WO2018042019A1 - Eukaryotische adulte zellen umfassend ein transfektionssystem und deren herstellung und verwendung - Google Patents

Eukaryotische adulte zellen umfassend ein transfektionssystem und deren herstellung und verwendung Download PDF

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WO2018042019A1
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mir
adult
eukaryotic
multipotent
cells
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Gustav Steinhoff
Robert David
Paula MÜLLER
Natalia VORONINA
Frauke HAUSBURG
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Universität Rostock
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    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
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Definitions

  • Eukaryotic adult cells comprising a transfection system and its preparation and use
  • the present invention relates to a eukaryotic adult cell comprising
  • transfection system wherein the transfection system comprises a cationic polymer having amino groups which are at least partially biotinylated, magnetic nanoparticles with streptavidin molecules bound thereto and at least one nucleic acid.
  • stem cells carry a great potential in that they are readily accessible by a subject or a healthy donor without causing ethical conflicts.
  • stem cells having the highly conserved transmembrane CD133 antigen (prominin-1) prove to be capable of differentiating into hematopoietic, endothelial, myogenic, and neurogenic cell lines, and to release various accessory paracrine factors.
  • prominin-1 the highly conserved transmembrane CD133 antigen
  • the clinical use of stem cells proves to be problematic due to various factors: Firstly, when introduced into the organ to be treated, there is a strong exodus, i. the retention of stem cells in the organ to be treated is very low. For example, highly perfused organs such as the liver or heart indicate a loss
  • transplanted cells from 90 to 99% during the first 1 to 2 hours after introduction, completely independent of the type of cells and the mode of introduction.
  • the retention in the organ to be treated is a fundamental criterion for effective therapy.
  • a massive cell death of the stem cells occurs upon introduction into the organ to be treated, which is due to the hostile environment in the organ to be treated.
  • Eukaryotic adult cells comprising a transfection system
  • the present invention therefore relates to eukaryotic adult cells comprising
  • the transfection system is shown schematically in Fig. 1.
  • the eukaryotic adult cells are obtained from adult, multipotent stem cells, preferably from adult, multipotent CD133 + stem cells, preferably by contacting adult, multipotent stem cells, more preferably by contacting adult, CD133 + multipotent stem cells, comprising the transfection system comprising (i), (ii) and (iii).
  • the "eukaryotic adult cell” may also be synonymously referred to as the "derivative of an adult, multipotent stem cell” by bringing into contact adult, multipotent
  • Stem cells more preferably by contacting adult CD133 + multipotential stem cells, with the transfection system comprising (i), (ii) and (iii).
  • the "contacting" can be synonymously also referred to as application of the transfection system to the adult, multipotent stem cell due to the changes that may occur due to the introduction of the transfection system, in particular by the at least one nucleic acid according to (iii) in the adult , multipotent stem cell, or in the adult, multipotential CD133 + stem cell, the "eukaryotic adult cell” in the context of the present invention even an adult, multipotent However, it can also be a differentiated or differentiated cell.
  • the adult multipotent stem cell which serves as a starting point for the eukaryotic adult cell, there are basically no restrictions.
  • the adult multipotent stem cell is an adult multipotential bone marrow stem cell or an adult multipotent blood stem cell, preferably an adult multipotent
  • Bone marrow stem cell more preferably an adult multipotent CD133 + - bone marrow stem cell or an adult multipotent CD133 + -Blutstammzelle, more preferably an adult multipotent CD133 + -Knochenmarksstammzelle. More preferably, the adult multipotent stem cell is a human adult multipotent stem cell, more preferably a human adult multipotential bone marrow stem cell or a human adult multipotent blood stem cell, preferably a human adult multipotent
  • Bone marrow stem cell more preferably a human adult multipotent CD133 + - bone marrow stem cell or a human adult multipotent CD133 + -Blutstammzelle, more preferably a human adult multipotent CD133 + -Knochenmarksstammzelle.
  • the adult multipotent stem cells are derived from subjects whose written
  • Consent to the removal was present. They are assigned to the respective source, i. the
  • Bone marrow or blood preferably the bone marrow, and isolated from the sampled sample using the existing CD133 + surface marker.
  • the at least one nucleic acid according to (iii) is preferably selected from the group consisting of plasmid DNA, modified mRNA (messenger RNA), IncRNA (long, non-coding RNA), microRNA and anti-microRNA, preferably from the group of microRNA and anti-microRNA, more preferably a microRNA.
  • the at least one nucleic acid, preferably the microRNA or anti-microRNA counteracts the death of the stem cells after introduction into the organ to be treated, i. she is anti-apoptotic.
  • the cells can be modified by anti-inflammatory or pro-angiogenic microRNAs.
  • the microRNA serves as a regulator in stem cell differentiation, for example in hematopoiesis, cardiogenesis, neurogenesis or endothelial development, which makes preprogramming into specific cell types possible before transplantation.
  • the microRNA (miR) comprises 15 to 25, preferably 20 to 24, more preferably 21 to 23
  • the microRNA is preferably selected from the group consisting of miR-146a, miR-125b and let-7c (anti-inflammatory microRNAs).
  • the microRNA is preferably selected from the group consisting of let-7f, miR-27b, miR-126 miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA -126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21, miR-21, miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR -503 and miR-210 (pro-angiogenic microRNAs).
  • the microRA is preferably selected from the group consisting of miR-1, miR-133, miR-208 and miR-499 (cardiac programming microRNAs).
  • the microRNA is preferably selected from the group consisting of miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a, miR-23a ( homing microRNAs).
  • homing microRNAs are human microRNAs.
  • the anti-microRNA which comprises 15 to 25, preferably 20 to 24, more preferably 21 to 23 nucleotides, is complementary to one
  • microRNA existing, microRNA and serves to neutralize the microRNA function.
  • the cationic polymer having amino groups according to (i) is a polymer which is suitable for introducing at least one nucleic acid, preferably microRNA or anti-microRNA, more preferably microRNA, into eukaryotic adult cells, preferably adult multipotent stem cells, more preferably adult multipotent CD133 + Stem cells, which is preferably polyethyleneimine, more preferably branched or unbranched, preferably branched polyethyleneimine, preferably with a number average Molecular weight in the range of 500 to 100,000 daltons, preferably in the range of 100 to 50,000 daltons, more preferably in the range of 10,000 to 30,000 daltons.
  • the cationic polymer comprising amino groups according to (i) and the at least one nucleic acid according to (iii), preferably the microRNA form a complex, a so-called polyplex, ie the at least one nucleic acid, preferably the microRNA is inserted into the cationic polymer having incorporated amino groups.
  • the amino groups of the cationic polymer having amino groups according to (i) are at least partially biotinylated, the degree of biotinylation in the range from 0.1 to 10 mmol biotin / mmol PEI, preferably in the range from 0.5 to 5 mmol biotin / mmol PEI preferably in the range of 1.0 to 2.0 mmol of biotin / mmol of PEI (determined by means of HABA assay).
  • the magnetic nanoparticles according to (ii) preferably comprise magnetic
  • Iron oxide particles more preferably FesC particles, which preferably have a spherical shape with a preferred diameter in the range of 1 to 20 nm, more preferably in the range of 1 to 10 nm, more preferably in the range of 2 to 8 nm, further preferably in the range of 4 to 5 nm.
  • two or more of the magnetic nanoparticles together form so-called particle complexes, which in turn have an approximately spherical shape and a diameter in the range from 10 to 1000 nm, more preferably in the range from 20 to 800 nm, more preferably in the range from 50 to 500 nm, more preferably in the range of 100 to 200 nm.
  • the magnetic nanoparticles have at least partially attached streptavidin molecules, at least partially meaning that at least 20%, more preferably at least 30%, more preferably at least 50%, further preferably at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90 % of the magnetic nanoparticles have streptavidin molecules bound thereto. Due to the streptavidin / biotin interaction, streptavidin molecules serve to bind cationically
  • compositions comprising eukaryotic adult cells comprising a transfection system, wherein the transfection system
  • the eukaryotic adult cell is obtained from an adult, multipotent stem cell, preferably from an adult, multipotent CD133 + parent cell, obtainable or obtainable and preferably obtained or obtainable by contacting the adult, multipotent, preferably CD133 + , Stem cell with the
  • the adult multipotent stem cell is preferably an adult multipotent bone marrow stem cell or an adult multipotent hematopoietic stem cell, more preferably an adult multipotent bone marrow stem cell, more preferably an adult multipotent CD133 + -Knochenmarksstammzelle or an adult multipotent CD133 + -Blutstammzelle, more preferably an adult multipotent CD133 + - bone marrow stem cell , More preferably, the adult multipotent stem cell is a human adult multipotent stem cell, more preferably a human adult multipotential bone marrow stem cell or a human adult multipotent blood stem cell, preferably a human adult multipotential bone marrow stem cell, more preferably a human adult CD133 + multiparous bone marrow stem cell or a human adult adult
  • the at least one nucleic acid according to (iii) is preferably selected from the group consisting of plasmid DNA, modified mRNA (messenger RNA), IncRNA (long, non-coding RNA), microRNA and anti-microRNA, preferably from the group of microRNA and anti-microRNA, more preferably a microRNA.
  • the at least one nucleic acid, preferably the microRNA counteracts the death of the stem cells after introduction into the organ to be treated, ie it has an anti-apoptotic effect.
  • the stem cell into which it is introduced may positively affect even before transplantation, for example, the cells may be modified by anti-inflammatory or pro-angiogenic microRNAs.
  • the microRNA serves as a regulator in stem cell differentiation, for example in haematopoiesis, cardiogenesis, neurogenesis or the
  • the microRNA comprises 15 to 25, preferably 20 to 24, more preferably 21 to 23 nucleotides and is more preferably selected from the group consisting of miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR 27b, miR-126, miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21, miR-21, miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 miR-210, miR-1, miR-133, miR-208, miR -499, miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-
  • the microRNA is preferably selected from the group consisting of miR-146a, miR-125b and let-7c (anti-inflammatory microRNAs).
  • the microRNA is preferably selected from the group consisting of let-7f, miR-27b, miR-126 miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA -126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21, miR-21, miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR -503 and miR-210 (pro-angiogenic microRNAs).
  • the microRA is preferably selected from the group consisting of miR-1, miR-133, miR-208 and miR-499 (cardiac programming microRNAs).
  • the microRNA is preferably selected from the group consisting of miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a, miR-23a ( homing microRNAs).
  • homing microRNAs are human microRNAs.
  • the anti-microRNA which comprises 15 to 25, preferably 20 to 24, more preferably 21 to 23 nucleotides, is complementary to a corresponding, preferably already present in the adult multipontent stem cell, microRNA and serves to neutralize the microRNA function.
  • the cationic polymer having amino groups according to (i) is preferably a polymer which is suitable for introducing at least one nucleic acid, preferably microRNA or anti-microRNA, more preferably microRNA, into eukaryotic adult cells, preferably adult multipotent stem cells, more preferably adult multipotics CD133 + - Stem cells, suitable, which preferably polyethyleneimine, more preferably branched or unbranched, preferably branched polyethyleneimine, preferably with a
  • number average molecular weight in the range of 500 to 100,000 daltons, preferably in the range of 100 to 50,000 daltons, more preferably in the range of 10,000 to 30,000 daltons.
  • the magnetic nanoparticles according to (ii) preferably comprise magnetic
  • Iron oxide particles more preferably FesC particles, which preferably have a spherical shape with a preferred diameter in the range of 1 to 20 nm, more preferably in the range of 1 to 10 nm, more preferably in the range of 2 to 8 nm, further preferably in the range of 4 to 5 nm.
  • the invention further relates to a method for producing eukaryotic adult cells comprising a transfection system comprising
  • the adult multipotent stem cell is an adult multipotential bone marrow stem cell or an adult multipotent blood stem cell, preferably an adult multipotent Bone marrow stem cell, more preferably an adult multipotent CD133 + - bone marrow stem cell or an adult multipotent CD133 + -Blutstammzelle, more preferably an adult multipotent CD133 + -Knochenmarksstammzelle. More preferably, the adult multipotent stem cell is a human adult multipotent stem cell, more preferably a human adult multipotential bone marrow stem cell or a human adult multipotent blood stem cell, preferably a human adult multipotent
  • Bone marrow stem cell more preferably a human adult multipotent CD133 + - bone marrow stem cell or a human adult multipotent CD133 + -Blutstammzelle, more preferably a human adult multipotent CD133 + -Knochenmarksstammzelle.
  • the at least one nucleic acid according to (iii) is preferably selected from the group consisting of plasmid DNA, modified mRNA (messenger RNA), IncRNA (long, non-coding RNA), microRNA and anti-microRNA, preferably from the group of microRNA and anti-microRNA, more preferably a microRNA.
  • the at least one nucleic acid preferably the microRNA, counteracts the death of the stem cells after introduction into the organ to be treated, ie it has an anti-apoptotic effect. Furthermore, it may have the therapeutic potential of the adult multipotent stem cell into which it is introduced, and thus of the resulting eukaryotic adult cells, even before
  • the cells can be modified by antiinflammatory or pro-angiogenic microRNAs.
  • the microRNA serves as a regulator in stem cell differentiation, for example in the
  • microRNA comprises 15 to 25, preferably 20 to 24, more preferably 21 to 23
  • the microRNA is preferably selected from the group consisting of miR-146a, miR-125b and let-7c (anti-inflammatory microRNAs).
  • the microRNA is preferably selected from the group consisting of let-7f, miR-27b, miR-126 miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126 , miRNA-126 , miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21, miR-21, miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 and miR-210 (pro-angiogenic microRNAs).
  • the microRA is preferably selected from the group consisting of miR-1, miR-133, miR-208 and miR-499 (cardiac programming microRNAs).
  • the microRNA is preferably selected from the group consisting of miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a, miR-23a ( homing microRNAs).
  • homing microRNAs are human microRNAs.
  • the anti-microRNA which comprises 15 to 25, preferably 20 to 24, more preferably 21 to 23 nucleotides, is complementary to one
  • the cationic polymer having amino groups according to (i) is preferably a polymer which is suitable for introducing at least one nucleic acid, preferably microRNA or anti-microRNA, more preferably microRNA, into eukaryotic adult cells, preferably adult multipotent stem cells, more preferably adult multipotics CD133 + - stem cells, which is preferably polyethyleneimine, more preferably branched or unbranched, preferably branched polyethyleneimine, preferably with a
  • the magnetic nanoparticles according to (ii) preferably comprise
  • magnetic iron oxide particles more preferably FesC particles, which preferably have a spherical shape with a preferred diameter in the range of 1 to 20 nm, more preferably in the range of 1 to 10 nm, more preferably in the range of 2 to 8 nm, more preferably in the range from 4 to 5 nm.
  • the described method is used to produce a eukaryotic adult cell comprising a transfection system as described at the beginning under "eukaryotic adult cells comprising a transfection system".
  • branched polyethylenimine (PEI) having a number-average molecular weight of 25 kDa is biotinylated and chromatographed
  • the degree of biotinylation is in the range of 1 to 10, preferably in the range of 1 to 2 mmol biotin / mml PEI.
  • nucleic acid in particular microRNA and biotinylated PEI, are dissolved in an aqueous solution which preferably contains glucose, more preferably 0.1 to 50% by weight of glucose, more preferably 1 to 10% by weight of glucose, and for a sufficiently long period, preferably at least 10 minutes at a temperature in the range of 1 to 40 ° C, more preferably in the range of 10 to 30 ° C, more preferably in the range of 15 to 25 ° C, incubated.
  • Magnetic nanoparticles preferably FesC particles, which are bound
  • Streptavidin are combined with the polypiexes of microRNA and biotinylated PEI.
  • the magnetic nanoparticles are previously treated with ultrasound, more preferably incubated in an ultrasonic bath to dissolve any clusters formed.
  • the mixture of magnetic nanoparticles, preferably FesC particles, which have bound streptavidin and the polypiexes of microRNA and biotinylated PEI is for a sufficiently long period of time, preferably at least 10 minutes, more preferably 15 minutes to 24 hours, further preferably 20 to 120 minutes, at a temperature in the range of 1 to 40 ° C, more preferably in the range of 10 to 30 ° C, more preferably in the range of 15 to 25 ° C, incubated.
  • Stem cells preferably adult CD133 + multipotent stem cells, are combined in a suitable vessel, for example a cell culture plate with the mixture of magnetic nanoparticles, preferably FesC particles, which have bound streptavidin and the polypiexes of microRNA and biotinylated PEI.
  • a suitable vessel for example a cell culture plate with the mixture of magnetic nanoparticles, preferably FesC particles, which have bound streptavidin and the polypiexes of microRNA and biotinylated PEI.
  • incubation is carried out at a temperature in the range of 1 to 50 ° C, more preferably in the range of 10 to 45 ° C, further preferably in the range of 30 to 40 ° C for a sufficiently long period, preferably at least 10 minutes, more preferably from 1 hour to 48 hours, more preferably from 10 to 24 hours, in the presence of a nutrient medium (eg DMEM, Dulbecco's Modified Eagle Medium) which preferably contains antibiotics (e.g.
  • a nutrient medium eg DMEM, Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • antibiotics e.g.
  • the invention also relates to eukaryotic adult cells comprising
  • the invention further relates to eukaryotic adult cells comprising
  • the eukaryotic adult cell is from an adult, multipotent stem cell, preferably from an adult, multipotent CD133 + stem cell, obtained or obtainable and preferably obtained or obtainable by contacting the adult, multipotent, preferably CD133 + , stem cell with the Transfection system comprising (i), (ii) and (iii).
  • the adult multipotent stem cell is preferably an adult multipotent bone marrow stem cell or an adult multipotent hematopoietic stem cell, preferably an adult multipotent bone marrow stem cell, more preferably an adult multipotent CD133 + -Knochenmarksstammzelle or an adult multipotent CD133 + - blood stem cell, more preferably an adult multipotent CD133 + - bone marrow stem cell.
  • the adult multipotent stem cell is a human adult multipotent stem cell, more preferably a human adult multipotential bone marrow stem cell or a human adult multipotent blood stem cell, preferably a human adult multipotential bone marrow stem cell, more preferably a human adult CD133 + multiparous bone marrow stem cell or a human adult
  • the at least one nucleic acid according to (iii) is preferably selected from the group consisting of plasmid DNA, modified mRNA (Messenger RNA), IncRNA (long, non-coding RNA), microRNA and anti-microRNA, preferably from the group of microRNA and anti-microRNA, more preferably a microRNA.
  • the at least one nucleic acid, preferably the microRNA counteracts the death of the stem cells after introduction into the organ to be treated, ie it has an anti-apoptotic effect.
  • the cells can be modified by anti-inflammatory or pro-angiogenic microRNAs.
  • the microRNA serves as a regulator in stem cell differentiation, for example in haematopoiesis, cardiogenesis, neurogenesis or the
  • the microRNA comprises 15 to 25, preferably 20 to 24, more preferably 21 to 23 nucleotides and is more preferably selected from the group consisting of miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR 27b, miR-126, miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21, miR-21, miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 miR-210, miR-1, miR-133, miR-208, miR -499, miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-
  • the microRNA is preferably selected from the group consisting of miR-146a, miR-125b and let-7c (anti-inflammatory microRNAs).
  • the microRNA is preferably selected from the group consisting of let-7f, miR-27b, miR-126 miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA -126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21, miR-21, miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR -503 and miR-210 (pro-angiogenic microRNAs).
  • the microRA is preferably selected from the group consisting of miR-1, miR-133, miR-208 and miR-499 (cardiac programming microRNAs).
  • the microRNA is preferably selected from the group consisting of miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a, miR-23a ( homing microRNAs).
  • homing microRNAs are human microRNAs.
  • the anti-microRNA which comprises 15 to 25, preferably 20 to 24, more preferably 21 to 23 nucleotides, is complementary to a corresponding, preferably present in the adult multipontent stem cell microRNA and serves to neutralize the microRNA function.
  • the invention further relates to eukaryotic adult cells comprising
  • Tissue damage preferably tissue damage to organs, more preferably tissue damage to the heart muscle or skeletal muscle.
  • the eukaryotic adult cell is obtained or obtainable from an adult, multipotent stem cell, preferably from an adult, multipotent CD133 + parent cell, and preferably obtained or obtainable by contacting the adult, multipotent, preferably CD133 + , stem cell with the transfection system comprising (i), (ii) and (iii).
  • the adult multipotent stem cell is preferably an adult multipotent bone marrow stem cell or an adult multipotent blood stem cell, more preferably an adult multipotent
  • Bone marrow stem cell more preferably an adult multipotent CD133 + - bone marrow stem cell or an adult multipotent CD133 + -Blutstammzelle, more preferably an adult multipotent CD133 + -Knochenmarksstammzelle. More preferably, the adult multipotent stem cell is a human adult multipotent stem cell, more preferably a human adult multipotential bone marrow stem cell or a human adult multipotent blood stem cell, preferably a human adult multipotent
  • Bone marrow stem cell more preferably a human adult multipotent CD133 + - bone marrow stem cell or a human adult multipotent CD133 + -Blutstammzelle, more preferably a human adult multipotent CD133 + -Knochenmarksstammzelle.
  • the at least one nucleic acid according to (iii) is preferably selected from the group consisting of plasmid DNA, modified mRNA (messenger RNA), IncRNA (long, non- coding RNA), microRNA and anti-microRNA, preferably from the group of microRNA and anti-microRNA, more preferably a microRNA.
  • the at least one nucleic acid preferably the microRNA, counteracts the death of the stem cells after introduction into the organ to be treated, ie it has an anti-apoptotic effect. Furthermore, it may have the therapeutic potential of the adult multipotent stem cell into which it is introduced, and thus of the resulting eukaryotic adult cells, even before
  • the cells can be modified by antiinflammatory or pro-angiogenic microRNAs.
  • the microRNA serves as a regulator in stem cell differentiation, for example in the
  • microRNA comprises 15 to 25, preferably 20 to 24, more preferably 21 to 23
  • the microRNA is preferably selected from the group consisting of miR-146a, miR-125b and let-7c (anti-inflammatory microRNAs).
  • the microRNA is preferably selected from the group consisting of let-7f, miR-27b, miR-126 miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA -126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21, miR-21, miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR -503 and miR-210 (pro-angiogenic microRNAs).
  • the microRA is preferably selected from the group consisting of miR-1, miR-133, miR-208 and miR-499 (cardiac programming microRNAs).
  • the microRNA is preferably selected from the group consisting of miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a, miR-23a ( homing microRNAs).
  • homing microRNAs are human microRNAs.
  • the anti-microRNA which comprises 15 to 25, preferably 20 to 24, more preferably 21 to 23 nucleotides, is complementary to one
  • the cationic polymer having amino groups according to (i) is preferably a polymer which is suitable for introducing the at least one nucleic acid, preferably microRNA, into eukaryotic adult cells, preferably adult multipotent stem cells, more preferably adult multipotent CD133 + stem cells prefers
  • Polyethyleneimine more preferably branched or unbranched, preferably branched polyethyleneimine, preferably having a number average molecular weight in the range of 500 to 100,000 daltons, preferably in the range of 100 to 50,000 daltons, more preferably in the range of 10,000 to 30,000 daltons.
  • the magnetic nanoparticles according to (ii) preferably comprise magnetic
  • Iron oxide particles more preferably FesC particles, which preferably have a spherical shape with a preferred diameter in the range of 1 to 20 nm, more preferably in the range of 1 to 10 nm, more preferably in the range of 2 to 8 nm, further preferably in the range of 4 to 5 nm.
  • the invention further relates to a method for the production of tissue, preferably for the in vitro production of tissue, comprising
  • a transfection system preferably of eukaryotic adult cells, comprising a transfection system as described above or obtained or obtainable by a method as described above to obtain a mixture of tissue and eukaryotic adult cells.
  • the method of producing tissue further comprises (C) culturing the mixture of tissue and eukaryotic adult cells obtained in (B).
  • a eukaryotic adult cell comprising a transfection system, wherein the
  • adult cell from an adult, multipotent stem cell preferably from an adult, multipotent CD133 + stem cell, obtained or obtainable, and preferably by contacting the adult, multipotent, preferably CD133 +, stem cell with the transfection system comprising (i), ( ii) and (iii), obtained or obtainable.
  • Bone marrow stem cell more preferably an adult multipotent CD133 + - bone marrow stem cell or an adult multipotent CD133 + -Blutstammzelle, more preferably an adult multipotent CD133 + -Knochenmarksstammzelle is.
  • nucleic acid according to (iii) is selected from the group consisting of plasmid DNA, modified mRNA, IncRNA, microRNA and anti-microRNA, preferably from the group of microRNA and anti-microRNA, more preferably microRNA.
  • microRNA comprises 15 to 25, preferably 20 to 24, more preferably 21 to 23 nucleotides and more preferably is selected from the group consisting of miR-146a, miR-125b, let-7c, lethal 7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21, miR-21, miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 miR-210, miR-1, miR-133, miR -208, miR-499, miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a and miR-23a.
  • the cationic polymer having amino groups according to (i) is a polymer which is capable of introducing the at least one nucleic acid, preferably microRNA or anti-microRNA, more preferably microRNA, into eukaryotic adult cells , preferably in adult multipotent stem
  • a pharmaceutical composition comprising eukaryotic adult cells comprising a transfection system, wherein the transfection system
  • composition according to embodiment 8 wherein the eukaryotic adult cell is obtained or obtainable from an adult, multipotent stem cell, preferably from an adult, multipotent CD133 + parent cell, and preferably by contacting the adult, multipotent, preferably CD133 + , Stem cell with the transfection system comprising (i), (ii) and (iii), obtained or obtainable.
  • Bone marrow stem cell more preferably an adult multipotent CD133 + - bone marrow stem cell or an adult multipotent CD133 + -Blutstammzelle, more preferably an adult multipotent CD133 + -Knochenmarksstammzelle is.
  • Polyethyleneimine more preferably branched or unbranched, preferably branched polyethyleneimine, preferably having a number average molecular weight in the range of 500 to 100,000 daltons, preferably in the range of 100 to 50,000 daltons, more preferably in the range of 10,000 to 30,000 daltons.
  • a process for producing eukaryotic adult cells which comprises
  • the adult multipotent stem cell is an adult multipotent bone marrow stem cell or an adult multipotent hematopoietic stem cell, preferably an adult multipotent bone marrow stem cell, more preferably an adult multipotent CD133 + -Knochenmarksstammzelle or an adult multipotent CD133 + -Blutstammzelle, more preferably an adult
  • Nucleic acid according to (iii) is selected from the group consisting of plasmid DNA, modified mRNA, IncRNA, microRNA and anti-microRNA, preferably from the group of microRNA and anti-microRNA, more preferably microRNA.
  • microRNA comprises 15 to 25, preferably 20 to 24, more preferably 21 to 23 nucleotides and more preferably is selected from the group consisting of miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR- 24, miRNA-23, miR-27, miR-21, miR-21, miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 miR-210, miR-1, miR-133, miR-208 , miR-499, miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a and miR-23a.
  • a process according to any one of embodiments 15 is selected from the group consisting of miR-146a, mi
  • the at least one nucleic acid preferably of microRNA or ant microRNA, more preferably of microRNA, into eukaryotic adult cells, preferably into adult multipotent stem cells, more preferably into adult multipotent CD133 + stem cells, which is preferably polyethyleneimine preferably branched or unbranched, preferably branched polyethyleneimine, preferably having a number average molecular weight in the range from 500 to 100,000 daltons, preferably in the range from 100 to 50,000 daltons, more preferably in the range from 10,000 to 30,000 daltons.
  • a method according to any one of embodiments 15 to 20 for producing a eukaryotic adult cell comprising a transfection system according to any one of embodiments 1 to 7.
  • a eukaryotic adult cell comprising a transfection system obtained or obtainable by a method according to any one of embodiments 15 to 20.
  • Eukaryotic adult cell comprising a transfection system which
  • tissue for use in the production of tissue, preferably in the in vitro production of tissue, more preferably in the production of myocardial tissue or skeletal muscle tissue, more preferably in the in vitro production of
  • a eukaryotic adult cell comprising a transfection system which
  • Tissue damage preferably tissue damage to organs, more preferably tissue damage to the heart muscle or skeletal muscle.
  • Iron oxide particles preferably FesC particles, which preferably have a spherical shape with a preferred diameter in the range of 1 to 20 nm, more preferably in the range of 1 to 10 nm, more preferably in the range of 2 to 8 nm, further preferably in the range of 4 to 5 nm.
  • a process for the production of tissue preferably for the in vitro production of tissue, comprising
  • a transfection system preferably of eukaryotic adult cells, comprising a transfection system according to any one of embodiments 1 to 7 or obtained or obtainable by a method according to any one of
  • Embodiments 15 to 20 to obtain a mixture of tissue and eukaryotic adult cells.
  • Fig. 1 shows schematically the structure of a transfection system (PEI:
  • Figure 2 shows the Boolean gating strategy for flow cytometric measurements of cell viability and surface marker integrity (SSC:
  • Fig. 3 shows the gating strategy for flow cytometric measurements
  • Figure 4 shows the transfection optimization of CD133 + cells when used
  • Fig. 5 shows the transfection optimization of CD133 + cells
  • Fig. 6 shows the magnetic targeting of transfected CD133 + cells
  • Fig. 7 shows the intracellular visualization of transfection complexes
  • Fig. 8 shows the viability and surface marker integrity after transfection
  • Fig. 9 shows the hematopoietic differentiation ability of cells after
  • Bone marrow was used by enlightened patients who gave their written consent to use their samples for research purposes under the Helsinki Declaration. The study was renewed by the Ethics Committee of the University of Rostock approved in 20102015 (registration number A 2010 23). Sternal bone marrow was taken from patients while undergoing coronary artery bypass grafting at the Institute of Cardiac Surgery (University Hospital Rostock, Germany). To the coagulation of the bone marrow too a heparin-sodium solution (250 IU / ml bone marrow) (Rathiopharm GmbH, Germany) was used.
  • CD133 + cells were isolated by magnetic-based cell sorting (MACS ®) using the CD133 MICROBEAD kit (Miltenyi Biotec GmbH, Germany) enriched according to the manufacturer's instructions. For subsequent experiments, only CD133 + cell fractions having a viability and a purity of> 80% were used.
  • Step 5 Selection of viable CD45VCD34VCD133 + cells (Fig. 2E)
  • Viability [%] " nir . ⁇ ⁇ ,, x 100
  • Cy3 TM dye-labeled Pre-miR Negative Control # 1 (Ambion, USA) was used to determine uptake efficiency, cytotoxicity, and magnetic targeting.
  • Pre-miR TM miRNA Precursor Molecules - Negative Control # 1 (Ambion, USA) was used for flow cytometric controls, analysis of surface marker expression, intracellular visualization of the complexes, and hematopoietic differentiation potential (CFU) assay.
  • PEI polyethyleneimine
  • EZ-Link sulfo-NHS-LC biotin Thermo Fisher Scientific GmbH, Germany
  • the final concentration of the amino groups was measured using the ninhydrin method (2% ninhydrin reagent, Sigma-Aldrich) and a Biotinyltechniksgrad of 1, 585 ⁇ 0.018 mmol biotin / mmol PEI using the HABA assay under
  • MagneSphere ® Paramagnetic Particles (Promega Corporation, USA) 0.45 ⁇ Millex-HV PVDF Syringe Filter Units (EMD Millipore Corporation, USA) filtered.
  • the biotinylated PEI and the filtered magnetic particles (MNPs) were stored at 4 ° C until use.
  • the corresponding amounts of microRNA Pre-miR Negative Control # 1, labeled with Cy3 according to the experimental setup (Ambion, USA)
  • PEI phosphate
  • N / P ratio Various ratios of nitrogen (PEI) to phosphate (miR)
  • the MNPs were incubated for 20 minutes in an ultrasonic bath before each application to remove shaped aggregates.
  • the MNPs were mixed with the previously prepared microRNA / PEI complexes in various concentrations and incubated for 30 min at RT.
  • CD133 + cells were seeded in a well of a 24 well plate and immediately added the previously prepared miR / PEI or miR / PEI / MNP complexes. After an incubation period of 18 h at 37 ° C. and 5% CO 2 in Dulbecco 's Modified Eagle Medium (DMEM, Pan Biotech GmbH, Germany), 1% penicillin / streptomycin (PAA Laboratories GmbH, Germany) and 2% fetal bovine serum ( Pan Biotech GmbH) was added, the cells were used directly for the measurement or it was a medium change.
  • DMEM Dulbecco 's Modified Eagle Medium
  • PAA Laboratories GmbH Pan Biotech GmbH
  • Pan Biotech GmbH fetal bovine serum
  • the CD133 + cells were stained 18 h after transfection for 10 min at 4 ° C with LIVE / DEAD® Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit (Molecular Probes, USA) and then with a 4% formaldehyde solution (FA ) (Merck Schuchardt OHG, Germany).
  • the samples were measured with the LSR-II flow cytometer and the data were analyzed using the FACSDiva software (BD Bioscience).
  • Fig. 3 shows the
  • the detection of the magnetic cell targeting of the CD133 + cells was carried out with the optimized transfection complexes (20 pmol miR, N / P ratio: 7.5, 3 and 5 ⁇ g / ml MNP). Eighteen hours after transfection, cells were transferred to a new well of a 12 well plate. A magnetic field was generated locally by a magnetic plate below the cell culture dish (OZ Biosciences, France, field strength 70-250 mT). After an incubation period of 24 h at 37 ° C.
  • the iron quantification of the samples was performed by determining the third harmonic frequency of the MPS spectrum (A3).
  • the MPS spectrum was normalized against a reference spectrum of the MN Ps and CD133 MircoBeads employed (known iron content, MNPs: 3.2 ⁇ g, CD133 MircoBeads: 2.5 ⁇ g).
  • the ratio of A5 / A3 is used as a characteristic fingerprint to identify the various magnetic nanoparticles.
  • Negative Control # 1 (Ambion) using the Label IT ® miRNA Labeling Kit (Mirus Bio LLC, USA) labeled with Cy5 TM dye according to the manufacturer - for visualization of the transfection was pre-miR TM miRNA precursor molecule. Excess dye was supplied by the
  • the concentration of Cy5-labeled miR was determined spectrophotometrically using ND-1000 NanoDrop (Thermo Scientific, Waltham, MA) and subsequently stored at -20 ° C protected from light.
  • PEI Green ® 488 Protein Labeling Kit (Molecular Probes), colored by the FluoReporter ® Oregon accordance with the specifications of the manufacturer.
  • PEI was mixed with 1 M sodium bicarbonate solution and incubated for 1 h with the Oregon Green® stock solution (10 mg / ml in DMSO). Unbound dye was removed by size exclusion chromatography using PD-10 desalting columns (GE Healthcare, Little Chalfont, UK).
  • the concentration of 488-labeled PEI was determined by ninhydrin analysis and subsequently stored protected from light at 4 ° C.
  • the MNPs were stained with the dye Atto 565-conjugated to biotin (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany). For this purpose, the MNPs were mixed with Atto 565 dye (ratio 1: 1000 w / w), parallel to the generation of miR / PEI complexes, and incubated for 30 min in the dark.
  • Atto 565 dye ratio 1: 1000 w / w
  • Fluorophores were made with a 100x alpha Plan-Apochromat objective
  • Excitation wavelengths were: 23 ⁇ for 405 nm, 34 ⁇ for 488 nm, 42 ⁇ for 561 nm and 51 ⁇ for 633nm.
  • the determined SI raw data were reconstructed by the ZEN software.
  • a 2D maximum projection was generated from the recorded z-stack and then the individual color channels were overlaid to form a single image.
  • the preselected polyplexes (20 pmol miR, N / P ratio 2.5, 5.0, and 7.5) were mixed with magnan nanoparticles (MNP) at five different concentrations (1, 2, 3 , 4 and 5 ⁇ g per ml of ready miR / PEI mixture).
  • MNP magnan nanoparticles
  • CD133 + stem cells were transfected with labeled miR / PEI and miR / PEI / MNP complexes.
  • SIM images were taken (lateral resolution 100 nm) ( Figure 7). These show that, 18 hours after transfection, all components of the transfection system are found in the cytoplasm, being localized in the perinuclear region with no apparent difference. The signal from PEI was found in each case in colocalization with MNPs and miR.
  • the transfection complexes have a size of about 100-400 nm and are located in a different image plane than the nucleus (data can be seen from z-stacks) miR / PEI / MNP complexes have no negative influence on the viability and expression of stem cell surface markers
  • Bone marrow-derived CD133 + cells are known for their multipotent potential for differentiation. CFU assays were used to determine the effect of transfection on their ability to hematopoietic differentiation. Comparison of non-transfected cells (control) and cells treated with optimized miR / PEI or miR / PEI / MNPs complexes (20 pmol miR; N / P ratio 7.5; 0, 3 or 5 ⁇ / ml MNPs), showed no significant difference in the amount of CFU granulocytes formed, erythroid, macrophages,
  • CFU-GEMM Megakaryocytes
  • CFU-GM CFU granulocytes
  • macrophages CFU-GM
  • BFU-E bursting unit erythroid
  • CFU-E CFU-erythroid

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine eukaryotische adulte Zelle umfassend ein Transfektionssystem, wobei das Transfektionssystem (i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest teilweise biotinyliert sind, (ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen, (ii) mindestens eine Nukleinsäure, umfasst.

Description

Eukaryotische adulte Zellen umfassend ein Transfektionssystem und deren Herstellung und Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine eukaryotische adulte Zelle, umfassend ein
Transfektionssystem, wobei das Transfektionssystem ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest teilweise biotinyliert sind, magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen und mindestens eine Nukleinsäure, umfasst.
Die Transplantation von Stammzellen für die Wiederherstellung von beschädigtem Gewebe stellt einen vielversprechenden Ansatz in der regenerativen Medizin dar. Adulte Stammzellen tragen hierfür ein großes Potential in sich, da sie leicht von einem Probanden oder einem gesunden Spender zugänglich sind, ohne dass sich ethische Konflikte ergäben. Unter den adulten Stammzellen erweisen sich insbesondere Stammzellen, welche das hoch konservierte Transmembran-CD133-Antigen aufweisen (Prominin-1 ), als geeignet, in hämatopoietische, endotheliale, myogene und neurogene Zelllinien auszudifferenzieren, und diverse unterstützende parakrine Faktoren freizusetzen. Allerdings erweist sich die klinische Anwendung von Stammzellen aufgrund verschiedener Faktoren als problematisch: Zum einen erfolgt bei Einbringung in das zu behandelnde Organ eine starke Abwanderung, d.h. die Retention der Stammzellen im zu behandelnden Organ ist sehr gering. Beispielsweise weisen stark perfundierte Organe wie die Leber oder das Herz einen Verlust an
transplantierten Zellen von 90 bis 99 % bereits während der ersten 1 bis 2 Stunden nach Einbringung auf, völlig unabhängig von der Art der Zellen und der Art der Einbringung.
Insbesondere die Retention im zu behandelnden Organ ist ein fundamentales Kriterium für eine effektive Therapie. Des Weiteren tritt ein massiver Zelltod der Stammzellen bei Einbringung in das zu behandelnde Organ auf, der durch die feindliche Umgebung im zu behandelnden Organ bedingt ist.
Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand daher in der
Bereitstellung von Zellen, welche bei Einbringung in ein zu behandelndes Organ eine höhere Überlebensrate und eine höhere Retention aufweisen. Überraschend wurde nun gefunden, dass solche Zellen bereitgestellt werden können, in dem in adulte multipotente Stammzellen mittels eines Transfektionssystems Nukelinsäuren, insbesondere microRNA, eingebracht wird.
Eukaryotische adulte Zellen, umfassend ein Transfektionssystem
Die vorliegende Erfindung betrifft daher eukaryotische adulte Zellen, umfassend ein
Transfektionssystem, wobei das Transfektionssystem
(i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest
teilweise biotinyliert sind,
(ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen, (ii) mindestens eine Nukleinsäure,
umfasst.
Das Transfektionssystem ist schematisch in Abb. 1 dargestellt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die eukaryotischen adulten Zellen aus adulten, multipotenten Stammzellen, bevorzugt aus adulten, multipotenten CD133+- Stammzellen, erhalten, bevorzugt durch in-Kontakt-bringen von adulten, multipotenten Stammzellen, weiter bevorzugt durch in-Kontakt-bringen von adulten, multipotenten CD133+- Stammzellen, mit dem Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii). Die„eukaryotische adulte Zelle" kann synonym auch als„Derivat einer adulten, multipotenten Stammzelle" bezeichnet werden, welches durch in-Kontakt-bringen von adulten, multipotenten
Stammzellen, weiter bevorzugt durch in-Kontakt-bringen von adulten, multipotenten CD133+- Stammzellen, mit dem Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii) erhalten ist. Das„in- Kontakt-bringen" kann synonym auch als Anwendung des Transfektionssystems auf die adulte, multipotente Stammzelle bezeichnet werden. Aufgrund der Veränderungen, die gegebenenfalls durch das Einbringen des Transfektionssystems, insbesondere durch die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii), in der adulten, multipotenten Stammzelle, bzw. in der adulten, multipotenten CD133+-Stammzelle, verursacht werden, kann die„eukaryotische adulte Zelle" im Rahmen der vorliegenden Erfindung selbst noch eine adulte, multipotente Stammzelle sein, kann aber auch eine ausdifferenzierte oder in Ausdifferenzierung befindliche Zelle sein.
Bezüglich der adulten multipotenten Stammzelle, welche als Ausgangspunkt für die eukaryotische adulte Zelle dient, existieren grundsätzlich keine Beschränkungen. Bevorzugt ist die adulte multipotente Stammzelle eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente Blutstammzelle, bevorzugt eine adulte multipotente
Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+- Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle. Weiter bevorzugt ist die adulte multipotente Stammzelle eine humane adulte multipotente Stammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine humane adulte multipotente Blutstammzelle, bevorzugt eine humane adulte multipotente
Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente CD133+- Knochenmarksstammzelle oder eine humane adulte multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle. Die adulten multipotenten Stammzellen stammen von Probanden, deren schriftliches
Einverständnis zur Entnahme vorlag. Sie werden der jeweiligen Quelle, d.h. dem
Knochenmark oder dem Blut, bevorzugt dem Knochenmark, entnommen und aus der entnommenen Probe anhand des vorhandenen CD133+-Oberflächenmarkers isoliert.
Die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii) ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, modifizierter mRNA (Boten-RNA), IncRNA (lange, nicht- codierende RNA), microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, weiter bevorzugt eine microRNA. Die mindestens eine Nukleinsäure, bevorzugt die microRNA oder anti-microRNA, wirkt dem Absterben der Stammzellen nach Einbringung in das zu behandelnde Organ entgegen, d.h. sie wirkt anti-apoptotisch.
Weiterhin kann sie das therapeutische Potential der adulten multipotenten Stammzelle, in welche sie eingebracht wird, und somit der resultierenden eukaryotischen adulten Zellen, bereits vor der Transplantation positiv beeinflussen, beispielsweise können die Zellen durch anti-entzündliche oder pro-angiogenische microRNAs modifiziert werden. Darüber hinaus dient die microRNA als Regulator in der Stammzelldifferenzierung, beispielsweise bei der Hämatopoese, Kardiogenese, Neurogenese oder der Endothelentwicklung, womit die Vorprogrammierung zu spezifischen Zelltypen vor der Transplantation möglich ist. Die microRNA (miR) umfasst 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23
Nukleotide und ist weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 miR-210, miR-1 , miR-133, miR-208, miR-499, miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494- 3p, miR-146a, miR-23a und miR-23a. In einer Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b und let-7c (antientzündliche microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus let-7f, miR-27b, miR-126 miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 und miR-210 (pro-angiogene microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-1 , miR-133, miR-208 und miR-499 (kardial prgrammierende microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a, miR-23a (homing microRNAs). Bevorzugt sind humane microRNAs. Die anti-microRNA, welche 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide umfasst, ist komplementär zu einer
entsprechenden, vorzugsweise in der adulten multipontenten Stammzelle bereits
vorhandenen, microRNA und dient der Neutralisation der microRNA-Funktion.
Das kationische Polymer aufweisend Aminogruppen gemäß (i) ist ein Polymer, welches zur Einbringung der mindestens einen Nukleinsäure, bevorzugt von microRNA oder anti- microRNA, weiter bevorzugt microRNA, in eukaryotische adulte Zellen, bevorzugt in adulte multipotente Stammzellen, weiter bevorzugt in adulte multipotente CD133+-Stammzellen, geeignet ist, welches bevorzugt Polyethylenimin, weiter bevorzugt verzweigtes oder unverzweigtes, bevorzugt verzweigtes Polyethylenimin, bevorzugt mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 100.000 Dalton, bevorzugt im Bereich von 100 bis 50.000 Dalton, weiter bevorzugt im Bereich von 10.000 bis 30.000 Dalton, umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform bilden das kationische Polymer aufweisend Aminogruppen gemäß (i) und die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii), bevorzugt die microRNA, einen Komplex, einen so genannten Polyplex, miteinander, d.h. die mindestens eine Nukleinsäure, bevorzugt die microRNA wird in das kationische Polymer aufweisend Aminogruppen eingelagert. Die Aminogruppen des kationischen Polymers aufweisend Aminogruppen gemäß (i) sind zumindest teilweise biotinyliert, wobei Der Biotinylierungsgrad im .Bereich von 0,1 bis 10 mmol Biotin/mmol PEI, bevorzugt im Bereich von 0,5 bis 5 mmol Biotin/mmol PEI, weiter bevorzugt im Bereich von 1 ,0 bis 2,0 mmol Biotin/mmol PEI liegt (bestimmt mittels HABA-Assay).
Die magnetischen Nanopartikel gemäß (ii) umfassen bevorzugt magnetische
Eisenoxidpartikel, weiter bevorzugt FesC -Partikel, welche bevorzugt eine sphärische Gestalt mit einem bevorzugten Durchmesser im Bereich von 1 bis 20 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 2 bis 8 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 4 bis 5 nm, aufweisen. In einer Ausgestaltung bilden jeweils zwei oder mehr der magnetischen Nanopartikel miteinander sogenannte Partikelkomplexe, welche wiederum eine annähernd sphärische Gestalt und einen Durchmesser im Bereich von 10 bis 1000 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 20 bis 800 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 50 bis 500 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 100 bis 200 nm aufweisen. Die magnetischen Nanopartikel weisen zumindest teilweise daran gebundene Streptavidin-Moleküle auf, wobei zumindest teilweise bedeutet, dass mindestens 20%, weiter bevorzugt mindestens 30%, weiter bevorzugt mindestens 50 %, weiter bevorzugt mindestens 70 %, bevorzugt mindestens 80 %, weiter bevorzugt mindestens 90 % der magnetische Nanopartikel daran gebundene Streptavidin-Moleküle aufweisen. Die Streptavidin-Molekühle dienen aufgrund der Streptavidin/Biotin-Wechselwirkung der Bindungsbildung zwischen kationischem
Polymer und magnetischen Nanopartikeln.
Pharmazeutische Zusammensetzung Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eukaryotische adulte Zellen, welche ein Transfektionssystem umfassen, wobei das Transfektionssystem
(i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest
teilweise biotinyliert sind,
(ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen, (ii) mindestens eine Nukleinsäure,
umfasst.
Hinsichtlich der pharmazeutischen Zusammensetzung ist die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten Stammzelle, bevorzugt aus einer adulten, multipotenten CD133+-Stammzelle, erhalten oder erhältlich und bevorzugt erhalten oder erhältlich durch in- Kontakt-bringen der adulten, multipotenten, bevorzugt CD133+, Stammzelle mit dem
Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii). Die adulte multipotente Stammzelle ist bevorzugt eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+- Knochenmarksstammzelle. Weiter bevorzugt ist die adulte multipotente Stammzelle eine humane adulte multipotente Stammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine humane adulte multipotente Blutstammzelle, bevorzugt eine humane adulte multipotente Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle oder eine humane adulte
multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle. Die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii) ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, modifizierter mRNA (Boten-RNA), IncRNA (lange, nicht-codierende RNA), microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, weiter bevorzugt eine microRNA. Die mindestens eine Nukleinsäure, bevorzugt die microRNA wirkt dem Absterben der Stammzellen nach Einbringung in das zu behandelnde Organ entgegen, d.h. sie wirkt anti-apoptotisch. Weiterhin kann sie das therapeutische Potential der adulten multipotenten Stammzelle, in welche sie eingebracht wird, und somit der resultierenden eukaryotischen adulten Zellen, bereits vor der Transplantation positiv beeinflussen, beispielsweise können die Zellen durch anti-entzündliche oder pro-angiogenische microRNAs modifiziert werden. Darüber hinaus dient die microRNA als Regulator in der Stammzelldifferenzierung, beispielsweise bei der Haematopoese, Kardiogenese, Neurogenese oder der
Endothelentwicklung, womit die Vorprogrammierung zu spezifischen Zelltypen vor der Transplantation möglich ist. Die microRNA (miR) umfasst 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide und ist weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA- 126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR-130a, miR- 16, 424, miR-503 miR-210, miR-1 , miR-133, miR-208, miR-499, miR-146a, miR-146a, miR- 150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a und miR-23a. In einer Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b und let-7c (antientzündliche microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus let-7f, miR-27b, miR-126 miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA- 126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR- 130a, miR-16, 424, miR-503 und miR-210 (pro-angiogene microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR- 1 , miR-133, miR-208 und miR-499 (kardial prgrammierende microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a, miR-23a (homing microRNAs). Bevorzugt sind humane microRNAs. Die anti-microRNA, welche 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide umfasst, ist komplementär zu einer entsprechenden, vorzugsweise in der adulten multipontenten Stammzelle bereits vorhandenen, microRNA und dient der Neutralisation der microRNA-Funktion. Das kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen gemäß (i) ist bevorzugt ein Polymer, welches zur Einbringung der mindestens einen Nukleinsäure, bevorzugt von microRNA oder anti-microRNA, weiter bevorzugt microRNA, in eukaryotische adulte Zellen, bevorzugt in adulte multipotente Stammzellen, weiter bevorzugt in adulte multipotente CD133+- Stammzellen, geeignet, welches bevorzugt Polyethylenimin, weiter bevorzugt verzweigtes oder unverzweigtes, bevorzugt verzweigtes Polyethylenimin, bevorzugt mit einem
zahlenmittleren Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 100.000 Dalton, bevorzugt im Bereich von 100 bis 50.000 Dalton, weiter bevorzugt im Bereich von 10.000 bis 30.000 Dalton, umfasst.
Die magnetische Nanopartikel gemäß (ii) umfassen bevorzugt magnetische
Eisenoxidpartikel, weiter bevorzugt FesC -Partikel, welche bevorzugt eine sphärische Gestalt mit einem bevorzugten Durchmesser im Bereich von 1 bis 20 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 2 bis 8 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 4 bis 5 nm, aufweisen.
Verfahren zur Herstellung von eukaryotischen adulten Zellen
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von eukaryotischen adulten Zellen, welche ein Transfektionssystem umfassen, umfassend
(a) Bereitstellen von adulten multipotenten Stammzellen, bevorzugt von adulten
multipotenten CD133+-Stammzellen,
(b) Zugabe eines Transfektionssystems, welches
(i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche
zumindest teilweise biotinyliert sind,
(ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin- Molekülen,
(ii) mindestens eine Nukleinsäure,
umfasst.
Das„Verfahren zur Herstellung von eukaryotischen adulten Zellen" kann auch aus „Verfahren zur Nukleinsäure-basierten Manipulation von adulten multipotenten Stammzellen" bezeichnet werden. Die„Zugabe eines Transfektionssystems" gemäß (b) kann auch als „Anwendung eines Transfektionssystems" bezeichnet werden. Bevorzugt ist die adulte multipotente Stammzelle eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente Blutstammzelle, bevorzugt eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+- Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle. Weiter bevorzugt ist die adulte multipotente Stammzelle eine humane adulte multipotente Stammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine humane adulte multipotente Blutstammzelle, bevorzugt eine humane adulte multipotente
Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente CD133+- Knochenmarksstammzelle oder eine humane adulte multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle. Die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii) ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, modifizierter mRNA (Boten-RNA), IncRNA (lange, nicht- codierende RNA), microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, weiter bevorzugt eine microRNA. Die mindestens eine Nukleinsäure, bevorzugt die microRNA wirkt dem Absterben der Stammzellen nach Einbringung in das zu behandelnde Organ entgegen, d.h. sie wirkt anti-apoptotisch. Weiterhin kann sie das therapeutische Potential der adulten multipotenten Stammzelle, in welche sie eingebracht wird, und somit der resultierenden eukaryotischen adulten Zellen, bereits vor der
Transplantation positiv beeinflussen, beispielsweise können die Zellen durch antientzündliche oder pro-angiogenische microRNAs modifiziert werden. Darüber hinaus dient die microRNA als Regulator in der Stammzelldifferenzierung, beispielsweise bei der
Haematopoese, Kardiogenese, Neurogenese oder der Endothelentwicklung, womit die Vorprogrammierung zu spezifischen Zelltypen vor der Transplantation möglich ist. Die microRNA (miR) umfasst 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23
Nukleotide und ist weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 miR-210, miR-1 , miR-133, miR-208, miR-499, miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494- 3p, miR-146a, miR-23a und miR-23a. In einer Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b und let-7c (antientzündliche microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus let-7f, miR-27b, miR-126 miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 und miR-210 (pro-angiogene microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-1 , miR-133, miR-208 und miR-499 (kardial prgrammierende microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a, miR-23a (homing microRNAs). Bevorzugt sind humane microRNAs. Die anti-microRNA, welche 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide umfasst, ist komplementär zu einer
entsprechenden, vorzugsweise in der adulten multipontenten Stammzelle bereits
vorhandenen, microRNA und dient der Neutralisation der microRNA-Funktion. Das kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen gemäß (i) ist bevorzugt ein Polymer, welches zur Einbringung der mindestens einen Nukleinsäure, bevorzugt von microRNA oder anti-microRNA, weiter bevorzugt microRNA, in eukaryotische adulte Zellen, bevorzugt in adulte multipotente Stammzellen, weiter bevorzugt in adulte multipotente CD133+- Stammzellen, geeignet ist, welches bevorzugt Polyethylenimin, weiter bevorzugt verzweigtes oder unverzweigtes, bevorzugt verzweigtes Polyethylenimin, bevorzugt mit einem
zahlenmittleren Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 100.000 Dalton, bevorzugt im Bereich von 100 bis 50.000 Dalton, weiter bevorzugt im Bereich von 10.000 bis 30.000 Dalton, umfasst. Die magnetischen Nanopartikel gemäß (ii) umfassen bevorzugt
magnetische Eisenoxidpartikel, weiter bevorzugt FesC -Partikel, welche bevorzugt eine sphärische Gestalt mit einem bevorzugten Durchmesser im Bereich von 1 bis 20 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 2 bis 8 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 4 bis 5 nm, aufweisen.
In einer bevorzugten Ausgestaltung dient das beschriebene Verfahren der Herstellung einer eukaryotischen adulten Zelle umfassend ein Transfektionssystem wie eingangs unter „eukaryotische adulte Zellen, umfassend ein Transfektionssystem" beschrieben. In einer beispielhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von eukaryotischen adulten Zellen wird verzweigtes Polyethylenimin (PEI) mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht von 25 kDA biotinyliert und chromatographisch
aufgereinigt. Der Grad der Biotinylierung beträgt im Bereich von 1 bis 10, bevorzugt im Bereich von 1 bis 2 mmol Biotin/mml PEI. Für die Ausbildung von Polypiexen werden Nukleinsäure, insbesondere microRNA und biotinyliertes PEI in einer wässrigen Lösung, die bevorzugt Glukose, weiter bevorzugt 0,1 bis 50 Gewichts-% Glukose, weiter bevorzugt 1 bis 10 Gewichts-% Glukose, enthält, gelöst und für einen ausreichend langen Zeitraum, bevorzugt mindestens 10 Minuten bei einer Temperatur im Bereich von 1 bis 40 °C, weiter bevorzugt im Bereich von 10 bis 30 °C, weiter bevorzugt im Bereich von 15 bis 25 °C, inkubiert. Magnetische Nanopartikel, bevorzugt FesC -Partikel, welche gebundenes
Streptavidin aufweisen, werden mit den Polypiexen aus microRNA und biotinyliertem PEI zusammengegeben. Bevorzugt werden die magnetischen Nanopartikel zuvor mit Ultraschall behandelt, weiter bevorzugt in einem Ultraschallbad inkubiert, um gegebenenfalls gebildete Cluster aufzulösen. Die Mischung aus magnetischen Nanopartikel, bevorzugt FesC -Partikel, welche gebundenes Streptavidin aufweisen und den Polypiexen aus microRNA und biotinyliertem PEI wird für einen ausreichend langen Zeitraum, bevorzugt mindestens 10 Minuten, weiter bevorzugt 15 min bis 24 Stunden, weiter bevorzugt 20 bis 120 Minuten, bei einer Temperatur im Bereich von 1 bis 40 °C, weiter bevorzugt im Bereich von 10 bis 30 °C, weiter bevorzugt im Bereich von 15 bis 25 °C, inkubiert. Adulte multipotente
Stammzellen, bevorzugt adulte multipotente CD133+-Stammzellen werden in einem geeigneten Gefäß, beispielsweise einer Zellkulturplatte mit der Mischung aus magnetischen Nanopartikel, bevorzugt FesC -Partikel, welche gebundenes Streptavidin aufweisen und den Polypiexen aus microRNA und biotinyliertem PEI zusammengegeben. Bevorzugt erfolgt eine Inkubation bei einer Temperatur im Bereich von 1 bis 50 °C, weiter bevorzugt im Bereich von 10 bis 45 °C, weiter bevorzugt im Bereich von 30 bis 40 °C für einen ausreichend lange Zeitraum, bevorzugt mindestens 10 Minuten, weiter bevorzugt von 1 Stunde bis 48 Stunden, weiter bevorzugt von 10 bis 24 Stunden, in Gegenwart eines Nährmediums (z.B. DMEM, Dulbecco's Modified Eagle Medium), welches bevorzugt Antibiotika (beispielsweise
Penicilin/Streptomycon) oder fetales Kälberserum, weiter bevorzugt Antibiotika und fetales Kälberserum, enthält. Die Erfindung betrifft ebenso eukaryotische adulte Zellen, umfassend ein
Transfektionssystem, erhalten oder erhältlich durch das beschriebene Verfahren.
Herstellung von Gewebe
Die Erfindung betrifft weiterhin eukaryotische adulte Zellen, umfassend ein
Transfektionssystem, welches
i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest
teilweise biotinyliert sind,
(ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen,
(ii) mindestens eine Nukleinsäure,
umfasst, zur Verwendung bei der Herstellung von Gewebe, bevorzugt bei der in vitro Herstellung von Gewebe, weiter bevorzugt bei der Herstellung von Herzmuskelgewebe oder Skelettmuskelgewebe, weiter bevorzugt bei der in vitro Herstellung von Herzmuskelgewebe oder Skelettmuskelgewebe. Bevorzugt ist die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten Stammzelle, bevorzugt aus einer adulten, multipotenten CD133+-Stammzelle, erhalten oder erhältlich und bevorzugt erhalten oder erhältlich durch in-Kontakt-bringen der adulten, multipotenten, bevorzugt CD133+, Stammzelle mit dem Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii). Bevorzugt ist die adulte multipotente Stammzelle eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente Blutstammzelle, bevorzugt eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente CD133+- Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+- Knochenmarksstammzelle. Weiter bevorzugt ist die adulte multipotente Stammzelle eine humane adulte multipotente Stammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine humane adulte multipotente Blutstammzelle, bevorzugt eine humane adulte multipotente Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle oder eine humane adulte
multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle. Die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii) ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, modifizierter mRNA (Boten-RNA), IncRNA (lange, nicht-codierende RNA), microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, weiter bevorzugt eine microRNA. Die mindestens eine Nukleinsäure, bevorzugt die microRNA wirkt dem Absterben der Stammzellen nach Einbringung in das zu behandelnde Organ entgegen, d.h. sie wirkt anti-apoptotisch. Weiterhin kann sie das therapeutische Potential der adulten multipotenten Stammzelle, in welche sie eingebracht wird, und somit der resultierenden eukaryotischen adulten Zellen, bereits vor der Transplantation positiv beeinflussen, beispielsweise können die Zellen durch anti-entzündliche oder pro-angiogenische microRNAs modifiziert werden. Darüber hinaus dient die microRNA als Regulator in der Stammzelldifferenzierung, beispielsweise bei der Haematopoese, Kardiogenese, Neurogenese oder der
Endothelentwicklung, womit die Vorprogrammierung zu spezifischen Zelltypen vor der Transplantation möglich ist. Die microRNA (miR) umfasst 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide und ist weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA- 126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR-130a, miR- 16, 424, miR-503 miR-210, miR-1 , miR-133, miR-208, miR-499, miR-146a, miR-146a, miR- 150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a und miR-23a. In einer Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b und let-7c (antientzündliche microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus let-7f, miR-27b, miR-126 miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA- 126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR- 130a, miR-16, 424, miR-503 und miR-210 (pro-angiogene microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR- 1 , miR-133, miR-208 und miR-499 (kardial prgrammierende microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a, miR-23a (homing microRNAs). Bevorzugt sind humane microRNAs. Die anti-microRNA, welche 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide umfasst, ist komplementär zu einer entsprechenden, vorzugsweise in der adulten multipontenten Stammzelle bereits vorhandenen, microRNA und dient der Neutralisation der microRNA-Funktion.
Behandlung von Erkrankungen, welche mit Gewebeschäden einhergehen
Die Erfindung betrifft weiterhin eukaryotische adulte Zellen, umfassend ein
Transfektionssystem, welches
i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest teilweise biotinyliert sind,
(ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen,
(ii) mindestens eine Nukleinsäure,
umfasst, zur Verwendung bei der Behandlung von Erkrankungen, welche mit
Gewebeschäden einhergehen, bevorzugt von Gewebeschäden an Organen, weiter bevorzugt von Gewebeschäden am Herzmuskel oder Skelettmuskel. Die eukaryotische adulte Zelle ist erhalten oder erhältlich aus einer adulten, multipotenten Stammzelle, bevorzugt aus einer adulten, multipotenten CD133+-Stammzelle, und bevorzugt erhalten oder erhältlich durch in-Kontakt-bringen der adulten, multipotenten, bevorzugt CD133+, Stammzelle mit dem Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii). Die adulte multipotente Stammzelle ist bevorzugt eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente
Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+- Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle. Weiter bevorzugt ist die adulte multipotente Stammzelle eine humane adulte multipotente Stammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine humane adulte multipotente Blutstammzelle, bevorzugt eine humane adulte multipotente
Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente CD133+- Knochenmarksstammzelle oder eine humane adulte multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine humane adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle. Die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii) ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, modifizierter mRNA (Boten-RNA), IncRNA (lange, nicht- codierende RNA), microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, weiter bevorzugt eine microRNA. Die mindestens eine Nukleinsäure, bevorzugt die microRNA wirkt dem Absterben der Stammzellen nach Einbringung in das zu behandelnde Organ entgegen, d.h. sie wirkt anti-apoptotisch. Weiterhin kann sie das therapeutische Potential der adulten multipotenten Stammzelle, in welche sie eingebracht wird, und somit der resultierenden eukaryotischen adulten Zellen, bereits vor der
Transplantation positiv beeinflussen, beispielsweise können die Zellen durch antientzündliche oder pro-angiogenische microRNAs modifiziert werden. Darüber hinaus dient die microRNA als Regulator in der Stammzelldifferenzierung, beispielsweise bei der
Haematopoese, Kardiogenese, Neurogenese oder der Endothelentwicklung, womit die Vorprogrammierung zu spezifischen Zelltypen vor der Transplantation möglich ist. Die microRNA (miR) umfasst 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23
Nukleotide und ist weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 miR-210, miR-1 , miR-133, miR-208, miR-499, miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494- 3p, miR-146a, miR-23a und miR-23a. In einer Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b und let-7c (antientzündliche microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus let-7f, miR-27b, miR-126 miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 und miR-210 (pro-angiogene microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-1 , miR-133, miR-208 und miR-499 (kardial prgrammierende microRNAs). In einer weiteren Ausführungsform ist die microRNA bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a, miR-23a (homing microRNAs). Bevorzugt sind humane microRNAs. Die anti-microRNA, welche 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide umfasst, ist komplementär zu einer
entsprechenden, vorzugsweise in der adulten multipontenten Stammzelle bereits vorhandenen, microRNA und dient der Neutralisation der microRNA-Funktion. Das kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen gemäß (i) ist bevorzugt ein Polymer, welches zur Einbringung der mindestens einen Nukleinsäure, bevorzug von microRNA in eukaryotische adulte Zellen, bevorzugt in adulte multipotente Stammzellen, weiter bevorzugt in adulte multipotente CD133+-Stammzellen, geeignet ist, welches bevorzugt
Polyethylenimin, weiter bevorzugt verzweigtes oder unverzweigtes, bevorzugt verzweigtes Polyethylenimin, bevorzugt mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 100.000 Dalton, bevorzugt im Bereich von 100 bis 50.000 Dalton, weiter bevorzugt im Bereich von 10.000 bis 30.000 Dalton, umfasst.
Die magnetischen Nanopartikel gemäß (ii) umfassen bevorzugt magnetische
Eisenoxidpartikel, weiter bevorzugt FesC -Partikel, welche bevorzugt eine sphärische Gestalt mit einem bevorzugten Durchmesser im Bereich von 1 bis 20 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 2 bis 8 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 4 bis 5 nm, aufweisen.
Herstellung von Gewebe
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Gewebe, bevorzugt zur in vitro Herstellung von Gewebe, umfassend
(A) Bereitstellen von Gewebe, bevorzugt Herzmuskelgewebe oder
Skelettmuskelgewebe,
(B) Zugabe von eukaryotischen adulten Zellen umfassend ein
Transfektionssystem, bevorzugt von eukaryotischen adulten Zellen umfassend ein Transfektionssystem wie oben beschrieben oder erhalten oder erhältlich durch ein Verfahren wie oben beschrieben, unter Erhalt einer Mischung aus Gewebe und eukaryotischen adulten Zellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Herstellung von Gewebe weiterhin (C) Kultivieren der in (B) erhaltenen Mischung aus Gewebe und eukaryotischen adulten Zellen.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Ausführungsformen und Kombinationen von Ausführungsformen, die sich aus den entsprechenden Rückbezügen und Verweisen ergeben, näher illustriert:
1 . Eukaryotische adulte Zelle, umfassend ein Transfektionssystem, wobei das
Transfektionssystem
(i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest
teilweise biotinyliert sind,
(ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen, (ii) mindestens eine Nukleinsäure,
umfasst.
2. Eukaryotische adulte Zelle gemäß Ausführungsform 1 , wobei die eukaryotische
adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten Stammzelle, bevorzugt aus einer adulten, multipotenten CD133+-Stammzelle, erhalten oder erhältlich ist und bevorzugt durch in-Kontakt-bringen der adulten, multipotenten, bevorzugt CD133+, Stammzelle mit dem Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii), erhalten oder erhältlich ist.
3. Eukaryotische adulte Zelle gemäß Ausführungsform 2, wobei die adulte multipotente Stammzelle eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente Blutstammzelle, bevorzugt eine adulte multipotente
Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+- Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle, ist.
4. Eukaryotische adulte Zelle gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 3, wobei die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, modifizierter mRNA, IncRNA, microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, weiter bevorzugt microRNA.
Eukaryotische adulte Zelle gemäß Ausführungsform 4, wobei die microRNA 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide umfasst und weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 miR-210, miR- 1 , miR-133, miR-208, miR-499, miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR- 494-3p, miR-146a, miR-23a und miR-23a.
Eukaryotische adulte Zelle gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 5, wobei das kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen gemäß (i) ein Polymer ist, welches zur Einbringung der mindestens einen Nukleinsäure, bevorzugt von microRNA oder anti-microRNA, weiter bevorzugt von microRNA, in eukaryotische adulte Zellen, bevorzugt in adulte multipotente Stammzellen, weiter bevorzugt in adulte multipotente CD133+-Stammzellen, geeignet ist, welches bevorzugt Polyethylenimin, weiter bevorzugt verzweigtes oder unverzweigtes, bevorzugt verzweigtes Polyethylenimin, bevorzugt mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 100.000 Dalton, bevorzugt im Bereich von 100 bis 50.000 Dalton, weiter bevorzugt im Bereich von 10.000 bis 30.000 Dalton, umfasst.
Eukaryotische adulte Zelle gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 6, wobei die magnetischen Nanopartikel gemäß (ii) magnetische Eisenoxidpartikel, bevorzugt Fe304-Partikel umfassen, welche bevorzugt eine sphärische Gestalt mit einem bevorzugten Durchmesser im Bereich von 1 bis 20 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 2 bis 8 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 4 bis 5 nm, aufweisen. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eukaryotische adulte Zellen, welche ein Transfektionssystem umfassen, wobei das Transfektionssystem
(i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest
teilweise biotinyliert sind,
(ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen, (ii) mindestens eine Nukleinsäure,
umfasst. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Ausführungsform 8, wobei die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten Stammzelle, bevorzugt aus einer adulten, multipotenten CD133+-Stammzelle, erhalten oder erhältlich ist und bevorzugt durch in-Kontakt-bringen der adulten, multipotenten, bevorzugt CD133+, Stammzelle mit dem Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii), erhalten oder erhältlich ist. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Ausführungsform 9, wobei die adulte multipotente Stammzelle eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente Blutstammzelle, bevorzugt eine adulte multipotente
Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+- Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle, ist. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Ausführungsform 9 oder 10, wobei die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, modifizierter mRNA, IncRNA, microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, weiter bevorzugt microRNA, ist. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Ausführungsform 1 1 , wobei die microRNA 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide umfasst und weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA- 210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR- 503 miR-210, miR-1 , miR-133, miR-208, miR-499, miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a und miR-23a. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einer der Ausführungsformen 9 bis 12, wobei das kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen gemäß (i) ein Polymer ist, welches zur Einbringung der mindestens einen Nukleinsäure, bevorzugt von microRNA oder anti-microRNA, weiter bevorzugt von microRNA, in eukaryotische adulte Zellen, bevorzugt in adulte multipotente Stammzellen, weiter bevorzugt in adulte multipotente CD133+-Stammzellen, geeignet ist, welches bevorzugt
Polyethylenimin, weiter bevorzugt verzweigtes oder unverzweigtes, bevorzugt verzweigtes Polyethylenimin, bevorzugt mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 100.000 Dalton, bevorzugt im Bereich von 100 bis 50.000 Dalton, weiter bevorzugt im Bereich von 10.000 bis 30.000 Dalton, umfasst. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einer der Ausführungsformen 9 bis 13, wobei die magnetische Nanopartikel gemäß (ii) magnetische Eisenoxidpartikel, bevorzugt FesC -Partikel umfassen, welche bevorzugt eine sphärische Gestalt mit einem bevorzugten Durchmesser im Bereich von 1 bis 20 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 2 bis 8 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 4 bis 5 nm, aufweisen. Verfahren zur Herstellung von eukaryotischen adulten Zellen, welche ein
Transfektionssystem umfassen, umfassend
(b) Bereitstellen von adulten multipotenten Stammzellen, bevorzugt von adulten
multipotenten CD133+-Stammzellen,
(b) Zugabe eines Transfektionssystems, welches
(i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest
teilweise biotinyliert sind, (ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen, (ii) mindestens eine Nukleinsäure,
umfasst.
Verfahren gemäß Ausführungsform 15, wobei die adulte multipotente Stammzelle eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente Blutstammzelle, bevorzugt eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte
multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle, ist. Verfahren gemäß Ausführungsform 15 oder 16, wobei die mindestens eine
Nukleinsäure gemäß (iii) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plasmid- DNA, modifizierter mRNA, IncRNA, microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, weiter bevorzugt microRNA.
Verfahren gemäß Ausführungsform 17, wobei die microRNA 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide umfasst und weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR-27b, miR- 126, miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA- 126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR- 21 , miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 miR-210, miR-1 , miR-133, miR-208, miR-499, miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR- 23a und miR-23a. Verfahren gemäß einer der Ausführungsformen 15 bis 18, wobei das kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen gemäß (i) ein Polymer ist, welches zur
Einbringung der mindestens einen Nukleinsäure, bevorzugt von microRNA oder anto- microRNA, weiter bevorzugt von micro-RNA, in eukaryotische adulte Zellen, bevorzugt in adulte multipotente Stammzellen, weiter bevorzugt in adulte multipotente CD133+-Stammzellen, geeignet ist, welches bevorzugt Polyethylenimin, weiter bevorzugt verzweigtes oder un verzweigtes, bevorzugt verzweigtes Polyethylenimin, bevorzugt mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 100.000 Dalton, bevorzugt im Bereich von 100 bis 50.000 Dalton, weiter bevorzugt im Bereich von 10.000 bis 30.000 Dalton, umfasst. Verfahren gemäß einer der Ausführungsformen 15 bis 19, wobei die magnetischen Nanopartikel gemäß (ii) magnetische Eisenoxidpartikel, bevorzugt FesC -Partikel umfassen, welche bevorzugt eine sphärische Gestalt mit einem bevorzugten
Durchmesser im Bereich von 1 bis 20 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis
10 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 2 bis 8 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 4 bis 5 nm, aufweisen. Verfahren gemäß einer der Ausführungsformen 15 bis 20 zur Herstellung einer eukaryotischen adulten Zelle umfassend ein Transfektionssystem gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 7. Eukaryotische adulte Zelle, umfassend ein Transfektionssystem, erhalten oder erhältlich durch ein Verfahren gemäß einer der Ausführungsformen 15 bis 20. Eukaryotische adulte Zelle, umfassend ein Transfektionssystem, welches
i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest
teilweise biotinyliert sind,
(ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen,
(ii) mindestens eine Nukleinsäure,
umfasst, zur Verwendung bei der Herstellung von Gewebe, bevorzugt bei der in vitro Herstellung von Gewebe, weiter bevorzugt bei der Herstellung von Herzmuskelgewebe oder Skelettmuskelgewebe, weiter bevorzugt bei der in vitro Herstellung von
Herzmuskelgewebe oder Skelettmuskelgewebe. Eukaryotische adulte Zelle zur Verwendung gemäß Ausführungsform 23, wobei die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten Stammzelle, bevorzugt aus einer adulten, multipotenten CD133+-Stammzelle, erhalten oder erhältlich ist und bevorzugt durch in-Kontakt-bringen der adulten, multipotenten, bevorzugt CD133+, Stammzelle mit dem Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii), erhalten oder erhältlich ist. Eukaryotische adulte Zelle zur Verwendung gemäß Ausführungsform 24, wobei die adulte multipotente Stammzelle eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente Blutstammzelle, bevorzugt eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+- Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle, ist. Eukaryotische adulte Zelle zur Verwendung gemäß einer der Ausführungsformen 23 bis 25, wobei die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, modifizierter mRNA, IncRNA, microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, und bevorzugt eine microRNA ist. Eukaryotische adulte Zelle, umfassend ein Transfektionssystem, welches
i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest
teilweise biotinyliert sind,
(ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen,
(ii) mindestens eine Nukleinsäure,
umfasst, zur Verwendung bei der Behandlung von Erkrankungen, welche mit
Gewebeschäden einhergehen, bevorzugt von Gewebeschäden an Organen, weiter bevorzugt von Gewebeschäden am Herzmuskel oder Skelettmuskel. Eukaryotische adulte Zelle zur Verwendung gemäß Ausführungsform 27, wobei die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten Stammzelle, bevorzugt aus einer adulten, multipotenten CD133+-Stammzelle, erhalten oder erhältlich ist und bevorzugt durch in-Kontakt-bringen der adulten, multipotenten, bevorzugt CD133+, Stammzelle mit dem Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii), erhalten oder erhältlich ist. Eukaryotische adulte Zelle zur Verwendung gemäß Ausführungsform 28, wobei die adulte multipotente Stammzelle eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente Blutstammzelle, bevorzugt eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+- Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle, ist. Eukaryotische adulte Zelle zur Verwendung gemäß einer der Ausführungsformen 27 bis 29, wobei die mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, modifizierter mRNA, IncRNA, microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, und bevorzugt eine microRNA ist. Eukaryotische adulte Zelle zur Verwendung gemäß Ausführungsform 30, wobei die microRNA 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide umfasst und weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA- 210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR- 503 miR-210, miR-1 , miR-133, miR-208, miR-499, miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR-494-3p, miR-146a, miR-23a und miR-23a. Eukaryotische adulte Zelle zur Verwendung gemäß einer der Ausführungsformen 27 bis 31 , wobei das kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen gemäß (i) ein Polymer ist, welches zur Einbringung der mindestens einen Nukleinsäure, bevorzugt von microRNA oder anti-microRNA, weiter bevorzugt von microRNA, in eukaryotische adulte Zellen, bevorzugt in adulte multipotente Stammzellen, weiter bevorzugt in adulte multipotente CD133+-Stammzellen, geeignet ist, welches bevorzugt Polyethylenimin, weiter bevorzugt verzweigtes oder unverzweigtes, bevorzugt verzweigtes Polyethylenimin, bevorzugt mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 100.000 Dalton, bevorzugt im Bereich von 100 bis 50.000 Dalton, weiter bevorzugt im Bereich von 10.000 bis 30.000 Dalton, umfasst.
33. Eukaryotische adulte Zelle zur Verwendung gemäß einer der Ausführungsformen 27 bis 32, wobei die magnetische Nanopartikel gemäß (ii) magnetische
Eisenoxidpartikel, bevorzugt FesC -Partikel umfassen, welche bevorzugt eine sphärische Gestalt mit einem bevorzugten Durchmesser im Bereich von 1 bis 20 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 2 bis 8 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 4 bis 5 nm, aufweisen.
34. Verfahren zur Herstellung von Gewebe, bevorzugt zur in vitro Herstellung von Gewebe, umfassend
(A) Bereitstellen von Gewebe, bevorzugt Herzmuskelgewebe oder
Skelettmuskelgewebe,
(B) Zugabe von eukaryotischen adulten Zellen umfassend ein
Transfektionssystem, bevorzugt von eukaryotischen adulten Zellen umfassend ein Transfektionssystem gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 7 oder erhalten oder erhältlich durch ein Verfahren gemäß einer der
Ausführungsformen 15 bis 20, unter Erhalt einer Mischung aus Gewebe und eukaryotischen adulten Zellen.
35. Verfahren zur Herstellung von Gewebe gemäß Ausführungsform 34, umfassend
(C) Kultivieren der in (B) erhaltenen Mischung aus Gewebe und eukaryotischen adulten Zellen.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Abb. 1 zeigt schematisch die Struktur eines Transfektionssystems (PEI:
Polyethylenimin; MNP: magnetische Nanopartikel; miR: microRNA); Abb. 2 zeigt die Boolean-Gating-Strategie für durchflusszytometrische Messungen der Zellviabilität und der Oberflächenmarkerintegrität (SSC:
Seitwärtsstreulicht, Side Scatter);
Abb. 3 zeigt die Gating-Strategie für durchflusszytometrische Messungen der
Aufnahmeeffizienz und Zytotoxizität von Transfektionskomplexen; Abb.4 zeigt die Transfektionsoptimierung von CD133+-Zellen bei Verwendung
verschiedener miR/PEI-Komplexe;
Abb. 5 zeigt die Transfektionsoptimierung von CD133+-Zellen bei
Verwendung verschiedener miR/PEI/MNP-Komplexe;
Abb. 6 zeigt die magnetische Zielführung transfizierter CD133+-Zellen
Abb. 7 zeigt die intrazelluläre Visualisierung von Transfektionskomplexen;
Abb. 8 zeigt die Viabilität und Oberflächenmarkerintegrität nach Transfektion;
Abb. 9 zeigt die hämatopoetische Differenzierungsfähigkeit von Zellen nach der
Transfektion.
Die vorliegende Erfindung wurde durch die folgenden Beispiele näher illustriert. [Beispiele
1. Material und Methoden
1.1 Knochenmarksproben
Knochenmark wurde von aufgeklärten Patienten, die ihre schriftliche Einwilligung zur Verwendung ihrer Proben für Forschungszwecke nach der Deklaration von Helsinki gegeben haben, verwendet. Die Studie wurde durch die Ethikkommission der Universität Rostock 2010 genehmigt erneuert2015) (Registrierungsnummer A 2010 23). Sternales Knochenmark wurde von Patienten entnommen während sie sich einer Koronararterien-Bypassoperation am Institut der Herzchirurgie (Universitätsklinikum Rostock, Deutschland) unterzogen. Um die Koagulationen des Knochenmarks zu verhindern wurde eine Heparin-Natrium-Lösung (250 i.E./ml Knochenmark) (Rathiopharm GmbH, Deutschland) verwendet.
Isolation von CD133+ Zellen
Mononukleare Zellen wurden durch eine Dichtegradientenzentrifugation aus dem Knochenmark isoliert. CD133+ Zellen wurden durch magnetbasierte Zellsortierung (MACS®) unter Verwendung des CD133 MicroBead Kits (Miltenyi Biotec GmbH, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers angereichert. Für nachfolgende Experimente wurden nur CD133+ Zellfraktionen die eine Viabilitat und eine Reinheit von > 80% aufwiesen verwendet.
[Bestimmung der Viabilität und der Reinheit von CD133+ Zellen
Die Viabilität und die Oberflächenmarkerexpression wurden mittels
Durchflusszytometne 0 h und 18 h nach der Zellisolation analysiert. Für die Färbung wurden die Proben mit folgenden Antikörpern behandelt: anti-CD34-FITC (Klon: AC136), anti-CD133/2-PE (Klon: 293C3), Isotypkontrolle Maus IgG 2b-PE (Miltenyi Biotec GmbH), anti-CD45-APC-H7 (Klon: 2D1 ) und 7-AAD (BD Biosciences, Deutschland). Um unspezifische Bindungen zu vermeiden wurde den Proben zusätzlich FcR blocking reagent (Miltenyi Biotec GmbH) hinzugefügt. Nach einer 10- minütigen Inkubation bei 4 °C wurden die Proben mit dem LSR-II
Durchflusszytometer (BD Biosciences) gemessen und mit Hilfe der FACSDiva Software (BD Bioscience) analysiert. Für die Evaluation wurde die Boolean-Gating- Strategie nach der ISHAGE-Richtlinie für CD34+ Zellanalysen [Sutherland, D. R., Anderson, L, Keeney, M., Nayar, R., and Chin-Yee, I. 1996. The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. International Society of
Hematotherapy and Graft Engineering. Journal of hematotherapy 5, 3, 213-226] wie folgt angeordnet:
1 . Schritt: Selektion der Zellpopulation (Abb. 2A)
2. Schritt: Selektion von CD45+ Zellen (Abb. 2B)
3. Schritt: Selektion von viablen CD45+ Zellen (Abb. 2C)
4. Schritt: Selektion von viablen CD45VCD34+ Zellen (Abb. 2D)
5. Schritt: Selektion von viablen CD45VCD34VCD133+ Zellen (Abb. 2E)
Die Berechnung der Zellviabilität und der Reinheit erfolgte nach folgenden
Gleichungen:
viable CD45+ Zellen
Viabilität [%] = „n i r.± ^ ,, x 100
L J CD45+ Zellen viable CD45+ / CD34+ /CD133+ Zellen
Reinheit [%] = , , ^ ,, x 100
L J viable CD45+ Zellen Präparation der Polyplexe und Transfektion
Cy3™ dye-labeled Pre-miR Negative Control #1 (Ambion, USA) wurde für die Bestimmung der Aufnahmeeffizienz, der Zytotoxizität und für das magnetische Targeting verwendet. Pre-miR™ miRNA Precursor Molecules - Negative Control #1 (Ambion, USA) wurde für durchflusszytometrische Kontrollen, die Analyse der Oberflachenmarkerexpression, die intrazelluläre Visualisierung der Komplexe und zur Untersuchung des hämatopoetischen Differenzierungspotenzials (CFU-Assay) verwendet.
Verzweigtes Polyethylenimin (PEI) mit einem Molekulargewicht von 25 kDA (Sigma- Aldrich, USA) wurde biotinyliert unter Verwendung des EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotins (Thermo Fisher Scientific GmbH, Germany) gemäß den Anweisungen des Herstellers und wie zuvor von unsere Gruppe beschrieben [Voronina, N., Lemcke, H., Wiekhorst, F., Kuhn, J.-P., Rimmbach, C, Steinhoff, G., and David, R. 2016. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine : nanotechnology, biology, and medicine]. Die finale Konzentration der Aminogruppen wurde mit Hilfe der Ninhydrin-Methode (2 %ige Ninhydrin Reagent, Sigma-Aldrich) gemessen und ein Biotinylierungsgrad von 1 ,585 ± 0,018 mmol Biotin/mmol PEI mit Hilfe des HABA Assays unter
Verwendung des Pierce Biotin Quantitation Kits (Thermo Fisher Scientific GmbH) bestimmt.
Um größere Aggregate und Partikel zu entfernen wurden die Streptavidin
MagneSphere® Paramagnetic Particles (Promega Corporation, USA) durch 0,45 μηη Millex-HV PVDF Syringe Filter Units (EMD Millipore Corporation, USA) gefiltert. Das biotinylierte PEI und die gefilterten Magnetpartikel (MNPs) wurden bei 4 °C bis zur Verwendung gelagert.
Für die Bildung der Polyplexe wurden die entsprechenden Mengen an microRNA (Pre-miR Negative Control #1 ; entsprechend der Versuchsanordnung mit Cy3 markiert (Ambion, USA)) und PEI in gleichen Volumina in 5 %iger Glukoselösung (MP Biomedicals, Deutschland) verdünnt. Dabei wurden verschiedene Verhältnisse von Stickstoff (PEI) zu Phosphat (miR) (N/P Verhältnis) getestet. Nach Vereinigung beider Proben und intensiver Durchmischung wurde die microRNA PEI-Lösung 30 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert.
Für die Bildung magnetischer Polyplexe wurden die MNPs vor jeder Anwendung für 20 min im Ultraschallbad inkubiert, um geformte Aggregate zu beseitigen.
Anschließend wurden die MNPs mit den zuvor präparierten microRNA/PEI- Komplexen in verschiedenen Konzentrationen gemischt und für 30 min bei RT inkubiert.
Für die Transfektion wurden 5x104 frisch isolierte CD133+ Zellen in ein Well einer 24er Wellplatte ausgesät und es erfolgte die sofortige Zugabe der zuvor präparierten miR/PEI- oder miR/PEI/MNP-Komplexe. Nach einer Inkubationszeit von 18 h bei 37 °C und 5 % C02 in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Pan Biotech GmbH, Deutschland) dem 1 % Penicillin/Streptomycin (PAA Laboratories GmbH, Germany) und 2 % fetales Rinderserum (Pan Biotech GmbH) zugesetzt war, wurden die Zellen direkt für die Messung verwendet oder es erfolgte ein Mediumwechsel.
Auf ahmeeffizienz und Zytotoxizität der Transfektionskomplexe
Für die Quantifizierung der Aufnahmeeffizienz und der Zytotoxizität der
unterschiedlich zusammengesetzten Transfektionskomplexe wurden die CD133+ Zellen 18 h nach der Transfektion für 10 min bei 4 °C mit LIVE/DEAD® Fixable Near- IR Dead Cell Stain Kit (Molecular Probes, USA) gefärbt und anschließend mit einer 4 %igen Formaldehydlösung (FA) (Merck Schuchardt OHG, Deutschland) fixiert. Die Proben wurden mit dem LSR-II Durchflusszytometer gemessen und die Daten mit Hilfe der FACSDiva Software (BD Bioscience) analysiert. Abb. 3 zeigt die
repräsentative Gating-Strategie.
Eine qualitative Analyse der transfizierten CD133+ Zellen erfolgte 18 h nach der Transfektion von Cy3™ dye-labeled Pre-miR Negative Control #1 (Ambion, USA). Hierzu wurden die Zellen mit 2 % FBS gewaschen um nicht aufgenommene Partikel zu lösen. Anschließend wurden die Zellen in 4 %iger FA-Lösung für 20 min fixiert. Danach wurden die Zellen auf ein Deckglas zentrifugiert und mit PBS gewaschen. Abschließend wurde das Deckglas mit Fluoroshield™ mit DAPI (Sigma-Aldrich, Germany) auf einem Objektträger gebettet. Mit Hilfe der Laser-Scanning Mikroskopie (LSM) (40x Ölimmersion) wurde ein tile-scan der Proben durchgeführt, welches zu einer besseren Übersicht von 1062.33 μηη x 1062.33 μηη führte. Desweiteren wurde ein z-stack mit einer Tiefe von 7 μηη zur Bestimmung der Aufnahme von Cy3- markierter miR durchgeführt. Magnetisches Targeting
Der Nachweis des magnetischen Zelltargetings der CD133+ Zellen erfolgte mit den optimierten Transfektionskomplexen (20 pmol miR; N/P Verhältnis: 7,5; 3 und 5 μg/ml MNP). 18 h nach der Transfektion wurden die Zellen in ein neues Well einer 12er Wellplatte überführt. Ein magnetisches Feld wurde, lokal durch eine Magnetplatte unterhalb der Zellkulturschale, erzeugt (OZ Biosciences, France; Feldstärke 70 - 250 mT). Nach einer Inkubationszeit von 24 h bei 37 °C und 5 % CO2 wurde die Zellzahl in den Areal mit (+M) und ohne (-M) Magnet mit Hilfe des LSM 780 ELYRA PS.1 erfasst und nachfolgend durch ZEN 201 1 Software (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Deutschland) und ImageJ 1 .48 (NIH, USA) analysiert. Das entsprechende Verhältnis des magnetischen Targetings wurde wie folgt ermittelt: Zahlzahl (+M)/ Zellzahl (-M). Magnetpartikel Spektroskopie zur [Bestimmung des Eisengehaltes in CD133+ Zellen
Zur Bestimmung der Eisenkonzentration wurden 5x105 CD133+ Zellen mit den optimalen miR/PEI/MNP Komplexen transifiziert (20 pmol miR; N/P Verhältnis 7,5; 3 μg/ml MNPs). Nach einer Inkubationszeit von 18 h wurden die Proben mit 2 % FBS in PBS gewaschen, anschließend mit 4 %iger FA-Lösung fixiert und in ein 0,2 ml Reaktionsgefäß überführt. Die Messungen wurden mit Hilfe eines MPS (Bruker Biospin, Deutschland) unter einer magnetischen Flussdichte von B<*nve = 25 mT und einer Frequenz von fo = 25 kHz durchgeführt. Hierbei werden nicht-lineare
dynamische magnetische Momente der Proben in höheren Frequenzen als fo bestimmt. Die Eisenquantifizierung der Proben erfolgte durch die Bestimmung der dritten harmonischen Frequenz des MPS-Spektrums (A3). Das MPS-Spektrum wurde gegen ein Referenzspektrum der eingesetzten MN Ps und CD133 MircoBeads normalisiert (bekannter Eisengehalt, MNPs: 3,2 μg; CD133 MircoBeads: 2,5 μg). das Verhältnis von A5/A3 wird als charakteristischer Fingerabdruck zur Identifizierung der verschiedenen magnetischen Nanopartikel herangezogen.
Intrazelluläre Visualisierung der Transfektionskomplexe
Zur Visualisierung der Transfektionskomplexe wurde Pre-miR™ miRNA Precursor Molecule - Negative Control #1 (Ambion) mit Hilfe des Label IT® miRNA Labeling Kits (Mirus Bio LLC, USA) mit Cy5™ Farbstoff markiert, entsprechend den Vorgaben des Herstellers. Überflüssiger Farbstoff wurde durch die mitgelieferten
Aufreinigungssäulen entfernt. Die Konzentration der Cy5-markierten miR wurde spektrophotometrisch mit Hilfe des NanoDrops ND-1000 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) ermittelt und nachfolgend lichtgeschützt bei -20 °C gelagert. PEI wurde mit Hilfe des FluoReporter® Oregon Green® 488 Protein Labeling Kits (Molecular Probes), entsprechend den Vorgaben des Herstellers, gefärbt. Hierzu wurde PEI mit 1 M Natriumbicarbonat-Lösung gemischt und 1 h mit der Oregon Green® Stammlösung (10 mg/ml in DMSO) inkubiert. Nichtgebundener Farbstoff wurde durch Größenausschluss-Chromatographie mittels PD-10 Entsalzungssäulen (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) entfernt. Die Konzentration von 488-markiertem PEI wurde durch eine Ninhydrinanalyse ermittelt und nachfolgend lichtgeschützt bei 4 °C gelagert.
Die MNPs wurde mit dem Farbstoff Atto 565-konjugiert zu Biotin (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Deutschland) gefärbt. Hierzu wurden die MNPs mit Atto 565 Farbstoff (Verhältnis 1 : 1000 w/w), parallel zur Generierung der miR/PEI Komplexe, gemischt und für 30 min im Dunkeln inkubiert.
Um die intrazelluläre Verteilung der Transfektionskomplexe zu verfolgen, wurden 5x104 CD133+ Zellen mit den oben beschriebenen fluoreszenzmarkierten Komplexen und unter den optimalen Bedingungen (20 pmol miR; N/P Verhältnis 7,5; 3 μg/ml MNPs) transfiziert. 18 h nach der Transfektion wurden die Zellen einmalig mit 2 % FBS in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, Pan Biotech GmbH) gewaschen um freie Partikel zu lösen, anschließend wurden diese mit 4 % FA für 20 min fixiert. Nachfolgend wurden die Zellen auf ein Deckglas zentrifugiert und nochmals mit PBS gewaschen. Abschließend wurde das Deckglas mit Fluoroshield™ mit DAPI (Sigma- Aldrich, Germany) auf einem Objektträger gebettet.
Zunächst wurde die intrazelluläre Lokalisation aller Transfektionskomplexbestandteile mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (LSM) untersucht. Hierzu wurde das ELYRA PS.1 LSM 780 System genutzt. Zur anschließenden Aufbereitung der aufgenommen Bilder wurde die ZEN Software (Carl Zeiss Microscopy GmbH) verwendet. Eine detaillierte Analyse zur Lokalisation der Komplexen erfolgte durch 3- dimensionale structured Illumination Mikroskopie (SIM), welche ebenfalls mit dem ELYRA PS.1 LSM 780 System durchgeführt wurde. SIM-Aufnahmen mit 4
Fluorophoren erfolgten mit einem 100x alpha Plan-Apochromat Objektiv
(Ölimmersion), NA=1 ,46 und bei Anregungswellenlängen von 405, 488, 561 und 633 nm. Die Aufnahmen wurden als 16bit z-Stapel generiert, mit 3 Rotationen, 3 Phasen und einem Average-Wert von 4. Der Gitterabstand für die jeweiligen
Anregungswellenlängen betrug: 23 μηη für 405 nm, 34 μηη für 488 nm, 42 μηη für 561 nm und 51 μηη für 633nm. Die ermittelten Sl Rohdaten wurden durch die ZEN Software rekonstruiert. Für jeden Farbkanal wurde aus dem aufgenommen z-Stapel eine 2D Maximum Projection generiert und anschließend erfolgte die Überlagerung der einzelnen Farbkanäle zu einem Einzelbild.
Hämatopoetischer CFU (CFU-H) Assay
Um das hämatopoetische Differenzierungspotenzial der microRNA-modifizierten CD133+ Zellen zu bestimmen wurde ein CFU-H Assay durchgeführt. 18 h nach der Transfektion mit Pre-miR™ miRNA Precursor Molecules - Negative Control #1 wurden die Zellen mit MethoCult H4434 Classic (STEMCELL Technologies,
Deutschland) gemischt und anschließend in einer Konzentration von 1x103 Zellen pro 35 mm Zellkulturschale ausgesät. Die Bewertung der gebildeten Kolonien, nach Anzahl und Art, wurde nach einer Inkubationszeit von 14 Tage bei 37 °C und
5 % CO2 durchgeführt. Nach Herstellerangaben wurden alle Proben in Duplikaten untersucht. Statistische Auswertung
Eine statistische Auswertung wurde mittels Student's t-test und der SigmaPlot 1 1 .0 Software (Systat Software GmbH, Deutschland) durchgeführt. Alle Daten sind dargestellt als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Daten mit p < 0.05 (*;#); p < 0.01 (**;##); und p < 0.001 (***;###) wurden als statistisch signifikant betrachtet. Für jedes Experiment wurden verschiedene Knochenmarksspender (n) verwendet. Ergebnisse
Optimierung der miR/PEI-Komplexe für die Transfektion
Für die Optimierung der Transfektion der CD133+-Stammzellen wurden verschiedene Zusammensetzungen von miR/PEI-Komplexen, die vier unterschiedliche Gehalte an miR aufwiesen (10, 20, 30 und 40 pmol pro 5x104 Zellen) und drei verschiedene N/P- Verhältnisse (2,5, 5,0 und 7,5) bezüglich der Aufnahmeeffizienz und Zytotoxizität untersucht. Bei allen Messungen dienten nicht-transfizierte Zellen als interne
Kontrolle. Komplexe mit der kleinsten miR-Menge (10 pmol) zeigten die geringsten Aufnahmeraten (im Bereich von 20 bis 60 % Cy3+ Zellen) und eine moderate
Zytotoxizität (ca. 40 tote Zellen) im Vergleich zur Kontrolle (ca. 25 % tote Zellen). Die Ergebnisse sind in Abbildung 4 gezeigt. Komplexe mit höheren Gehalten an miR ergaben eine signifikant erhöhte Aufnahmeeffizienz (bis zu ca. 95 % Cy3+ Zellen), ergaben aber auch erhöhte zytotoxische Effekte (bis zu ca. 80 % tote Zellen), wobei höhere PEI-Mengen erforderlich waren. Daher wurden Komplexe, die 20 pmol miR enthielten, als optimal für die Transfektion der CD133+-Stammzellen angesehen, da sie eine Balance zwischen erhöhten Aufnahmeraten (ca. 75-90 % Cy3+ Zellen) und relativ geringer Zytotoxizität aufwiesen. miR/PEI/MNP Komplexe sind geeignet für eine CD133+ Stammzelltransfektion
Zur Ermöglichung einer magnetischen Zielführung und Auffindung wurden die vorher ausgewählten Polyplexe (20 pmol miR, N/P-Verhältnis 2,5, 5,0 und 7,5) mit magnatischen Nanopartikeln (MNP) in fünf verschiedenen Konzentrationen (1 , 2, 3, 4 und 5 μg pro ml fertiger miR/PEI-Mischung) versetzt. Der Einfluss der MNPs auf die Aufnahmeeffizienz und die Zytotoxizität wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Nicht-transfizierte Zellen wurden als Kontrolle eingesetzt.
Die Aufnahmeraten der miR/PEI/MNP-Komplexe unterschieden sich nicht signifikant von denen der entsprechenden miR/PEI-Komplexe (ohne MNP), die Ergebnisse sind in Abb. 5 dargestellt. Dahingegen führten erhöhte N/P-Verhältnisse (2,5, 5 und 7,5) zu erhöhten Aufnahmeeffizienzen (ca. 40 %, ca. 60 % und ca. 80 % Cy3+-Zellen). Repräsentative Aufnahmen belegen die intrazelluläre Lokalisation von Cy3-markierter miR und der gleichzeitigen hohen Aufnahmeeffizienz bei einem Einsatz von 20 pmol miR N/P-Verhätnis 7,5 kombiniert mit 3 μg/ml MNPs. Weiterhin konnten keine signifikanten Veränderungen in der Zytotoxizität zwischen Kontrolle (36 % ± 1 1 tote Zellen) und den transfizierten Zellen (zwischen ca. 25 % und ca. 35 % tote Zellen) ermittelt werden. In Folgeexperimenten wurden magnetische Komplexe,
zusammengesetzt aus 20 pmol miR, N/P-Verhältnis 7,5, kombiniert mit 3 und 5 μg/ml MNPs, verwendet im Hinblick auf ihre höchsten Aufnahmeraten und geringe
Zytotoxizität im Vergleich zur Kontrolle. Für die Vergleichsuntersuchung wurden Komplexe, zusammengesetzt aus 20 pmol miR, N/P-Verhältnis 5 kombiniert mit 3 und 5 μg/ml MNPs für Folgeuntersuchungen verwendet.
Zielführung von transfizierte CD133+-Zellen in einem magnetischen Feld
Zur Untersuchung des Einflusses eines Magnetfeldes auf die Zielführung von Zellen, die mit optimierten miR/PEI/MNP-Komplexen transfiziert waren, wurde eine
Magnetplatte lokal unter einem Teilbereich der Zellkulturplatte für 24 Stunden angebracht (Abb.6).
Bei nicht-transfizierten Zellen wurde nahezu die gleiche Anzahl von Zellen in beiden Bereichen (mit und ohne Magnet, siehe Abb. 6b und c) beobachtet. Diese Resultate indizierten, dass MACS CD133 Microbeads allein nicht ausreichend waren für eine Zielführung der Zellen. Im Gegensatz dazu zeigten Zellen, die mit magnetischen Komplexen, zusammengesetzt aus 20 pmol miR, einem N/P-Verhältnis von 5 und 7,5, kombiniert mit 3 und 5 μg/ml MNPs höhere Zellzahlen im Bereich des Magneten (+M) als in dem Bereich ohne Magnet (-M). Entsprechend zeigten transfizierte Zellen signifikant höhere magnetische Zielführungsverhältnisse (Verhältnis zwischen 1 ,6 und 2,6) als nicht-transfizierte Zellen (Verhältnis 1 ±0,12). Die Ergebnisse sind in Abb. 6a dargestellt. Weiterhin zeigten Transfektionskomplexe mit einem N/P-Verhältnis von 7.5 signifikant höhere Zielführungsverhältnisse (2,6±0,17 und 2,2±0,08 mit 3 und 5 μg/ml MNPs). Daher wurden Komplexe, zusammengesetzt aus 20 pmol miR, einem N/P-Verhältnis von 7,5 in Kombination mit 3 oder 5 μg/ml MNPs als am besten geeignet für die Zielführung von transfizierten Zellen in einem Magnetfeld angesehen und daher für die weiteren Untersuchungen eingesetzt. Abb. 6c zeigt eine Übersicht der Ergebnisse. Intrazelluläre Eisenkonzentration
Zur Bestimmung der Eisenkonzentration wurden Transfektionskomplexe
herangezogen, welche als optimal für die Transfektion von CD133+ Zellen sowie für ihre magnetische Zielführung definiert wurden. Die intrazelluläre Eisenkonzentration wurde mit Hilfe der magnetischen Partikelspektroskopie (MPS) quantifiziert. Eine Eisenkonzentration von 0,155 ± 0,0419 pg Eisen pro Zelle konnte durch die
Transfektion von miR/PEI/MNP Komplexen erzielt werden. Ein entsprechender A5/A3 Wert von 20,5 ± 3,1 % erlaubt eine eindeutige Identifizierung von MNPs und verhindert somit ein falsch-positives Signal ausgehend von CD133 MicroBeads (A5/A3: 27 - 30 %). Intrazelluläre Visualisierung von Transfektionskomplexen
Zur intrazellulären Bestimmung optimierter Transfektionskomplexe wurden CD133+- Stammzellen mit markierten miR/PEI- und miR/PEI/MNP-Komplexen transfiziert. Um eine genaue Verteilung der Komplexbestandteile zu untersuchen wurde SIM- Aufnahmen erstellt (laterale Auflösung 100 nm) (Abb. 7). Diese zeigen, dass 18 h nach der Transfektion alle Bestandteile des Transfektionssystems im Zytoplasma zu finden sind, wobei sie in der perinukleären Region, ohne erkennbaren Unterschied, lokalisiert sind. Das Signal von PEI wurde jeweils in Kolokalisation mit MNPs und miR vorgefunden. Die Transfektionskomplexe weisen eine Größe von etwa 100 - 400 nm auf und befinden sich in einer anderen Bildebene als der Nukleus (Daten ersichtlich aus z-stacks) miR/PEI/MNP Komplexe haben keinen negativen Einfluss auf die Viabilität und die Expression von Stammzelloberflächenmarkern
Zur Untersuchung des Einflusses von 18 Stunden Kultivierungszeit und Transfektion auf die Viabilität und Oberflächenmarkerintegrität von transfizierten CD133+-Zellen wurden durchflusszytometrische Messungen vorgenommen. Wie eingangs beschrieben wurden Parameter angewandt, die als optimal für den Zielführungsansatz ermittelt worden waren; als interne Kontrolle wurden nicht- transfizierte Zellen eingesetzt. Ein signifikanter Abfall in der Viabilität von nicht- transfizierten CD133+-Zellen von ca. 95 % ± 1 (0 h Kontrolle) auf ca. 77 % ± 3 (18 h Kontrolle) wurde beobachtet (siehe Abb. 8), was einen Zelltod, verursacht durch die 18 h Kultivierung, bedeutet. Jedoch wurde kein signifikanter Unterschied in der Viabilität nach 18 h zwischen Kontrolle und Zellen, die mit 20 pmol miR, einem N/P- Verhältnis von 7,5 und 0, 3 oder 5 pg/ml MNPs transfiziert waren (ca. 70 % lebende Zellen), festgestellt, was illustriert, dass die Transfektionsbedingungen einen milden Charakter aufwiesen. Im Gegensatz dazu wurden keine signifkanten Veränderungen in der Oberflächenmarkerintegrität nach 18 h Kultivierungszeit beobachtet (93 % ± 2 bei der 0 h Kontrolle; 87 % ± 2 bei der 18 h Kontrolle). Darüberhinaus zeigte die Analyse der Zellen, die mit 20 pmol miR, N/P-Verhältnis von 7,5 und 0, 3 oder 5 pg/ml MNPs transfiziert worden waren (92 % ± 2; 90 % ± 4; 89 % ± 4), keinen signifikanten Unterschied bei beiden Kontrollen, was den Erhalt von hämatopoetischen
Stammzellmarkern anzeigt.
Multipotentes Differenzierungspotenzial von transfizierten CD133+-Zellen
Dem Knochenmark entstammende CD133+-Zellen sind bekannt für ihr multipotentes Differenzierungspotenzial. Zur Bestimmung der Auswirkung der Transfektion auf ihre Fähigkeit zur hämatopoetischen Differenzierung wurden CFU-Assays verwendet. Der Vergleich von nicht-transfizierten Zellen (Kontrolle) und Zellen, die mit optimierten miR/PEI- bzw. miR/PEI/MNPs-Komplexen (20 pmol miR; N/P-Verhältnis 7,5; 0, 3 oder 5 μΙ/ml MNPs) transfiziert worden waren, zeigte keinen signifikanten Unterschied in der Menge der gebildeten CFU-Granulozyten, Erythroid, Makrophagen,
Megakaryocyten (CFU-GEMM), CFU-Granulozyten, Makrophagen (CFU-GM), Burst- bildender Unit-Erythroid (BFU-E) und CFU-Erythroid (CFU-E), siehe Abb. 9e.
Vielmehr wiesen die transfizierten Zellen keine morphologischen Abnormitäten auf (siehe Abb. 9a-d). Diese Ergebnisse zeigen klar, dass eine Transfektion unter optimierten Bedingungen keinen Einfluss auf das multipotente Differenzierungspotenzial von CD133+-Zellen hat.

Claims

Ansprüche
1 . Eukaryotische adulte Zelle umfassend ein Transfektionssystem, wobei das
Transfektionssystem
(i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest teilweise biotinyliert sind,
(ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen, (ii) mindestens eine Nukleinsäure,
umfasst.
2. Eukaryotische adulte Zelle gemäß Anspruch 1 , wobei die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten Stammzelle, bevorzugt aus einer adulten, multipotenten CD133+-Stammzelle, erhalten oder erhältlich ist und bevorzugt durch in-Kontakt-bringen der adulten, multipotenten, bevorzugt CD133+, Stammzelle mit dem Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii), erhalten oder erhältlich ist.
3. Eukaryotische adulte Zelle gemäß Anspruch 2, wobei die adulte multipotente
Stammzelle eine adulte multipotente Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente Blutstammzelle, bevorzugt eine adulte multipotente
Knochenmarksstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+- Knochenmarksstammzelle oder eine adulte multipotente CD133+-Blutstammzelle, weiter bevorzugt eine adulte multipotente CD133+-Knochenmarksstammzelle, ist.
4. Eukaryotische adulte Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die
mindestens eine Nukleinsäure gemäß (iii) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, modifizierter mRNA, IncRNA, microRNA und anti-microRNA, bevorzugt aus der Gruppe von microRNA und anti-microRNA, und bevorzugt eine microRNA ist.
5. Eukaryotische adulte Zelle gemäß Anspruch 4, wobei die microRNA 15 bis 25, bevorzugt 20 bis 24, weiter bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide umfasst und weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus miR-146a, miR-125b, let-7c, let-7f, miR-27b, miR-126, miRNA-34a, miR-34a, miR-210, miRNA-210, miRNA-210, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-126, miRNA-92a, miR-24, miRNA-23, miR-27, miR-21 , miR-21 , miR-130a, miR-130a, miR-16, 424, miR-503 miR-210, miR- 1 , miR-133, miR-208, miR-499, miR-146a, miR-146a, miR-150, miR-494-3p, miR- 494-3p, miR-146a, miR-23a und miR-23a.
6. Eukaryotische adulte Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das
kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen gemäß (i) ein Polymer ist, welches zur Einbringung der mindestens einen Nukleinsäure, bevorzug von microRNA in eukaryotische adulte Zellen, bevorzugt in adulte multipotente Stammzellen, weiter bevorzugt in adulte multipotente CD133+-Stammzellen, geeignet ist, welches bevorzugt Polyethylenimin, weiter bevorzugt verzweigtes oder unverzweigtes, bevorzugt verzweigtes Polyethylenimin, bevorzugt mit einem zahlenmittleren
Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 100.000 Dalton, bevorzugt im Bereich von 100 bis 50.000 Dalton, weiter bevorzugt im Bereich von 10.000 bis 30.000 Dalton, umfasst.
7. Eukaryotische adulte Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die
magnetischen Nanopartikel gemäß (ii) magnetische Eisenoxidpartikel, bevorzugt Fe304-Partikel umfassen, welche bevorzugt eine sphärische Gestalt mit einem bevorzugten Durchmesser im Bereich von 1 bis 20 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 2 bis 8 nm, weiter bevorzugt im Bereich von 4 bis 5 nm, aufweisen.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eukaryotische adulte Zellen, welche ein Transfektionssystem umfassen, wobei das Transfektionssystem
(i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest
teilweise biotinyliert sind,
(ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen, (ii) mindestens eine Nukleinsäure, umfasst.
9. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, wobei die eukaryotische adulte Zelle aus einer adulten, multipotenten Stammzelle, bevorzugt aus einer adulten, multipotenten CD133+-Stammzelle, erhalten oder erhältlich ist und bevorzugt durch in-Kontakt-bringen der adulten, multipotenten, bevorzugt CD133+, Stammzelle mit dem Transfektionssystem umfassend (i), (ii) und (iii), erhalten oder erhältlich ist.
10. Verfahren zur Herstellung von eukaryotischen adulten Zellen, welche ein
Transfektionssystem umfassen, umfassend
(a) Bereitstellen von adulten multipotenten Stammzellen, bevorzugt von adulten
multipotenten CD133+-Stammzellen,
(b) Zugabe eines Transfektionssystems, welches
(i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest
teilweise biotinyliert sind,
(ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen, (ii) mindestens eine Nukleinsäure,
umfasst.
1 1 . Verfahren gemäß Anspruch 10 zur Herstellung einer eukaryotischen adulten Zelle umfassend ein Transfektionssystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7.
12. Eukaryotische adulte Zelle umfassend ein Transfektionssystem, erhalten oder
erhältlich durch ein Verfahren gemäß Anspruch 10.
13. Eukaryotische adulte Zelle umfassend ein Transfektionssystem, welches
i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest
teilweise biotinyliert sind,
(ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen, (ii) mindestens eine Nukleinsäure, umfasst, zur Verwendung bei der Herstellung von Gewebe, bevorzugt bei der in vitro Herstellung von Gewebe, weiter bevorzugt bei der Herstellung von Herzmuskelgewebe oder Skelettmuskelgewebe, weiter bevorzugt bei der in vitro Herstellung von
Herzmuskelgewebe oder Skelettmuskelgewebe.
14. Eukaryotische adulte Zelle umfassend ein Transfektionssystem, welches
i) ein kationisches Polymer aufweisend Aminogruppen, welche zumindest
teilweise biotinyliert sind,
(ii) magnetische Nanopartikel mit daran gebundenen Streptavidin-Molekülen, (ii) mindestens eine Nukleinsäure,
umfasst, zur Verwendung bei der Behandlung von Erkrankungen, welche mit
Gewebeschäden einhergehen, bevorzugt von Gewebeschäden an Organen, weiter bevorzugt von Gewebeschäden am Herzmuskel oder Skelettmuskel.
15. Verfahren zur Herstellung von Gewebe, bevorzugt zur in vitro Herstellung von Gewebe, umfassend
(A) Bereitstellen von Gewebe, bevorzugt Herzmuskelgewebe oder
Skelettmuskelgewebe,
(B) Zugabe von eukaryotischen adulten Zellen umfassend ein
Transfektionssystem, bevorzugt von eukaryotischen adulten Zellen umfassend ein Transfektionssystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 oder erhalten oder erhältlich durch ein Verfahren gemäß Anspruch 10, unter Erhalt einer
Mischung aus Gewebe und eukaryotischen adulten Zellen.
16. Verfahren zur Herstellung von Gewebe gemäß Anspruch 15, umfassend
(C) Kultivieren der in (B) erhaltenen Mischung aus Gewebe und eukaryotischen adulten Zellen.
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