DE102016216657B4

DE102016216657B4 - Eukaryotische adulte Zellen umfassend ein Transfektionssystem und deren Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE102016216657B4
Application number: DE102016216657.3A
Authority: DE
Inventors: Gustav Steinhoff; Robert David; Paula Müller; Natalia Voronina; Frauke Hausburg
Original assignee: Universitaet Rostock
Current assignee: Universitaet Rostock
Priority date: 2016-09-02
Filing date: 2016-09-02
Publication date: 2019-10-24
Anticipated expiration: 2036-09-03
Also published as: DE102016216657A1; WO2018042019A1

Abstract

Eukaryotische adulte Zelle umfassend ein Transfektionssystem, wobei das Transfektionssystem
(i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest teilweise biotinyliert sind,
(ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen,
(iii) mindestens eine Nukleinsäure, umfasst, wobei die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten CD133⁺-Blutstammzelle erhalten oder erhältlich ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine eukaryotische adulte Zelle, umfassend ein Transfektionssystem, wobei das Transfektionssystem ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest teilweise biotinyliert sind, magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen und mindestens eine Nukleinsäure, umfasst, wobei die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten CD133⁺-Blutstammzelle erhalten oder erhältlich ist.
Die Transplantation von Stammzellen für die Wiederherstellung von beschädigtem Gewebe stellt einen vielversprechenden Ansatz in der regenerativen Medizin dar. Adulte Stammzellen tragen hierfür ein großes Potential in sich, da sie leicht von einem Probanden oder einem gesunden Spender zugänglich sind, ohne dass sich ethische Konflikte ergäben. Unter den adulten Stammzellen erweisen sich insbesondere Stammzellen, welche das hoch konservierte Transmembran-CD133-Antigen aufweisen (Prominin-1), als geeignet, in hämatopoetische, endotheliale, myogene und neurogene Zelllinien auszudifferenzieren, und diverse unterstützende parakrine Faktoren freizusetzen. Allerdings erweist sich die klinische Anwendung von Stammzellen aufgrund verschiedener Faktoren als problematisch: Zum einen erfolgt bei Einbringung in das zu behandelnde Organ eine starke Abwanderung, d.h. die Retention der Stammzellen im zu behandelnden Organ ist sehr gering. Beispielsweise weisen stark perfundierte Organe wie die Leber oder das Herz einen Verlust an transplantierten Zellen von 90 bis 99 % bereits während der ersten 1 bis 2 Stunden nach Einbringung auf, völlig unabhängig von der Art der Zellen und der Art der Einbringung. Insbesondere die Retention im zu behandelnden Organ ist ein fundamentales Kriterium für eine effektive Therapie. Des Weiteren tritt ein massiver Zelltod der Stammzellen bei Einbringung in das zu behandelnde Organ auf, der durch die feindliche Umgebung im zu behandelnden Organ bedingt ist. Schade et al. (Schade, A. et al.,„Magnetic Nanoparticles Based Nonviral MicroRNA Delivery into Freshly Isolated CD105+ hMSCs", Stem Cells International, Volume 2014, März 2014, S.1-11) thematisiert CD105⁺ humane mesenchymale Stammzellen, in welche mittels eines Transfektionssystems basierend auf magnetischen Nanopartikeln nicht-virale microRNA eingebracht wird.
Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand daher in der Bereitstellung von Zellen auf Basis von hämatopoetischen Stammzellen, welche bei Einbringung in ein zu behandelndes Organ eine höhere Überlebensrate und eine höhere Retention aufweisen.
Überraschend wurde nun gefunden, dass solche Zellen bereitgestellt werden können, in dem in adulte multipotente CD133⁺-Blutstammzellen mittels eines Transfektionssystems Nukleinsäuren, insbesondere microRNA, eingebracht wird.
Eukaryotische adulte Zellen, umfassend ein Transfektionssystem
Die vorliegende Erfindung betrifft daher eukaryotische adulte Zellen, umfassend ein Transfektionssystem, wobei das Transfektionssystem

(i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest teilweise biotinyliert sind,
(ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen,
(iii) mindestens eine Nukleinsäure,

⁺

Das Transfektionssystem ist schematisch in dargestellt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind die eukaryotischen adulten Zellen aus adulten, multipotenten CD133⁺Blutstammzellen durch in-Kontakt-bringen von adulten, multipotenten CD133⁺-Blutstammzellen, mit dem Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii) erhalten oder erhältlich. Die „eukaryotische adulte Zelle“ kann synonym auch als „Derivat einer adulten, multipotenten Stammzelle“ bezeichnet werden, welches durch in-Kontakt-bringen von adulten, multipotenten CD133⁺-Blutstammzellen, mit dem Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii) erhalten ist. Das „in-Kontakt-bringen“ kann synonym auch als Anwendung des Transfektionssystems auf die adulte, multipotente CD133⁺-Blutstammzelle bezeichnet werden. Aufgrund der Veränderungen, die gegebenenfalls durch das Einbringen des Transfektionssystems, insbesondere durch die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii), in der adulten, multipotenten CD133⁺-Blutstammzelle, verursacht werden, kann die „eukaryotische adulte Zelle“ im Rahmen der vorliegenden Erfindung selbst noch eine adulte, multipotente Stammzelle sein, kann aber auch eine ausdifferenzierte oder in Ausdifferenzierung befindliche Zelle sein.
Die adulte multipotente Stammzelle ist erfindungsgemäß eine adulte multipotente CD133⁺-Blutstammzelle. Die adulten multipotenten Stammzellen stammen von Probanden, deren schriftliches Einverständnis zur Entnahme vorlag. Sie werden der jeweiligen Quelle, d.h. dem Knochenmark oder dem Blut, bevorzugt dem Knochenmark, entnommen und aus der entnommenen Probe anhand des vorhandenen CD133⁺-Oberflächenmarkers isoliert.
Die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii) ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, modifizierter mRNA (Boten-RNA), IncRNA (lange, nicht-codierende RNA), microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, weiter bevorzugt eine microRNA. Die mindestens eine Nukleinsäure, bevorzugt die microRNA oder anti-microRNA, wirkt dem Absterben der Stammzellen nach Einbringung in das zu behandelnde Organ entgegen, d.h. sie wirkt anti-apoptotisch. Weiterhin kann sie das therapeutische Potential der adulten multipotenten Stammzelle, in welche sie eingebracht wird, und somit der resultierenden eukaryotischen adulten Zellen, bereits vor der Transplantation positiv beeinflussen, beispielsweise können die Zellen durch anti-entzündliche oder pro-angiogenetische microRNAs modifiziert werden. Darüber hinaus dient die microRNA als Regulator in der Stammzelldifferenzierung, beispielsweise bei der Hämatopoese, Kardiogenese, Neurogenese oder der Endothelentwicklung, womit die Vorprogrammierung zu spezifischen Zelltypen vor der Transplantation möglich ist. Die microRNA (miR) umfasst 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide und ist weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21, miR-130a, miR-16, miR-424, miR-503, miR-1, miR-133, miR-208, miR-499, miR-150, miR-494-3p und miR-23a. In einer Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b und let-7c (anti-entzündliche microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus let-7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-210, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21, miR-130a, miR-16, miR-424, miR-503 und miR-210 (pro-angiogenetische microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-1, miR-133, miR-208 und miR-499 (kardial programmierende microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-150, miR-494-3p, miR-146a und miR-23a (homing microRNAs). Bevorzugt sind humane microRNAs. Die anti-microRNA, welche 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide umfasst, ist komplementär zu einer entsprechenden, vorzugsweise in der adulten multipotenten Stammzelle bereits vorhandenen, microRNA und dient der Neutralisation der microRNA-Funktion.
Das kationische Polymer aufweisend Aminogruppen gemäß (i) ist ein Polymer, welches zur Einbringung der mindestens einen Nukleinsäure, bevorzugt von microRNA oder anti-microRNA, weiter bevorzugt microRNA, in adulte multipotente CD133⁺-Blutstammzellen, geeignet ist, welches bevorzugt Polyethylenimin, weiter bevorzugt verzweigtes oder unverzweigtes, bevorzugt verzweigtes Polyethylenimin, bevorzugt mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 100.000 Dalton, bevorzugt im Bereich von 100 bis 50.000 Dalton, weiter bevorzugt im Bereich von 10.000 bis 30.000 Dalton, umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform bilden das kationische Polymer aufweisend Aminogruppen gemäß (i) und die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii), bevorzugt die microRNA, einen Komplex, einen so genannten Polyplex, miteinander, d.h. die mindestens eine Nukleinsäure, bevorzugt die microRNA wird in das kationische Polymer aufweisend Aminogruppen eingelagert. Die Aminogruppen des kationischen Polymers aufweisend Aminogruppen gemäß (i) sind zumindest teilweise biotinyliert, wobei der Biotinylierungsgrad im Bereich von 0,1 bis 10 mmol Biotin/mmol PEI, bevorzugt im Bereich von 0,5 bis 5 mmol Biotin/mmol PEI, weiter bevorzugt im Bereich von 1,0 bis 2,0 mmol Biotin/mmol PEI liegt (bestimmt mittels HABA-Assay).
Die magnetischen Nanopartikel gemäß (ii) umfassen bevorzugt magnetische Eisenoxidpartikel, weiter bevorzugt Fe₃O₄-Partikel, welche bevorzugt eine sphärische Gestalt mit einem bevorzugten Durchmesser im Bereich von 1 bis 20 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 2 bis 8 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 4 bis 5 nm, aufweisen. In einer Ausgestaltung bilden jeweils zwei oder mehr der magnetischen Nanopartikel miteinander sogenannte Partikelkomplexe, welche wiederum eine annähernd sphärische Gestalt und einen Durchmesser im Bereich von 10 bis 1000 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 20 bis 800 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 50 bis 500 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 100 bis 200 nm aufweisen. Die magnetischen Nanopartikel weisen zumindest teilweise daran gebundene Streptavidin-Moleküle auf, wobei zumindest teilweise bedeutet, dass mindestens 20%, weiter bevorzugt mindestens 30%, weiter bevorzugt mindestens 50 %, weiter bevorzugt mindestens 70 %, bevorzugt mindestens 80 %, weiter bevorzugt mindestens 90 % der magnetische Nanopartikel daran gebundene Streptavidin-Moleküle aufweisen. Die Streptavidin-Moleküle dienen aufgrund der Streptavidin/Biotin-Wechselwirkung der Bindungsbildung zwischen kationischem Polymer und magnetischen Nanopartikeln.
Pharmazeutische Zusammensetzung
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eukaryotische adulte Zellen, welche ein Transfektionssystem umfassen, wobei das Transfektionssystem

⁺

Hinsichtlich der pharmazeutischen Zusammensetzung ist die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten CD133⁺-Blutstammzelle erhalten oder erhältlich durch in-Kontakt-bringen der adulten, multipotenten CD133⁺-Blutstammzelle mit dem Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii). Die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii) ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, modifizierter mRNA (Boten-RNA), IncRNA (lange, nicht-codierende RNA), microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, weiter bevorzugt eine microRNA. Die mindestens eine Nukleinsäure, bevorzugt die microRNA wirkt dem Absterben der Stammzellen nach Einbringung in das zu behandelnde Organ entgegen, d.h. sie wirkt anti-apoptotisch. Weiterhin kann sie das therapeutische Potential der adulten multipotenten Stammzelle, in welche sie eingebracht wird, und somit der resultierenden eukaryotischen adulten Zellen, bereits vor der Transplantation positiv beeinflussen, beispielsweise können die Zellen durch anti-entzündliche oder pro-angiogenetische microRNAs modifiziert werden. Darüber hinaus dient die microRNA als Regulator in der Stammzelldifferenzierung, beispielsweise bei der Hämatopoese, Kardiogenese, Neurogenese oder der Endothelentwicklung, womit die Vorprogrammierung zu spezifischen Zelltypen vor der Transplantation möglich ist. Die microRNA (miR) umfasst 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide und ist weiter bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-210, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21, miR-130a, miR-16, miR-424, miR-503, miR-1, miR-133, miR-208, miR-499, miR-150, miR-494-3p, miR-146a und miR-23a. In einer Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b und let-7c (antientzündliche microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus let-7f, miR-27b, miR-126 miRNA-34a, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21, miR-130a, miR-16, miR-424, miR-503 und miR-210 (pro-angiogenetische microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-1, miR-133, miR-208 und miR-499 (kardial programmierende microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-150, miR-494-3p, miR-146aund miR-23a (homing microRNAs). Bevorzugt sind humane microRNAs. Die anti-microRNA, welche 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide umfasst, ist komplementär zu einer entsprechenden, vorzugsweise in der adulten multipotenten Stammzelle bereits vorhandenen, microRNA und dient der Neutralisation der microRNA-Funktion. Das kationische Polymer aufweisend Aminogruppen gemäß (i) ist bevorzugt ein Polymer, welches zur Einbringung der mindestens einen Nukleinsäure, bevorzugt von microRNA oder anti-microRNA, weiter bevorzugt microRNA, in eukaryotische adulte Zellen, bevorzugt in adulte multipotente Stammzellen, weiter bevorzugt in adulte multipotente CD133⁺-Stammzellen, geeignet, welches bevorzugt Polyethylenimin, weiter bevorzugt verzweigtes oder unverzweigtes, bevorzugt verzweigtes Polyethylenimin, bevorzugt mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 100.000 Dalton, bevorzugt im Bereich von 100 bis 50.000 Dalton, weiter bevorzugt im Bereich von 10.000 bis 30.000 Dalton, umfasst.
Die magnetische Nanopartikel gemäß (ii) umfassen bevorzugt magnetische Eisenoxidpartikel, weiter bevorzugt Fe₃O₄-Partikel, welche bevorzugt eine sphärische Gestalt mit einem bevorzugten Durchmesser im Bereich von 1 bis 20 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 2 bis 8 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 4 bis 5 nm, aufweisen.
Verfahren zur Herstellung von eukaryotischen adulten Zellen
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von eukaryotischen adulten Zellen, welche ein Transfektionssystem umfassen, umfassend

(a) Bereitstellen von adulten multipotenten CD133⁺-Blutstammzellen,
(b) Zugabe eines Transfektionssystems, welches
1. (i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest teilweise biotinyliert sind,
2. (ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen,
3. (iii) mindestens eine Nukleinsäure,
umfasst.

⁺

₃

₄

In einer bevorzugten Ausgestaltung dient das beschriebene Verfahren der Herstellung einer eukaryotischen adulten Zelle umfassend ein Transfektionssystem wie eingangs unter „eukaryotische adulte Zellen, umfassend ein Transfektionssystem“ beschrieben.
In einer beispielhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von eukaryotischen adulten Zellen wird verzweigtes Polyethylenimin (PEI) mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht von 25 kDA biotinyliert und chromatographisch aufgereinigt. Der Grad der Biotinylierung beträgt im Bereich von 1 bis 10, bevorzugt im Bereich von 1 bis 2 mmol Biotin/mml PEI. Für die Ausbildung von Polyplexen werden Nukleinsäure, insbesondere microRNA und biotinyliertes PEI in einer wässrigen Lösung, die bevorzugt Glukose, weiter bevorzugt 0,1 bis 50 Gewichts-% Glukose, weiter bevorzugt 1 bis 10 Gewichts-% Glukose, enthält, gelöst und für einen ausreichend langen Zeitraum, bevorzugt mindestens 10 Minuten bei einer Temperatur im Bereich von 1 bis 40 °C, weiter bevorzugt im Bereich von 10 bis 30 °C, weiter bevorzugt im Bereich von 15 bis 25 °C, inkubiert. Magnetische Nanopartikel, bevorzugt Fe₃O₄-Partikel, welche gebundenes Streptavidin aufweisen, werden mit den Polyplexen aus microRNA und biotinyliertem PEI zusammengegeben. Bevorzugt werden die magnetischen Nanopartikel zuvor mit Ultraschall behandelt, weiter bevorzugt in einem Ultraschallbad inkubiert, um gegebenenfalls gebildete Cluster aufzulösen. Die Mischung aus magnetischen Nanopartikel, bevorzugt Fe₃O₄-Partikel, welche gebundenes Streptavidin aufweisen und den Polyplexen aus microRNA und biotinyliertem PEI wird für einen ausreichend langen Zeitraum, bevorzugt mindestens 10 Minuten, weiter bevorzugt 15 min bis 24 Stunden, weiter bevorzugt 20 bis 120 Minuten, bei einer Temperatur im Bereich von 1 bis 40 °C, weiter bevorzugt im Bereich von 10 bis 30 °C, weiter bevorzugt im Bereich von 15 bis 25 °C, inkubiert. Adulte multipotente Stammzellen, bevorzugt adulte multipotente CD133+-Stammzellen werden in einem geeigneten Gefäß, beispielsweise einer Zellkulturplatte mit der Mischung aus magnetischen Nanopartikel, bevorzugt Fe₃O₄-Partikel, welche gebundenes Streptavidin aufweisen und den Polyplexen aus microRNA und biotinyliertem PEI zusammengegeben. Bevorzugt erfolgt eine Inkubation bei einer Temperatur im Bereich von 1 bis 50 °C, weiter bevorzugt im Bereich von 10 bis 45 °C, weiter bevorzugt im Bereich von 30 bis 40 °C für einen ausreichend lange Zeitraum, bevorzugt mindestens 10 Minuten, weiter bevorzugt von 1 Stunde bis 48 Stunden, weiter bevorzugt von 10 bis 24 Stunden, in Gegenwart eines Nährmediums (z.B. DMEM, Dulbecco's Modified Eagle Medium), welches bevorzugt Antibiotika (beispielsweise Penicilin/Streptomycon) oder fetales Kälberserum, weiter bevorzugt Antibiotika und fetales Kälberserum, enthält.
Verwendung zur Herstellung von Gewebe
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer eukaryotischen adulten Zelle, umfassend ein Transfektionssystem, welches

i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest teilweise biotinyliert sind,
(ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen,
(iii) mindestens eine Nukleinsäure,

⁺

Verwendung bei der Behandlung von Erkrankungen, welche mit Gewebeschäden einhergehen
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer eukaryotischen adulten Zelle, umfassend ein Transfektionssystem, welches

⁺

Die magnetischen Nanopartikel gemäß (ii) umfassen bevorzugt magnetische Eisenoxidpartikel, weiter bevorzugt Fe₃O₄-Partikel, welche bevorzugt eine sphärische Gestalt mit einem bevorzugten Durchmesser im Bereich von 1 bis 20 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 2 bis 8 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 4 bis 5 nm, aufweisen.
Verfahren zur Herstellung von Gewebe
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur in vitro Herstellung von Gewebe umfassend

(A) Bereitstellen von Gewebe, bevorzugt Herzmuskelgewebe oder Skelettmuskelgewebe,
(B) Zugabe von eukaryotischen adulten Zellen umfassend ein Transfektionssystem wie oben beschrieben oder erhalten oder erhältlich durch ein Verfahren wie oben beschrieben, unter Erhalt einer Mischung aus Gewebe und eukaryotischen adulten Zellen.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zur in vitro Herstellung von Gewebe weiterhin

(C) Kultivieren der in (B) erhaltenen Mischung aus Gewebe und eukaryotischen adulten Zellen.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Ausführungsformen und Kombinationen von Ausführungsformen, die sich aus den entsprechenden Rückbezügen und Verweisen ergeben, näher illustriert:

1. Eukaryotische adulte Zelle, umfassend ein Transfektionssystem, wobei das Transfektionssystem
1. (i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest teilweise biotinyliert sind,
2. (ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen,
3. (iii) mindestens eine Nukleinsäure,
umfasst, wobei die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten CD133⁺-Blutstammzelle erhalten oder erhältlich ist.
2. Eukaryotische adulte Zelle, wobei die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten CD133⁺-Blutstammzelle durch in-Kontakt-bringen der adulten, multipotenten, bevorzugt CD133+-Blutstammzelle mit dem Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii) erhalten oder erhältlich ist.
3. Eukaryotische adulte Zelle gemäß Ausführungsform 1 oder 2, wobei die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, modifizierter mRNA, IncRNA, microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, weiter bevorzugt microRNA.
4. Eukaryotische adulte Zelle gemäß Ausführungsform 3, wobei die microRNA 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide umfasst und weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-210, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21, miR-130a, miR-16, miR-424, miR-503, miR-1, miR-133, miR-208, miR-499, miR-150, miR-494-3p und miR-23a.
5. Eukaryotische adulte Zelle gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 4, wobei das kationische Polymer aufweisend Aminogruppen gemäß (i) ein Polymer ist, welches zur Einbringung der mindestens einen Nukleinsäure, bevorzugt von microRNA oder anti-microRNA, weiter bevorzugt von microRNA, in adulte multipotente CD133⁺-Blutstammzellen, geeignet ist, welches bevorzugt Polyethylenimin, weiter bevorzugt verzweigtes oder unverzweigtes, bevorzugt verzweigtes Polyethylenimin, bevorzugt mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 100.000 Dalton, bevorzugt im Bereich von 100 bis 50.000 Dalton, weiter bevorzugt im Bereich von 10.000 bis 30.000 Dalton, umfasst.
6. Eukaryotische adulte Zelle gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 5, wobei die magnetischen Nanopartikel gemäß (ii) magnetische Eisenoxidpartikel, bevorzugt Fe₃O₄-Partikel umfassen, welche bevorzugt eine sphärische Gestalt mit einem bevorzugten Durchmesser im Bereich von 1 bis 20 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 2 bis 8 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 4 bis 5 nm, aufweisen.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eukaryotische adulte Zellen, welche ein Transfektionssystem umfassen, wobei das Transfektionssystem
1. (i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest teilweise biotinyliert sind,
2. (ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen,
3. (iii) mindestens eine Nukleinsäure,
umfasst, wobei die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten CD133⁺-Blutstammzelle erhalten oder erhältlich ist.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Ausführungsform 7, wobei die eukaryotische adulte Zelle durch in-Kontakt-bringen der adulten, multipotenten CD133⁺-Blutstammzelle mit dem Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii), erhalten oder erhältlich ist.
9. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Ausführungsform 7 oder 8, wobei die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, modifizierter mRNA, IncRNA, microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, weiter bevorzugt microRNA, ist.
10. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Ausführungsform 9, wobei die microRNA 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide umfasst und weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-210, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21, miR-130a, miR-16, miR-424, miR-503, miR-210, miR-1, miR-133, miR-208, miR-499, miR-150, miR-494-3p, miR-146a und miR-23a.
11. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einer der Ausführungsformen 7 bis 10, wobei das kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen gemäß (i) ein Polymer ist, welches zur Einbringung der mindestens einen Nukleinsäure, bevorzugt von microRNA oder anti-microRNA, weiter bevorzugt von microRNA, in eukaryotische adulte Zellen, bevorzugt in adulte multipotente Stammzellen, weiter bevorzugt in adulte multipotente CD133⁺-Stammzellen, geeignet ist, welches bevorzugt Polyethylenimin, weiter bevorzugt verzweigtes oder unverzweigtes, bevorzugt verzweigtes Polyethylenimin, bevorzugt mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 100.000 Dalton, bevorzugt im Bereich von 100 bis 50.000 Dalton, weiter bevorzugt im Bereich von 10.000 bis 30.000 Dalton, umfasst.
12. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einer der Ausführungsformen 7 bis 11, wobei die magnetische Nanopartikel gemäß (ii) magnetische Eisenoxidpartikel, bevorzugt Fe₃O₄-Partikel umfassen, welche bevorzugt eine sphärische Gestalt mit einem bevorzugten Durchmesser im Bereich von 1 bis 20 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 2 bis 8 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 4 bis 5 nm, aufweisen.
13. Verfahren zur Herstellung von eukaryotischen adulten Zellen, welche ein Transfektionssystem umfassen, umfassend
- (b) Bereitstellen von adulten multipotenten CD133⁺-Blutstammzellen,
- (b) Zugabe eines Transfektionssystems, welches
  1. (i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest teilweise biotinyliert sind,
  2. (ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen,
  3. (iii) mindestens eine Nukleinsäure,
umfasst.
14. Verfahren gemäß Ausführungsform 13, wobei die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, modifizierter mRNA, IncRNA, microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, weiter bevorzugt microRNA.
15. Verfahren gemäß Ausführungsform 14, wobei die microRNA 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide umfasst und weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-210, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21, miR-130a, miR-16, miR-424, miR-503, miR-210, miR-1, miR-133, miR-208, miR-499, miR-150, miR-494-3p, miR-146a und miR-23a.
16. Verfahren gemäß einer der Ausführungsformen 13 bis 15, wobei das kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen gemäß (i) ein Polymer ist, welches zur Einbringung der mindestens einen Nukleinsäure, bevorzugt von microRNA oder anti-microRNA, weiter bevorzugt von micro-RNA, in eukaryotische adulte Zellen, bevorzugt in adulte multipotente Stammzellen, weiter bevorzugt in adulte multipotente CD133⁺-Stammzellen, geeignet ist, welches bevorzugt Polyethylenimin, weiter bevorzugt verzweigtes oder unverzweigtes, bevorzugt verzweigtes Polyethylenimin, bevorzugt mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 100.000 Dalton, bevorzugt im Bereich von 100 bis 50.000 Dalton, weiter bevorzugt im Bereich von 10.000 bis 30.000 Dalton, umfasst.
17. Verfahren gemäß einer der Ausführungsformen 13 bis 16, wobei die magnetischen Nanopartikel gemäß (ii) magnetische Eisenoxidpartikel, bevorzugt Fe₃O₄-Partikel umfassen, welche bevorzugt eine sphärische Gestalt mit einem bevorzugten Durchmesser im Bereich von 1 bis 20 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 2 bis 8 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 4 bis 5 nm, aufweisen.
18. Verfahren gemäß einer der Ausführungsformen 13 bis 17 zur Herstellung einer eukaryotischen adulten Zelle umfassend ein Transfektionssystem gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 6.
19. Verwendung einer eukaryotischen adulten Zelle, umfassend ein Transfektionssystem, welches
- i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest teilweise biotinyliert sind,
- (ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen,
- (iii) mindestens eine Nukleinsäure,
umfasst, bei der in vitro Herstellung von Gewebe, weiter bevorzugt bei der Herstellung von Herzmuskelgewebe oder Skelettmuskelgewebe, weiter bevorzugt bei der in vitro Herstellung von Herzmuskelgewebe oder Skelettmuskelgewebe, wobei die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten CD133⁺-Blutstammzelle erhalten oder erhältlich ist.
20. Verwendung gemäß Ausführungsform 19, wobei die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten CD133⁺-Blutstammzelle erhalten oder erhältlich ist durch in-Kontakt-bringen der adulten, multipotenten CD133⁺-Blutstammzelle mit dem Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii).
21. Verwendung gemäßAusführungsform 19 oder 20, wobei die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, modifizierter mRNA, IncRNA, microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, und bevorzugt eine microRNA ist.
22. Verwendung einer eukaryotischen adulten Zelle, umfassend ein Transfektionssystem, welches
- i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest teilweise biotinyliert sind,
- (ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen,
- (iii) mindestens eine Nukleinsäure,
bei der Behandlung von Erkrankungen, welche mit Gewebeschäden einhergehen, bevorzugt von Gewebeschäden an Organen, weiter bevorzugt von Gewebeschäden am Herzmuskel oder Skelettmuskel, wobei die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten CD133⁺-Blutstammzelle erhalten oder erhältlich ist.
23. Verwendung gemäß Ausführungsform 22, wobei die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten CD133⁺-Blutstammzelle durch in-Kontakt-bringen der adulten, multipotenten, CD133+-Blutstammzelle mit dem Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii) erhalten oder erhältlich ist.
24. Verwendung gemäß Ausführungsform 22 oder 23, wobei die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, modifizierter mRNA, IncRNA, microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, und bevorzugt eine microRNA ist.
25. Verwendung gemäß Ausführungsform 24, wobei die microRNA 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide umfasst und weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-210, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21, miR-130a, miR-16, miR-424, miR-503, miR-1, miR-133, miR-208, miR-499, miR-150, miR-494-3p und miR-23a.
26. Verwendung gemäß einer der Ausführungsformen 22 bis 25, wobei das kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen gemäß (i) ein Polymer ist, welches zur Einbringung der mindestens einen Nukleinsäure, bevorzugt von microRNA oder anti-microRNA, weiter bevorzugt von microRNA, in eukaryotische adulte Zellen, bevorzugt in adulte multipotente Stammzellen, weiter bevorzugt in adulte multipotente CD133⁺-Stammzellen, geeignet ist, welches bevorzugt Polyethylenimin, weiter bevorzugt verzweigtes oder unverzweigtes, bevorzugt verzweigtes Polyethylenimin, bevorzugt mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 100.000 Dalton, bevorzugt im Bereich von 100 bis 50.000 Dalton, weiter bevorzugt im Bereich von 10.000 bis 30.000 Dalton, umfasst.
27. Verwendung gemäß einer der Ausführungsformen 22 bis 25 wobei die magnetische Nanopartikel gemäß (ii) magnetische Eisenoxidpartikel, bevorzugt Fe₃O₄-Partikel umfassen, welche bevorzugt eine sphärische Gestalt mit einem bevorzugten Durchmesser im Bereich von 1 bis 20 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 2 bis 8 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 4 bis 5 nm, aufweisen.
28. Verfahren zur in vitro Herstellung von Gewebe umfassend
1. (A) Bereitstellen von Gewebe, bevorzugt Herzmuskelgewebe oder Skelettmuskelgewebe,
2. (B) Zugabe von eukaryotischen adulten Zellen umfassend ein Transfektionssystem, bevorzugt von eukaryotischen adulten Zellen umfassend ein Transfektionssystem gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 6 oder erhalten oder erhältlich durch ein Verfahren gemäß einer der Ausführungsformen 13 bis 18, unter Erhalt einer Mischung aus Gewebe und eukaryotischen adulten Zellen.
29. Verfahren zur Herstellung von Gewebe gemäß Ausführungsform 28, umfassend
- (C) Kultivieren der in (B) erhaltenen Mischung aus Gewebe und eukaryotischen adulten Zellen.

Figurenliste

zeigt schematisch die Struktur eines Transfektionssystems (PEI: Polyethylenimin; MNP: magnetische Nanopartikel; miR: microRNA);
zeigt die Boolean-Gating-Strategie für durchflusszytometrische Messungen der Zellviabilität und der Oberflächenmarkerintegrität (SSC: Seitwärtsstreulicht, Side Scatter);
zeigt die Gating-Strategie für durchflusszytometrische Messungen der Aufnahmeeffizienz und Zytotoxizität von Transfektionskomplexen;
zeigt die Transfektionsoptimierung von CD133⁺-Zellen bei Verwendung verschiedener miR/PEI-Komplexe;
zeigt die Transfektionsoptimierung von CD133⁺-Zellen bei Verwendung verschiedener miR/PEI/MNP-Komplexe;
zeigt die magnetische Zielführung transfizierter CD133⁺-Zellen
zeigt die intrazelluläre Visualisierung von Transfektionskomplexen;
zeigt die Viabilität und Oberflächenmarkerintegrität nach Transfektion;
zeigt die hämatopoetische Differenzierungsfähigkeit von Zellen nach der Transfektion.

Die vorliegende Erfindung wurde durch die folgenden Beispiele näher illustriert.
Beispiele
Material und Methoden
Knochenmarksproben
Knochenmark wurde von aufgeklärten Patienten, die ihre schriftliche Einwilligung zur Verwendung ihrer Proben für Forschungszwecke nach der Deklaration von Helsinki gegeben haben, verwendet. Die Studie wurde durch die Ethikkommission der Universität Rostock 2010 genehmigt (erneuert2015) (Registrierungsnummer A 2010 23). Sternales Knochenmark wurde von Patienten entnommen während sie sich einer Koronararterien-Bypassoperation am Institut der Herzchirurgie (Universitätsklinikum Rostock, Deutschland) unterzogen. Um die Koagulationen des Knochenmarks zu verhindern wurde eine Heparin-Natrium-Lösung (250 i.E./ml Knochenmark) (Rathiopharm GmbH, Deutschland) verwendet.
Isolation von CD133⁺ Zellen
Mononukleäre Zellen wurden durch eine Dichtegradientenzentrifugation aus dem Knochenmark isoliert. CD133⁺ Zellen wurden durch magnetbasierte Zellsortierung (MACS®) unter Verwendung des CD133 MicroBead Kits (Miltenyi Biotec GmbH, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers angereichert. Für nachfolgende Experimente wurden nur CD133⁺ Zellfraktionen die eine Viabilität und eine Reinheit von ≥ 80% aufwiesen verwendet.
Bestimmung der Viabilität und der Reinheit von CD133⁺ Zellen
Die Viabilität und die Oberflächenmarkerexpression wurden mittels Durchflusszytometrie 0 h und 18 h nach der Zellisolation analysiert. Für die Färbung wurden die Proben mit folgenden Antikörpern behandelt: anti-CD34-FITC (Klon: AC136), anti-CD133/2-PE (Klon: 293C3), Isotypkontrolle Maus IgG 2b-PE (Miltenyi Biotec GmbH), anti-CD45-APC-H7 (Klon: 2D1) und 7-AAD (BD Biosciences, Deutschland). Um unspezifische Bindungen zu vermeiden wurde den Proben zusätzlich FcR blocking reagent (Miltenyi Biotec GmbH) hinzugefügt. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei 4 °C wurden die Proben mit dem LSR-II Durchflusszytometer (BD Biosciences) gemessen und mit Hilfe der FACSDiva Software.(BD Bioscience) analysiert. Für die Evaluation wurde die Boolean-Gating-Strategie nach der ISHAGE-Richtlinie für CD34+ Zellanalysen [Sutherland, D. R., Anderson, L., Keeney, M., Nayar, R., and Chin-Yee, I. 1996. The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. International Society of Hematotherapy and Graft Engineering. Journal of hematotherapy 5, 3, 213-226] wie folgt angeordnet:

1. Schritt: Selektion der Zellpopulation (
2. Schritt: Selektion von CD45⁺ Zellen (
3. Schritt: Selektion von viablen CD45⁺ Zellen ( )
4. Schritt: Selektion von viablen CD45⁺/CD34⁺ Zellen ( )
5. Schritt: Selektion von viablen CD45⁺/CD34⁺/CD133⁺ Zellen (

Die Berechnung der Zellviabilitat und der Reinheit erfolgte nach folgenden Gleichungen: $V i a b i l i t ä t [%] = \frac{v i a b l e C D 45^{+} Z e l l e n}{C D 45^{+} Z e l l e n} \times 100$
$R e i n h e i t [%] = \frac{v i a b l e C D 45^{+} / C D 34^{+} / C D 133^{+} Z e l l e n}{v i a b l e C D 45^{+} Z e l l e n} \times 100$
Präparation der Polyplexe und Transfektion
Cy3™ dye-labeled Pre-miR Negative Control #1 (Ambion, USA) wurde für die Bestimmung der Aufnahmeeffizienz, der Zytotoxizität und für das magnetische Targeting verwendet. Pre-miR™ miRNA Precursor Molecules - Negative Control #1 (Ambion, USA) wurde für durchflusszytometrische Kontrollen, die Analyse der Oberflächenmarkerexpression, die intrazelluläre Visualisierung der Komplexe und zur Untersuchung des hämatopoetischen Differenzierungspotenzials (CFU-Assay) verwendet.
Verzweigtes Polyethylenimin (PEI) mit einem Molekulargewicht von 25 kDA (Sigma-Aldrich, USA) wurde biotinyliert unter Verwendung des EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotins (Thermo Fisher Scientific GmbH, Germany) gemäß den Anweisungen des Herstellers und wie zuvor von unsere Gruppe beschrieben [Voronina, N., Lemcke, H., Wiekhorst, F., Kuhn, J.-P., Rimmbach, C., Steinhoff, G., and David, R. 2016. Nonviral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine : nanotechnology, biology, and medicine]. Die finale Konzentration der Aminogruppen wurde mit Hilfe der Ninhydrin-Methode (2 %ige Ninhydrin Reagent, Sigma-Aldrich) gemessen und ein Biotinylierungsgrad von 1,585 ± 0,018 mmol Biotin/mmol PEI mit Hilfe des HABA Assays unter Verwendung des Pierce Biotin Quantitation Kits (Thermo Fisher Scientific GmbH) bestimmt.
Um größere Aggregate und Partikel zu entfernen wurden die Streptavidin MagneSphere® Paramagnetic Particles (Promega Corporation, USA) durch 0,45 µm Millex-HV PVDF Syringe Filter Units (EMD Millipore Corporation, USA) gefiltert. Das biotinylierte PEI und die gefilterten Magnetpartikel (MNPs) wurden bei 4 °C bis zur Verwendung gelagert.
Für die Bildung der Polyplexe wurden die entsprechenden Mengen an microRNA (Pre-miR Negative Control #1; entsprechend der Versuchsanordnung mit Cy3 markiert (Ambion, USA) und PEI in gleichen Volumina in 5 %iger Glukoselösung (MP Biomedicals, Deutschland) verdünnt. Dabei wurden verschiedene Verhältnisse von Stickstoff (PEI) zu Phosphat (miR) (N/P Verhältnis) getestet. Nach Vereinigung beider Proben und intensiver Durchmischung wurde die microRNA/PEI-Lösung 30 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert.
Für die Bildung magnetischer Polyplexe wurden die MNPs vor jeder Anwendung für 20 min im Ultraschallbad inkubiert, um geformte Aggregate zu beseitigen.
Anschließend wurden die MNPs mit den zuvor präparierten microRNA/PEI-Komplexen in verschiedenen Konzentrationen gemischt und für 30 min bei RT inkubiert.
Für die Transfektion wurden 5×10⁴ frisch isolierte CD133⁺ Zellen in ein Well einer 24er Wellplatte ausgesät und es erfolgte die sofortige Zugabe der zuvor präparierten miR/PEI- oder miR/PEI/MNP-Komplexe. Nach einer Inkubationszeit von 18 h bei 37 °C und 5 % CO₂ in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Pan Biotech GmbH, Deutschland) dem 1 % Penicillin/Streptomycin (PAA Laboratories GmbH, Germany) und 2 % fetales Rinderserum (Pan Biotech GmbH) zugesetzt war, wurden die Zellen direkt für die Messung verwendet oder es erfolgte ein Mediumwechsel.
Aufnahmeeffizienz und Zytotoxizität der Transfektionskomplexe
Für die Quantifizierung der Aufnahmeeffizienz und der Zytotoxizität der unterschiedlich zusammengesetzten Transfektionskomplexe wurden die CD133⁺ Zellen 18 h nach der Transfektion für 10 min bei 4 °C mit LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit (Molecular Probes, USA) gefärbt und anschließend mit einer 4 %igen Formaldehydlösung (FA) (Merck Schuchardt OHG, Deutschland) fixiert. Die Proben wurden mit dem LSR-II Durchflusszytometer gemessen und die Daten mit Hilfe der FACSDiva Software (BD Bioscience) analysiert. zeigt die repräsentative Gating-Strategie.
Eine qualitative Analyse der transfizierten CD133+ Zellen erfolgte 18 h nach der Transfektion von Cy3™ dye-labeled Pre-miR Negative Control #1 (Ambion, USA). Hierzu wurden die Zellen mit 2 % FBS gewaschen um nicht aufgenommene Partikel zu lösen. Anschließend wurden die Zellen in 4 %iger FA-Lösung für 20 min fixiert. Danach wurden die Zellen auf ein Deckglas zentrifugiert und mit PBS gewaschen.
Abschließend wurde das Deckglas mit Fluoroshield™ mit DAPI (Sigma-Aldrich, Germany) auf einem Objektträger gebettet. Mit Hilfe der Laser-Scanning Mikroskopie (LSM) (40x Ölimmersion) wurde ein tile-scan der Proben durchgeführt, welches zu einer besseren Übersicht von 1062.33 µm x 1062.33 µm führte. Desweiteren wurde ein z-stack mit einer Tiefe von 7 µm zur Bestimmung der Aufnahme von Cy3-markierter miR durchgeführt.
Magnetisches Targeting
Der Nachweis des magnetischen Zelltargetings der CD133⁺ Zellen erfolgte mit den optimierten Transfektionskomplexen (20 pmol miR; N/P Verhältnis: 7,5; 3 und 5 µg/ml MNP). 18 h nach der Transfektion wurden die Zellen in ein neues Well einer 12er Wellplatte überführt. Ein magnetisches Feld wurde, lokal durch eine Magnetplatte unterhalb der Zellkulturschale, erzeugt (OZ Biosciences, France; Feldstärke 70 - 250 mT). Nach einer Inkubationszeit von 24 h bei 37 °C und 5 % CO₂ wurde die Zellzahl in den Areal mit (+M) und ohne (-M) Magnet mit Hilfe des LSM 780 ELYRA PS.1 erfasst und nachfolgend durch ZEN 2011 Software (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Deutschland) und ImageJ 1.48 (NIH, USA) analysiert. Das entsprechende Verhältnis des magnetischen Targetings wurde wie folgt ermittelt: Zahlzahl (+M)/ Zellzahl (-M).
Magnetpartikel Spektroskopie zur Bestimmung des Eisengehaltes in CD133⁺ Zellen
Zur Bestimmung der Eisenkonzentration wurden 5×10⁵ CD133⁺ Zellen mit den optimalen miR/PEI/MNP Komplexen transifiziert (20 pmol miR; N/P Verhältnis 7,5; 3 µg/ml MNPs). Nach einer Inkubationszeit von 18 h wurden die Proben mit 2 % FBS in PBS gewaschen, anschließend mit 4 %iger FA-Lösung fixiert und in ein 0,2 ml Reaktionsgefäß überführt. Die Messungen wurden mit Hilfe eines MPS (Bruker Biospin, Deutschland) unter einer magnetischen Flussdichte von B_drive = 25 mT und einer Frequenz von f₀ = 25 kHz durchgeführt. Hierbei werden nicht-lineare dynamische magnetische Momente der Proben in höheren Frequenzen als f₀ bestimmt. Die Eisenquantifizierung der Proben erfolgte durch die Bestimmung der dritten harmonischen Frequenz des MPS-Spektrums (A₃). Das MPS-Spektrum wurde gegen ein Referenzspektrum der eingesetzten MNPs und CD133 MircoBeads normalisiert (bekannter Eisengehalt, MNPs: 3,2 µg; CD133 MircoBeads: 2,5 µg). das Verhältnis von A₅/A₃ wird als charakteristischer Fingerabdruck zur Identifizierung der verschiedenen magnetischen Nanopartikel herangezogen.
Intrazelluläre Visualisierung der Transfektionskomplexe
Zur Visualisierung der Transfektionskomplexe wurde Pre-miR™ miRNA Precursor Molecule - Negative Control #1 (Ambion) mit Hilfe des Label IT® miRNA Labeling Kits (Mirus Bio LLC, USA) mit Cy5™ Farbstoff markiert, entsprechend den Vorgaben des Herstellers. Überflüssiger Farbstoff wurde durch die mitgelieferten Aufreinigungssäulen entfernt. Die Konzentration der Cy5-markierten miR wurde spektrophotometrisch mit Hilfe des NanoDrops ND-1000 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) ermittelt und nachfolgend lichtgeschutzt bei -20 °C gelagert. PEI wurde mit Hilfe des FluoReporter® Oregon Green® 488 Protein Labeling Kits (Molecular Probes), entsprechend den Vorgaben des Herstellers, gefärbt. Hierzu wurde PEI mit 1 M Natriumbicarbonat-Lösung gemischt und 1 h mit der Oregon Green® Stammlösung (10 mg/ml in DMSO) inkubiert. Nichtgebundener Farbstoff wurde durch Größenausschluss-Chromatographie mittels PD-10 Entsalzungssäulen (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) entfernt. Die Konzentration von 488-markiertem PEI wurde durch eine Ninhydrinanalyse ermittelt und nachfolgend lichtgeschützt bei 4 °C gelagert.
Die MNPs wurde mit dem Farbstoff Atto 565-konjugiert zu Biotin (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Deutschland) gefärbt. Hierzu wurden die MNPs mit Atto 565 Farbstoff (Verhältnis 1:1000 w/w), parallel zur Generierung der miR/PEI Komplexe, gemischt und für 30 min im Dunkeln inkubiert.
Um die intrazelluläre Verteilung der Transfektionskomplexe zu verfolgen, wurden 5×10⁴ CD133⁺ Zellen mit den oben beschriebenen fluoreszenzmarkierten Komplexen und unter den optimalen Bedingungen (20 pmol miR; N/P Verhältnis 7,5; 3 µg/ml MNPs) transfiziert. 18 h nach der Transfektion wurden die Zellen einmalig mit 2 % FBS in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, Pan Biotech GmbH) gewaschen um freie Partikel zu lösen, anschließend wurden diese mit 4 % FA für 20 min fixiert. Nachfolgend wurden die Zellen auf ein Deckglas zentrifugiert und nochmals mit PBS gewaschen. Abschließend wurde das Deckglas mit Fluoroshield™ mit DAPI (Sigma-Aldrich, Germany) auf einem Objektträger gebettet.
Zunächst wurde die intrazelluläre Lokalisation aller Transfektionskomplexbestandteile mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (LSM) untersucht. Hierzu wurde das ELYRA PS.1 LSM 780 System genutzt. Zur anschließenden Aufbereitung der aufgenommenen Bilder wurde die ZEN Software (Carl Zeiss Microscopy GmbH) verwendet. Eine detaillierte Analyse zur Lokalisation der Komplexen erfolgte durch 3-dimensionale structured illumination Mikroskopie (SIM), welche ebenfalls mit dem ELYRA PS.1 LSM 780 System durchgeführt wurde. SIM-Aufnahmen mit 4 Fluorophoren erfolgten mit einem 100x alpha Plan-Apochromat Objektiv (Ölimmersion), NA=1,46 und bei Anregungswellenlängen von 405, 488, 561 und 633 nm. Die Aufnahmen wurden als 16bit z-Stapel generiert, mit 3 Rotationen, 3 Phasen und einem Average-Wert von 4. Der Gitterabstand für die jeweiligen Anregungswellenlängen betrug: 23 µm für 405 nm, 34 µm für 488 nm, 42 µm für 561 nm und 51 µm für 633nm. Die ermittelten SI Rohdaten wurden durch die ZEN Software rekonstruiert. Für jeden Farbkanal wurde aus dem aufgenommen z-Stapel eine 2D Maximum Projection generiert und anschließend erfolgte die Überlagerung der einzelnen Farbkanäle zu einem Einzelbild.
Hämatopoetischer CFU (CFU-H) Assay
Um das hämatopoetische Differenzierungspotenzial der microRNA-modifizierten CD133⁺ Zellen zu bestimmen wurde ein CFU-H Assay durchgeführt. 18 h nach der Transfektion mit Pre-miR™ miRNA Precursor Molecules - Negative Control #1 wurden die Zellen mit MethoCult H4434 Classic (STEMCELL Technologies, Deutschland) gemischt und anschließend in einer Konzentration von 1×10³ Zellen pro 35 mm Zellkulturschale ausgesät. Die Bewertung der gebildeten Kolonien, nach Anzahl und Art, wurde nach einer Inkubationszeit von 14 Tage bei 37 °C und 5 % CO₂ durchgeführt. Nach Herstellerangaben wurden alle Proben in Duplikaten untersucht.
Statistische Auswertung
Eine statistische Auswertung wurde mittels Student's t-test und der SigmaPlot 11.0 Software (Systat Software GmbH, Deutschland) durchgeführt. Alle Daten sind dargestellt als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Daten mit p ≤ 0.05 (*;#); p ≤ 0.01 (**;# #); und p ≤ 0.001 (***;# # #) wurden als statistisch signifikant betrachtet. Für jedes Experiment wurden verschiedene Knochenmarksspender (n) verwendet.
Ergebnisse
Optimierung der miR/PEI-Komplexe für die Transfektion
Für die Optimierung der Transfektion der CD133⁺-Stammzellen wurden verschiedene Zusammensetzungen von miR/PEI-Komplexen, die vier unterschiedliche Gehalte an miR aufwiesen (10, 20, 30 und 40 pmol pro 5×10⁴ Zellen) und drei verschiedene N/P-Verhältnisse (2,5; 5,0 und 7,5) bezüglich der Aufnahmeeffizienz und Zytotoxizität untersucht. Bei allen Messungen dienten nicht-transfizierte Zellen als interne Kontrolle. Komplexe mit der kleinsten miR-Menge (10 pmol) zeigten die geringsten Aufnahmeraten (im Bereich von 20 bis 60 % Cy3⁺ Zellen) und eine moderate Zytotoxizität (ca. 40 % tote Zellen) im Vergleich zur Kontrolle (ca. 25 % tote Zellen). Die Ergebnisse sind in gezeigt. Komplexe mit höheren Gehalten an miR ergaben eine signifikant erhöhte Aufnahmeeffizienz (bis zu ca. 95 % Cy3⁺ Zellen), ergaben aber auch erhöhte zytotoxische Effekte (bis zu ca. 80 % tote Zellen), wobei höhere PEI-Mengen erforderlich waren. Daher wurden Komplexe, die 20 pmol miR enthielten, als optimal für die Transfektion der CD133⁺-Stammzellen angesehen, da sie eine Balance zwischen erhöhten Aufnahmeraten (ca. 75-90 % Cy3⁺ Zellen) und relativ geringer Zytotoxizität aufwiesen.
miR/PEI/MNP Komplexe sind geeignet für eine CD133⁺ Stammzelltransfektion
Zur Ermöglichung einer magnetischen Zielführung und Auffindung wurden die vorher ausgewählten Polyplexe (20 pmol miR, N/P-Verhältnis 2,5; 5,0 und 7,5) mit magnetischen Nanopartikeln (MNP) in fünf verschiedenen Konzentrationen (1, 2, 3, 4 und 5 µg pro ml fertiger miR/PEI-Mischung) versetzt. Der Einfluss der MNPs auf die Aufnahmeeffizienz und die Zytotoxizität wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Nicht-transfizierte Zellen wurden als Kontrolle eingesetzt.
Die Aufnahmeraten der miR/PEI/MNP-Komplexe unterschieden sich nicht signifikant von denen der entsprechenden miR/PEI-Komplexe (ohne MNP), die Ergebnisse sind in dargestellt. Dahingegen führten erhöhte N/P-Verhältnisse (2,5; 5 und 7,5) zu erhöhten Aufnahmeeffizienzen (ca. 40 %, ca. 60 % und ca. 80 % Cy3⁺-Zellen). Repräsentative Aufnahmen belegen die intrazelluläre Lokalisation von Cy3-markierter miR und der gleichzeitigen hohen Aufnahmeeffizienz bei einem Einsatz von 20 pmol miR N/P-Verhätnis 7,5 kombiniert mit 3 µg/ml MNPs. Weiterhin konnten keine signifikanten Veränderungen in der Zytotoxizität zwischen Kontrolle (36 % ± 11 tote Zellen) und den transfizierten Zellen (zwischen ca. 25 % und ca. 35 % tote Zellen) ermittelt werden. In Folgeexperimenten wurden magnetische Komplexe, zusammengesetzt aus 20 pmol miR, N/P-Verhältnis 7,5, kombiniert mit 3 und 5 µg/ml MNPs, verwendet in Hinblick auf ihre höchsten Aufnahmeraten und geringe Zytotoxizität im Vergleich zur Kontrolle. Für die Vergleichsuntersuchung wurden Komplexe, zusammengesetzt aus 20 pmol miR, N/P-Verhältnis 5 kombiniert mit 3 und 5 µg/ml MNPs für Folgeuntersuchungen verwendet.
Zielführung von transfizierte CD133⁺-Zellen in einem magnetischen Feld
Zur Untersuchung des Einflusses eines Magnetfeldes auf die Zielführung von Zellen, die mit optimierten miR/PEI/MNP-Komplexen transfiziert waren, wurde eine Magnetplatte lokal unter einem Teilbereich der Zellkulturplatte für 24 Stunden angebracht ( ).
Bei nicht-transfizierten Zellen wurde nahezu die gleiche Anzahl von Zellen in beiden Bereichen (mit und ohne Magnet, siehe und ) beobachtet. Diese Resultate indizierten, dass MACS CD133 Microbeads allein nicht ausreichend waren für eine Zielführung der Zellen. Im Gegensatz dazu zeigten Zellen, die mit magnetischen Komplexen, zusammengesetzt aus 20 pmol miR, einem N/P-Verhältnis von 5 und 7,5, kombiniert mit 3 und 5 µg/ml MNPs höhere Zellzahlen im Bereich des Magneten (+M) als in dem Bereich ohne Magnet (-M). Entsprechend zeigten transfizierte Zellen signifikant höhere magnetische Zielführungsverhältnisse (Verhältnis zwischen 1,6 und 2,6) als nicht-transfizierte Zellen (Verhältnis 1±0,12). Die Ergebnisse sind in dargestellt. Weiterhin zeigten Transfektionskomplexe mit einem N/P-Verhältnis von 7.5 signifikant höhere Zielführungsverhältnisse (2,6±0,17 und 2,2±0,08 mit 3 und 5 µg/ml MNPs). Daher wurden Komplexe, zusammengesetzt aus 20 pmol miR, einem N/P-Verhältnis von 7,5 in Kombination mit 3 oder 5 µg/ml MNPs als am besten geeignet für die Zielführung von transfizierten Zellen in einem Magnetfeld angesehen und daher für die weiteren Untersuchungen eingesetzt. zeigt eine Übersicht der Ergebnisse.
Intrazelluläre Eisenkonzentration
Zur Bestimmung der Eisenkonzentration wurden Transfektionskomplexe herangezogen, welche als optimal für die Transfektion von CD133⁺ Zellen sowie für ihre magnetische Zielführung definiert wurden. Die intrazelluläre Eisenkonzentration wurde mit Hilfe der magnetischen Partikelspektroskopie (MPS) quantifiziert. Eine Eisenkonzentration von 0,155 ± 0,0419 pg Eisen pro Zelle konnte durch die Transfektion von miR/PEI/MNP Komplexen erzielt werden. Ein entsprechender A₅/A₃ Wert von 20,5 ± 3,1 % erlaubt eine eindeutige Identifizierung von MNPs und verhindert somit ein falsch-positives Signal ausgehend von CD133 MicroBeads (A₅/A₃: 27 - 30 %).
Intrazelluläre Visualisierung von Transfektionskomplexen
Zur intrazellulären Bestimmung optimierter Transfektionskomplexe wurden CD133⁺-Stammzellen mit markierten miR/PEI- und miR/PEI/MNP-Komplexen transfiziert. Um eine genaue Verteilung der Komplexbestandteile zu untersuchen wurde SIM-Aufnahmen erstellt (laterale Auflösung 100 nm) ( ). Diese zeigen, dass 18 h nach der Transfektion alle Bestandteile des Transfektionssystems im Zytoplasma zu finden sind, wobei sie in der perinukleären Region, ohne erkennbaren Unterschied, lokalisiert sind. Das Signal von PEI wurde jeweils in Kolokalisation mit MNPs und miR vorgefunden. Die Transfektionskomplexe weisen eine Größe von etwa 100 - 400 nm auf und befinden sich in einer anderen Bildebene als der Nukleus (Daten ersichtlich aus z-stacks)
miR/PEI/MNP Komplexe haben keinen negativen Einfluss auf die Viabilität und die Expression von Stammzelloberflächenmarkern
Zur Untersuchung des Einflusses von 18 Stunden Kultivierungszeit und Transfektion auf die Viabilität und Oberflächenmarkerintegrität von transfizierten CD133⁺-Zellen wurden durchflusszytometrische Messungen vorgenommen. Wie eingangs beschrieben wurden Parameter angewandt, die als optimal für den Zielführungsansatz ermittelt worden waren; als interne Kontrolle wurden nicht-transfizierte Zellen eingesetzt. Ein signifikanter Abfall in der Viabilität von nicht-transfizierten CD133⁺-Zellen von ca. 95 % ± 1 (0 h Kontrolle) auf ca. 77 % ± 3 (18 h Kontrolle) wurde beobachtet (siehe ), was einen Zelltod, verursacht durch die 18 h Kultivierung, bedeutet. Jedoch wurde kein signifikanter Unterschied in der Viabilität nach 18 h zwischen Kontrolle und Zellen, die mit 20 pmol miR, einem N/P-Verhältnis von 7,5 und 0, 3 oder 5 µg/ml MNPs transfiziert waren (ca. 70 % lebende Zellen), festgestellt, was illustriert, dass die Transfektionsbedingungen einen milden Charakter aufwiesen. Im Gegensatz dazu wurden keine signifikanten Veränderungen in der Oberflächenmarkerintegrität nach 18 h Kultivierungszeit beobachtet (93 % ± 2 bei der 0 h Kontrolle; 87 % ± 2 bei der 18 h Kontrolle). Darüber hinaus zeigte die Analyse der Zellen, die mit 20 pmol miR, N/P-Verhältnis von 7,5 und 0, 3 oder 5 µg/ml MNPs transfiziert worden waren (92 % ± 2; 90 % ± 4; 89 % ± 4), keinen signifikanten Unterschied bei beiden Kontrollen, was den Erhalt von hamatopoetischen Stammzellmarkern anzeigt.
Multipotentes Differenzierungspotenzial von transfizierten CD133⁺-Zellen
Dem Knochenmark entstammende CD133⁺-Zellen sind bekannt für ihr multipotentes Differenzierungspotenzial. Zur Bestimmung der Auswirkung der Transfektion auf ihre Fähigkeit zur hämatopoetischen Differenzierung wurden CFU-Assays verwendet. Der Vergleich von nicht-transfizierten Zellen (Kontrolle) und Zellen, die mit optimierten miR/PEI- bzw. miR/PEI/MNPs-Komplexen (20 pmol miR; N/P-Verhältnis 7,5; 0, 3 oder 5 µl/ml MNPs) transfiziert worden waren, zeigte keinen signifikanten Unterschied in der Menge der gebildeten CFU-Granulozyten, Erythroid, Makrophagen, Megakaryocyten (CFU-GEMM), CFU-Granulozyten, Makrophagen (CFU-GM), Burst-bildender Unit-Erythroid (BFU-E) und CFU-Erythroid (CFU-E), siehe . Vielmehr wiesen die transfizierten Zellen keine morphologischen Abnormitäten auf (siehe ). Diese Ergebnisse zeigen klar, dass eine Transfektion unter optimierten Bedingungen keinen Einfluss auf das multipotente Differenzierungspotenzial von CD133⁺-Zellen hat.

Claims

Eukaryotische adulte Zelle umfassend ein Transfektionssystem, wobei das Transfektionssystem (i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest teilweise biotinyliert sind, (ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen, (iii) mindestens eine Nukleinsäure, umfasst, wobei die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten CD133⁺-Blutstammzelle erhalten oder erhältlich ist.
Eukaryotische adulte Zelle gemäß Anspruch 1, wobei die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten CD133⁺-Blutstammzelle erhalten oder erhältlich ist durch in-Kontakt-bringen der adulten, multipotenten CD133⁺-Blutstammzelle mit dem Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii).
Eukaryotische adulte Zelle gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, modifizierter mRNA, IncRNA, microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, und bevorzugt eine microRNA ist.
Eukaryotische adulte Zelle gemäß Anspruch 3, wobei die microRNA 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide umfasst und weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-210, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21, miR-130a, miR-16, 424, miR-503, miR-1, miR-133, miR-208, miR-499, miR-150, miR-494-3p und miR-23a.
Eukaryotische adulte Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen gemäß (i) ein Polymer ist, welches zur Einbringung der mindestens einen Nukleinsäure, bevorzugt von microRNA in adulte multipotente CD133⁺-Blutstammzellen geeignet ist, welches bevorzugt Polyethylenimin, weiter bevorzugt verzweigtes oder unverzweigtes, bevorzugt verzweigtes Polyethylenimin, bevorzugt mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 100.000 Dalton, bevorzugt im Bereich von 100 bis 50.000 Dalton, weiter bevorzugt im Bereich von 10.000 bis 30.000 Dalton, umfasst.
Eukaryotische adulte Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die magnetischen Nanopartikel gemäß (ii) magnetische Eisenoxidpartikel, bevorzugt Fe₃O₄-Partikel umfassen, welche bevorzugt eine sphärische Gestalt mit einem bevorzugten Durchmesser im Bereich von 1 bis 20 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 2 bis 8 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 4 bis 5 nm, aufweisen.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eukaryotische adulte Zellen, welche ein Transfektionssystem umfassen, wobei das Transfektionssystem (i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest teilweise biotinyliert sind, (ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen, (iii) mindestens eine Nukleinsäure, umfasst, wobei die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten CD133⁺-Blutstammzelle erhalten oder erhältlich ist
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, wobei die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten CD133⁺-Blutstammzelle erhalten oder erhältlich ist durch in-Kontakt-bringen der adulten, multipotenten CD133⁺ Blutstammzelle mit dem Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii).
Verfahren zur Herstellung von eukaryotischen adulten Zellen, welche ein Transfektionssystem umfassen, umfassend (a) Bereitstellen von adulten multipotenten CD133⁺-Blutstammzellen, (b) Zugabe eines Transfektionssystems, welches (i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest teilweise biotinyliert sind, (ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen, (iii) mindestens eine Nukleinsäure, umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 9 zur Herstellung einer eukaryotischen adulten Zelle umfassend ein Transfektionssystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6.
Verwendung einer eukaryotischen adulten Zelle umfassend ein Transfektionssystem, welches i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest teilweise biotinyliert sind, (ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen, (iii) mindestens eine Nukleinsäure, umfasst, bei der in vitro Herstellung von Gewebe, wobei die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten CD133⁺-Blutstammzelle erhalten oder erhältlich ist.
Verwendung einer eukaryotischen adulten Zelle umfassend ein Transfektionssystem gemäß Anspruch 11 bei der in vitro Herstellung von Herzmuskelgewebe oder Skelettmuskelgewebe.
Verwendung einer eukaryotischen adulten Zelle umfassend ein Transfektionssystem, welches i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest teilweise biotinyliert sind, (ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen, (iii) mindestens eine Nukleinsäure, umfasst, bei der Behandlung von Erkrankungen, welche mit Gewebeschäden einhergehen, wobei die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten CD133⁺-Blutstammzelle erhalten oder erhältlich ist.
Verwendung einer eukaryotischen adulten Zelle umfassend ein Transfektionssystem gemäß Anspruch 13 bei der Behandlung von Erkrankungen, welche mit Gewebeschaden an Organen einhergehen.
Verwendung einer eukaryotischen adulten Zelle umfassend ein Transfektionssystem gemäß Anspruch 13 oder 14 bei der Behandlung von Erkrankungen, welche mit Gewebeschäden am Herzmuskel oder Skelettmuskel einhergehen.
Verfahren zur in vitro Herstellung von Gewebe umfassend (A) Bereitstellen von Gewebe, (B) Zugabe von eukaryotischen adulten Zellen umfassend ein Transfektionssystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder erhalten oder erhältlich durch ein Verfahren gemäß Anspruch 9, unter Erhalt einer Mischung aus Gewebe und eukaryotischen adulten Zellen.
Verfahren zur in vitro Herstellung von Gewebe gemäß Anspruch 16, wobei das gemäß (A) bereitgestellte Gewebe Herzmuskelgewebe oder Skelettmuskelgewebe ist.
Verfahren zur Herstellung von Gewebe gemäß Anspruch 16 oder 17, umfassend (C) Kultivieren der in (B) erhaltenen Mischung aus Gewebe und eukaryotischen adulten Zellen.