粒子。首先对于包围策略，像围攻者一样，含季铵的磁性纳米粒子可以快速 有效地捕获带负电荷的病原体，从而在小区域内形成纳米粒子/病原体聚集；然 后是剿灭策略，H2O2与过氧化物酶类磁性纳米催化剂反应产生的羟基自由基可诱 导细胞壁和细胞膜的氧化损伤。羟基与抗菌活性季铵结合在一起，能有效杀灭 病原菌。与单独的催化作用或季铵化作用相比，纳米复合材料与细菌捕获、过 氧化物酶样活性和季铵结合的多功能化结合，在体外对革兰氏阴性大肠杆菌和 革兰氏阳性金色葡萄球菌提供了快速和有效的杀灭结果。
附图说明
图1为本发明PEG修饰的磁性/季铵化壳聚糖磁性纳米粒子的制备流程示意 图；
图2为本发明Fe3O4、Fe3O4@PEG/PAA/CS和Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +磁性 粒子的SEM照片；
图3为本发明Fe3O4、Fe3O4@PEG/PAA/CS和Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +磁性 粒子的红外光谱图；
图4为本发明Fe3O4、Fe3O4@PEG/PAA/CS和Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3+ 磁性粒子(A)水动力直径(Dh)分布的变化；(B)ζ电势变化情况；
图5为本发明磁性纳米粒子(A)热重曲线；(B)饱和磁滞回线和后者在磁场 中的分离图；
图6为磁性纳米粒子透过率随时间的变化曲线图；
图7为磁性纳米粒子对细菌悬浮液的影响结果图；
图8为Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +分离前后5分钟内细菌细胞悬浮液对比 图；
图9为Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +处理5分钟前后平板培养的照片对比图；
图10为TMB在H2O2条件下的过氧化物酶样活性图以及646nm处吸光度随时 间的变化图；
图11大肠杆菌和金色葡萄球菌暴露于不同状态下的对照图；
图12为通过平板计数法测定大肠杆菌和金色葡萄球菌在不同状态下分别孵 育20分钟后的相对细菌活度对照图；
图13为Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +的细胞生物相容性图。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附 图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。
流程如图1所示。首先，壳聚糖溶解在含有MBA(N，N′-亚甲基双(丙烯酰 胺))作为交联剂的丙烯酸水溶液中。然后含羧基的高磁性四氧化三铁Fe3O4被完 全分散在该溶液中进行自组装。在混合物中加入单体MPEGMA和自由基引发剂KPS 后，丙烯酸和MPEGMA与MBA进行交联共聚，最终在含羧基的Fe3O4粒子(磁性 纳米粒子)上形成聚合物壳(PEG/PAA/CS)。含羧基的Fe3O4粒子上生成的聚合 物壳由交联的聚酰胺/壳聚糖聚电解质复合物的中层和质子化的壳聚糖和亲水 性聚乙二醇链的外壳组成。接下来，磁性壳聚糖纳米粒子的外壳聚糖链在水溶 液中与缩水甘油三甲基氯化铵反应，接枝带正电荷的季铵(表示为 Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +)。
实施例1：高磁性纳米粒子Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +的制备；
1)制备富含羧基的高磁性四氧化三铁Fe3O4纳米结晶粒子；将水合氯化铁 (6.5g)、柠檬酸三钠二水合物(1.8g)和醋酸钠(7.2g)溶解在乙二醇(120 毫升)中。将所得混合物密封在衬有特氟隆的不锈钢高压釜中，加热至200℃并 保持10小时，然后冷却至室温。用磁分离出产物依次用乙醇和去离子水彻底洗 涤，最后在50℃真空下干燥至恒重。
2)制备PEG化磁性壳聚糖粒子Fe3O4@PEG/PAA/CS；2.1)CS/AA滤液的制 备：依次称取220mg AA、22mg MBA和500mg精制CS(分子量约4万)，加入 20mL双蒸水，室温下搅拌过夜，使CS溶解并充分与AA静电络合。然后加入 100mL双蒸水，搅拌均匀后，抽滤除去杂质。2.2)Fe3O4@PAA/PEG/CS的制备： 称取400mg制备的Fe3O4，加入40mL双蒸水并超声分散均匀，然后加入上述 CS/AA滤液。边超声、边搅拌，自组装半小时后，加入33mg聚乙二醇甲醚甲 基丙烯酸酯。通氩气除去体系中空气后，升温至70℃，加入110mg精制KPS引 发聚合，并在氩气气氛保护下反应5小时。停止反应，通过磁铁分离出产物后， 依次用1％醋酸和乙醇分散洗涤三次，真空干燥至恒重，即制得水分散型的磁性 壳聚糖复合纳米粒子Fe3O4@PAA/PEG/CS。
3)Fe3O4@PAA/PEG/CS纳米粒子壳聚糖层季铵化改性；步骤2)得到的 Fe3O4@PAA/PEG/CS纳米粒子(50mg)分散在5mL含有缩水甘油三甲基氯化铵水溶 液(0.1g/mL)中，然后反应在60℃下进行24小时。最后，产物Fe3O4@PEG/PAA/CS-N (CH3)3 +)通过磁分离收集，用水洗涤，最后冷冻干燥至恒重。
测试与表征：
1、SEM表征：透射电镜观察了富含羧基的Fe3O4、Fe3O4@PEG/PAA/CS和 Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +磁性粒子。如图2中A所示，富含羧基的Fe3O4是窄 分散的纳米粒子，平均约100纳米，呈现粗糙的表面，并且可以观察到每个纳 米粒子内部的微小纳米晶体。如图2中B和C所示，Fe3O4@PEG/PAA/CS和 Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +的粒子具有相似的结构和直径，其大于Fe3O4。这些 透射电镜图像反映出，在包裹聚合物后，这些粒子仍保持球形，并像最初的微 纳米粒子一样窄范围分散，但粒子表面变得光滑。
2、红外光谱表征：图3为红外光谱表征，其中(a)为富含羧基的Fe3O4；(b) 为Fe3O4@PEG/PAA/CS；(c)为Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +；对于富含羧基的Fe3O4粒子的光谱，1625和1401cm-1处的带与羧酸盐基团相关联，这是由于螯合了柠 檬酸钠。在修饰有聚乙二醇/聚酰胺/壳聚糖后，所得Fe3O4@PEG/PAA/CS的光谱 在1629cm-1处显示出新的吸收带，为壳聚糖的NH3 +吸收峰，这也意味着束缚的 壳聚糖链与带相反电荷的聚酰胺复合，然后形成中性聚电解质壳。此外，2934cm-1处的谱带显现的C-H拉伸振动吸收，且1074cm-1的特征峰有聚乙二醇碳链中的 C-O拉伸振动吸收。在Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +粒子的光谱中，1482cm-1的出现表明季氢键甲基存在不对称角弯曲，表明季铵化反应成功。
3、DLS测量水动力直径(Dh)分布的变化；在基本富含羧基的Fe3O4粒子表 面上聚合PEG和AA/CS复合物后，Dh将增加。如图4中A所示，在壳聚糖链壳 上接枝季铵，Dh的平均值也比以前稍大，这是由于Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +壳的亲水性更强的溶胀。因此，Dh平均值的变化可以证实不同聚合物层的存在。 特别需要指出，基于这些样品的DLS的多分散指数(PDI)值分别为0.036、0.043 和0.062，这表明原始富含羧基的Fe3O4、Fe3O4@PEG/PAA/CS和所得 Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +核壳粒子的均匀尺寸分布。图4中B显示了这些粒子 的ζ电势变化情况。由于表面有大量离子化的羧基，最初的纳米粒子，呈现出 最大的负电荷，而Fe3O4@PEG/PAA/CS粒子呈现出非常小的负电荷。 Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +的ζ电位与Fe3O4@PEG/PAA/CS粒子相反，呈现较强 的正电荷，从而证实了季铵基团的成功修饰。
4、热重测试和饱和磁滞回线测试：图5为(A)热重曲线和(B)饱和磁滞回 线和后者在磁场中的分布，其中，(a)富含羧基的Fe3O4；(b)Fe3O4@PEG/PAA/CS；(c) Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +，对这些粒子进行的热重分析进一步验证了聚合物层 的成功包裹，它们的热重曲线如图5中A所示。与原始富含羧基Fe3O4粒子相比， 所有改性样品都表现出质量损失，因此进一步验证了相应功能部分的成功修饰。 基于最终的残余重量百分比，富含羧基Fe3O4粒子上的聚乙二醇/壳聚糖/聚丙烯 酸层的质量含量约为12wt％。如图5中A所示，接枝的季铵基团的量不是很高， 这可能是因为改性是在碱性水溶液中进行的，其中表面CS链断裂，因此不利于 CS与缩水甘油三甲基氯化铵的反应
磁滞曲线如图5中B所示。羧基封端的Fe3O4的饱和磁化强度(Ms)为42.08 emu/g，涂覆一层聚乙二醇/壳聚糖/聚丙烯酰胺层后，所得Fe3O4@PEG/PAA/CS粒 子的Ms下降到36.86emu/g，随着季铵基团接枝到Fe3O4@PEG/PAA/CS表面，相 应的Ms值依次下降到37.63emu/g，所有这些样品显示出接近超顺磁性(矫顽力 小于20Oe)；也就是说，当去除施加到磁分散体上的外部磁场时，会存在微小 的剩磁，因此磁性粒子会容易地重新分散在介质中。Fe3O4@PEG/PAA/CS粒子(1 mg/mL)的水分散体可在1分钟内被磁体(4000G)分离，并可在磁体移出后通过 摇动再次容易地分散(见图5B中的插图)。
5、磁性聚合物纳米粒子在水介质中的稳定性；磁性聚合物纳米粒子在水介 质中的稳定分散对于它们在细菌分离中的应用特别重要。将不同的磁性粒子分 散在浓度为0.5mg/mL(PBS，pH 7.4,10mM)中，用紫外/可见分光光度计在 600纳米用浊度法检查其分散稳定性。如图6(磁性纳米粒子分散液的透过率随 时间的变化曲线，a)富含羧基的Fe3O4，b)Fe3O4@PEG/PAA/CS和C) Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +)。插图是c)24小时前后相应分散液的照片)所示， Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +溶液的透过率在24小时后保持不变，表明分散体稳定性良好。尽管聚乙二醇壳可以提高Fe3O4@PEG/PAA/CS的分散性，但未改性的 Fe3O4@PEG/PAA/CS-粒子只能保持不超过5小时。相应的照片反映了类似的结果 (见图6中的插图)。这些结果表明静电排斥和空间排斥都有助于磁性粒子的稳 定以防止聚集和凝固。在pH 7.4时，Fe3O4@PEG/PAA/CS表面上的壳聚糖链被去 质子化并因此塌陷。相反，Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +粒子具有拉伸质子化聚合 物链，因此表现出更好的稳定性。
6、Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +粒子细菌捕获能力。
细菌溶液的准备。以本实验室保藏的革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性金 色葡萄球菌为模型菌。然后，每种细菌的纯培养物在37℃下，在旋转振荡器上， 在营养肉汤中以180转/分的速度生长过夜，产生大约1×108CFU/mL的细胞计 数。最后，通过离心(8000转/分钟，1分钟)收集细菌，然后用PBS(10mM，pH＝ 7.4)洗涤。弃去上清液，将剩余的细菌重新悬浮在PBS中，并在600nm处稀释 至0.1的光密度(OD600＝0.1)。所有样品在处置前都要在121℃的高压釜中放 置20分钟，与样品接触的所有玻璃器皿在使用前后都要消毒。
将细菌悬浮液稀释至所需浓度(约2.5×108CFU/mL，0.5OD)，然后将 悬浮在PBS中的50mL一定量的Fe3O4@PEG/PAA/CS或Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +纳米粒子加入细菌溶液(2.5mL)，纳米粒子的最终浓度分别为50ppm、100ppm、 200ppm、300ppm和500ppm。混合溶液通过旋转摇动器以180转/分钟的速度 孵育5分钟，使得纳米粒子能够有效地与细菌结合。在纳米粒子的磁性分离之 后，通过测量600nm处的光密度(OD600)来确定磁性纳米粒子的细菌捕获效率。 捕获效率(E)根据以下公式计算:
Figure BDA0002036037650000081
其中A0为初始OD600，细胞捕获后为OD600。
通常，由于脂多糖和磷壁酸的存在，大多数细菌具有带负电荷的细胞壁。 因此，阳离子纳米材料，特别是阳离子磁性纳米材料，已经通过静电相互作用 应用于细菌分离，随后通过外部磁场从环境的去除中恢复。在这里，为了检测 这些带正电荷的Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +的细菌捕获能力，我们使用了两种 常见的细菌菌株，大肠杆菌(革兰氏阴性菌)和金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌) 作为模型。通过改变细菌浓度为2.5×108CFU/m1(OD600＝0.5)的细菌悬浮 液中Fe3O4@PEG/PAA/CS和Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +的量来进行实验。从图7 中可以看出，Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +对大肠杆菌(图7中A)和金黄色葡萄 球菌(图7中B)都显示出优异的细菌捕获能力。例如，需要0.3mg mL-1 Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +才能分别获得大肠杆菌97.6％和金黄色葡萄球菌 98.8％的捕获效率。此外，Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +在两个浓度水平上的细菌 捕获效率均高于Fe3O4@PEG/PAA/CS，这是由于纳米粒子表面存在季铵离子，其与 带负电荷的细菌具有更强的静电结合力。图8显示了磁性分离前后5分钟内细 菌细胞悬浮液(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)的图像。当施加外部磁力时，细菌 悬浮液变得清晰。这些结果表明Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +具有良好的细菌捕 获和磁性分离性能。
7、超低浓度病原体溶液的分离效率；为了定量评估纳米载体对超低浓度病 原体溶液的分离效率，图9示出Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +(100μg·mL-1) 处理5分钟前后平板培养的照片；分析从1×103到1×101CFU·mL-1的细菌悬 浮液的捕获能力至关重要，因为高毒性病原体的感染剂量通常小于1×101 CFU·mL-1。采用经典的平板计数法验证了去除能力。大肠杆菌和金黄色葡萄球 菌平板计数照片如图9所示。原始细菌溶液(对照)的计数菌落数与用 Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +(100μg·m1)孵育30分钟和磁分离后溶液的计数 菌落数显著不同。Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +的捕获效率即使在大肠杆菌和金黄 色葡萄球菌的超低细菌浓度下也保持优异。由于多价效应，功能化磁性纳米粒 子在超低浓度下显示出优异的细菌捕获效率。
8、Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +的抑制细菌活性实验；
检测条件：为了测试Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +的过氧化物酶活性，在H2O2的存在下，对过氧化物酶底物TMB的催化氧化进行了测试。以3,3,5,5′-四 甲基联苯胺(TMB)为底物，加H2O2，进行催化氧化TMB发生颜色变化，在最大吸 收波长λ＝646nm处，进行紫外-可见光谱测试。具体为取1mM TMB为反应底 物，在10mM H2O2存在的条件下，0.25μg/mL Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +在醋 酸缓冲液(4mL，pH 4.0，0.1M)中室温条件下能催化底物生成氧化产物，溶液 颜色由无色变为蓝色，溶液颜色变化使用UV-vis分光光度法测定。
结果讨论：对于抗菌治疗，高浓度的H2O2会对正常组织产生副作用，甚至延 迟伤口愈合。然而，羟氧自由基·OH比H2O2具有更高的抗菌能力，具有过氧化 物酶样活性的Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +能催化低浓度H2O2生成羟氧自由基。在 3，3，5，5-四甲基联苯胺和H2O2存在下，在pH 4.0乙酸溶液中检测 Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +纳米粒子的过氧化物酶样酶活性。 Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +纳米粒子在5分钟时的催化活性如图10所示，在一 起添加TMB和H2O2后观察到蓝色。该反应具有400nm至800nm的吸光度，特征吸 光度峰值在646nm，这是物TMB氧化产物OxTMB特征峰。它类似于天然过氧化物 酶催化的产物。检测吸光度随时间的变化可见，随着时间延长至30分钟， Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +纳米粒子在646纳米处的吸光度增加，但速度逐渐减 慢；图10中，A)TMB在H2O2条件下的过氧化物酶样活性。照片插图分别显示了 各体系的照片：(a)H2O2+TMB，(b)Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 ++TMB，(c)H2O2 +Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 ++TMB反应溶液的紫外-可见吸收度；B) Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +纳米粒子在646nm处吸光度随时间的变化。
9、Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +在H2O2存在下对大肠杆菌和金色葡萄球菌的 抗菌能力；
用平板计数法测定菌落总数，检测过氧化物酶样Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +纳米复合材料的抗菌能力。大肠杆菌或金色葡萄球菌分为八组:(a)细菌；(b) 细菌+Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +；(c)细菌+H2O2；(d)细菌+H2O2+ Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +；(e)细菌+外磁场；细菌+Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 + +外磁场；(g)细菌+外磁场+H2O2；(h)细菌+Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 ++ 外磁场+H2O2。简而言之，用PBS将0.1OD600的细菌稀释100倍，并将50μL 的这种稀释的细菌加入48孔细胞培养板中。Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +、H2O2和细菌的最终浓度分别为100μg mL 1,100μM,and 1.0×105CFU mL 1。 每个孔中溶液的总体积为0.5mL。孵育20分钟后，将100μL a-d组的细菌 悬浮液铺展在琼脂培养板上，并在37℃孵育18小时。e-f组区别于a-d组的是 有一个外磁场作用。具体为：f，h组先加入Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +纳米粒 子溶液与菌液一起混合均匀，然后置于在外磁场作用后，再加入H2O2，孵育20min后，超声震荡，使磁性纳米粒子充分分散，e,g组的操作是在外磁场作用下直 接加入PBS或双氧水，其他与f，h相同，最后将100μL a-d组的细菌悬浮 液铺展在琼脂培养板上，并在37℃孵育18小时。所有实验重复三次。
平板计数法用于测定抗菌能力(图11)。图11中，(A)大肠杆菌和(B) 金色葡萄球菌暴露于(a)细菌；(b)细菌+Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +；(c) 细菌+H2O2；(d)细菌+H2O2+Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +；(e)细菌+外磁场； 细菌+Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 ++外磁场；(g)细菌+外磁场+H2O2；(h)细 菌+Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 ++外磁场+H2O2；图11中分别经(a)PBS溶液， (b)季铵化纳米粒子Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +和(c)低浓度H2O2溶液处理后 相比发现，(d)中经模拟酶Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +催化低浓度H2O2的抑菌效 果比单纯的Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +或者H2O2要显著。但是，即使在Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +催化下，H2O2为100μM时，大肠杆菌和金色葡萄球 菌的细菌存活率仍然分别高于46％和13％；有趣的是，在经外磁场作用后观察 到抗菌活性显著增强(图11)。Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +纳米粒子经10分钟磁 分离后，再加入低浓度双氧水可分别完全抑制大肠杆菌和金色葡萄球菌的细菌 生长。此外，还在LB琼脂平板上检测了这些试剂的抗菌活性。将营养琼脂铺在培养皿上，并将含有103个细菌细胞的细菌培养物接种在培养皿上。从图11可 以看出，有外磁场作用后菌落明显减少，并且没有观察到菌落，这与LB液体培 养基试验中的上述结果非常一致。一般来说，磁性抗菌系统，首先用来杀死细 菌，然后是磁场从环境中去除纳米材料。然而，使用这样合成的纳米材料，分 离和根除细菌病原体是分开的目标。在这里，利用具有过氧化物酶样活性的细 菌捕获纳米复合材料开发了一种新的“围剿”策略。首先，用简便的绿色方法 制备季铵官能化Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +纳米复合材料。对于“包围”策略， 磁性复合材料如围堵者，外壳上含有丰富的季铵，可以快速有效地捕获细菌， 从而在小面积内形成纳米复合材料/细菌复合体。随后，在“剿灭”策略中，由 低浓度H2O2与过氧化物酶样纳米催化剂反应产生的羟基自由基(·OH)，其可诱 导细胞壁和膜的氧化损伤，并且显著地与抗菌活性季铵结合，其可有效杀死病 原体。图12通过平板计数法测定(A)大肠杆菌和(B)金色葡萄球菌分别与PBS, Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +(100μg mL 1),H2O2(100μM)及 Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 ++H2O2，分别在有无外加磁场情况下，孵育20分钟后的 相对细菌活度。
10、Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +的细胞生物相容性；以膀胱癌EJ细胞为模型 样本。将EJ细胞(104)在37℃下接种在96孔板中12小时。随后，用不同浓 度的Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +处理细胞。再孵育24小时后，用标准CCK8测 定法测试细胞活力。
图13显示了通过将EJ细胞与不同浓度的Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +孵育24 小时，然后进行CCK8测定而获得的细胞生存力。显然，Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +处理的细胞和对照细胞之间的相对细胞活力没有观察到显著差异。即使 Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +的浓度增加到500ppm，细胞存活率也约为81.5％。 结果表明，Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +具有良好的细胞生物相容性。
以上内容仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依据本 发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不 应理解为对本发明的限制。

Claims (2)

1.一种具有过氧化物酶活性的PEG修饰的磁性/季铵化壳聚糖纳米粒子的应用，其特征在于：应用于制备消除细菌病原体的纳米粒子；
应用具体包括下述步骤:Fe3O4@PEG/PAA/CS-N(CH3)3 +纳米粒子溶液与菌液一起混合均匀，然后置于在外磁场作用后，再加入H2O2，孵育20min后，超声震荡，使磁性纳米粒子充分分散；
其中，所述的磁性/季铵化壳聚糖纳米粒以高磁性Fe3O4为磁芯，交联的聚酰胺/PEG/壳聚糖聚电解质复合物的中层，季铵化壳聚糖和亲水性聚乙二醇链为外壳；
所述的磁性/季铵化壳聚糖纳米粒制备方法，包括下述步骤：
1）制备富含羧基的高磁性四氧化三铁Fe3O4纳米结晶粒子；
2）将步骤1）的富含羧基的高磁性四氧化三铁Fe3O4分散到CS/AA滤液中，之后加入聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯进行聚合，得到水分散型的磁性壳聚糖复合纳米粒子Fe3O4@PAA/PEG/CS；
具体包括下述步骤：2.1）CS/AA的制备：将AA、MBA以及CS加入双蒸水，室温搅拌过夜后，抽滤去除杂质，得到CS/AA滤液；2.2)将步骤1)制备的富含羧基的高磁性四氧化三铁Fe3O4纳米结晶粒子，加入双蒸水超声分散后加入步骤2.1)得到的CS/AA滤液，室温超声自组装后加入聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯，通氩气除去体系中空气后，升温加入引发剂引发聚合，并在氩气气氛保护充分反应，反应结束后，通过磁铁分离出产物后，依次用醋酸和乙醇分散洗涤三次，真空干燥至恒重，即制得水分散型的磁性壳聚糖复合纳米粒子Fe3O4@PAA/PEG/CS；AA、MBA、CS、聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯以及富含羧基的高磁性四氧化三铁Fe3O4纳米结晶粒子的质量比220:22:500:33:400；
3)将步骤2）得到的Fe3O4@PAA/PEG/CS的壳聚糖层进行季铵化改性，具体包括下述步骤：将Fe3O4@PAA/PEG/CS纳米粒子分散在0.1 g/mL缩水甘油三甲基氯化铵的水溶液中，反应在60℃下反应，反应结束后产物Fe3O4@PEG/PAA/CS-N (CH3)3 +通过磁分离收集，用水洗涤，最后冷冻干燥至恒重；Fe3O4@PAA/PEG/CS纳米粒子与缩水甘油三甲基氯化铵的水溶液的质量比为50:5000。
2.根据权利要求1所述的具有过氧化物酶活性的PEG修饰的磁性/季铵化壳聚糖纳米粒子的应用，其特征在于，步骤1）具体包括下述步骤：将氯化铁、柠檬酸三钠二水合物、乙酸钠溶于乙二醇中置于反应釜中200℃反应，反应结束后洗涤干燥得到富含羧基的高磁性四氧化三铁Fe3O4纳米结晶粒子。
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