DD243713A1

DD243713A1 - Verfahren zur gewinnung von monoklonalen antikoerpern gegen ratten-peritonealmastzellen

Info

Publication number: DD243713A1
Application number: DD27969585A
Authority: DD
Inventors: Heinrich Repke; Suse-Brigitte Savoly; Jutta Odarjuk; Norbert Rossow
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1985-08-15
Filing date: 1985-08-15
Publication date: 1987-03-11

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von monoklonalen Antikoerpern gegen Ratten-Peritonealmastzellen. Durch den Einsatz dieses Antikoerpers zur Separation von Mastzellpopulationen und potentiellen Praekusorzellen von Mastzellen aus natuerlichen Peritonealzellsuspensionen bzw. Kulturen unreifer lymphatischer Stammzellen ist eine neue Moeglichkeit zur Analyse des Problems der Mastzelldifferenzierung gegeben. Die Aufgabe wurde durch die Immunisierung von Maeusen mit chemisch modifizierten Praeparationen zytoplasmatischer Membranen reiner Ratten-Peritonealmastzellen geloest, wobei durch Fusion der Immun-Milzzellen mit einer speziellen Maus-Myelomzellinie Klone von Hybridzellen gebildet werden koennen, die den genannten Antikoerper in das Kulturmedium absondern. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die pharmazeutische Industrie.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von monoklonalen Antikörpern gegen Ratten-Pertionealmastzellen. Durch den Einsatz dieses Antikörpers zur Separation von Mastzellpopulationen und potentiellen Präkusorzellen von Mastzellen aus natürlichen Peritoneal-Zellsuspensionen bzw. Kulturen unreifer lymphatischer Stammzellen ist eine neue Möglichkeit zur Analyse des Problems der Mastzelldifferenzierung gegeben

Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die pharmazeutische Industrie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

In der Fachliteratur ist bereits bekannt, daß durch Fusion einer Zelle, die einen Antikörper zu erzeugen vermag, mit einer in vitro kultivierten Myelomzelle ein Hybridoma-Zellklon erhalten werden kann, der einen spezifischen Antikörper produziert (Köhler et al., Nature 256,495-497 [1975] und Eur. J. Immunol. 6, 511-519 [1976]).

Es wurden monoklonale Antikörper beschrieben, die mit hoher Selektivität mit den Granula menschlicher Mastzellen (Rimmer et al., J. Clin. Pathol.37,1 249-1255 [1984]) reagieren. Darüber hinaus wurde über solche monoklonalen Antikörper berichtet, mit deren Hilfe Membranantigene von monokleären Zellen und Mastzellen der Maus erkannt werden können. Dabei konnten unterschiedliche Antigene auf in Kultur differenzierten Mastzellen und Peritonealmastzellen nachgewiesen werden (Katz et al., Proc. Nat. Acad. Sei [USA] 80, 5916-5918 [1983]). . ·

Es ist jedoch nachteilig, daß die hier genannten Antikörper nicht für das international gebräuchliche Modell zur Testung potentieller Antianaphylaktika, die Ratten-Peritonealmastzelle, anwendbar sind.

Weiterhin ist nachteilig, daß die Antikörper, die gegen Maus-Mastzellen hergestellt wurden, durch Immunisierung mit kultivierten (d.h. hinsichtlich ihres Antigenspektrums veränderten) Mastzellen induziert wurden. Weiterhin sind diese Antikörper hinsichtlich ihrer Selektivität unzureichend charakterisiert. Die gegen humane Mastzellgranula gerichteten Antikörper erlauben nicht den Nachweis undegranulierter Mastzellen.

Bisher ist ein Hybridoma-Zellklon, der einen gegen antigene Oberflächendeterminanten der RattenmastzelIe gerichteten Antikörper in das Nährmedium ausscheidet, nicht bekannt geworden.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht in der Herstellung von Antikörpern, die in der Lage sind, selektiv mit Differenzierungsantigenen zu reagieren, die auf derZytoplasmamembran von Ratten-Peritonealmastzellen und deren potentiellen Präkursorzellen aus der mononukleären Reihe vorkommen. Damit sollen neue Möglichkeiten für das Verständnis der Mastzelldifferenzierung sowie zur Trennung bislang unbekannter Subpopulationen von Peritonealzellen eröffnet werden. Derartige Subpopulationen'sollen u.a. als neuartige Testmodelle für Immunpharmaka Verwendung finden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Hybridome herzustellen, die monoklonale Antikörper gegen Zelloberflächenantigene der Rattenmastzelle und ihrer potentiellen Präkursorzellen erzeugen. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß mit kultivierten Myelomzellen der Maus und Zellen aus der Milz einer zur Antikörperproduktion gegen Rattenmastzellen stimulierten Maus eine Zellfusion durchgeführt wurde. Die Kultivierung der entstandenen Hybride im Selektionsmedium führte zu Populationen von Hybridzellen, die die genannten monoklonalen Antikörper zu bilden imstande sind. Der Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht in folgendem:

1. Es werden Antikörper gegen die, international als Modell für die Testung potentieller Antianaphylaktika gebräuchliche Ratten-Peritonealmastzelle erzeugt.

2. Als Ausgangsmaterial der zur Immunisierung verwendeten Präparationen wurden frisch präparierte, nahezu vollständig gereinigte Ratten-Peritonealmastzellen benutzt.

3. Zur Vermeidung immunsuppressiver Effekte der Inhaltsstoffe der Mastzellgranula wurden diese durch Homogenisation mit anschließender Dichtegradientenzentrifugation nahezu vollständig von den zytoplasmatischen Membranen getrennt.

4. Eine weitere Antigenpräparation wurde ausgehend von intakten, nahezu vollständig gereinigten Ratten-Peritonealmastzellen durch Acetonextraktion und Glutaraldehydfixierung erzeugt. Durch dieses Verfahren findet neben der Eliminierung der Granula-Inhaltsstoffe eine strukturelle chemische Modifikation der potentiellen Antigene statt.

5. Zur Immunisierung wurden Mastzellpräparatipnen analog Punkt 3. und 4. (die 5 χ 10⁶ Zellen entsprachen) im Verhältnis 1:1 i.p. injiziert sowie ein 0,5 bis 1 x 10⁶ Zellen entsprechendes Äquivalent unter Zusatz von kompletten Freundschen Adjuvans in die axilliären Lymphknoten gespritzt.

6. Entsprechend der Aufgabenstellung konnte eine spezifische Reaktion der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper mit Peritonealmastzellen und bestimmten Zellpopulationen der mononukleären Reihe nachgewiesen werden, während mit den anderen untersuchten Zellen bzw. Geweben der Ratte keine Reaktion auftrat (Milz, Lymphknoten, Thymus, Knochenmark, mononukleäre Zellen und Granulozyten des Blutes, Erythrozyten, Leber, Hirn; vergl. Abb. 1). Die o. g. Antikörper gehören nicht zur Immunglobulinklasse E und weisen keine Anti-Ratte-lgE-Aktivität auf. Die Klone 14-1 /D5,14-1/F2,14-3/C12 und 14/3/A12 sind im Institut für Wirkstofforschung der ADW der DDR zugänglich und die Antikörper wurden im Zentralinstitut für Molekularbiologie der ADW der DDR unter den Nummern DDR 0130, DDR 0131 registriert. Die Erfindung soll anhand eines Beispiels näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiel

A) Herstellung einer den Antikörper erzeugenden Zelle 1. Präparation des Antigens

Nach Ethernarkose und Dekapitierung männlicher Wistarratten im Alter von 3 bis 4 Monaten wurden 10 ml isotonische Phosphatpuffer, pA 7,4 (PBS), intraperitoneal appliziert. Nach Peritonealmassage (1,5 Minuten) wurde der Bauchraum geöffnet, das Peritonealexsudat entnommen und in ein 10μ,Ι Heparin enthaltendes Zentrifugenglas gegeben. Das durch Zentrifugation gewonnene Zellpellet (10 Min./160 χ g; 4°C) wurde in 1 ml isotonischem Phosphatpuffer suspendiert und auf einen kontinuierlichen Percoll-Gradienten geschichtet. Es schloß sich eine Zentrifugation bei 4°C für 20 Minuten bei 380 χ g an. Die Mastzellfraktion (Ausbeute 40 bis 60%) wurde durch Zentrifugation (10 Min. 160 x g, 4 C) zweimal in PBS-(I % HSA) gewaschen. Zuletzt wurde das Pellet in 1 ml PBS-(I % HSA) aufgenommen, die Zellzahl ermittelt und mittels Neutralrotfärbung der Reinheitsgrad der Präparation bestimmt, der bei 97 bis 100% Mastzellen lag.

Zur Herstellung granulafreier Membranfragmente wurde die so gereinigte Mastzellsuspension im Potter-Homogenisator homogensiert, gewaschen (4°C, 10Min. bei 160 χ g) und in 1 ml PBS-(I % HSA) aufgenommen. Die erste Abtrennung freier Mastzellgranula erfolgte durch Überschichtung auf eine 100%ige Saccharoselösung und nachfolgender Zentrifugation bei 160 χ g (10 Min., 4⁰C). Das entstandene Pellet setzt sich aus Membranen und Zytoskelett-Granula-Assoziaten zusammen. Das in isotonem Puffer gewaschene Pellet wird mit 0,3 ml einer gesättigten Saccharoselösung für 15 Minuten inkubiert und anschließend mit 10ml eines hypotonen Phosphatpuffers (30 Minuten) einem osmotischen Schock unterworfen. Durch die nachfolgende milde Ultraschallbehandlung (45Min., Raumtemperatur) werden Zytoskelett-Granula-Aggregate aufgelöst. Das durch Zentrifugation (10 Minuten, 160 χ g,4°C) entstehende Pellet wird in 1 ml isotonischem Phosphatpuffer resuspendiert. Die Abtrennung der freien Granula erfolgt wie oben beschrieben. Die Fixierung der Mastzellen erfolgte so, daß das Pellet gereinigter Mastzellen für 5 Minuten mit 5 ml eiskaltem Aceton (p.A.) versetzt und anschließend zentrifugiert wurde (4⁰C, 10 Min., 160 x g). Danach erfolgte bei Raumtemperatur die Zugabe von 2 ml Glutaraldehyd (2,5%ig) für 5 Min., dessen Überschuß durch zweimaliaes Waschen im PBS (4⁰C, 10Min., 160 x g) entfernt wurde.

2. Immunisierung der Mäuse

Zur Immunisierung der weiblichen A/J χ Balb/c F1-Hybride wurde eine Mischung von Membranen und fixierten Zellen im Volumenverhältnis 1:1 verwendet. Es wurden jeweils 5 χ 10⁶ Zellen (und die aus dieser Zellmenge gewonnenen Membranfragmente) in 0,5mi PBS i.p. und 0,5 bis 1 x 10⁶Zellen bzw. Zelläquivalente (1:3 mit komplettem Freundschen Adjuvans gemischt) in die axilliären Lymphknoten appliziert. Immunisiert wurde am 1 .,8. und 29.Tag. Die Fusion erfolgte 4 Tage nach der letzten Immunisierung.

3. Gewinnung der Milzzellsuspension

Immun-Milzzellen der Maus wurden unter sterilen Bedingungen durch Homogenisation vereinzelt und nach Filtration durch Müller-Gaze 2 x mit PRMI 1640 mit2mM Glutamin (RPMI-GIu) gewaschen (10Min., 200 X g) und auf 1,4 x 10⁷ Milzzellen/ml verdünnt.

B) Zellfusion zur Bildung der Hybridoma-Zellklone

Die nach A) 3. erzeugte Milzzellsuspension (7 χ 10⁷ Zellen) wurde mit 5 x 10^e serumfrei gewaschenen Myelomzellen der ZellinieP301 (ACOLLA, Lousanne) bei 4⁰C vermischt, welche vorher 48 Std. in vitro kultiviert wurden. Die Zellsuspension wurde anschließend bei4°Csedimentiert. Die anschließende Fusionsprozedur erfolgte im Wasserbad bei +37⁰C. Zunächst wurden 0,5 ml Polyethylenglykol, MG: 1000 (42%ig), unter ständigem Bewegen der Zellsuspension im Verlaufe einer Minute und dann 0,5ml Polyethylenglykol (25%ig) ebenfalls innerhalb der gleichen Zeitspanne zugetropft. Anschließend wurden in der gleichen Weise 4ml RPMI-GIu im Verlaufe von 4 Minuten zugesetzt. In 27 ml desauf 37⁰C vorgewärmten kompletten Nährmediums (RPMI-GIu + 20% ultrafiltriertes Rinderserum der Fa. Bioveta, CSSR + 5 x 10"⁵M Mercaptoethanol) wird diese Zellsuspension in einem Erlenmeyer-Kolben unterschichtend zugesetzt. Dann erfolgte zum Abschluß der Fusionsprozedur die Inkubation bei 37⁰C über 3 Stunden in einem CO₂-lnkubator. Während dieser Zeit wurde der Kolben mehrmals vorsichtig geschwenkt. Nach Abschluß der Inkubation werden je 0,1 ml der Zellsuspension in die jeweils 96 Vertiefungen von Falcon-Mikrotestplatten übertragen. Diese wurden 24 Stunden vorher mit 7 χ 10~⁴ Feederzellen in 0,1 ml beschickt.

C) Selektion der Hybridoma-Zellklone

Die Selektio der aufwachsenden Hybridzellklone erfolgte im HAT-Medium nach Littlefield. Nach 1,3, 6 und 9 Tagen wurden 100/aI des Mediums entnommen und durch frisches HAT-Medium ersetzt. Nach weiteren 4 Tagen wurde HT-Medium verwendet.

D) Erzeugung und Isolierung der Antikörper

Nach 14 Tagen erfolgte der erste Test der Klonüberstände gegen gereinigte intakte Mastzellen im indirekten Immunofluoreszenztest. Zur Testung unter Einsatz geringer Zellmengen wurde eine Testplatte mit 96 Vertiefungen und einem Glasboden verwendet. Pro Vertiefung wurden ca. 5 bis 20000 Zellen eingesetzt, die durch Zentrifugation der Platte (10 Min., 150g, Raumtemperatur) so fest an den Glasboden gebunden werden, daß eine nachweisbare Ablösung während der Waschprozeduren unterbleibt. 50μΙ der Klonüberstände wurden pro Vertiefung appliziert. Anschließend wurde die Testplatte in einer feuchten Kammer bei 37⁰C für 60 Min. inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS wurden pro Vertiefung 20μΙ ZAMAK-FITC pipettiert und erneut bei 37⁰C für 45 Min. inkubiert. Nach dreimaligem Waschen in PBS erfolgte die Auswertung.

E) Spezifität und Eigenschaften der monoklonalen Antikörper

Zur Untersuchung der Spezifität der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper wurden diese mit Hilfe des indirekten Immunofluoreszenztestes hinsichtlich der Reaktion mit anderen lymphatischen Zellen der Ratte getestet bzw. mit Homogenaten verschiedener Organe der Ratte absorbiert. Die hierzu benötigten Gewebspräparationen wurden wie folgt hergestellt:

— Peritonealzellen wurden aus dem Bauchraum nach Injektion von 10ml isotonischem Puffer und Massage gewonnen,

— Peritonealmakrophagen wurden 3 Tage nach Paraffinstimulation aus dem Peritoneum entnommen,

— Knochenmarkzellen wurden aus Knochen der hinteren Extremitäten gewonnen,

— Einzelzellsuspensionen von Milz, Thymus und Lymphknoten werden durch schonende Homogenisation des Gewebes und Gazefiltration gewonnen,

— Granulozyten und mononukleäre Zellen des Blutes wurden mit Hilfe von Ficoll/Visotrast-Gradienten gewonnen.

— Zu Absorbtionsuntersuchungen wurden Homogenatevon Leber, Hirn und Milz hergestellt, die im Volumenverhältnis4:1 mit unterschiedlichen Verdünnungsstufen der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper bei 25⁰C für 60 Min. inkubiert und durch Zentrifugation eliminiert wurden. Der Absorbtionserfolg wurde durch den Vergleich der Reaktion der unterschiedlichen Verdünnungsstufen mit der Reaktion unabsorbierter Klonüberstände gegenüber Ratten-Peritonealmastzellen im Immunofluoreszenztest bewertet.

Die in Abb. 1 zusammengefaßten typischen Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen Antikörper mit 100% der Peritonealmastzellen, 60% der Gesamtperitonealzellen und rund 35% der Peritonealmakrophagen, die nach Paraffinstimulation gewonnen wurden, reagieren. Alle anderen untersuchten Zellen bzw. Gewebe der Ratte weisen keine Reaktion mit den Antikörpern auf.

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper gehören nicht zur Klasse der Immunoglobuline E, wie durch die fehlende Reaktion mit Peritonealmastzellen und anderen Peritonealzellen von zwei Mausstämmen gezeigt werden konnte. Die o.g.

Antikörperführen in Abwesenheit von Phosphatidylserin nicht zur Mediatorfreisetzung aus Ratten-Peritonealmastzellen und stellen somit keine Anti-Ratten-lgE-Antikörper dar.

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper beeinflussen die durch Protaminsulfat, Poly-L-Lysin, Compound 48/80, A23187 bzw. durch Mellitin induzierte Mediatorfreisetzung aus Ratten-Peritonealmastzellen nicht.

Die Aktivität der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper wird nicht durch Einfrieren (-2O⁰C) und Auftauen beeinflußt.

Das Einfrieren und Reaktivieren der entsprechenden antikörperproduzierenden Hybridzellklone beeinflußt deren Antikörperbildung nicht.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Ratten-Peritonealmastzellen, gekennzeichnet dadurch, daß eine Hybridzelle zwischen einer Zelle, die angeregt wurde. Antikörper gegen frisch präparierte Ratten-Peritonealmastzellen zu bilden, wobei zur Immunisierung ein Gemisch aus Mastzellmembranen und fixierten Mastzellen verwendet wurde, und einer Zelle, die permanent durch eine in vitro-Kultur unterhalten werden kann, gebildet wird, und daß der, von der Hybridzelle abgesonderte Antikörper spezifisch ist für ein Oberflächenantigen von Mastzellen und anderen Peritonealzellen der Ratte.

2. Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei der Zelle, die den Antikörper bilden kann, um eine Milzzelle handelt.

3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Zelle aus einer Maus stammt.

4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei der Maus um eine BALB/c-Maus oder eine Hybridmaus davon handelt.

5. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei der Zelle, die durch eine in vitro-Subkultur permanent unterhalten werden kann, um eine Myelomzelle handelt.

6. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle, die permanent durch eine in vitro-Subkultur unterhalten werden kann, einen Mangel an Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase hat.

7. Verfahren nach Punkt 5 oder 6, gekennzeichnet dadurch, daß die Zelle aus einer Maus stammt.

8. Verfahren nach Punkt 7, gekennzeichnet dadurch, daß dieZelleausderZellinie P301 stammt.

9. Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnet dadurch, daß die Milz-Zelle aus einem mit Mastzellpräparationen immunisierten Tier stammt.

10. Verfahren nach Punkt 1 und 9, gekennzeichnet dadurch, daß zur Immunisierung ein Gemisch aus Mastzellen und nativen Mastzellmembranen verwendet wird.

11. Verfahren nach Punkt 1,9 und 10, gekennzeichnet dadurch, daß Mastzellpräparationen von 95 bis 99% Reinheit verwendet werden.

12. Verfahren nach Punkt 1 und 9 bis 11, gekennzeichnet dadurch, daß die Mastzellen mit Aceton und Glutaraldehyd fixiert werden.

13. Verfahren nach Punkt 9 bis 11, gekennzeichnet dadurch, daß durch Homogenisation, osmotischen Schock, Ultraschallbehandlung sowie Dichtegradientenzentrifugation granulafreie Membranpräparationen aus Ratten-Peritonealmastzellen hergestellt werden.

14. Verfahren nach Punkt 1 und 9 bis 11, gekennzeichnet dadurch, daß die fixierten Mastzellen und die Mastzellmembranen im Verhältnis 1:1 gemischt für die Immunisierung verwendet werden.

15. Verfahren nach Punkt 1 und 9 bis 14, gekennzeichnet dadurch, daß etwa 5 χ 10⁶ Mastzellen bzw. die aus dieser Zellmenge gewonnenen Membranen pro Immunisierung i.p. und 0,5 bis 1 χ 10⁶ Mastzellen entsprechende Zahl von Membranfragmenten in die axilliären Lymphknoten, die man mit 1:3 Freunds kompletten Adjuvans vermischt, appliziert werden.

16. Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnet dadurch, daß die Hybridzelle in Gegenwart von Polyethylenglykol hergestellt wird.

17. Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnet dadurch, daß die Hybridzelle in einem Hypoxanthin, Aminoopterin undThymidin enthaltenden Medium für die Selektion kultiviert wird.

18. Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnet dadurch, daß Klone von Hybridzellen hergestellt werden.

19. Verfahren nach Punkt 1 und 18, gekennzeichnet dadurch, daß für das Klonieren das limitierte Verdünnungsverfahren angewendet wird.

20. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß Hybridzellen zur Absonderung des Antikörpers in vitro kultiviert werden.

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