DE3851372T2

DE3851372T2 - Von menschlichen B-lymphoblastoiden Zellen abstammender Faktor zur Stimulierung der Antikörperproduktion und Verfahren zur Antikörperherstellung unter Verwendung dieses stimulierenden Faktors.

Info

Publication number: DE3851372T2
Application number: DE3851372T
Authority: DE
Inventors: Hiroki Murakami; Hirohisa Omura; Kazuhisa Toyoda; Koji Yamada
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1987-06-12
Filing date: 1988-06-13
Publication date: 1995-01-19
Anticipated expiration: 2008-06-14
Also published as: DE3851372D1; EP0295605B1; EP0295605A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen physiologischen Wirkstoff, der die Produktion eines Antikörpers durch ein Hybridom stimuliert, und ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers durch Züchtung eines Antikörper-produzierenden Hybridoms unter Verwendung dieses Wirkstoffes.
Ein von einem Hybridom produzierter monoclonaler Antikörper ist ein sehr nützlicher Stoff für Untersuchungen in Biologie und Medizin und hat neue Forschungsverfahren geschaffen zur Klassifizierung, Bestimmung und Aufreinigung von Zellmembran-Antigenen, zur Verifizierung und Reinigung interzellulärer Wirkstoffe und zur Untersuchung von Rezeptoren. Für die praktische Anwendung erwartet man von diesem monoclonalen Antikörper ferner seine Eignung für die Diagnose und Heilbehandlung von Krankheiten sowie für die Reinigung von Stoffen bis zu einem hohen Reinheitsgrad. Von herkömmlichen monoclonalen Maus-Antikörpern wird angenommen, daß sie für die Diagnose und Heilbehandlung von menschlichen Krankheiten nur beschränkt anwendbar sind. Demgemäß ist kürzlich das Verfahren zur Herstellung von Mensch-Mensch-Hybridomen entwickelt worden, welche menschliche monoclonale Antikörper produzieren. Diese monoclonalen Antikörper werden durch entsprechende Hybridome produziert und sezerniert. Im Prinzip können monoclonale Antikörper durch Hybridomzüchtung erhalten werden. Ein in der Praxis zufriedenstellendes Verfahren für die Herstellung hochreiner monoclonaler Antikörper in großen Mengen ist jedoch nicht entwickelt worden.
Zur Gewinnung monoclonaler Antikörper in hoher Ausbeute ist hauptsächlich ein Verfahren verwendet worden, bei dem ein Hybridom in der Bauchfellhöhle einer Maus gezüchtet wird. Die Züchtung eines Mensch- Mensch-Hybridoms in der Bauchfellhöhle einer Maus ist jedoch schwierig und außerdem erhält man bei Züchtung eines Maus-Hybridoms in der Maus- Bauchfellhöhle ein Gemisch aus einem vom Hybridom produzierten monoclonalen Antikörper und einem von der Maus per se produzierten unspezifischen Antikörper, weshalb ein monoclonaler Antikörper mit großer Reinheit nicht gewonnen werden kann. Folglich ist die Nutzbarmachung der Hybridomzüchtung in der Maus-Bauchfellhöhle äußerst beschränkt.
Die in vitro-Herstellung von Hybridomzellen in hoher Ausbeute ist versucht worden, wobei im allgemeinen ein Hybridom ausreichendes Wachstum in einem Kulturmedium mit fötalem Rinderserum (nachstehend als "FCS" bezeichnet) zeigt und Antikörper effektiv produziert werden. In einem FCS enthaltenden Kulturmedium sind aber Serumproteine in hohen Konzentrationen vorhanden, die eine Vielzahl physikalischer und chemischer Eigenschaften sowie eine sehr breite Molekulargewichtsverteilung besitzen, weshalb es aus einer Serumkultur sehr schwierig ist, einen Antikörper bis zu einem hohen Reinheitsgrad aufzureinigen. Aus diesen Gründen ist zur Gewinnung großer Mengen monoclonaler Antikörper hoher Reinheit die Züchtung einer großen Anzahl von Hybridomzellen in einem serumfreien Medium notwendig.
Im Grunde kann ein serumfreies Medium die Bedingungen bieten, die entsprechend den Eigenschaften des verwendeten Hybridoms für die Antikörperproduktion am geeignetsten sind. Außerdem ist das serumfreie Medium auch für die Trennung und Aufreinigung von Antikörpern wertvoll. Da ein serumfreies Medium nur einige Proteine mit bekannten Eigenschaften enthält und der Proteingehalt viel niedriger ist als in einem serumhaltigen Medium, kann der Antikörper bei einem serumfreien Medium einfach abgetrennt und mühelos aufgereinigt werden, bis er hochgradig rein ist.
Im allgemeinen ist jedoch die Fähigkeit eines Hybridoms zur Antikörperproduktion in einem herkömmlichen serumfreien Medium viel geringer als in einem serumhaltigen Medium. Folglich ist es notwendig, ein serumfreies Medium zu entwickeln, in welchem ein Hybridom ein Potential zur Antikörperproduktion ausbilden kann, das dem in einem serumhaltigen Medium vergleichbar ist, ohne daß die Reinigung der produzierten monoclonalen Antikörper gestört wird.
Ein erfindungsgemäßer Gegenstand ist die Bereitstellung eines die Antikörperproduktion eines Hybridoms anregenden physiologischen Wirkstoffes. Ein anderer erfindungsgemäßer Gegenstand ist die Bereitstellung eines Verfahrens für die Antikörperproduktion durch Züchtung eines Antikörper-produzierenden Hybridoms unter Verwendung dies es physiologischen Wirkstoffes.
Es ist jetzt gefunden worden, daß menschliche B-lymphoblastoide Zellen, insbesondere die Zelle HO-323 [H. Ohashi et al., Cell Biol. Intern. Reports, 10(2), (1986), 77], einen die Antikörperproduktion eines Hybridoms anregenden physiologischen Wirkstoff produzieren (nachstehend als "IPSF" bezeichnet). Außerdem wurde gefunden, daß das Hybridom durch Zugabe dieses IPSF monoclonale Antikörper in großer Menge sezerniert, und zwar nicht nur bei Züchtung in einem serumhaltigen Medium, sondern auch bei Züchtung in einem serumfreien Medium.
Fig. 1 ist eine graphische Darstellung eines Beispiels für die Beziehung, die zwischen den dem Kulturmedium zugesetzten Fraktionsarten und der von HF10B4 produzierten IgM-Menge besteht;
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung eines weiteren Beispiels für die Beziehung, die zwischen den dem Kulturmedium zugesetzten Fraktionsarten und der von HF10B4 produzierten IgM-Menge besteht;
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung noch eines weiteren Beispiels für die Beziehung, die zwischen den dem Kulturmedium zugesetzten Fraktionsarten und der von HF10B4 produzierten IgM-Menge besteht; und
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung eines Beispiels für die Beziehung, die zwischen der Züchtungsdauer und der Zelldichte besteht.
IPSF kann aus einem Überstand der menschlichen B-lymphoblastoiden Zelle, vorzugsweise Kulturmedium von HO-323 oder ein HO-323-Zellysat, abgetrennt und aufgereinigt werden, wobei die Züchtungsbedingungen von HO-323 keine Beziehung zu den Eigenschaften des gewonnenen IPSF haben. Für die Züchtung von HO-323 sind keine besonderen Bedingungen nötig, da HO-323 unter normalen, entsprechend angepaßten Bedingungen wachsen kann. Bei IPSF-Aufreinigung aus dem Überstand des Kulturmediums kann die Züchtung nach den herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden, vorzugsweise wird jedoch ein Kulturmedium mit niedrigerem Proteingehalt verwendet, weil ein geringerer Proteingehalt des Kulturmediums die IPSF- Reinigung erleichtert.
Ein IPSF mit niedrigerem Gehalt an Fremdbestandteilen kann durch Züchtung von HO-323 erhalten werden. Zur Züchtung werden die Zellen z. B. in ein Medium mit FCS überimpft und dann abgetrennt und gewaschen. Unter zur IPSF-Produktion geeigneten Bedingungen werden die Zellen z. B. erneut in ein serumfreies Kulturmedium ohne FCS überimpft und darin gezüchtet.
Ein kommerziell erhältliches Kulturmedium kann als Hauptbestandteil des Mediums für HO-323 verwendet werden. Geeignet sind beispielsweise das RPMI-1640-Medium, nach Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) und Ham-F12-Medium (F12). Vorzugsweise wird RDF-Medium verwendet (RPMI1640: DMEM: F12 = etwa 2 : 1:1 im Volumen). Falls nötig können als Zusatz zu derartigen Medien verwendet werden: 1) etwa 20 bis 250 Einheiten Penicillin pro ml Kulturmedium, vorzugsweise etwa 100 Einheiten, 2) etwa 20 bis 250 ug Streptomycin pro ml Kulturmedium, vorzugsweise etwa 100 ug, 3) etwa 5 bis 30 mM HEPES, vorzugsweise 20 mM, und 4) etwa 8 bis 20 mM NaHCO&sub3;, vorzugsweise 14 mM.
Als zur Züchtung von HO-323 geeignetes Medium kann z. B. das vorstehend erwähnte RDF-Medium verwendet werden, das etwa 5 bis 10 Vol.% FCS, bezogen auf das Gesamtvolumen des Kulturmediums, enthält. Als zur IPSF-Produktion geeignetes Medium wird vorzugsweise ITES/RDF-Medium, hergestellt durch Hinzufügen der folgenden vier Zusätze zu dem RDF-Medium, nämlich verwendet, 10 ug/ml Insulin, 35 ug/ml Transferrin, 20 uM Ethanolamin und 25 nM Natriumselenit. Wenn IPSF unter Verwendung von HO-323 produziert wird, muß ein Serumbestandteil, wie z. B. FCS, dem Kulturmedium nicht extra zugefügt werden, und durch das folgende Reinigungsverfahren kann sehr reines IPSF mühelos hergestellt werden.
Was die Bedingungen für die HO-323-Züchtung anbelangt, liegt die Temperatur vorzugsweise bei etwa 35 bis 37ºC und die Zellen werden in 5 bis 10% Kohlendioxid-Gas enthaltender Luft mit regulierter Luftfeuchtigkeit gezüchtet. Der pH-Wert des Kulturmediums sollte bei einem leicht alkalischen Wert von etwa 7,0 bis 7,4 gehalten werden.
Die für das Wachstum von HO-323 geeignete Zellimpfdichte beträgt 5 · 10&sup4; bis 5 · 10&sup5; Zellen pro ml Kulturmedium, vorzugsweise 2 · 10&sup5; Zellen pro ml Kulturmedium. Wenn die Zellen unter diesen Bedingungen gezüchtet werden, erhöht sich die Zelldichte in 2 bis 4 Tagen auf 8 · 10&sup5; bis 2 · 10&sup6; Zellen pro ml Kulturmedium. Demgemäß werden die Zellen erneut in vorstehend erwähnter Dichte überimpft und die Züchtung wird fortgeführt.
Zur Gewinnung von IPSF aus dem Zellysat wird die Züchtung von HO-323 in dem FCS-haltigen RDF-Medium oder einem ähnlichen Medium durchgeführt, bis die beabsichtigte Zellzahl erreicht ist, dann werden die Zellen durch Zentrifugieren oder dergleichen abgetrennt, in einem geeigneten Puffer suspendiert, z. B. in einer Phosphat-gepufferten physiologischen Kochsalzlösung, und zur Herstellung des Zellysats mit Ultraschall oder Einfrieren-Auftauen behandelt. Es kann ein Verfahren angewandt werden, bei dem HO-323 nach Züchtung in serumhaltigem Medium in dem serumfreien Medium weitergezüchtet und danach das Zellysat hergestellt wird. Aber selbst wenn die Züchtung in dem serumfreien Medium nicht durchgeführt wird, besteht kein Risiko eines Einschlusses von Fremdbestandteilen.
Zur IPSF-Gewinnung aus dem Überstand des Kulturmediums kann ein Verfahren angewendet werden, bei dem die Zellen genauso abgetrennt werden wie bei der Herstellung des Zellysates, wobei der Überstand gewonnen wird. Zur Gewinnung von IPSF mit einem geringeren Gehalt an Fremdbestandteilen wird jedoch vorzugsweise ein Verfahren angewendet, bei dem die abgetrennten HO-323-Zellen mindestens einmal mit einem synthetischen Medium gewaschen werden, wie z. B. RDF-Medium, die Zellen werden dann erneut in einer Dichte von 5 · 10&sup5; bis 2 · 10&sup6; Zellen pro ml Kulturmedium in ein serumfreies Medium überimpft und die Züchtung wird fortgeführt. Im Lauf der Zeit ändert sich die Konzentration des von HO-323 produzierten IPSF im Kulturmedium, wobei sich IPSF im Lauf der Zeit anreichert. Bei Überimpfung der Zellen unter den vorstehend erwähnten Bedingungen werden die Zellen im allgemeinen nach 3 bis 5 Tagen Zellzüchtung aus dem Kulturmedium entfernt und der Kulturüberstand gewonnen.
IPSF kann aus dem vorstehend erwähnten Kulturüberstand oder Zellysat mit verschiedenen Verfahren gereinigt werden, wie z. B. Aussalzen, Ultrafiltration, Gelfiltrations-Chromatographie, Ionenaustausch- Chromatographie, Affinitätschromatographie, hydrophobe Chromatographie und Gelelektrophorese.
Die Menge des produzierten IPSF wird durch Prüfung der IPSF-Wirksamkeit bestimmt. D.h. die IPSF-Wirksamkeit wurde unter Verwendung des Mensch- Mensch-Hybridoms HF10B4 (nachstehend als "HF10B4" bezeichnet), bestimmt, das mit IPSF reagiert, wobei sich dessen Fähigkeit zur IgM-Produktion erhöht [H. Murakami et al., In vitro Cell. Develop. Biol., 21, (1985) 593]. HF10B4 wird in einer Dichte von 5 · 10&sup4; bis 2 · 10&sup5; Zellen pro ml Kulturmedium in ITES/RDF- Medium überimpft, enthaltend 10% der Probenflüssigkeit, deren IPSF- Wirksamkeit gemessen werden soll. Die Züchtung wird in Gegenwart von 5% CO&sub2; bei 37ºC durchgeführt. Die IgM-Menge im Überstand des Kulturmediums wird mit dem Enzym-markierten Antikörperverfahren gemessen. IPSF ist in der Probenflüssigkeit vorhanden, wenn die IgM-Menge nach der Zugabe der Probenflüssigkeit mehr als zweimal so groß ist wie die in der Abwesenheit von IPSF produzierte IgM-Menge. Die von dem Hybridom produzierte Antikörpermenge wird durch Zugabe des gemäß der vorliegenden Erfindung gewonnenen IPSF zu dem Hybridom-Kulturmedium erhöht. Insbesondere bei Zugabe des erfindungsgemäßen Faktors zu einem serumfreien Medium, wie z. B. ITES/RDF-Medium, zeigt das Hybridom ein Potential zur Antikörperproduktion, das mit dem in einem 10% FCS enthaltenden Medium erreichten vergleichbar ist. Außerdem ist die IPSF-Trennung von dem monoclonalen Antikörper sehr einfach, weil die zugebene IPSF-Menge sehr klein ist, und deshalb kann bei Hybridomzüchtung unter Verwendung eines serumfreien, IPSF enthaltenden Mediums ein hochreiner monoclonaler Antikörper durch mühelose Reinigung gewonnen werden.
Ferner ist, obwohl auf diese Weise die Fähigkeit des Hybridoms zur Antikörperproduktion verbessert wird, die Wachstumsrate nicht so hoch wie in einem serumhaltigen Medium, die Hybridomzüchtung per se wird aber mühelos bewerkstelligt und durch die ununterbrochene Züchtung des Hybridoms über einen langen Zeitraum können monoclonale Antikörper in hoher Ausbeute gewonnen werden
Das erfindungsgemäße IPSF wird von der menschlichen B- lymphoblastoiden Zelle HO-323 produziert und besitzt eine physiologische Wirksamkeit, welche die Antikörperproduktion von Hybridomen angeregt. Durch die IPSF-Zugabe wird außerdem die Antikörperproduktion eines Hybridoms nicht nur in einem serumhaltigen Medium, sondern auch in einem serumfreien Medium verbessert. Weiterhin läßt man, obwohl das Potential des Hybridoms zur Antikörperproduktion in einem herkömmlichen serumfreien, mit IPSF angereicherten Medium höher ist, das Hybridom nicht so schnell wachsen wie in einem serumhaltigen Medium. Wenn eine Hybridom- Massenzüchtung in einem mit IPSF angereicherten serumfreien Medium durchgeführt wird, kann also eine große Anzahl monoclonaler Antikörper ununterbrochen über einen langen Zeitraum produziert werden. Da die Wachstumsrate des Hybridoms niedriger ist als in einem serumhaltigen Medium, kann überdies die Massenzüchtung des Hybridoms per se sehr einfach ausgeführt werden. Weiterhin wird, da IPSF eine sehr hohe physiologische Wirksamkeit aufweist, eine ausreichende Wirkung nur durch Zugabe einer kleinen IPSF-Menge zu einem serumfreien Medium erreicht und IPSF kann leicht von den produzierten monoclonalen Antikörpern abgetrennt werden. Bei Züchtung eines Hybridoms unter Verwendung des IPSF enthaltenden, serumfreien Mediums kann demgemäß ein hochreiner monoclonaler Antikörper mühelos gewonnen werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezug auf die folgenden Beispiele genauer beschrieben. Diese Beispiele veranschaulichen nur die Erfindung und beschränken keinesfalls den Schutzumfang der Erfindung.

Beispiel 1

10% FCS wurde einem RDF-Medium zugesetzt, enthaltend 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin, 5 mM HEPES und 14 mM NaHCO&sub3; als Zusätze, und HO-323 wurde in dem Kulturmedium in einer Dichte von 2 · 10&sup5; Zellen pro ml Kulturmedium suspendiert. Dann wurden jeweils 10 ml Zellsuspension in 25 Plastik-Petrischalen mit einem Durchmesser von 10 cm (Falcon # 3003, geliefert von Nippon Becton-Dickinson) gegossen. In Gegenwart von 5% CO&sub2; wurden die Zellen 2 Tage bei 37ºC gezüchtet und dann wurde das Kulturmedium zentrifugiert, wobei nur Zellen gewonnen wurden. Die Zellen wurden zweimal mit dem vorstehend erwähnten Kulturmedium gewaschen und in 200 ml ITES/RDF-Medium in einer Dichte von 1 · 10&sup6; Zellen pro ml Kulturmedium suspendiert, danach wurden jeweils 10 ml der Zellsuspension in 20 Petrischalen mit einem Durchmesser von 10 cm gegossen. In Gegenwart von 5% CO&sub2; wurden die Zellen 3 Tage bei 37ºC gezüchtet und danach wurde das Kulturmedium zentrifugiert und der Überstand gewonnen.
Aus dem durch HO-323-Züchtung gewonnenen, IPSF enthaltenden Überstand wurde IPSF nach dem folgenden Verfahren aufgereinigt. Der Überstand wurde unter Verwendung eines Filters mit einer Porengröße von 0,22 um gefiltert (geliefert von Millipore), danach wurde das Filtrat in einen mit der Ultrafiltrationsmembran UF-1000PS, UF-300PS, UF-100PS , UF-50PS oder UF-10PS (geliefert von Tosoh Corp.) ausgestatteten Filterhalter gegeben (UHP- 43, geliefert von Toyo Kagaku Sangyo) und einer Ultrafiltration unter einem Stickstoffdruck von etwa 2 kg/cm² unterworfen. 100 ml des Filtrates wurden der Ultrafiltration mit UF-1000PS unterworfen, wobei etwa 10 ml des Konzentrates (nachstehend als "UF-1000PS-Fraktion" bezeichnet) auf der Ultrafiltrationsmembran zurückblieben und etwa 90 ml Filtrat erhalten wurden. Dann wurde das Filtrat unter Verwendung von UF-300PS gefiltert, wobei etwa 10 ml des Konzentrates (nachstehend als "UF-300PS-Fraktion" bezeichnet) und etwa 80 ml des Filtrates parallel erhalten wurden. In ähnlicher Weise wurde das Filtrat hintereinander unter Verwendung von UF- 100PS, UF-50PS und UF-10PS gefiltert. Es wurden jeweils 10 ml des nach dem Molekulargewicht getrennten Überstandkonzentrates erhalten (nachstehend als "UF-100PS-Fraktion, UF-50PS-Fraktion und UF-10PS-Fraktion" bezeichnet).
Jedes Konzentrat wurde gegen Phosphat-gepufferte physiologische Kochsalzlösung (PBS) dialysiert und die in der Dialysemembran enthaltene Flüssigkeit (nachstehend als "Dialysat" bezeichnet) wurde dem Mensch- Mensch-Hybridom HF10B4 zugesetzt, um die Stimulierungswirkung auf die Antikörperproduktion zu untersuchen. D.h. HF10B4 wurde in einer Zelldichte von 5 · 10&sup4; pro ml Kulturmedium auf 10% Dialysat enthaltendes ITES/RDF- Medium und zum Vergleich auf 10% PBS enthaltendes ITES/RDF-Medium überimpft. In Gegenwart von 5% CO&sub2; wurde die Züchtung 3 Tage bei 37ºC durchgeführt. Dann wurde die IgM-Menge im Kulturüberstand nach dem Enzym-markierten Antikörperverfahren gemessen.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt, wobei die Histogramme a, b, c, d, e und f PBS, UF-10PS, UF-50PS, UF-100PS, UF-300PS bzw. UF-1000PS bedeuten. Wie aus den in Fig. 1 gezeigten Ergebnissen deutlich wird, konnte IPSF durch die Ultrafiltration mit der Ultrafiltrationsmembran UF-1000PS oder UF-300PS aufgereinigt werden.

Beispiel 2

In der gleichen Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde HO-323 in dem serumhaltigen Medium sowie anschließend in dem ITES/RDF-Medium gezüchtet. Es wurden 200 ml eines IPSF enthaltenden Kulturüberstandes gewonnen. Ammoniumsulfat wurde dem Überstand in einer 40% der Sättigungskonzentration entsprechenden Konzentration zugesetzt und der pH- Wert wurde mit IN Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt. Dann wurde der gesamte Überstand zur Adsorbierung von IPSF auf eine Säule gegeben (30 ml: 16 mm · 15 cm), die mit "Butyl-Toyopearl 650M" gefüllt (geliefert von Tosoh Corp.) und mit 20 mM Tris-Salzsäure (Tris-HCl)-Puffer (pH 7,0) enthaltend Ammoniumsulfat mit 40% Sättigungskonzentration, äquilibriert war. Die Elution wurde nacheinander mit jeweils 90 ml 20 mM Tris-HCl-Puffern durchgeführt (pH 7,0), die Ammoniumsulfat in einer 30%, 20%, 10% oder 0% Sättigungskonzentration enthielten. Jedes Eluat wurde in einen mit der Ultrafiltrationsmembran UF-30PS (geliefert von Tosoh Corp.) versehenen Filterhalter gegeben (UHP-43, geliefert von Toyo Kagaku Sangyo) und der Ultrafiltration unter einem Stickstoffdruck von etwa 2 kg/cm² unterworfen. Auf diese Weise erhielt man jeweils etwa 10 ml Konzentrat auf der Ultrafiltrationsmembran.
Jedes Konzentrat wurde gegen PBS dialysiert. HF10B4 wurde in einer Dichte von 1 · 10&sup5; Zellen pro ml Kulturmedium in ITES/RDF-Medium überimpft, dem 10% des Dialysates zugegeben wurden, und zum Vergleich auch in 10% PBS enthaltendes ITES/RDF-Medium. In Gegenwart von 5% CO&sub2; wurde die Züchtung 24 Stunden bei 37ºC durchgeführt, dann wurde die IgM-Menge im Kulturüberstand gemessen.
Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt, wobei die Histogramme g, h, i, j, k und l PBS, 40% gesättigte Ammoniumsulfat-Konzentration, 40-30% gesättigte Ammoniumsulfat-Konzentration, 30-20% gesättigte Ammoniumsulfat- Konzentration, 20-10% gesättigte Ammoniumsulfat-Konzentration bzw. 10-0% gesättigte Ammoniumsulfat-Konzentration bedeuten. Wie aus den in Fig. 2 gezeigten Ergebnissen deutlich wird, wurde IPSF in den Fraktionen eluiert, die Ammoniumsulfat in einer 20-10% Sättigungskonzentration und 10-0% Sättigungskonzentration enthielten.

Beispiel 3

In der gleichen wie in Beispiel 1 beschriebenen Weise wurden der Kulturüberstand von HO-323 einer Ultrafiltration unter Verwendung der Ultrafiltrationsmembranen UF-1000PS und UF-300PF unterworfen und die auf den Membranen zurückgebliebenen Konzentrate (UF-1000PS-Fraktion und UF-300PS-Fraktion) gewonnen.
Jedes Konzentrat wurde gegen PBS dialysiert und HF10B4 wurde in einer Dichte von 2 · 10&sup5; Zellen pro ml Kulturmedium in 10% des Dialysates enthaltendes ITES/RDF-Medium überimpft. In Gegenwart von 5% CO&sub2; wurde die Züchtung 24 Stunden bei 37ºC durchgeführt und dann die IgM-Menge im Kulturüberstand mit dem Enzym-markierten Antikörperverfahren gemessen. In ähnlicher Weise wurde die Züchtung gleichzeitig in dem ITES/RDF-Medium, das statt des Dialysates 10% FCS enthielt, und in dem ITES/RDF-Medium, das statt des Dialysates 10% PBS enthielt, durchgeführt und in jedem Überstand wurde die produzierte IgM-Menge gemessen.
Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt, wobei die Histogramme m, n, o und p PBS, UF-300PS, UF-1000PS bzw. FCS bedeuten. Es ist ersichtlich, daß sich bei Zugabe des Dialysates der UF-1000PS-Fraktion die von HF10B4 produzierte Antikörpermenge auf etwa das Achtfache der bei PBS-Zugabe produzierten Antikörpermenge belief und daß die Fähigkeit von HF10B4 zur Antikörperproduktion im wesentlichen genauso groß ist wie die, welche man bei Zugabe von FCS beobachtet.

Beispiel 4

In der gleichen wie in Beispiel 3 beschriebenen Weise wurden 10% des Dialysates der UF-1000PS-Fraktion aus dem Überstand des HO-323- Kulturmediums dem ITES/RDF-Medium zugegeben und HF10B4 in einer Dichte von 5 · 10&sup4; Zellen pro ml Kulturmedium angeimpft. Die Züchtung wurde 3 Tage bei 37ºC in Gegenwart von 5% CO&sub2; durchgeführt und zur Untersuchung der Zellwachstumsrate wurde die Zelldichte im Kulturmedium während des Zeitablaufs gemessen. Gleichzeitig wurde die Züchtung in ähnlicher Weise in ITES/RDF-Medium durchgeführt, das statt des Dialysates 10% FCS enthielt, und desweiteren in ITES/RDF-Medium, das statt des Dialysates 10% PBS enthielt, und die Wachstumsrate wurde untersucht.
Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt, wobei q, r und s FCS, Dialysat bzw. PBS bedeuten. Es ist ersichtlich, daß sich die Wachstumsrate von HF10B4 bei Dialysatzugabe nicht wesentlich von der Wachstumsrate unterschied, die bei PBS-Zugabe erhalten wurde, und daß die Verdopplungszeit im Fall der Dialysatzugabe 33,6 Stunden und die Verdopplungszeit im Fall der PBS-Zugabe 36 Stunden betrug. Dies bestätigte, daß das Dialysat keinen wesentlichen Einfluß auf das Wachstum von HF10B4 hat. Im Gegensatz dazu betrug die Verdopplungszeit bei FCS-Zugabe 15,6 Stunden, was bestätigte, daß FCS die Zellwachstumsrate drastisch erhöht.

Claims

1. Physiologischer Wirkstoff,

(i) der die Antikörperproduktion eines Hybridoms anregt und

(ii) der durch Züchtung der menschlichen B-lymphoblastoiden Zellinie HO- 323 und durch Gewinnung des physiologischen Wirkstoffes aus dem Kulturmedium erhalten werden kann und

(iii) der unfähig ist, die UF-300PS-Ultrafiltrationsmembran zu durchdringen.

2. Physiologischer Wirkstoff nach Anspruch 1, der erhalten werden kann durch Züchtung der menschlichen B-lymphoblastoiden Zellinie HO-323 in einem Medium, ausgewählt aus RPMI 1640-Medium, nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), Ham-F12-Medium und einem Gemisch davon.

3. Physiologischer Wirkstoff nach Anspruch 2, wobei das Kulturmedium ein Gemisch ist, umfassend RPMI 1640-Medium, nach Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium und Ham-F12-Medium in einem Volumenverhältnis von etwa 2 : 1:1.

4. Physiologischer Wirkstoff nach Anspruch 2 oder 3, wobei das Kulturmedium pro ml Kulturmedium etwa 20 bis 250 Einheiten Penicillin, etwa 20 bis 250 ug Streptomycin, etwa 5 bis 30 mM HEPES und etwa 8 bis 20 mM NaHCO&sub3; enthält.

5. Physiologischer Wirkstoff nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei das Kulturmedium weiterhin etwa 5 bis 10 Vol.% fötales Rinderserum bezogen auf das Gesamtvolumen des Kulturmediums enthält.

6. Physiologischer Wirkstoff nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei die menschliche B-lymphoblastoide Zellinie HO-323 bei einer Temperatur von etwa 35 bis 37ºC in Luft mit eingestellter Luftfeuchtigkeit, enthaltend etwa 5 bis 10% Kohlendioxid, und bei einem pH-Wert von etwa 7,0 bis 7,4 gezüchtet wird.

7. Verfahren zur Antikörperherstellung, umfassend die Züchtung eines Antikörper-produzierenden Hybridoms in einem Kulturmedium, das einen physiologischen Wirkstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 6 enthält.