DE102006043625A1

DE102006043625A1 - Verfahren zur Isolierung und/oder Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen (MSC)

Info

Publication number: DE102006043625A1
Application number: DE102006043625A
Authority: DE
Inventors: Hans-Jörg Dr. Bühring; Sabrina Treml; Venkata Lokesh Dr. Battula; Reiner Dr. Lammers
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Current assignee: TETEC Tissue Engineering Technologies AG
Priority date: 2006-09-12
Filing date: 2006-09-12
Publication date: 2008-03-27
Anticipated expiration: 2026-09-13
Also published as: EP2560002A2; EP2560002B1; ES2539798T3; US8163495B2; DE102006043625B4; EP1901063A3; ES2539905T3; EP2560002A3; US20080075699A1; EP1901063B1; EP1901063A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Antikörpern, die von Hybridomzelllinien generiert werden, welche ausgewählt sind aus der Gruppe, umfassend W8B2, W1C3, W7C6, W5C4, 24D2, 28D4, HEK-3D6, W4A5, W3D5, W5C5, 9A3G9, 58B1, F9-3C2F1, 39D5, zur Isolierung und/oder Identifizierung von homogenen mesenchymalen Stammzellen. Ferner wird ein Verfahren bereitgestellt, mit dem mesenchymale Stammzellen aus adultem Primärgewebe, wie bspw. Knochenmark, identifiziert und hoch-rein isoliert werden können.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur prospektiven Isolierung und/oder Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen.
Der Begriff „mesenchymale Stammzellen" (MSC) ist in der Literatur nicht einheitlich definiert. Grundsätzlich können zwei Zelltypen unterschieden werden: MSC, die direkt aus nicht-hämatopoetischem Primärgewebe isoliert werden (z.B. Knochenmark, Fettgewebe, Plazenta) und Zellen, die sich aus diesen Primärzellen in Kultur zu adhärenten, fibroblastoiden Zellen differenzieren und dort Zelloberflächenmarker wie CD73, CD105, CD166 exprimieren, jedoch negativ für den hämatopoetischen Stammzellmarker CD34 und den Pan-Leukozytenmarker CD45 sind. Im Allgemeinen werden die in Kultur generierten Zellen als mesenchymale Stammzellen bezeichnet, da sie selbst nach diesem Verfahren noch eine multipotente Differenzierungskapazität besitzen. Erst kürzlich hat jedoch die „International Society for Cellular Therapy" ein „position statement" verfasst mit dem Ziel, die Nomenklatur dieser Zellen zu vereinheitlichen (Horwitz EM, et al., „Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement", Cytotherapy 2005:7; 393-395). In dieser Publikation werden Zellen aus Primärgewebe, die die Fähigkeit besitzen, in Kultur Fibroblastenkolonien (Colony forming unit-fibroblast = CFU-F) zu bilden, als eigentliche mesenchymale Stammzellen (MSC) bezeichnet. Im Gegensatz dazu werden adhärente Zellen mit fibroblastoider Morphologie, die durch Kultur von Zellen aus Primärgewebe generiert wurden, als „multipotent mesenchymal stromal cells" bezeichnet. Das Kürzel „MSC" wurde jedoch auch für diese Zellen beibehalten.
Aufgrund ihrer Multipotenz, d.h. ihrer Eigenschaft, unter geeigneten in vitro- und in vivo-Bedingungen in verschiedene mesenchymale Gewebe (wie bspw. Knochen, Fett, Muskel, Knorpel, etc.) differenzieren zu können, werden mesenchymale Stammzellen bereits für den therapeutischen Einsatz verwendet. So können bspw. aus Nabelschnurblut, Knochenmark und Fettgewebe isolierte differenzierungsfähige MSCs in vitro expandiert, zu Osteoblasten, Chondrozyten und Myozyten differenziert werden, und anschließend in vivo wieder eingesetzt werden, bspw. zur Regeneration von Knochen, Knorpel, Sehnen, Muskeln, Fettgewebe sowie Stroma.
Außer der Eigenschaft, schnell und stabil auf Plastik- oder Glasoberflächen zu adhärieren, sind die MSC („multipotent mesenchymal stromal cells”) durch ihre fibroblastoide Morphologie sowie durch die Expression (von bspw. CD73, CD90, CD105, CD166) bzw. fehlende Expression (CD34, CD45) phänotpyisch charakterisiert. Viele der auf MSC exprimierten Oberflächenmoleküle findet man auch auf endothelialen, epithelialen Zellen und auf Muskelzellen. Andererseits lassen sich MSCs aber deutlich von hämatopoetischen Stammzellen abgrenzen, da sie keine spezifischen hämatopoetischen Marker wie z.B. CD45 exprimieren.
Stand der Technik ist einerseits, dass mesenchymale Stammzellen aus Knochenmark mittels Antikörpern, die gegen den niedrig-affinen Rezeptor für den Nervenwachstumsfaktor („low affinity nerve growth factor receptor” = CD271) gerichtet sind, isoliert werden können (Quirici et al., „Isolation of bone marrow mesenchymal stem cells by anti-nerve growth factor receptor antibodies", Exp. Hematol., 2002, 30(7):783-791). Weiterhin wurde beschrieben, dass MSC über Antikörper gegen SH2 (CD105), SH3 (CD73) und SH4 (CD73) isoliert werden können (siehe Barry F, et al., „The SH-3 and SH-4 antibodies recognize distinct epitopes an CD73 from human mesenchymal stem cells", Biochem Biophys Res Commun. 2001; 289:519-24; und Pittenger MF, et al., "Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells", Science. 1999; 284:143-7). Der Nachteil der bisherigen Marker ist jedoch, dass sie alle nicht spezifisch für MSC sind, sondern noch weitere Zellpopulationen im Knochenmark erkennen.
Ferner beschreiben Vogel et al., (Vogel W, et al., „Heterogeneity among human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and neural progenitor cells.", Haematologica, 2003, 888:126-133) das durch den Antikörper W8D2 definierte Antigen als einen neuen Marker, der sehr heterogen auf kultivierten MSC exprimiert ist.
Der Zelloberflächenmarker CD271 ist der bisher spezifischste Zelloberflächenmarker für die Isolierung von mesenchymalen Stammzellen, der kommerziell erhältlich ist. So werden bspw. monoklonale Antikörper gegen diesen Marker von den Firmen BD PharMingen, San Diego, USA, und Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Deutschland, vertrieben. Allerdings hat sich herausgestellt, dass dieser Marker nicht selektiv für MSC ist, sondern auch auf weiteren CD45-positiven hämatopoetischen Zellen exprimiert wird. Dadurch werden bei einem Isolationsverfahren mit anti-CD271-Antikörpern nicht nur mesenchymale Zellen, sondern auch hämatopoetische Zellen isoliert.
Vor dem Hintergrund der aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile, ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Möglichkeiten bereitzustellen, um mesenchymale Stammzellen (MSC) möglichst rein zu isolieren.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird diese Aufgabe dadurch gelöst, dass Antikörper oder funktionale Fragmente davon zur Isolierung und/oder Identifizierung von homogenen mesenchymalen Stammzellen aus Primärgewebe bereitgestellt werden, die von Hybridomzelllinien generiert werden, welche ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend, W8B2, W1C3, W7C6, W5C4, 24D2, 28D4, HEK-3D6, W4A5, W3D5, W5C5, 9A3G9, 58B1, F9-3C2F1, 39D5, die bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt wurden, bzw. publiziert oder käuflich erhältlich sind.
Ferner wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Identifizierung und/oder Isolierung von homogenen mesenchymalen Stammzellen gelöst, das die folgenden Schritte aufweist:

a) In-Verbindung-Bringen einer Probe einer Zellsuspension aus Primärgewebe, die mesenchymale Stammzellen enthält, mit zumindest einem Antikörper oder Fragment davon, der von den Hybridomzelllinien W8B2, W1C3, W7C6, W5C4, 24D2, 28D4, HEK-3D6, W4A5, W3D5, W5C5, 9A3G9, 58B1, F9-3C2F1 und 39D5 produziert wird,
b) Identifizieren und/oder Isolieren der Zellen in der Probe, die die Antikörper aus Schritt a) gebunden haben.

Ferner betrifft die Erfindung auch die Antikörper, die vorliegend zu Isolierung/Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen eingesetzt werden, und die von einer der Hybridomzelllinien mit der Bezeichnung W1C3, W7C6, W5C4, HEK-3D6, W4A5, W3D5, W5C5, 9A3G9, 58B1, F9-3C2F1, 39D5 generiert werden, die bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen gemäß dem Budapester Vertrag ordnungsgemäß hinterlegt wurden.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auf diese Weise vollkommen gelöst.
Die Erfinder haben erkannt, dass es mit den neu generierten Antikörpern möglich ist, homogene MSC-Subpopulationen bspw. aus Knochenmark, und damit aus Primärgewebe, hoch-rein zu isolieren. So konnten bspw. aus einem CD271-positiven Zellpool mittels der erfindungsgemäßen Antikörper in der Doppelfluoreszenz ein Subset von CD271-positiven Zellen identifiziert werden, das ausschließlich MSC enthält. Nur die Antikörper-positive Fraktion enthielt klonogene mesenchymale Stammzellen, d.h. sie besaßen die Kapazität, CFU-F zu bilden.
Wie bereits oben erwähnt, war es bisher nicht möglich, mesenchymale Stammzellen aus Primärgeweben hoch-rein zu isolieren. Vielmehr war es – wie weiter oben erwähnt – im Stand der Technik lediglich bekannt, MSC-Zellen durch Kultur von Zellen aus Primärgewebe zu isolieren und zu identifizieren, also adhärente Zellen mit fibroblastoider Morphologie, die Oberflächenmarker wie CD73, CD105, CD166 exprimieren, und die als „multipotent mesenchymal stromal cells" bezeichnet werden.
Mit den neu generierten Antikörpern werden daher neue Werkzeuge für die Identifizierung von MSC bereitgestellt, da diese Antikörper eine Spezifität für Antigene besitzen, die zellgebundene, extrazelluläre Domänen von Plasmamembranproteinen erkennen, die hoch-selektiv auf MSC exprimiert werden. Solche Antikörper sind daher zum „Targeting" geeignet, d.h., es können lebende Zellen isoliert und anschließend kultiviert oder (Tumor-)Zellen eliminiert werden.
Diese Ergebnisse waren völlig überraschend, da bisher mesenchymale Stammzellen nicht in einer derart großen Reinheit produziert werden konnten. Mit den neuen Antikörpern kann somit eine äußerst reine MSC-Population bereitgestellt werden, die bspw. für Zell- und Gentherapien eingesetzt werden können.
Mit der neuen Verwendung ist es daher möglich, die aus dem Stand der Technik bekannten Isolierungs-/Identifizierungsmaßnahmen von mesenchymalen Stammzellen, deutlich zu verbessern, da es nur mit der erfindungsgemäßen Verwendung, bzw. den darin eingesetzten erfindungsgemäßen neuen Antikörpern möglich ist, hochreine bzw. homogene MSC-Subpopulationen zu gewinnen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann statt des jeweils angesprochenen Antikörpers auch ein Fragment des Antikörpers verwendet werden, das die gleichen Markierungseigenschaften wie der vollständige Antikörper aufweist, ohne dass dies jeweils ausdrücklich erwähnt wird. Unter "funktionelles Fragment" wird dabei jedes Fragment eines Antikörpers verstanden, das die Antigenbindungsfunktion des Antikörpers beibehält. Solche Fragmente sind bspw. F_ab, F_(ab')2, F_v und andere Fragmente wie CDR-Fragmente. Die genannten Fragmente weisen die Bindungsspezifität des Antikörpers auf und können auch bspw. mit bekannten Verfahren hergestellt werden.
Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, humanisierte Antikörper einzusetzen. Da in reinen Maus-Antikörpern der konstante Teil der Antikörper murin ist, können solche Antikörper, wenn sie bspw. beim Menschen eingesetzt werden sollen, zu Abstoßungsreaktionen durch das Immunsystem führen. Monoklonale Antikörper aus der Maus, die gegen ein humanes Antigen generiert wurden, enthalten neben der in der variabeln Region residierenden Spezifität gegen humane Antigene antigene Domänen der Maus, die das menschliche Immunsystem als fremdartig abstoßen kann. Mit Hilfe molekularbiologischer Verfahren können deshalb die murinen Teile der konstanten Abschnitte entfernt und durch baugleiche konstante Teile menschlicher Antikörper ersetzt werden. Die konstanten Abschnitte der Antikörper spielen für die spezifische Bindung des monoklonalen Antikörpers keine Rolle. Der so entstandene monoklonale Antikörper wird als „humanisierter monoklonaler Antikörper" bezeichnet und wird vom Immunsystem des Menschen nicht mehr abgestoßen. Humanisierte Antikörper werden bspw. in einer Kultur aus Hamster-Ovarialzellen hergestellt. (zur Generierung von humanisierten Antikörpern siehe bspw. Sharon et al., Nature 309: 364-367, 1984). Dem Fachmann wird vorliegend somit klar sein, dass die vorliegend erstmals beschriebenen Maus-Antikörper, durch entsprechende molekularbiologische Verfahren entsprechend für einen Einsatz beim Menschen modifiziert werden können, eben etwa durch Austausch der konstanten Regionen der Maus Antikörper durch humane konstante Regionen.
Es versteht sich, dass die erfindungsgemäßen Antikörper je nach Anwendung oder gewünschtem Einsatz im Zusammenhang mit der Detektionsmethode auch unterschiedlich markiert/konjugiert sein können, bspw. mit chemischen Reagenzien. Derartige Modifizierungen der Antikörper liegen im Gebiet und Können des Fachmanns.
In einer Ausführungsform ist bevorzugt, wenn das Primärgewebe ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Knochenmark, Fettgewebe und Plazenta. Von diesen Geweben ist bekannt, dass sie mesenchymale Stammzellen enthalten. Diese Zellen, bzw. die Zellen-enthaltende Probe, werden nach im Stand der Technik bekannten Labor-/Entnahmemethoden gewonnen.
Antikörper, die von der Hybridomzelllinie 24D2 produziert werden, sind gegen HER2 (CD340) gerichtet. Das HER2-Gen kodiert für ein Mitglied der Epidermal-Growth-Factor (EGF)-Rezeptor Familie der Rezeptortyrosinkinasen. Der durch die Hybridomzelllinie 24D2 produzierte Antikörper ist bspw. bei der Firma Santa Cruz, Californien, USA, käuflich erhältlich. Antikörper, die von der Hybridomzelllinie 28D4 produziert werden, sind gegen das Antigen CD140b gerichtet und sind bspw. bei der Firma BD Biosciences PharMingen erhältlich.
Die mit 39D5 bezeichnete Hybridomzelllinie produziert Antikörper, die gegen CD56 gerichtet sind (Leucocyte Typing V, White Cell Differentiation Antigens, Schlossman SF et al; 1993; p. 2012). Im Gegensatz zu den anderen Antikörpern mit Spezifität für CD56 erkennt 39D5 als einziger keine NK-Zellen im peripheren Blut und Knochenmark. Er reagiert daher hoch-spezifisch mit einer distinkten MSC-Subpopulation.
Die Antikörper, deren Antigene bereits identifiziert wurden, d.h. also 24D2 (CD340), 28D4 (CD140b) und 39D5 (CD56), und die zum Teil bereits käuflich erhältlich sind, sind hinsichtlich ihrer Eignung für die Isolierung/Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen, wie es hierin beschrieben wird, bisher nicht beschrieben worden. Die von den Erfindern ermittelte neue Eigenschaft ist vielmehr völlig unerwartet und bietet die Möglichkeit, bereits bekannte Antikörper für eine neue Verwendung in einem neuen Verfahren einzusetzen.
Die Eigenschaft der genannten, bereits käuflich erhältlichen Antikörper, zur Isolierung/Identifizierung von hoch-reinen mesenchymalen Stammzellen geeignet zu sein, war bisher im Stand der Technik nicht beschrieben oder bekannt.
Auch die hierin erstmals offenbarten Antikörper, bzw. diese produzierenden Hybridomzelllinien, weisen wie die zuletzt genannten Antikörper die vorteilhafte Eigenschaft auf, zur Isolierung/Identifizierung von hoch-reinen mesenchymalen Stammzellen geeignet zu sein.
Ferner ist bei weiteren Ausführungsformen bevorzugt, wenn ein Antikörper eingesetzt wird, der an das gleiche Antigen bindet wie ein von den Hybridomzelllinien W8B2, W1C3, W7C6, W5C4, 24D2, 28D4, HEK-3D6, W4A5, W3D5, W5C5, 9A3G9, 58B1, F9-3C2F1, 39D5 produzierter Antikörper.
Mit den von den Erfindern bereitgestellten Antikörpern ist es möglich, die jeweiligen Antigene auf den MSC genau zu charakterisieren und zu identifizieren, wonach es wiederum möglich ist, gezielt Antikörper gegen die so ermittelten Antigene zu generieren. Diese können dann wiederum in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Isolierung von MSC eingesetzt werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das In-Verbindung-Bringen einer Probe einer Zellsuspension, die mesenchymale Zellen enthält, dabei in Lösung vollzogen werden, wie es bspw. bei Anwendungen eines Durchflusszytometers (fluorescentactivated cell sorter (FACS)) der Fall ist.
Bei der Durchflusszytometrie werden Zellen, die mit Fluorochromen gekoppelten Antikörpern markiert sind, analysiert und einzeln sortiert. Somit kann also festgestellt werden, welcher Anteil einer Zellpopulation positiv für einen Marker ist.
Eingesetzt werden kann auch ein Verfahren zur magnetischen Zellseparation (MACS, magnetic cell sorting). Bei diesem Verfahren werden die Zellen über Antikörper separiert, an die magnetische Beads gekoppelt sind.
Die auf diese Weise identifizierten/isolierten mesenchymalen Stammzellen können dann bspw. für eine Transplantation eingesetzt werden, um die Regeneration von bspw. geschädigten Knochen, Knorpel etc., zu erreichen.
Bei einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist bevorzugt, wenn die Probe, die heterogene mesenchymale Stammzellen enthält, mit einem Antikörper in Kontakt gebracht wird, der generiert wird von Hybridomzelllinien, die ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend W8B2, W1C3, W7C6, W5C4, 24D2, 28D4, HEK-3D6, W4A5, W3D5, W5C5, 9A3G9, 58B1, F9-3C2F1, 39D5, und mit einem anti-CD271-Antikörper; in anschließend können dann solche Zellen in der Probe isoliert oder identifiziert werden, die beide Antikörper, oder Fragmente davon, gebunden haben. Der anti-CD271-Antikörper und die erfindungsgemäßen Antikörper weisen dabei vorzugsweise eine unterschiedliche Farb-/Fluoreszenzmarkierung auf. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können der ante-CD271-Antikörper sowie zumindest einer der erfindungsgemäßen neuen Antikörper dabei gleichzeitig oder hintereinander eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft ferner Hybridomzelllinien, die die Fähigkeit besitzen, derartige Antikörper zu produzieren und freizusetzen, und insbesondere die Hybridomzelllinien W1C3, W7C6, W5C4, HEK-3D6, W4A5, W3D5, W5C5, 9A3G9, 58B1, F9-3C2F1, 39D5, die bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen gemäß dem Budapester Vertrag ordnungsgemäß hinterlegt wurden.
Die Erfinder haben mit den neuen Antikörpern erstmals monoklonale Antikörper sowie diese produzierende und freisetzende Hybridomzelllinien hergestellt, die eine gezielte Erkennung von mesenchymalen Stammzellen ermöglichen. Die Antikörper stellen somit ein bisher einzigartiges Mittel für den Arzt und Forscher dar, um einerseits derartige Zellen nachzuweisen und um andererseits diese Zellen ggf. zu manipulieren, entweder durch den Antikörper selbst oder durch daran gekoppelte Reagenzien. Dabei wurden die Antikörper W1C3, W3D5, W4A5, W5C4, W5C5, W7C6 und W8B2 durch Immunisierung mit der Retinoblastomzelllinie WERI-RB-1 erhalten. Ferner wurden die Antikörper HEK-3D6 und F9-3C2F1 durch Immunisierung mit der embryonalen Nierenzelllinie HEK erhalten. Der Antikörper 58B1 wurde durch Immunisierung mit der hämatopoetischen Zelllinie UT-7 erhalten. Die Antikörper 24D2 und 28D4 wurden durch Immunisierung mit NIH-3T3-Zellen erhalten, die mit humanem HER-2 bzw. PDGF-Rezeptor-beta transfiziert wurden. Der Antikörper 9A3G9 wurde durch Immunisierung mit der Brusttumorzelllinie DU.4475 erhalten.
Die Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend einen oder mehrere der obengenannten erfindungsgemäßen Antikörper oder funktionelle Fragmente davon.
Eine derartige pharmazeutische Zusammensetzung kann neben dem einen oder mehreren Antikörpern weitere geeignete Substanzen enthalten, wie bspw. Verdünnungsmittel, Lösungsmittel, Stabilisatoren usw. Hierzu zählen bspw. physiologische Kochsalzlösungen, Wasser, Alkohole, und weitere geeignete Substanzen, die bspw. in A. Kibble, "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3. Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press, zu finden sind.
Die Erfindung betrifft ferner ein Kit, das zumindest einen der neuen Antikörper enthält, sowie ein Kit, das neben zumindest einem der erfindungsgemäßen neuen Antikörpern ein anti-CD271-Antikörper aufweist.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen homogenen mesenchymalen Stammzellen zur Herstellung eines Arzneimittels für die Gen- oder Zelltherapie.
Die gemäß dem erfindungemäßen Verfahren gewonnenen homogenen mesenchymalen Stammzellen können vorteilhafterweise als Zelltherapeutika eingesetzt werden. Die Zellen sollen dabei defektes oder degeneriertes Gewebe oder Zellen eines Patienten, wie bspw. degeneriertes Knochen- oder Knorpelgewebe, ersetzen. Nach deren Einbringen und durch ggf. Verabreichung von weiteren Differenzierungsfaktoren differenzieren die mesenchymalen Stammzellen in vivo in die Zelltypen, die sie zu ersetzen sollen. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierten mesenchymalen Stammzellen können dabei entweder direkt implantiert/verabreicht werden oder aber auf entsprechende Implantate aufgebracht werden, wo sie auch vor der Implantation durch Zugabe von entsprechenden Faktoren in die gewünschten Zellen differenzieren.
Auf diese Weise kann vorteilhaft bspw. degeneriertes Knochen- oder Knorpelgewebe regeneriert werden.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen homogenen mesenchymalen Stammzellen zur in vitro Herstellung von Osteoblasten, Chondrozyten, Adipozyten oder Fibroblasten.
Bei dieser Verwendung werden die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen mesenchymalen Stammzellen vor deren Einbringung in einen Patienten in den gewünschten Zelltypus differenziert.
Die isolierten mesenchymalen Stammzellen können dabei entweder aus dem Patienten isoliert werden, der entsprechend behandelt werden soll, oder aber aus einem anderen Spender.
Weitere Vorteile ergeben sich aus den beigefügten Figuren und der Beschreibung.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nach-stehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in Alleinstellung oder in anderen Kombinationen verwendet werden können, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Ausführungsbeispiele sind in der beigefügten Zeichnung dargestellt und werden in der Beschreibung näher erläutert. Es zeigen:
1 FACS-Analysen von Knochenmarkszellen, die mit CD271-APC (Miltenyi Biotech, Deutschland) und mit den durch die Hybridomzelllinien 28D4, W8B2, W1C3, W7C6, 24D2, HEK-3D6, W5C5, 39D5, (1a) und 9A3G9, 58B1, F9-3C2F1, W3D5, W4A5 oder W5C4 (1b) produzierten Antikörpern (indirekte Markierung mit anti-Maus-Phycoerythrin) markiert wurden. Nur die Antikörper-positive Fraktion (gleichzeitig positiv für CD271) enthält MSC mit CFU-F-Kapazität;
2 Säulendiagramme, die die CFU-F Aktivität von sortierten CD271+W8B2±, CD271+CD140b±, CD271+HEK3D6± (2a) und CD271+CD56± (2b) Knochenmarkszellen zeigen;
3 Zytospinpräparat von CD271+W8B2+ sortierten MSC aus Knochenmark. Nach Präparation wurden die Zellen mit May-Grünwald-Giemsa-Lösung gefärbt;
4a mikroskopische Aufnahmen von CD271-positiven und W8B2-positiven/-negativen Knochenmarkszellen; und
4b mikroskopische Aufnahmen von CD271-positiven und CD140b-positiven/-negativen Knochenmarkszellen.
Beispiel
Material und Methoden
Knochenmark-mononukleäre (BM-MNC) Zellen wurden aus dem Femurschaft von Patienten gewonnen, die eine neue Hüfte erhielten. Es wurden ca. 25 ml Knochenmarkzellen gesammelt und mit 5000 U Heparin (Sigma-Aldrich) gemischt. Mononucleäre Zellen wurden durch Ficoll Histopac Dichtegradientenfraktionierung gewonnen (750 × g, 20 min, bei Raumtemperatur) und die noch verbliebenen Erythrocyten in einer Ammoniumchloridlösung für 10 min bei 4 °C lysiert.
Für die fluorometrischen Analysen wurden monoklonale Antikörper oder Antikörper-Konjugate eingesetzt, die von den folgenden Hybridomzelllinien produziert werden: W8B2, W1C3, W7C6, W5C4, 24D2, 28D4, HEK-3D6, W4A5, W3D5, W5C5, 9A3G9, 58B1, F9-3C2F1, 39D5. Die Hybridomzelllinie 24D2 produziert Antikörper, die gegen HER-2 (CD340) gerichtet sind, die Hybridomzelllinie 28D4 Antikörper, die gegen CD140b gerichtet sind, und die Hybridomzelllinie 39D5 Antikörper, die gegen CD56 gerichtet sind. Die Antikörper-produzierenden Hybridomzelllinien W1C3, W3D5 (=W3D5A9), W4A5, W5C4 (=W5C4W5), W5C5, W7C6 und W8B2 (=W8B2B10) wurden durch Immunisierung mit der Retinoblastomzelllinie WERI-RB-1 erhalten. Die Hybridomzelllinien HEK-3D6 und F9-3C2F1 wurden durch Immunisierung mit der embryonalen Nierenzelllinie HEK erhalten. Die Hybridomzelllinie 58B1 (=58B1A2) wurde durch Immunisierung mit der hämatopoetischen Zelllinie UT-7 erhalten. Die Hybridomzelllinien 24D2 und 28D4 wurden durch Immunisierung mit NIH-3T3-Zellen erhalten, die mit humanem HER-2 bzw. PDGF-Rezeptor-beta transfiziert wurden. Die Hybridomzelllinie 9A3G9 wurde durch Immunisierung mit der Brusttumorzelllinie DU.4475 erhalten.
Als weiterer Antikörper mit bekannter Spezifität wurde CD271-(LNGFR)-APC eingesetzt, das als APC-Konjugat im Kit mit Anti-APC MicroBeads von Miltenyi Biotech, Berglisch-Gladbach, Deutschland erhältlich ist.
Für die Charakterisierung und Isolierung von MSC wurden Knochenmarkzellen zunächst mit den von den Hybridomzelllinien W8B2, W1C3, W7C6, W5C4, 24D2, 28D4, HEK-3D6, W4A5, W3D5, W5C5, 9A3G9, 58B1, F9-3C2F1, 39D5 produzierten Antikörpern inkubiert und anschließend mit einem Kaninchen-anti-Maus-Antikörper, der mit PE gekoppelt war, markiert. Danach wurden die Zellen mit einem Überschuss an Maus IgG inkubiert (zur Sättigung freier Valenzen) und schließlich mit einem CD271-APC-Konjugat gegengefärbt. Nach der Färbung wurden die Zellen im FACS analysiert oder fraktioniert.
Nach Färbung wurden die Zellen im FACSCanto Durchflusszytometer (Becton Dickinson) analysiert und ausgewertet. In 1 sind jeweiligen Plots (CD271-APC versus Testantikörper-PE) wiedergegeben. Die Antikörper-positiven Zellen wurden dann isoliert und die CFU-F-Kapazität bestimmt. Wie den Plots aus 1 zu entnehmen ist, konnten aus den CD271-positiven mesenchymalen Stammzellen Subpopulationen isoliert bzw. identifiziert werden, die auch hinsichtlich des jeweils verwendeten Antikörpers positiv waren. Von diesen Subpopulationen konnte in anschließenden Assays gezeigt werden, dass die klonogene CFU-F-Aktivität jeweils in der Antikörper-positiven Fraktion zu finden war, während die Antikörper-negative, CD271-positive Fraktion entweder negativ war oder nur wenige CFU-F enthielt.
Zur Durchführung dieses Assays wurden die in den vorherigen Schritten isolierten Zellen in T-25 Flaschen unter Bedingungen mit Serum+Gelatine–, Serum+Gelatine+, Serum–Gelatine– oder Serum–Gelatine+ kultiviert. Nach 14 Tagen Kultur wurden die adhärierenden Zellen zweimal mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS) gewaschen, mit Methanol fixiert (5 min. bei Raumtemperatur) und anschließend luftgetrocknet. Um die MSC CFU-F sichtbar zu machen und auszuzählen, wurden die Zellen Giemsagefärbt (Giemsa-Lösung 1:20 mit entionisiertem Wasser verdünnt; 5 min bei Raumtemperatur), zweimal mit entionisiertem Wasser gewaschen und luftgetrocknet. CFU-F Kolonien wiesen typischerweise eine Durchmesser zwischen 1 bis 8 mm auf und wurden makroskopisch ausgewertet.
Darüber hinaus besteht auch die Möglichkeit, die Zellen alternativ zu differenzieren, bspw. in Adipozyten, Chondrozyten oder Osteoblasten. Hier kann ebenfalls entsprechend den Vorgaben des Herstellers (bspw. Miltenyi Biotech) vorgegangen werden. Für die Differenzierung der MSC in Adipozyten und Osteoblasten wurden die Zellen in Gegenwart von entweder NK AdipoDiff Medium oder NK OsteoDiff Medium (jeweils von Miltenyi Biotech) nach Herstellerangaben kultiviert. Hierzu wurden die MSC (12 × 10⁴ Zellen für die Adipogenese; 4,5 × 10⁴ Zellen für die Osteogenese) in 1,5 ml des geeigenten Mediums resuspendiert und auf 6-well Platten (Falcon, Heiderlberg, Deutschland) überführt. Das Medium wurde alle drei Tage erneuert. Die Adipocyten-Bildung wurde an Tag 18 der Kultivierung durch Fixierung der Zellen mit Methanol über 5 min. bei –20 °C und durch nachfolgende Färbung der intrazellulären Lipide mit Oil Red O Farbstoff (Sigma-Aldrich) über 30 min bei Raumtemperatur evaluiert. Die Bildung der osteogenetischen Zellen wurde an Tag 10 der Kultivierung durch Anfärben der Alkalischen-Phosphatase-Aktivität methanol-fixierter Zellen (-20 °C, 5 min.) mit 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat/Nitroblau-Tetrazolium (FAST^TM BCIP/NBT Substrat; Sigma-Aldrich) für 10 min bei Raumtemperatur analysiert.
In 2 sind die Ergebnisse des CFU-F Assays der sortierten Populationen gezeigt. Wie 2a zu entnehmen ist (hier wurden 5000 Zellen ausgewertet), enthalten weder CD271+CD140b– Zellen eine signifikante CFU-F Aktivität noch CD271+W8B2-Zellen. Im Gegensatz dazu enthalten CD271+CD140b+, CD271+HEK-3D6+ und CD271+W8B2+ Zellen eine stark angereicherte CFU-F Aktivität verglichen zu unseparierten Zellen. Ca. jede 50. –100. Zelle in den positiven Fraktionen war eine MSC mit CFU-F Kapazität. 2b ist zu entnehmen (hier wurden 500 Zellen ausgewertet), dass die CFU-F Kapazität in der CD271+CD56+ Fraktion deutlich höher ist als in der CD271+CD56– Fraktion. In der doppelt-positiven Fraktion ist jede 10. Zelle eine CFU-F.
Wie 2 zu entnehmen ist, weisen CD271-positive, aber CD140b-negative Zellen keine oder nur nicht-signifikante CFU-F Aktivität auf, ebenso wie CD271-positive, W8B2-negative Zellen. Auf der anderen Seite weisen CD271-positive und CD140b- /bzw. W8B2-positive Zellen eine CFU-F Aktivität auf, was sie als „echte" mesenchymale Stammzellen auszeichnet.
3 zeigt nach Wissen der Erfinder erstmalig in der Literatur die Morphologie sortierter MSC aus Knochenmark. MSC zeichnen sich demnach durch einen relativ hohen Zytoplasmateil aus, in dem zusätzlich noch Lipidtropfen lokalisiert zu sein scheinen. Die Aufnahmen wurden mit einem Zeiss-Axiovert-Mikroskop unter Verwendung der Axiovision Software durchgeführt und ausgewertet. Vergrößerung: 100 fach.
In 4a und 4b sind vergrößerte Aufnahmen von sortierten Zellen gezeigt, die nach 10 Tagen in vitro Differenzierung erhalten wurden. Die Zellen waren nach Sortierung in beiden Figuren jeweils CD271-positiv. 4a zeigt in der linken Abbildung Zellen, die zusätzlich über W8B2 isoliert wurden, und demnach das entsprechende Antigen exprimieren. Wie aus den Abbildungen ersichtlich, konnten MSC nur aus Zellen der doppelt-positiven Fraktion (CD271+W8B2+), nicht jedoch aus der CD271+W8B2– Fraktion in Kultur generiert werden. 4b zeigt wie 4a ein analoges Wachstumsverhalten für Zellen der CD271+CD140b+ Fraktion.

Claims

Verwendung von Antikörpern oder funktionellen Fragmenten davon, die von Hybridomzelllinien produziert werden, die ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend, W8B2, W1C3, W7C6, W5C4, 24D2, 28D4, HEK-3D6, W4A5, W3D5, W5C5, 9A3G9, 58B1, F9-3C2F1, 39D5, zur Isolierung und/oder Identifizierung von homogenen mesenchymalen Stammzellen aus Primärgeweben.
Verwendung von Antikörpern oder funktionellen Fragmenten davon zur Isolierung und/oder Identifizierung von homogenen mesenchymalen Stammzellen aus Primärgeweben, dadurch gekennzeichnet, dass ein Antikörper eingesetzt wird, der an das gleiche Antigen bindet wie ein von den Hybridomzelllinien W8B2, W1C3, W7C6, W5C4, 24D2, 28D4, HEK-3D6, W4A5, W3D5, W5C5, 9A3G9, 58B1, F9-3C2F1, 39D5 produzierter Antikörper.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Primärgewebe ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend, Knochenmark, Plazenta, Fettgewebe.
Verfahren zur Isolierung und/oder Identifizierung von homogenen mesenchymalen Stammzellen aus Primärgewebe, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgende Schritte aufweist: a) In-Verbindung-Bringen einer Probe einer aus Primärgewebe gewonnenen Zellsuspension, die mesenchymale Stammzellen aufweist, mit einem Antikörper oder funktionellen Fragmenten davon, der produziert wird von Hybridomzelllinien, die ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend W8B2, W1C3, W7C6, W5C4, 24D2, 28D4, HEK-3D6, W4A5, W3D5, W5C5, 9A3G9, 58B1, F9-3C2F1, 39D5, und; b) Identifizieren und/oder Isolieren solcher Zellen in der Probe, an die ein Antikörper aus Schritt a), oder Fragmente davon, gebunden haben.
Verfahren zur Isolierung und/oder Identifizierung von homogenen mesenchymalen Stammzellen aus Primärgewebe, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgende Schritte aufweist: a) In-Verbindung-Bringen einer Probe einer aus Primärgewebe gewonnenen Zellsuspension, die mesenchymale Stammzellen aufweist, mit einem anti-CD271-Antikörper; b) In Verbindung-Bringen der Probe aus Schritt a) mit einem Antikörper oder funktionellen Fragmenten davon, der generiert wird von Hybridomzelllinien, die ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend W8B2, W1C3, W7C6, W5C4, 24D2, 28D4, HEK-3D6, W4A5, W3D5, W5C5, 9A3G9, 58B1, F9-3C2F1, 39D5; und c) Identifizieren und/oder Isolieren solcher Zellen in der Probe, an die der Antikörper aus Schritt a) und ein Antikörper aus Schritt b) oder funktionelle Fragmente davon gebunden haben.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte a) und b) gleichzeitig, hintereinander oder in umgekehrter Reihenfolge durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Primärgewebe ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Knochenmark, Plazenta, Fettgewebe.
Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend einen Antikörper oder funktionelle Fragmente davon, der von einer Hybridomzelllinie generiert wird, die ausgewählt ist aus Gruppe umfassend W1C3, W7C6, W5C4, 24D2, 28D4, HEK-3D6, W4A5, W3D5, W5C5, 9A3G9, 58B1, F9-3C2F1, 39D5.
Kit, enthaltend zumindest einen Antikörper oder funktionelle Fragmente davon, der von einer Hybridomzelllinie generiert wird, die ausgewählt ist aus Gruppe umfassend W1C3, W7C6, W5C4, 24D2, 28D4, HEK-3D6, W4A5, W3D5, W5C5, 9A3G9, 58B1, F9-3C2F1, 39D5.
Kit nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Kit ferner einen anti-CD271-Antikörper aufweist.
Verwendung der nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 7 gewonnenen homogenen mesenchymalen Stammzellen zur Herstellung eines Arzneimittels für die Gen- oder Zelltherapie.
Verwendung nach Anspruch 11, zur Behandlung von degeneriertem Knochen- oder Knorpelgewebe.
Verwendung der nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 7 gewonnenen homogenen mesenchymalen Stammzellen zur in vitro Herstellung von Osteoblasten, Chondrozyten, Adipozyten oder Fibroblasten.