DE4109973C2 - In ovo-Kultivierungssystem für Hybridomzellen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Kultivierungssystem für Säugerzellen, nämlich monoklonale Antikörper (mAk) produzierende Hybridomzellinien sowie die Gewinnung der von den Zellen produzierten Stoffe, den mAk aus diesem System. Die Erfindung findet in Kultivierungsverfahren für Säugerzellen Anwendung - z. B. für Hybridoma heterologen und homologen Ursprungs - sowie in der Hybridomtechnik im Rahmen der Medizin, Veterinärmedizin und Biotechnologie.

Die Säugerzellkultur wird seit geraumer Zeit für die Herstellung verschiedener biologisch aktiver Proteine, wie Virusantigene, Interferone, Plasminogenaktivator u. a. genutzt. In den letzten 10 Jahren ist die Massenkultivierung von Säugerzellen deutlich intensiviert worden, wie das 10. Meeting der ESACT (European Society for Animal Cell Technology) 1990 zeigte (ESCAT: Production of Biologicals from Animal Cells in Culture Research, Development and Achievements, Palais des Papes, Avignon, France, May 7-11, 1990). In den Präsentationen wurde die Produktion von verschiedenen biologisch aktiven rekombinanten Proteinen sowie einer Reihe von mAk in Säugerzellkulturen vorgestellt.

Die Herstellung mAk wurde erstmals von Köhler und Meilstein beschrieben (Nature, 1975, 256, 495). Sie hatten ein Verfahren zur Fusion von murinen antikörperbildenden Zellen (B-Lymphozyten) mit permanent wachsenden Plasmozytomzellen entwickelt, daraus Hybridomzellen etabliert und aus ihnen mAk gewonnen.

Eine entscheidende Etappe bei der Herstellung mAk ist die "Massenproduktion", um die benötigten hohen Antikörpermengen für eine Anwendung, z. B. in diagnostischen Systemen, zu sichern. Nach H. Katinger ist die physiologische Stabilität der Hybridoma eine wesentliche Voraussetzung für eine Massenkultur (Katinger, H.: Massenproduktion monoklonaler Antikörper, in: von Baehr, R., Ferber, H. P., und Porstmann, T. (Hrsg.): Monoklonale Antikörper, Anwendung in der Medizin, Springer-Verlag, Wien; New York, 1989, 3-17). Die Massenproduktion von mAk könne

• 1. über die Anzucht hoher Zellmassen,
• 2. über die Langzeiterhaltungskultur einer bestimmten Zellmasse und
• 3. über eine Kombination aus Masse und Langzeiterhaltung

erzielt werden.

Gegenwärtig stehen für die Produktion größerer Mengen muriner mAk zwei Verfahren zur Verfügung (Tesch, M., et al.: Methodische Aspekte der Herstellung humaner und muriner Antikörper in Maus-Ascites-Flüssigkeit, in: von Baehr et al., ibid., 47):

• - Massenzellkultur durch Fermentation mit verschiedenen technischen Variationen und
• - Injektion der Hybridomzellen in syngene Mäuse und Gewinnung der Ak aus der gebildeten Ascites-Flüssigkeit.

Trotz aller Verbesserungen an den Fermentation-Verfahren und ihren Reaktoren - von statischen Erhaltungskulturen, wie Hohlfasermodulen bzw. Wachstumsmodulen mit Flachmembranen oder Schlaufenreaktoren mit mechanischen Rührwerken bzw. Airlift-Reaktoren (Katinger, H., ibid.) - stellt die Produktion von mAk nach dieser Methode vor allem wegen des Anfalls relativ großer Flüssigkeitsmengen eine aufwendige Technik dar. Dazu kommt, daß die Herstellung größerer Mengen humaner mAk Schwierigkeiten bereitet: "Bereits in der in-vitro-Kultur zeigen Hybridome mit Produktion humaner monoklonaler Antikörper Wachstums- und Produktionsinstabilität" (Tesch, M., et al., ibid., 49).

Deshalb könnte, so wird dieses Zitat fortgesetzt, die Herstellung humaner mAk in Maus-Ascites einen Weg zur effektiven Produktion dieser Antikörper darstellen.

Doch der Massenproduktion von mAk aus der Ascites-Flüssigkeit stehen andere schwerwiegende Einwendungen entgegen. Zum einen verteuert sich die Tierzüchtung und -erhaltung ständig, zum anderen werden durch das Tierschutzgesetz die Möglichkeiten der Herstellung mAk in der Ascitesflüssigkeit der Maus künftig erheblich eingeschränkt (Tierschutzgesetz in der Fassung der Bekanntmachung vom 18. 08. 1986; BGbl. S. 1319).

Aus der Literatur ist bekannt, daß die Kultivierung von Tierzellen möglich ist, wenn das Kultivierungssystem ein embryoniertes Hühnerei ist ("Culture of animal cells", R. Jan Freshney, Alan R. Liss Inc. New York, 1988, S. 1). Ferner ist die Reinigung von monoklonalen Antikörpern beschrieben worden, wobei chromatographische Techniken, wie Absorption, Ionenaustausch oder Affinität, insbesondere an Protein a-Sepharose, Anwendung finden ("Animal Cell Technology: Principles and Products", M. Butler, Open University Press, 1988, S. 98).

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Möglichkeit zu schaffen, mit Hilfe eines geeigneten Systems sowohl die Nachteile der Fermentationstechnik als auch der Ascites- Produktion auszuschließen. Erfindungsgemäß wurde die Aufgabe dadurch gelöst, daß als System das Ei (ovum) Verwendung findet. Es hat sich herausgestellt, daß Hybridomzellen in Eiern, insbesondere in Vogeleiern, lebensfähig sind. Wenn Hybridomzellen, die in der Lage sind, mAk zu produzieren, in embryonierte SPF (specific pathogen free-)Hühnereier inokuliert werden, leben sie in den verschiedenen Kompartimenten des Eies weiter, vermehren sich dort und produzieren mAk.

Das Überleben der Hybridomzellen und die Produktion von mAk läßt sich nachweisen, wenn die Inokulation der Zellsuspension z. B. in die Allantoishöhle, den Dottersack oder unter bzw. auf die Chorio-Allantois-Membran (CAM) des embryonierten Vogeleies erfolgt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung besteht darin, die Hybridomzellen nach der Kultivierungsphase in der Eiflüssigkeit zurückzugewinnen. Dazu wird die zellhaltige Eiflüssigkeit zentrifugiert, das entstehende Zellpellet in Zellkulturmedium resuspendiert und die Zellsuspension in Zellkulturplatten ausgesät.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung besteht darin, die in der Eiflüssigkeit, vorzugsweise in der Allantoisflüssigkeit, angereicherten mAk zu gewinnen. Dazu wird der mAk über eine Protein-A-Säule gebunden, nach der Eluierung dialysiert und nach Eiweißbestimmung sowie Sterilfiltration bei -70°C gelagert.

Das erfindungsgemäße in ovo-Kultivierungssystem stellt ein neues Kultivierungssystem für Hybridomzellen dar. Ein wesentlicher Vorteil dieses Systems besteht darin, daß es die Herstellung mAk aus der Mausascitesflüssigkeit umgeht.

Die folgenden Beispiele stellen Ausführungsformen der Erfindung dar, ohne sie jedoch darauf zu beschränken.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1: Hybridomzellinien Beispiel 1.1

Die in Zellkulturflaschen (Greiner/Labortechnik GmbH, D-5650 Solingen, Katalog für Medizin und Forschung, 1990; Technomara Deutschland GmbH / Costar, D-6301 Fernwald, Katalog 1989/90) kultivierten mAk produzierenden Hybridomzellen heterologen bzw. homologen Ursprungs sowie unterschiedlicher Spezifität werden resuspendiert und bei 1000 U/min in serumfreiem Zellkulturmedium - RPMI 1640 (Moore, G. E., et al., J. Am. Assoc., 199, 519-524, 1967) - 10 min zentrifugiert.

Nach Resuspension der Zellen in serumfreiem Zellkulturmedium wird die Zellkonzentration eingestellt (von 1,5 bis 6×10⁶ Zellen pro 500 µl). 10 Tage vorbebrüteten SPF-Eiern werden jeweils 500 µl der Zellsuspension in die Allantoisflüssigkeit mittels der bei Mayr et al. beschriebenen Methode inokuliert (Mayr, A., Bachmann, P. A., Bibrack, B., und Wittmann, G.: Virologische Arbeitsmethoden, Bd. 1, Zellkulturen - Bebrütete Hühnereier - Versuchstiere, Gustav Fischer Verlag, Jena, 1974).

Die Weiterbebrütung der Eier, vorzugsweise Hühnereier, erfolgt unter den herkömmlichen Bedingungen (insbesondere Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Wendeintervalle). 3 Tage nach der Inokulation der Zellsuspension wird durch Öffnung des Eies und mittels Pipetten die zellhaltige Allantoisflüssigkeit gewonnen.

Die wiedergefundenen Hybridomzellen werden mikroskopisch bestimmt (Wiederfindungsrate), und mittels eines FITC-(Fluorescein- Isothiocyanat-)markierten anti-Maus-IgG-Antikörpers wird der Anteil von Zellen mit zytoplasmatischen Immunglobulinen an der Gesamtzellpopulation ermittelt.

Der Antikörpergehalt der gewonnenen Allantoisflüssigkeit wird durch die Bestimmung im Enzymimmunoassay festgestellt. Je nach Zellinie werden 1,5 bis 110 µg pro ml mAk in der Allantoisflüssigkeit nachgewiesen.

Als Kontrollen wurden unbehandelte SPF-Eier der gleichen Eieinlage sowie SPF-Eier, die nur mit 500 µl PBS oder RPMI 1640 (ohne Zellen) beimpft wurden, mitgeführt.

Beispiel 1.2

Nach der Gewinnung der Hybridomzellen aus den Standardkulturgefäßen und der Zentrifugation (wie unter Beispiel 1.1 beschrieben) werden Zellsuspensionen mit folgenden Zellkonzentrationen hergestellt:
2×10⁶, 3×10⁶ und 5×10⁶ Zellen pro 500 µl Zellkulturmedium.

Mit diesen verschiedenen Zellsuspensionen werden 6 Tage vorbebrütete SPF-Hühnereier in folgende Kompartimente beimpft:

• a) in die Allantoishöhle,
• b) in den Dottersack,
• c) auf die Chorio-Allantois-Membran (CAM).

Dabei werden die Standardmethoden (Mayr et al., 1974, ibid.) angewendet.

Nach der Inokulation der Zellsuspension erfolgt die Weiterbebrütung unter herkömmlichen Bedingungen.

5 Tage post inoculationem wird die zellhaltige Allantoisflüssigkeit, wie unter Beispiel 1.1 beschrieben, geerntet.

Die Bestimmung der Zellzahl pro ml sowie des Antikörpergehaltes der gewonnenen Allantoisflüssigkeit erfolgt wie unter Beispiel 1.1.

Die Zellzahl erhöhte sich, je nach eingesetzter Zellinie und Beimpfungsroute, um den Faktor 4 bis 6.

Der mittlere Antikörpergehalt der Allantoisflüssigkeit liegt bei 10 bis 110 µg pro ml.

Die mitgeführten Kontrollen entsprechen denen in Beispiel 1.1.

Beispiel 1.3

Nach Vorbereitung der Hybridomzellen und Einstellen der Zellkonzentration entsprechend Beispiel 1.1 werden die Hybridomzellen in die Allantoishöhle von 12 bis 14 Tage vorbebrüteten Enteneiern, z. B. Pekingenteneiern oder Flugenten-(Cairina moschota-)eiern inokuliert.

Die Weiterbebrütung erfolgt unter den herkömmlichen Bedingungen.

4 bis 5 Tage post inoculationem wird die zellhaltige Allantoisflüssigkeit, wie unter Beispiel 1.1 beschrieben, gewonnen.

Die Bestimmung der Zellzahl sowie des Antikörpergehaltes der Allantoisflüssigkeit erfolgt wie in Beispiel 1.1.

Der mittlere Anikörpergehalt liegt, je nach Zellinie, bei 5 bis 110 µg/ml.

Die mitgeführten Kontrollen entsprechen denen in Beispiel 1.1.

Beispiel 1.4

Aus 10 SPF-Hühnereiern wird nach einer Inokulation von Hybridomzellen und einer dreitägigen Bebrütung (wie im Beispiel 1.1 beschrieben) die zellhaltige Allantoisflüssigkeit gewonnen. Sie wird 1 : 1 mit PBS verdünnt und zweimal 10 min mit 1000 U/min zentrifugiert.

Nach Resuspension des Zellpellets wird die Zellzahl auf 0,25×10⁶ Zellen/ml eingestellt. Danach werden die Zellen in 96-well- bzw. 24-well-Zellkulturplatten (Greiner/Labortechnik) ausgesät. Nach 24 Stunden wird das Zellkulturmedium - RPMI 1640/10% FKS (Fetales Kälberserum) - erneuert.

72 Stunden nach Einsaat wird der Antikörpergehalt im Zellkulturüberstand nachgewiesen. Er entspricht der etablierten Ausgangszellinie.

Beispiel 1.5

Eine 10-ml-Protein-A-Sepharosesäule (Protein A: Surolia, A., et al., Trends Bioch. Sci., 7 [1981], 74; Islikawa, E., and Kato, K., Scand. J. Immunol., Suppl. 7 [1978], 43) wird mit 80 ml 0,05 mol/l Trispuffer (Tris) mit 0,15 mol/l NaCl pH 8,2 equilibriert. Der pH-Wert der zu reinigenden Ak-haltigen Allantoisflüssigkeit wird mit 2 mol/l Tris auf pH 8,6 eingestellt.

Die Ak-haltige Allantoisflüssigkeit wird bei 2000 U/min^-1 15 min abzentrifugiert und sterilfiltriert. Danach wird das Konzentrat auf die equilibrierte Säule aufgetragen und mit dem Trispuffer nachgewaschen. Mit 0,05 mol/l Citratpuffer mit 0,15 mol/l NaCl wird der gebundene Antikörper bei pH 3,0 von der Säule eluiert. Das eluierte Produkt wird durch ein Sterilfilter in einen vorbereiteten Dialysebeutel filtriert und 12 Stunden gegen 5 Liter 0,05 mol/l Phosphatpuffer mit 0,15 mol/l NaCl pH 7,2 dialysiert. Nach der Dialyse wird die Extinktion bei 280 nm bestimmt und die Eiweißkonzentration im Präparat ermittelt. Der gereinigte Antikörper wird sterilfiltriert und für weitere Untersuchungen bei -70°C gelagert.

Antikörper, die sich nicht an Protein A binden lassen, werden nach der Ermittlung des isoelektrischen Punktes mittels Ionenaustauschchromatographie präpariert.

Claims (7)

1. In ovo-Kultivierungssystem für Säugerzellen auf der Grundlage embryonierter Eier, dadurch gekennzeichnet, daß es durch Inokulation von Hybridomzellen in das embryonierte Ei entsteht.

2. Kultivierungssystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Inokulation der Hybridomzellen in verschiedene Kompartimente eines Vogeleies, wie in die Allantoishöhle, den Dottersack oder in die Chorio-Allantois-Membran, erfolgt.

3. Verwendung des Kultivierungssystems nach den Ansprüchen 1 und 2 zur Produktion von monoklonalen Antikörpern.

4. Verfahren zur Gewinnung eines in ovo-Kultivierungssystems für Säugerzellen auf der Grundlage embryonierter Eier nach den Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß Hybridomzellen in das embryonierte Ei inokuliert werden.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Kultivierungssystem die Hybridomzellen monoklonale Antikörper produzieren.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridomzellen aus dem Kultivierungssystem durch Zentrifugieren der zellhaltigen Eiflüssigkeit, Resuspendieren des entstehenden Zellpellets in Zellkulturmedium und Aussäen der Zellsuspension in Zellkulturplatten zurückgewonnen werden.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß aus der Eiflüssigkeit die monoklonalen Antikörper durch chromatographische Methoden und durch Dialysieren gewonnen werden.