DE10006904C1 - Ein GPI-verankertes Antigen auf Zelloberflächen von Fibroblasten und mesenchymalen Stammzellen, seine Verwendung zur Gewinnung von monoklonalen Antikörpern und darauf aufbauende Testkits, die solche Antikörper enthalten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein mesenchymales Stammzellantigen, das mit einem monoklonalen Antikörper aus der 32 kDa-Fraktion der Zellmembran von kultivierten humanen mesenchymalen Stammzellen/Vorläuferzellen abgetrennt wird, den Antikörper als solchen, die den Antikörper produzierende Hybridoma-Zelllinie und einen vielseitig einsetzbaren immunologischen Testkit, geeignet u. a. zur Typisierung von Knochenmarkspenden für die Knochenmarktransplantation, als Prognosemarker für die Knochenmarktransplantation, als Aktivierungsmarker für humane mikrovaskuläre Endothelzellen und zur Gewinnung von mesenchymalen Stammzellen/Vorläuferzellen aus Knochenmark und Vollblut zur Therapie von Hautdefekten und chronischen, nichtheilenden Wunden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Antigen, welches sich auf der Zelloberfläche von humanen Fibroblasten und mesenchymalen Stammzellen/Vorläuferzellen befindet und die nach Immunisierung resultierenden Antikörper insbesondere monoklonale Antikörper, die gegen ein solches Antigen gerichtet sind, ein Verfahren zu ihrer Herstellung so­ wie ihre Verwendung als Testkit für die klinische Histologie und Flowzytometrie, ins­ besondere zur Typisierung von Knochenmarksspenden und zur Identifikation und Selektion von mesenchymalen Stammzellen in Vollblut und Knochenmark.

Vor über 100 Jahren postulierte COHNHEIM die Existenz mesenchymaler Stamm­ zellen im Blut und Knochenmark, nachdem er experimentell nachweisen konnte, daß fibroblastenähnliche Zellen aus dem Blut in Wunden einwandern und an Bindegewe­ be adhärieren. Das Wissen über die Natur dieser adhärenten Zellen ist auch heute noch äußerst lückenhaft. In der Folgezeit konnte sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene gezeigt worden, daß diese Zellen Proteine der ECM synthetisieren, so z. B. Kollagen Typ I, Kollagen Typ IV, Laminin, Fibronektin und zahlreiche Proteogly­ kane. Einige dieser Zellen synthetisieren das Faktor VIII-assoziierte Antigen, eine Tatsache die zu der Vermutung Anlaß gab, daß es sich bei diesen Zellen auch um Vorläufer von Endothelzellen handeln könnte. Diese Zellen synthetisieren und sezernieren Zytokine, wie z. B. IL-1, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11, den Kolonie-stimulierenden Faktor-1 (CSF-1), GM-CSF und den Stammzell-Faktor (c-kit Ligand).

Seit Beginn der 90iger Jahre gelang es durch Vereinzelung dieser adhärenten me­ senchymalen Stammzellen/Vorläuferzellen und spezieller Klonierungstechniken ho­ mogenere Zellpopulationen zu gewinnen. Als ein entscheidender Nachteil diese Ar­ beiten ist die Tatsache anzusehen, daß alle Arbeitsgruppen nach einem individuellen Protokoll gearbeitet haben, dadurch von ganz unterschiedlichen Ausgangszellpopu­ lationen ausgegangen sind und somit die resultierenden Ergebnisse nur äußerst schlecht vergleichbar waren.

Weiterhin ist heute noch sehr wenig über die molekularen Mechanismen, die zur Differenzierung in die unterschiedlichen mesenchymalen Zelltypen führen bekannt. Es ist unklar, ob die fraglich einheitliche Population der mesenchymalen Stammzel­ len zunächst einen gemeinsamen Weg der Differenzierung durchlaufen, um sich dann erst in einen speziellen Phänotyp (Chondroblast, Fibroblast, Osteoblast, Fett­ zelle) zu differenzieren, oder ob schon präformierte Vorläuferzellen für diese einzel­ nen Phänotypen existieren.

In den letzten Jahren sind verstärkte Anstrengungen unternommen worden, die Plu­ ripotenz dieser mesenchymalen Stammzellen für therapeutische Zwecke zu nutzen. So wurden diese Zellen nach der klassischen Adhärenztechnik aus autologem Kno­ chenmark gewonnen, die Zellen über mehrere Verdopplungszeiten passagiert und diese Zellen dann in Gelenke des gleichen Patienten mit degenerativer Arthritis inji­ ziert. Entsprechende Heilungsversuche wurden erfolgreich bei Patienten mit schlecht heilenden Frakturen unternommen. Theoretischer Hintergrund dieser Versuche war die Vorstellung, dass die pluripotenten Stammzellen am Ort ihres natürlichen regula­ tiven Umfeldes die für sie adäquaten Differenzierungssignale bekommen und dann den gewünschten mesenchymalen Phänotyp ausbilden.

Neuere Beobachtungen zeigten weiterhin, dass es häufig bei Knochenmarktrans­ plantationen trotz guter Übereinstimmung an MHC-Antigenen zwischen Spender und Empfänger zu Intoleranz- bzw. Abstoßungsreaktionen kommt, wenn im übertragenen Knochenmark ein relativ hoher Anteil (< 5%) an solchen adhärenten mesenchymalen Stammzellen nachweisbar war.

Eine möglichst hohe Übereinstimmung von MHC-Antigenen des Spenders und des Empfängers stellt eine notwendige Voraussetzung für die Akzeptanz von Zell- bzw. Gewebespenden durch den Empfänger dar. Neben diesen MHC-Antigenen sind im Laufe der letzten Jahre eine Reihe von sog. Minorantigenen bekannt geworden, bei deren Inkompatibilität (Nichtübereinstimmung) zwischen Spender und Empfänger es auch bei sehr guter Übereinstimmung in den MHC-Merkmalen zu einer Abstoßungs- bzw. Unverträglichkeitsreaktion kommen kann. Es besteht deshalb heute das Ziel, neben einer weitgehenden Übereinstimmung in den MHC-Antigenen auch eine Übereinstimmung in den teilweise noch unbekannten Minorantigenen anzustreben. Es ist deshalb notwendig, solche relevanten Zelloberflächenstrukturen auf ausge­ wählten Zellen zu erkennen und mittels einfacher Methoden, insbesondere mittels spezifischer monoklonaler Antikörper, nachzuweisen und gegebenenfalls diese Zel­ len über eine Magnetseparation zu entfernen.

Die Erfindung hat daher zum Ziel, ein GPI-verankertes Zelloberflächenantigen (MS- Antigen) bereitzustellen, welches von mesenchymale Stammzellen exprimiert wird und dadurch deren zweifelsfreie Erkennung und Elimination aus z. B. hämatopoeti­ schen Zellgemischen erlaubt.

Die Erfindung hat weiterhin zum Ziel, Antikörper bereitzustellen, die mit humanen mesenchymalen Stammzellen/Vorläuferzellen reagieren und gleichzeitig hämatopoe­ tische Stammzellen diskriminieren.

Das erfindungsgemäße MS-Antigen ist gemäß Anspruch 1 erhältlich.

In einer bevorzugten Ausführungsform hat es sich als zweckmäßig erwiesen, den Natrium-Deoxycholat/Triton® X-100 Proteinextrakt zuerst mittels gelchromatographi­ schen Verfahren an Sepharose 4B oder Sephadex® G-200 aufzutrennen. Dabei wer­ den die das Antigen enthaltenen Fraktionen, insbesondere der Bereich zwischen 25 kDa bis 65 kDa mit den zuvor benannten monoklonalen Antikörpern in Kontakt ge­ bracht und so auf an sich bekannte Weise biochemisch rein isoliert.

Für das enzymatische Ablösen der in Kultur gezüchteten adhärenten Zellen wird vor­ zugsweise eine 0,01 bis 0,1 Gew.-% Trypsinlösung verwendet. Zweckmäßigerweise enthält die zum Ablösen der adhärenten Zellen verwendete Lösung zusätzlich 0,001 bis 0,1 Gew.-% EDTA. Zum Solubilisieren des in der Membran verankerten Antigens wird zweckmäßigerweise ein Detergenz verwendet, welches gemäß einer bevorzug­ ten Ausführungsform ein nichtionogenes Tensid, wie beispielsweise Triton® X-100 und 0,1 bis 2% Natrium-Deoxycholat, ist. Unerwünschte Membrananteile, die von der Membran mit dem gewünschten Antigen mit abgelöst werden, können zweckmäßi­ gerweise mittels Gelchromatographie entfernt werden. Hierzu können beliebige dem Fachmann bekannte Chromatographieverfahren verwendet werden. Erfindungsge­ mäß hat es sich jedoch als zweckmäßig erwiesen, als Trägermaterial Sepharose® 4B zu verwenden. Mit einer solchen chromatographischen Auftrennung lassen sich ohne weiteres diejenigen Fraktionen abtrennen, die das in Frage kommende ca. 32 kDa große Antigen bzw. das ca. 64 kDa große dimere Antigen enthalten. Das Antigen wird dann vorzugsweise mittels einer Wheat-Germ-Lektin-Affinitätschromatographie weiter aufgereinigt, wobei das gebundene Antigen mit N-Acetylglucosamin abgelöst wird. Mittels DEAE-Ionenaustausch-chromatographie läßt sich sowohl das abgelöste Antigen (ca. 60%), als auch das nicht gebundene Antigen (ca. 40%) der Wheat- Germ-Lektin-Affinitätschromatographie weiter aufreinigen. Besonders reine Antigen­ präparate lassen sich dadurch erhalten, daß man das solubilisierte erfindungsgemä­ ße Antigen mit einem monoklonalen Antikörper reagieren läßt, der aus der Hybrido­ ma-Zellinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2402 erhältlich ist. Dabei ist es sowohl möglich, das Antigen mittels einem immobilisierten, auf eine Matrix aufgebrachten Antikörper selektiv aus einem Proteingemisch "herauszufischen", wie z. B. durch Auftragen der Proteinlösung auf eine Chromatographiesäule, als auch das An­ tigen durch Zugabe des Antikörpers aus der Lösung auszufällen (Immunpräzipitati­ on).

In einem besonders bevorzugten Verfahren wird das erfindungsgemäße Zelloberflä­ chenantigen mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers isoliert, der aus o. g. Hybridoma- Zellinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2402 erhältlich ist. Hierbei werden die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper an Ziege-anti-Maus-Antikörper gebunden, die an Magnetpartikel kovalent gekoppelt sind. Hierzu wird das Antigen enthaltende Proteingemisch wie zuvor beschrieben präpariert. Zur Isolierung wird das Proteingemisch bei Raumtem­ peratur unter leichtem Schütteln mit dem Antikörper-Magnetpartikel-Komplex inku­ biert und dann an einem Magneten immobilisiert (Magnetseparation). Alle durch den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper nicht spezifisch gebundenen Protein­ verunreinigungen werden durch mehrmaliges Waschen mit PBS eliminiert. Das ge­ bundene Antigen wird mittels eines kommerziellen Elutionspuffers vom an den Magnetpartikeln gebundenen Antikörper eluiert und anschließend neutralisiert. Das so über Magnetseparation gewonnene Antigen zeigt im Westernblot eine einheitliche Proteinhauptbande bei ca. 32 kDa (Abb. 1) und eine Minorbande bei ca. 63 kDa, die das dimere Antigen repräsentiert. Diese Pro­ teinbanden entsprechen dem erfindungsgemäßen Zelloberflächenantigen auf me­ senchymalen Stammzellen gegen welches die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper gerichtet sind.

Die Erfindung betrifft auch monoklonale Antikörper, die mit, der erfindungsgemäßen Hybridoma-Zellinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2402 erhältlich sind.

Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper bindet sich an humane mesenchy­ male Stammzellen, humane Fibroblasten sowie von ihnen abgeleitete Differenzie­ rungsstadien, an vereinzelte Nierenzellen der proximalen Tubuli und an einige Ner­ venzellen des menschlichen Gehirns. Er diskriminiert sämtliche später aufgeführten relevanten Zelltypen. Auf diese Weise ist es möglich, mesenchymale Stammzellen/Vorläuferzellen und von ihnen abgeleiteten Differenzierungsstadien, hierbei ins­ besondere Fibroblasten, immunhistologisch nachzuweisen.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Antigens zur Herstellung von mesenchymalen Stammzell-Antikörpern, und zwar sowohl von monoklonalen als auch polyklonalen Antikörpern, auf an sich bekannte Weise. Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird derart vorgegangen, daß man mit­ tels dem Fachmann bekannten Methoden mit einem Antigengemisch immunisiert, das dadurch erhältlich ist, daß man kultivierte humane mesenchymale Stammzel­ len/Vorläuferzellen bzw. Fibroblasten durch Trypsin/EDTA von ihren Kulturgefäßen ablöst und die dadurch erhaltene Zellsuspension dreimal mit PBS serumfrei wäscht. Die dadurch erhaltene Zellsuspension wird mit einem Detergenz, und zwar vorzugs­ weise mit einem nichtionischen Detergenz, wie Triton® X-100/Natrium-Deoxycholat inkubiert, um die relevanten Membranproteine, die in der Membran GPI-verankert sind, zu solubilisieren. Nach Zentrifugation wird das Zellpelett verworfen und der Überstand, in dem sich neben anderen Antigenen auch das erfindungsgemäße Anti­ gen befindet, über eine Gelfiltrationschromatographie aufgetrennt. Im weiteren wird mittels einer Affinitätschromatographie an Wheat-Germ-Lektin das erfindungsgemä­ ße Antigen weiter aufgereinigt und über eine DEAE-Ionenaustauschchromatographie biochemisch rein dargestellt. Mit dem so gereinigten Antigen werden in einer für den Fachmann bekannten Art und Weise Balb-c-Mäuse immunisiert. Ausgehend von die­ ser beschriebenen Primärimmunisierung mit oben beschriebenem Antigen wird in einer bekannten Methode nach KÖHLER und MILSTEIN (Nature 256 (1975) 495- 497; Naturwissenschaften 77 (1990); Natur 349 (1991) 293-299) eine Zellfusion mit den Antikörper produzierenden Mauslymphozyten, wie beispielsweise einer Zellinie X63-Ag 8.653, durchgeführt. Eine der dadurch erhaltenen Hybridoma-Zelllinien pro­ duziert die erfindungsgemäßen Antikörper gegen ein Zelloberflächenantigen mesen­ chymaler Stammzellen/Vorläuferzellen.

Derartige Antikörper reagieren mit den oben erwähnten humanen mesenchymalen Stammzellen/Vorläuferzellen und Fibroblasten als deren Differenzierungsstadium sowohl in Kultur als auch in humanen histologischen Schnitten von beispielsweise Haut, Hirn, Plazenta, Niere, Nabelschnur, Herz, Muskulatur, Pankreas etc. Mittels Durchflußzytometrie konnte gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper an humane mesenchymale Stammzellen/Vorläuferzellen aus dem Knochenmark und an humane Fibroblasten unabhängig von deren Gewebeherkunft binden. Auf die gleiche Weise wurde nachgewiesen, daß diese Antikörper nicht an Zellen des normalen Vollblutes wie z. B. Lymphozyten, Granulozyten, Monozyten und Thrombozyten binden. CD 34⁺ angereicherte hämatopoetische Stammzellen werden in unterschiedlichem Ausmaß bis zu 25% positiv durch den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper markiert, ein Befund der darauf hinweist, daß es sich bei diesen positiven Zellen um mesenchymale Stammzellen bzw. deren Differenzie­ rungszustände handelt. Mit der flowzytometrischen Analyse konnte weiterhin nach­ gewiesen werden, daß der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper keine in vitro kultivierten mikro- und makrovaskulären Endothelzellen, Keratinozyten, Chondro­ zyten und glatte bzw. quergestreifte Muskelzellen erkennt.

Mit dem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper ist es neben der Erkennung von mesenchymalen Stammzellen/Vorläuferzellen auch möglich, Fibroblasten bzw. Fibroblasten-Subpopulationen in Kultur zu charakterisieren und sie zweifelsfrei von anderen morphologisch ähnlichen Zelltypen zu unterscheiden. Damit kann in der pathologischen Histologie der vermutete mesenchymale Ursprung bestimmter Tumo­ ren eindeutig belegt werden und gegebenenfalls kann die Expression des korre­ spondierenden Antigens als Prognosemarker bei solchen Tumoren Verwendung fin­ den. Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper kann weiterhin für embryologi­ sche Fragestellungen zum Nachweis der mesenchymalen Abstammung von Zellen und Gewebe im Verlauf der Embryogenese und Organogenese genutzt werden.

Ein weiteres Anwendungsbeispiel des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikör­ pers ergibt sich auf Grund seiner Fähigkeit aktivierte, jedoch nicht ruhende Endothel­ zellen zu erkennen. Diese Eigenschaft konnte sowohl in histologischen Schnitten von Patienten mit unterschiedlichen entzündlichen Gefäßerkrankungen wie Kaposi- Sarkome bei HIV Infektionen, autoimmune Vaskulitiden und bei akuter Rheumatoid Arthritis, als auch in in vitro Endothelzellkulturen nach Stimulation mit Phorbolmyri­ stat-Acetat (PMA) und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) nachgewiesen werden. Auf Grund dieses Verhaltens erscheint deshalb der erfindungsgemäße monoklonale An­ tikörper MS1 sehr gut geeignet, als Aktivierungsmarker für Endothelzellen eingesetzt zu werden.

Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper eignet sich auch zur Charakterisie­ rung des zellulären Ursprungs von Bindegewebszellen im Verlaufe der Wundheilung und kann darüber hinaus genutzt werden, um Ursachen von schlecht bzw. nichthei­ lenden Wunden aufzudecken. Es existieren experimentelle Hinweise, daß Fibrobla­ sten der Wundumgebung von chronischen, nichtheilenden Wunden in ihren syntheti­ schen und funktionellen Parametern viel schlechter sind als entsprechende potente Fibroblasten aus normaler Haut. Diese Wundfibroblasten exprimieren auch erheblich weniger des erfindungsgemäßen Zelloberflächenantigens. Es ist denkbar, daß von Patienten mit nichtheilenden Wunden mit Hilfe des erfindungsgemäßen monoklona­ len Antikörpers potente mesenchymale Stammzellen/Vorläuferzellen aus Knochen­ markspunktaten bzw. aus angereichertem Vollblut gewonnen und als autologes Zell­ transplantat in die nichtheilenden Wunden eingebracht werden. Diese Stammzel­ len/Vorläuferzellen differenzieren nun in natürlicher Umgebung zu hochpotenten Fi­ broblasten und bewerkstelligen den vormals mangelhaften bis unmöglichen Wund­ verschluß.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Gewinnung des korrespondierenden Antigens auf mesenchymalen Stammzellen/Vorläuferzellen, welches durch die erfin­ dungsgemäßen monoklonalen Antikörper erkannt wird.

Die Erfindung soll anhand der folgenden Beispiele näher erläutert werden.

Beispiel 1

Humane mesenchymale Stammzellen/Vorläuferzellen wurden mittels Magnetsepara­ tion mit Hilfe des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers aus angereichertem Vollblut gewonnen und bis zu ihrer Konfluenz in einer Zellmonolayerschicht kultiviert. Die adhärenten Zellen wurden dann mit einer 0,05%igen Trypsin-/0,02%igen EDTA- Lösung abgelöst und suspendiert. Nach dreimaligen Waschen der so suspendierten Stammzellen mit eiskaltem PBS wurde jeweils bei 4°C und 900 U/min zentrifugiert. Das resultierende Zellpelett wurde mit 0,5% Triton® X-100 und bis zu 2% Natrium- Deoxycholat und 1 mmol Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) in PBS-Puffer unter leichtem Schütteln auf Eis für ca. 30 Minuten inkubiert. Die Zellkonzentration betrug ca. 10⁷ Zellen pro 100 ml Puffer. Im Anschluß daran wurde nochmals bei 4°C und 20.000 U/min für 10 Minuten zentrifugiert, um die durch das Detergenz herausgelö­ sten Membranproteine von dem restlichen Zellpelett zu trennen. Der Überstand wur­ de auf einer Sepharose® 4B-Säule chromatographiert, die Fraktionen mit einem Mole­ kulargewicht zwischen 25000 und 90000 gepoolt und einer Wheat-Germ-Lektin- Affinitätschromatographie unterzogen. Mit den antigenhaltigen Fraktionen wurden im Anschluß eine DEAE-Ionenaustauschchromatographie durchgeführt. Die antigenhal­ tigen Fraktionen wurden gepoolt und das Protein über eine 70%ige Ammoniumsul­ fatfällung konzentriert. Das so angereicherte Antigen wurde auf einem SDS-Gel (Sammelgel 5%, Trenngel 10%) mittels Elektrophorese aufgetrennt. Nach einem Elektroblotting (Laufpuffer ohne SDS zzgl. 20% Methanol) auf Nitrocellulose wurden noch freie Bindungsstellen auf der Membran mit 5% Magermilchpulver bei 37°C für 2 Stunden blockiert. Das Antigen läßt sich auf dem so behandelten Filter durch Inkuba­ tion über Nacht bei 4°C mit dem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper in einer Sandwich-Technik mit einem Ziege-anti-Maus-POD-markierten Antikörper mit­ tels der bekannten Farbreaktion durch DAB plus H₂O₂ (10 mg/10 ml PBS + 50 µl 30%iges H₂O₂) als eine einheitliche Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 32000 nachweisen (Abb. 1). Unter nichtreduzierenden Elektrophoresebedingun­ gen ändert sich weder Laufverhalten noch das Molekulargewicht des Antigens.

Beispiel 2

Mit dem wie oben erfindungsgemäß beschriebenen monoklonalen Antikörper wurden die folgenden Versuche durchgeführt:

• 1. Flowzytometrie kultivierter humaner mesenchymaler Stammzellen; wie oben be­ schrieben, wurden humane mesenchymale Stammzeilen aus Vollblut isoliert und in einer Monolayerkultur kultiviert. Es wurden 10⁵ Zellen mit 20 µl des erfindungs­ gemäßen monoklonalen Antikörpers (DSM ACC2402) bei 4°C für 45 min. inku­ biert und anschließend flowzytometrisch analysiert. Es konnte nachgewiesen werden, daß sich der Antikörper an alle kultivierten mesenchymalen Stammzel­ len/Vorläuferzellen bindet. Die Fluoreszenzintensität der gebundenen Antikörper ist mit der von anti-CD 44 (HCAM) auf Fibroblasten vergleichbar.
• 2. Flowzytometrie kultivierter humaner dermaler Fibroblasten; kultivierte humane dermale Fibroblasten (10⁵ Zellen) wurden mit 50 µl des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper (DSM ACC2402) bei 4°C für 45 min. inkubiert und an­ schließend flowzytometrisch analysiert. Es wurde gefunden, dass der Antikörper alle Fibroblasten markiert. Werden statt Fibroblasten dermalen Ursprungs Fibro­ blasten aus anderen menschlichen Geweben (Herz, Leber, Nabelschnur, Pla­ zenta etc.) eingesetzt, dann ergeben sich sowohl im Ausmaß der Bindung als auch in der Intensität keine Unterschiede zu den dermalen Fibroblasten. Fibrobla­ sten anderer Spezies (Kaninchen, Maus, Ratte, Rind etc.) reagieren nicht mit dem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper.
• 3. Flowzytometrie kultivierter humaner Keratinozyten; Humane Keratinozyten (10⁵ Zellen) wurden mit 50 µl des erfindungsgemäßen Antikörpers bei 4°C für 45 min. inkubiert und anschließend flowzytometrisch analysiert. Keine der eingesetzten Zellen wurde von den Antikörpern markiert.
• 4. Flowzytometrie kultivierter humaner makrovaskulärer Endothelzellen; 10⁵ En­ dothelzellen wurden mit 50 µl des erfindungsgemäßen Antikörpers bei 4°C für 45 min. inkubiert und anschließend flowzytometrisch analysiert. Keine der einge­ setzten Zellen wurde von dem Antikörper markiert.
• 5. Flowzytometrie kultivierter humaner mikrovaskulärer Endothelzellen; 10⁵ En­ dothelzellen wurden mit 50 µl des erfindungsgemäßen Antikörpers bei 4°C für 45 min. inkubiert und anschließend flowzytometrisch analysiert. Keine der einge­ setzten Zellen wurde von dem Antikörper markiert.
  Werden jedoch solche negativen mikrovaskulären Endothelzellen mit Phorbolmy­ ristat-Acetat (PMA) oder Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) inkubiert, dann expri­ miert ein Teil (30%) diese vormals negativen Zellen das korrespondierende Anti­ gen und wird nunmehr durch den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper MS1 erkannt.
• 6. Flowzytometrie humaner Chondrozyten; 10⁵ Chondrozyten wurden mit 50 µl des erfindungsgemäßen Antikörpers bei 4°C für 45 min. inkubiert und anschließend flowzytometrisch analysiert. Keine der eingesetzten Zellen wurde von dem Anti­ körper markiert.
• 7. Flowzytometrie humaner Granulozyten; 10⁵ Granulozyten wurden mit 50 µl des erfindungsgemäßen Antikörpers bei 4°C für 45 min inkubiert und anschließend flowzytometrisch analysiert. Keine der eingesetzten Zellen wurde von dem Anti­ körper markiert.
• 8. Flowzytometrie humaner Lymphozyten; 10⁵ Lymphozyten wurden mit 50 µl des erfindungsgemäßen Antikörpers bei 4°C für 45 min inkubiert und anschließend flowzytometrisch analysiert. Keine der eingesetzten Zellen wurde von dem Anti­ körper markiert.
• 9. Flowzytometrie humaner Monozyten; 10⁵ Monozyten wurden mit 50 µl des erfin­ dungsgemäßen Antikörpers bei 4°C für 45 min inkubiert und anschließend flowzytometrisch analysiert. Keine der eingesetzten Zellen wurde von dem Anti­ körper markiert.
• 10. Flowzytometrie humaner Thrombozyten; 10⁵ Thrombozyten wurden mit 50 µl des erfindungsgemäßen Antikörpers bei 4°C für 45 min inkubiert und anschließend flowzytometrisch analysiert. Keine der eingesetzten Zellen wurde von dem Anti­ körper markiert.
• 11. Immunhistologie humaner Haut (Avidin-Biotin-Technik); Kryostatschnitte von hu­ maner Haut wurden entsprechend eines bekannten Protokolls mit 100 µl des erfindungsgemäßen Antikörpers (1 : 200 Verdünnung) bei 4°C für 12 Stunden inkubiert. Im histologischen Schnitt färbten sich nur die Fibroblasten der Dermis und des subkutanen Bindegewebes an. Komponenten der Epidermis und der nicht bindegewebigen Hautanhangsge­ bilde wie Haarfollikel, Talgdrüsen, Schweißdrüsen färbten sich nicht an. Gleich­ falls negativ erschienen die Endothelzellen der Blutgefäße der Haut.
  Ein anderes Verteilungsmuster des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikör­ pers MS1 auf Endothelzellen ist bei einigen pathologischen Hautveränderungen mit entzündlichen Endothelzellreaktionen zu beobachten. So werden ein Teil der mikrovaskuläre Endothelzellen im histologischen Schnitten von Patienten mit Ka­ posi-Sarkomen bei einer HIV-Infektion, einige entzündliche Vaskulitisformen und Endothelzellen bei einer akuten entzündlichen Rheumatoid Arthritis durch den Antikörper MS1 als positiv erkannt. Aus diesen experimentellen in vitro und in vi­ vo Befunden lässt sich zweifelsfrei ableiten, dass der erfindungsgemäße mono­ klonale Antikörper MS1 ruhende, d. h. nicht aktivierte Endothelzellen nicht er­ kennt, aber deren aktivierte Stadien als positiv markiert. Diese experimentellen Befunde belegen, dass der Antikörper MS1 sehr gut als Aktivierungsmarker für humane Endothelzellen geeignet ist.
• 12. Immunhistologie humaner Tonsille (Avidin-Biotin-Technik); Kryostatschnitte von humaner Tonsille wurden entsprechend eines bekannten Protokolls mit 100 µl des erfindungsgemäßen Antikörpers (1 : 200 Verdünnung) bei 4°C für 12 Stunden inkubiert. Im histologischen Schnitt färbten sich nur die Fibroblasten des Bindegewebes der Gefäße und der Kapsel an, während die Follikel gänzlich negativ waren.
• 13. Immunhistologie humaner Niere (Avidin-Biotin-Technik); Kryostatschnitte von hu­ maner Niere wurden entsprechend eines bekannten Protokolls mit 100 µl des erfindungsgemäßen Antikörpers (1 : 200 Verdünnung) bei 4°C für 12 Stunden inkubiert. Im Nierenschnitt erschei­ nen das Parenchym und die Tubuluszellen weitgehend negativ, bis auf einige proximale Tubuli, an die sich der Antikörper teilweise bindet. Die Glomeruli sind in ihrem Gefäßkonvolut deutlich granulär positiv, ein Befund der nahelegt, daß mög­ licherweise die Mesangiumzellen, die mesenchymalen Ursprungs sind, das vom Antikörper erkannte Antigen exprimieren.
• 14. Immunhistologie humaner Plazenta (Avidin-Biotin-Technik); Kryostatschnitte von humaner Plazenta wurden entsprechend eines bekannten Protokolls mit 100 µl des erfindungsgemäßen Antikörpers (1 : 200 Verdünnung) bei 4°C für 12 Stunden inkubiert. Der Antikörper markiert in­ tensiv alle Fibroblasten des Mesenchyms. Die Endothelzellen des angeschnitte­ nen Gefäßes der Plazenta werden durch den Antikörper nicht erkannt. Alle epithelialen Strukturen wie Amnionepithel, Zytotrophoblasten und Synzytiotrophobla­ sten werden gleichfalls nicht durch diesen Antikörper markiert.
• 15. Immunhistologie humaner Leber (Avidin-Biotin-Technik); Kryostatschnitte von ge­ sunder humaner Leber wurden entsprechend eines bekannten Protokolls mit 100 µl des erfindungsgemäßen Antikör­ pers (1 : 200 Verdünnung) bei 4°C für 12 Stunden inkubiert. Der Antikörper reagiert nicht mit den Zellen des Leberparenchyms. Es werden ausschließlich die Fibro­ blasten des Leberbindegewebes uni des perivaskulären Bindegewebes ange­ färbt. Das Epithel der Gallenblasenwand und die unter der Lamina propria liegen­ de glatte Muskulatur wird nicht markiert. Die Fibroblasten des Bindegewebes der Lamina propria und des lockeren Bindegewebsgerüstes zwischen den Muskel­ bündeln wird durch den Antikörper deutlich angefärbt.
• 16. Immunhistologie humaner Schilddrüse (Avidin-Biotin-Technik); Kryostatschnitte von humaner Schilddrüse wurden entsprechend eines bekannten Protokolls mit 100 µl des erfindungsgemäßen Antikörpers (1 : 200 Verdünnung) bei 4°C für 12 Stunden inkubiert. Das einschich­ tige Follikelepithel des Schilddrüsenfollikels wird durch den Antikörper nicht an­ gefärbt. Es werden ausschließlich die Fibroblasten des perifollikulären Bindege­ webes markiert.

Claims (15)

1. Mesenchymales Stammzellantigen, dadurch erhältlich, daß man humane mesen­ chymale Stammzellen bis zur Konfluenz in einem Monolayer kultiviert, mit Tryp­ sin/EDTA ablöst, mit einem Detergenz inkubiert und mittels Gelchromatographie, Lektin-Affinitätschromatographie und DEAE-Ionenaustausch-chromatographie auftrennt, die Antigen enthaltenen Fraktionen vereinigt und die ca. 32 kDa Frakti­ on mit einem aus der Hybridoma-Zellinie DSM ACC2402 erhaltenen Antikörper immunaffinitätschromatographisch abtrennt.

2. Antigen nach Anspruch 1. dadurch erhältlich, daß man die Stammzellen mit einer Lösung, die 0,01-0,1 Gew.-% Trypsin enthält, ablöst und mit eiskaltem PBS wäscht und abzentrifugiert.

3. Antigen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stamm­ zellen mit einer Lösung ablöst, die zusätzlich noch 0,001-0,1 Gew.-% EDTA enthält.

4. Antigen nach Anspruch 1, dadurch erhältlich, daß man als Detergenz 0,01-0,1%iges Triton® X-100 verwendet.

5. Antigen nach Anspruch 4, dadurch erhältlich, daß man zusätzlich zum Detergenz Triton® X-100 noch 0,1-2% Natrium-Deoxycholat verwendet.

6. Antigen nach einen der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß man die Gelchromatographie an einer Sepharose® 4B-Säule durchführt.

7. Antigen nach einen der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lektin-Affinitätschromatographie an einer Wheat-Germ- Chromatographie-Säule durchführt.

8. Antigen nach einen der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß man die Ionenaustauschchromatographie an einer DEAE-Ionenaustausch­ chromatographiesäule durchführt.

9. Hybridom, hinterlegt unter DSM ACC2402.

10. Monoklonaler-Antikörper, erhältlich aus der Hybridoma-Zelllinie mit der Hinterle­ gungsnummer DSM ACC2402.

11. Immunologischer Testkit, enthaltend zumindest einen Antikörper nach Anspruch 10.

12. Verwendung des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 10 in einem immunologischen Testkit zur Charakterisierung von mesenchymalen Stammzellen in Kultur, in der Histologie, als Prognosemarker bei Wundheilungsstörungen und/oder zur Bestimmung von Differenzierungsstadien von Zellen mesenchymalen Ursprungs.

13. Verwendung des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 10 in einem immunologischen Testkit zur Typisierung von Knochenmarkspenden für eine Knochenmarktransplantation und/oder als Prognosemarker für eine Knochen­ marktransplantation.

14. Verwendung des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 10 zur Magnetseparation von mesenchymalen Stammzellen aus Knochenmarkspenden.

15. Verwendung des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 10 in einem immunologischen Testkit zur Gewinnung von mesenchymalen Stammzellen aus Vollblut, zur Therapie nichtheilender Wunden mittels autologer mesenchymaler Stammzellen.