DE4407242A1

DE4407242A1 - Fibroblasten-spezifisches Antigen, seine Verwendung zur Gewinnung von Antikörpern und Testkits, die solche Antikörper enthalten

Info

Publication number: DE4407242A1
Application number: DE19944407242
Authority: DE
Inventors: Konrad Prof Dr Med Herrmann; Anja Dipl Biol Saalbach
Original assignee: HERRMANN KONRAD PROF DR MED HA
Current assignee: Dianova Gesellschaft fur Biochemische immunol De
Priority date: 1994-03-04
Filing date: 1994-03-04
Publication date: 1995-09-14
Anticipated expiration: 2014-03-05
Also published as: DE4407242C2

Description

Die Erfindung betrifft ein Fibroblasten-spezifisches Antigen, Antikörper, und zwar insbesondere monoklonale Antikörper, die gegen ein solches Antigen gerichtet sind, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung, insbesondere in Testkits.

Bindegewebe ist ein morphologischer Sammelbegriff für funk tionell sehr verschiedene, nicht homogene Gewebearten, die insbesondere Speicher-, Stütz-, Schutz- und Hüllfunktionen aufweisen. Der zelluläre Bestandteil des Bindegewebes setzt sich im wesentlichen aus Fibroblasten zusammen, die sich entsprechend der Gewebespezifität bzw. besonderer Aktivie rungsbedingungen ausdifferenzieren können. Da dieser Zelltyp an einer Vielzahl von physiologisch und pathophysiologisch bedeutsamen Regulationsvorgängen beteiligt ist, ist es wichtig, ihn zweifelsfrei identifizieren zu können. Da auch andere Zelltypen unter bestimmten Bedingungen einen Fibroblasten-ähnlichen Phänotyp annehmen können, ist eine morphologische Typisierung zwecks Identifikation nicht aussagekräftig. Eine einfache reproduzierbare Methode hierfür ist die Verwendung von spezifischen Antikörpern, beispiels weise im histologischen Schnitt oder auch in Zellkulturen.

Die Erfindung hat daher zum Ziel, ein Antigen bereitzu stellen, das für Fibroblasten spezifisch ist und das insbe sondere auch in ausdifferenzierten Fibroblastenzellen unab hängig vom Gewebstyp auftritt.

Die Erfindung hat weiterhin zum Ziel, Antikörper bereit zustellen, die spezifisch mit Fibroblasten reagieren und gleichzeitig andere Zelltypen diskriminieren.

Das erfindungsgemäße Fibroblasten-spezifische Antigen ist dadurch erhältlich, daß man humane dermale Fibroblasten bis zur Konfluenz in einer Monoschicht kultiviert, mit Trypsin ablöst, mit einem Detergenz, vorzugsweise einem nichtiono genen Tensid, gegebenenfalls zusammen mit einem Trypsin inhibitor, wie beispielsweise Phenylmethansulfonylchlorid, inhibiert und dann die so erhaltene Lösung mit Antikörpern abtrennt, die mit der Hybridoma-Zellinie DSM ACC 2164 erhalten werden. In einer bevorzugten Ausführungsform hat es sich als zweckmäßig erwiesen, den zuvor beschriebenen Proteinextrakt zuerst mittels gelchromatographischen Verfah ren aufzutrennen. Dabei werden die das Antigen enthaltenden Fraktionen, insbesondere die ca. 63 kDa enthaltende Fraktion, dann mit den zuvor genannten Antikörpern in Kontakt gebracht und so auf an sich bekannte Weise isoliert.

Für das Ablösen der in Kultur gezüchteten Fibroblasten wird vorzugsweise eine 0,01 bis 0,1 Gew.-% Trypsinlösung verwen det. Zweckmäßigerweise enthält die zum Ablösen der Zellen verwendete Lösung zusätzlich 0,001 bis 0,1 Gew.-% EDTA. Zum Solubilisieren des an die Membran gebundenen Antigens wird zweckmäßigerweise ein Detergenz verwendet, welches gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ein nichtionogenes Tensid, wie beispielsweise Triton® X 100 (erhältlich von Rohm und Haas), ist. Unerwünschte Membranteile, die von der Membran mit dem gewünschten Antigen mit abgelöst werden, können zweckmäßigerweise mittels Gelchromatographie entfernt werden. Hierzu können beliebige dem Fachmann bekannte Chromato graphieverfahren verwendet werden. Erfindungsgemäß hat es sich jedoch als zweckmäßig erwiesen, als Chromatographie material Sepharose 4B zu verwenden. Mit einer solchen chromatographischen Auftrennung lassen sich ohne weiteres diejenigen Fraktionen abtrennen, welches das 63 kDa große Antigen enthalten. Das Antigen wird dann vorzugsweise mit einer Ammoniumsulfatfällung weiter aufgereinigt. Dabei fällt es bei Ammoniumsulfatkonzentrationen von 60 bis 80%, insbe sondere von 65 bis 75% und üblicherweise bei etwa 70% aus. Besonders reine Antigene lassen sich dadurch erhalten, daß man das solubilisierte erfindungsgemäße Antigen mit einem Antikörper reagieren läßt, der aus der Hybridoma-Zellinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC 2164 erhältlich ist. Dabei ist es sowohl möglich, das Antigen mittels einem immobili sierten, auf einen Träger aufgebrachten Antikörper selektiv aus einer Lösung herauszufischen, wie z. B. durch Aufgabe der Lösung auf eine Chromatographiesäule, als auch das Antigen durch Zugabe des Antikörpers aus der Lösung auszufällen, gegebenenfalls auch unter Zuhilfenahme von gegen den F_c-Teil gerichteten Antikörpern.

In einem besonders bevorzugten Verfahren wird das erfindungsgemäße spezifische Fibroblasten-Antigen mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers isoliert, der aus der o. g. Hybridoma-Zellinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC 2164 erhältlich ist. Hierbei werden die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper an Ziege-anti-Maus-Antikörper gebun den, die an Magnetpartikel gekoppelt sind (Dynabeads M-450, Fa. DYNAL, Oslo, Norwegen). Das Antigen enthaltende Prote ingemisch wird präpariert wie zuvor beschrieben. Zur Isolierung wird das Proteingemisch bei Raumtemperatur mit dem monoklonalen Antikörper-Magnetpartikel-Komplex unter leichtem Schütteln inkubiert und dann mittels dem Magneten immobili siert. Alle nicht spezifisch gebundenen Proteine werden durch mehrmaliges Waschen mit PBS entfernt. Das gebundene Antigen wird mittels eines Elutionspuffers (MAbTrap GII; Pharmacia) vom Antikörper eluiert und anschließend neutralisiert. Das so über Affinitätschromatographie gewonnene Antigen zeigt gleichfalls im Western blot eine einheitliche Proteinbande von ca. 63 kDa und entspricht dem Fibroblastenoberflächen antigen, gegen welches die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper gerichtet sind.

Die Erfindung betrifft auch monoklonale Antikörper, die mit den erfindungsgemäßen Hybridoma-Zellinien mit der Hinterle gungsnummer DSM ACC 2164 erhältlich sind.

Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper bindet spezifisch und diskriminiert sämtliche später aufgeführten Zelltypen. Auf diese Weise ist es möglich, Fibroblasten sowie von ihnen abgeleitete Differenzierungsstadien mesenchymaler Zellen nachzuweisen.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des erfindungs gemäßen Antigens zur Herstellung von Fibroblasten-spezifi schen Antikörpern, und zwar sowohl von monoklonalen als auch von polyklonalen Antikörpern, auf an sich bekannte Weise. Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird derart vorge gangen, daß man mittels dem Fachmann bekannten Methoden mit einem Antigengemisch immunisiert, das dadurch erhältlich ist, daß man kultivierte humane dermale Fibroblasten nach konflu entem Auswachsen mittels Kollagenase von ihrer Unterlage (Zellkulturflasche) ablöst und die dadurch erhaltene Zellsus pension dreimal mit PBS serumfrei wäscht. Die dadurch erhaltene Zellsuspension wird mit einem Detergenz, und zwar vorzugsweise mit einem nichtionischen Detergenz, wie Triton® X 100, inkubiert, um Membranproteine zu solubili sieren. Nach Zentrifugation wird das Zellpellet verworfen und der Überstand, in dem sich neben anderen Antigenen auch das erfindungsgemäße Antigen befindet, über eine Gelfiltrations chromatographie aufgetrennt. Mit einer Fraktion von einem Molekulargewichtsbereich zwischen 30-100 kDa werden in einer für den Fachmann bekannten Art und Weise Balb c-Mäuse immunisiert. Ausgehend von dieser beschriebenen Primärimmuni sierung mit oben beschriebenen Antigengemisch wird in einer bekannten Methode nach Köhler und Milstein [Nature 256 (1975) 495-497; Naturwissenschaften 77 (1990); Nature 349 (1991) 293-299] eine Zellfusion mit den Antikörper produzierenden Mauslymphozyten, wie beispielsweise einer Zellinie X63-Ag 8.653, durchgeführt. Die dadurch erhaltenen Hybridoma zellinien produzieren die erfindungsgemäßen Fibroblasten spezifischen monoklonalen Antikörper.

Derartige Antikörper reagieren mit humanen Fibroblasten sowohl in Kultur als auch in humanen histologischen Schnitten von beispielsweise der Haut, Plazenta, Niere, Tonsillen, der quergestreiften Muskulatur, Pankreas Nabelschnur, etc. Mittels Flow-Cytometrie konnte gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen Antikörper an 100% der Fibroblasten binden. Auf die gleiche Weise wurde nachgewiesen, daß diese Antikör per nicht an Blutzellen wie Lymphozyten, Granulozyten, Monozyten und Thrombozyten binden. Weiter wurde gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Fibroblasten-spezifischen Antikörper sowohl im immunhistologischen Test als auch mittels Flow- Cytometrie nicht an humane mikrovaskuläre und makrovaskuläre Endothelzellen, und auch nicht an Keratinozyten binden.

Mit den erfindungsgemäßen Antikörpern ist es möglich, Fibro blasten bzw. Fibroblasten-Subpopulationen in Kultur zu charakterisieren. Auf diese Weise ist es möglich, Fibro blasten von anderen Zelltypen zweifelsfrei zu unterscheiden. Darüber hinaus können auch spezielle Aktivierungs- und/oder Funktionszustände von Fibroblasten erkannt werden. Mit den erfindungsgemäßen Antikörpern kann auch der Ursprung von Tumoren nachgewiesen werden. Gegebenenfalls sind sie auch als Prognosemarker bei mesenchymalen Tumoren verwendbar. Auch in der Histologie können sie als einziger spezifischer Marker für Fibroblasten, sowie in der Embryologie zur Untersuchung und zum Nachweis der Abstammung mesenchymaler Zellen und Gewebe, beispielsweise bei der Organentwicklung während der Embryogenese, verwendet werden.

Die erfindungsgemäßen Antikörper eignen sich auch zur zellulären Charakterisierung von Bindegewebsfibrosen und Fibroblasien, insbesondere von Haut, Lunge und Leber, bei Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes, des Herzens, der Niere, Pankreas sowie des Nervensystems, aber auch als ein möglicher Marker zur Beurteilung der Aktivität der Rheumatoiden Arthritis, und zwar insbesondere bei der histo logischen Diagnostik der Synovialmembran. Auch der Nachweis von häufig auftretenden Kontaminationen durch Fibroblasten in anderen Zellkulturen ist mit den erfindungsgemäßen Antikör pern aufgrund ihrer hohen Spezifität ohne weiteres möglich. Schließlich eignen sich diese Antikörper auch zur quantita tiven Einschätzung von spezifischen Zell-Zell- und Zell-Ma trix-Interaktionen und zur Überprüfung und zum Nachweis von Differenzierungsstadien bei Zellen mesenchymalen Ursprungs, wie Chondrozyten, Endothelzellen und Fibroblasten.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Gewinnung des Fibroblasten-Antigens, welches durch die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper erkannt wird.

Die Erfindung soll anhand der folgenden Beispiele näher erläutert werden.

Beispiel 1

Humane dermale Fibroblasten wurden bis zur Konfluenz in einer Monoschicht kultiviert. Die Zellen wurden dann mit einer 0.05%igen Trypsin-/0.02%igen EDTA-Lösung abgelöst und suspendiert. Nach dreimaligen Waschen der so suspendierten Fibroblasten mit eiskaltem PBS wurde bei 4°C mit 900 UpM zentrifugiert. Das Zellpellet wurde mit 0.5% Triton® X 100 und 1 mmol Phenylmethansulfonylfluorid (PMFS) in PBS-Puffer unter leichtem Schütteln auf Eis 30 Minuten lang inkubiert (Konzentration 10⁷ Fibroblasten pro 100 ml Puffer). Danach wurde nochmals bei 4°C und 14 000 UpM 5 Minuten zentrifu giert, um die durch das Detergenz Triton® X 100 herausge lösten Membranproteine vom restlichen Zellpellet zu trennen. Der Überstand wurde auf einer Sepharose 4B-Säule chromato graphiert, und mit einer 70%igen Ammoniumsulfatfällung wurde das Protein konzentriert. Das so angereicherte Antigen wurde auf einem SDS-Gel (Sammelgel 5%, Trenngel 10%) mittels Elektrophorese aufgetrennt. Nach einem Elektroblotting (Laufpuffer ohne SDS plus 20% Methanol) auf Nitrozellulose wurden noch freie Bindungsstellen mit 5% Magermilchpulver bei 37°C für 2 Stunden blockiert. Das Antigen läßt sich auf dem so behandelten Filter durch Inkubation über Nacht bei 4°C mit den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern in einer Sandwich-Technik mit einem Ziege-anti-Maus-POD-markierten Antikörper mittels der bekannten Farbreaktion durch DAB plus H₂O₂ (10 mg/10 ml PBS + 50 µl 30%iges H₂O₂ ) als eine einheit liche Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 63 kDa nachweisen [Abb. 1]. Durch Weglassen von Mercaptoethanol in der Elektrophorese (nicht reduzierende Bedingungen) ändert sich weder das Laufverhalten noch das Molekulargewicht des Antigens.

Beispiel 2

Mit einem wie oben erfindungsgemäß beschriebenen monoklonalen Antikörper wurden die folgenden Versuche durchgeführt:

1. Flow-Cytometrie kultivierter humaner dermaler Fibroblasten

Kultivierte dermale Fibroblasten (1×10⁵ Zellen) wurden mit 50 µl des Fibroblasten-spezifischen Antikörpers (DSM ACC 2164) bei 4°C für 45 min inkubiert und anschließend flowcyto metrisch analysiert. Es wurde gefunden, daß der Antikörper an alle vitalen Fibroblasten bindet. Die Fluoreszenzintensität der gebundenen Antikörper entspricht der von anti-CD 44 (HCAM) erhaltenen auf Fibroblasten.

2. Flow-Cytometrie kultivierter humaner Keratinozyten

Humane Keratinozyten (1×10⁵ Zellen) wurden mit 50 µl des Fibroblasten-spezifischen Antikörpers bei 4°C für 45 min inkubiert und anschließend flowcytometrisch analysiert. Keine der eingesetzten Zellen wurde von den Antikörpern markiert.

3. Flow-Cytometrie kultivierter humaner makrovaskulärer Endothelzellen

Humane makrovaskuläre Endothelzellen (1×10⁵ Zellen) wurden mit 50 µl des Fibroblasten-spezifischen Antikörpers bei 4°C für 45 min inkubiert und anschließend flowcyto metrisch analysiert. Keine der eingesetzten Zellen wurde von den Antikörpern markiert.

4. Flow-Cytometrie kultivierter humaner mikrovaskulärer Endothelzellen

Humane mikrovaskuläre Endothelzellen (1×10⁵ Zellen) wurden mit 50 µl des Fibroblasten-spezifischen Antikörpers bei 4°C für 45 min inkubiert und anschließend flowcyto metrisch analysiert. Keine der eingesetzten Zellen wurde von den Antikörpern markiert.

5. Flow-Cytometrie humaner Granulozyten

Humane Granulozyten (1×10⁵ Zellen) wurden mit 50 µl des Fibroblasten-spezifischen Antikörpers bei 4°C für 45 min inkubiert und anschließend flowcytometrisch analysiert. Keine der eingesetzten Zellen wurde von den Antikörpern markiert.

6. Flow-Cytometrie humaner Lymphozyten

Humane Lymphozyten (1×10⁵ Zellen) wurden mit 50 µl des Fibroblasten-spezifischen Antikörpers bei 4°C für 45 min inkubiert und anschließend flowcytometrisch analysiert. Keine der eingesetzten Zellen wurde von den Antikörpern markiert.

7. Flow-Cytometrie humaner Monozyten

Humane Monozyten (1×10⁵ Zellen) wurden mit 50 µl des Fibroblasten-spezifischen Antikörpers bei 4°C für 45 min inkubiert und anschließend flowcytometrisch analysiert. Keine der eingesetzten Zellen wurde von den Antikörpern markiert.

8. Flow-Cytometrie humaner Thrombozyten

Humane Thrombozyten (1×10⁵ Zellen) wurden mit 50 µl des Fibroblasten-spezifischen Antikörpers bei 4°C für 45 min inkubiert und anschließend flowcytometrisch analysiert. Keine der eingesetzten Zellen wurde von den Antikörpern markiert.

9. Immunhistologie humaner Haut (Avidin-Biotin-Technik)

Kryostatschnitte von humaner Haut wurden entsprechend eines bekannten Protokolls (LSAB-Kit, Fa. DAKO, Carpinteria, CA, USA) mit 100 µl des Fibroblasten-spezifischen Antikörpers bei 4°C für 12 Stunden inkubiert. Im histologischen Schnitt färben sich nur die Fibroblasten der Dermis an. Komponenten der Epidermis werden durch den Antikörper nicht erkannt.

Gleichfalls negativ stellen sich alle Hautanhangsgebilde wie Haarfollikel, Talgdrüsen und Schweißdrüsen, aber auch Endothelzellen dar.

10. Immunhistologie humaner Tonsille (Avidin-Biotin-Technik)

Kryostatschnitte von humaner Tonsille werden entsprechend eines bekannten Protokolls (LSAB-Kit, Fa. DAKO, Carpinteria, CA, USA) mit 100 µl des Fibroblasten-spezifischen Antikörpers bei 4°C für 12 Stunden inkubiert. Im histologischen Schnitt färben sich nur die Fibroblasten des Bindegewebes der Gefäße und der Kapsel an, während die Follikel gänzlich negativ sind.

11. Immunhistologie humaner Niere (Avidin-Biotin-Technik)

Im Nierenschnitt erscheinen das Parenchym und die Tubuluszellen weitgehend negativ, bis auf einige Fibroblasten der bindegewebigen Septen. Die Glomeruli sind in ihrem Gefäßkonvulat deutlich granulär positiv, ein Befund, der nahelegt, daß möglicherweise die Mesangiumzellen, die mesenchymalen Ursprungs sind, dieses vom Antikörper erkannte Antigen exprimiert haben.

Claims

1. Fibroblasten-spezifisches Antigen, dadurch erhält lich, daß man

- humane dermale Fibroblasten bis zur Konfluenz in einer Monoschicht kultiviert, mit Trypsin ablöst, mit einem Detergenz inkubiert und mittels Gelchromatographie auftrennt, die Antigen enthaltenden Fraktionen vereinigt und die 63 kDa enthaltende Fraktion mit einem aus der Hybridomazellinie DSM ACC 2164 erhaltenen Antikörper abtrennt.

2. Antigen nach Anspruch 1, dadurch erhältlich, daß man die Fibroblasten mit einer Lösung, die 0,01-0,1 Gew.-% Trypsin enthält, ablöst und mit eiskaltem PBS wäscht und abzentrifugiert.

3. Antigen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich net, daß man die Fibroblasten mit einer Lösung ablöst, die 0,001-0,1 Gew.-% EDTA enthält.

4. Antigen nach Anspruch 1, dadurch erhältlich, daß man als Detergenz 0,01-0,1%-iges Triton® X 100 verwendet.

5. Antigen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Gelchromatographie auf einer Sepharose 4B-Säule durchführt.

6. Antigen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch erhältlich, daß man es einer fraktionierten Ammoni umsulfat-Fällung unterzieht.

7. Antigen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch erhältlich, daß man das ausgefällte Antigen mittels SDS-Elektrophorese auftrennt und noch freie Bindungsstellen mit Magermilchpulver abblockt.

8. Verwendung eines Antigens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Gewinnung von mono- und/oder polyklonalen Anti- Fibroblasten-spezifischen Antikörpern.

9. Hybridoma-Zellinie mit der Hinterlegungsnr. DSM ACC 2164.

10. Anti-Fibroblasten-spezifischer Antikörper, erhält lich nach Anspruch 8.

11. Anti-Fibroblasten-spezifischer Antikörper, erhält lich aus der Hybridoma-Zellinie mit der Hinterlegungsnr. DSM ACC 2164.

12. Immunologischer Testkit, enthaltend zumindest einen Antikörper nach einem der Ansprüche 10 und/oder 11.

13. Immunologischer Testkit nach Anspruch 12, zur Cha rakterisierung von Fibroblasten in Kultur, in der Histologie, in mesenchymalen Tumoren in der Embryologie, zur zellulären Charakterisierung von Bindegewebsfibrosen, als Marker bei der Stadieneinteilung der rheumatoiden Arthritis, zur Bestimmung der Fibroblastenkontamination von Zellkulturen und/oder zur Bestimmung von Differenzierungsstadien von Zellen mesenchy malen Ursprungs.