CN102140476B - 重组葡萄球菌蛋白a基因、含有该基因的表达载体及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组葡萄球菌蛋白A基因及其用途。本发明重组葡萄球菌蛋白A基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，所编码的蛋白质氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。本发明将葡萄球菌蛋白A与小泛素融合得到了重组葡萄球菌蛋白A基因，所表达的重组蛋白既利于蛋白的提纯又增加了蛋白的稳定性和活性，经实验证明，本发明所表达的重组葡萄球菌蛋白A与天然葡萄球菌蛋白A的生物活性无明显区别。本发明重组葡萄球菌蛋白表达和纯化方法具有生产时间短、表达效率高、表达量大、易于纯化等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种重排的基因，尤其涉及重组葡萄球菌蛋白A基因，本发明还涉及含有该基因的表达载体以及工程菌株，本发明进一步涉及它们在制备葡萄球菌蛋白A中的用途，属于葡萄球菌蛋白A基因工程领域。
背景技术
葡萄球菌蛋白A(staphylococcus protein A，SPA)是从金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细胞壁分离的一种蛋白质。葡萄球菌是革兰氏阳性菌，是最常见的化脓性球菌，为医院交叉感染的重要来源。菌体直径约0.8mm，小球形，常堆聚成葡萄串状，但在液体培养基的前期培养中，常常分散，菌细胞单独存在。早在1940年，Verwey发现在某些金黄色葡萄球菌中含有一种物质，在双向扩散试验中能与正常人血清形成沉淀。1959年Jensen发现此物质可与免疫球蛋白(主要为1gG)结合，并将其命名为A抗原。1963年Lofkvist等分离了该抗原，并证明它是一种蛋白质。1964年，Grov将其命名为葡萄球菌蛋白A，简称SPA或A蛋白(proteinA)。SPA为单链多肽，由于其结构中不含有胱氨酸及半胱氨酸，所以无二硫键。SPA全长为1503bp，其核酸序列、氨基酸序列见SEQID NO3，SEQ ID NO4，主要分三部分：第一部分是从N-端起的36 个氨基酸残基构成的信号肽序列S(在蛋白质转运后被切除)；第二部分是五个高度同源的IgG结合结构域E、D、A、B、C，每个结构域约58个氨基酸残基组成，为反3a螺旋束结构；第三部分是C-末端的X蛋白，是与细胞壁结合的成分，不具有IgG结合活性。SPA粘度高于球蛋白，等电点为pH 5.1，其天然结构十分稳定，在6mol/L鸟嘌呤盐酸盐变性剂的条件下，尚能保存某些三级结构，如将此变性剂除去，则能自然矫正恢复原有结构。
葡萄球菌蛋白A具有和很多种属的哺乳动物IgG的Fc端结合的能力，所以在发现之初就受到关注，经过多年的发展，蛋白A已经成为一种应用广泛的免疫学试剂于抗体纯化和免疫学的相关研究中。蛋白A占葡萄球菌菌体蛋白的1.7％，且葡萄球菌为致病菌，所以利用传统的方法从葡萄球菌中提取蛋白A有一定的难度，已经无法满足日益发展的生物产业，所以近些年来利用基因重组技术对蛋白A的重组原核表达技术也逐渐发展起来，期望以更简单的方法获得活性，稳定性更好的产品。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种重组葡萄球菌蛋白A基因，该基因可以在原核表达系统中稳定、高效的表达重组葡萄球菌蛋白A；
本发明目的之二是提供含有上述重组葡萄球菌蛋白A基因的表达载体；
本发明目的之三是提供由上述重组葡萄球菌蛋白A基因所转化的工程菌株；
本发明目的之四是提供一种制备重组葡萄球菌蛋白A的方法；
本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：
一种重组葡萄球菌蛋白A基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。
本发明的重组葡萄球菌蛋白A基因是以SUMO标签和葡萄球菌蛋白A抗体结合区域(SEQ ID NO：3)连接而成。SUMO标签为pSUMO载体上自带标签，构建时在葡萄球菌蛋白A抗体结合区域序列两端添加酶切位点BsaI和BamHI用于与载体相连，并在下游添加终止密码子TAA，上下游的序列分别为：
上游GGTCTCAAGGTAATGCTGCGCAACACG
下游CGCGGATCCTTAAGCATCGTTTAGCTTTTT。
本发明的重组葡萄球菌蛋白A基因的结构由6个His、SUMO标签、蛋白A抗体结合功能区串联而成，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，所编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；其中，葡萄球菌蛋白A基因的序列为SEQ ID NO.3所示，所编码的氨基酸序列由SEQ IDNO.4所示(由1185个核苷酸构成编码395个氨基酸)。
本发明还构建林含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组表达质粒及由该重组表达质粒的工程菌株。
本发明的重组表达质粒可通过本领域的常规方法构建而成，即将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为一个参考的实施方案，例如，可以将葡萄球菌蛋白A抗体结合区基因(SEQ ID NO：3)与大肠杆菌表达载体pSUMO利用酶切位点BsaI和BamHI相连，命名为p-SUMO-SPA。
本发明所构建的重组表达质粒可通过各种常规的方法转化宿主 细胞。作为参考，可以将含有重组蛋白A基因的表达载体p-SUMO-SPA转化大肠杆菌Rosetta得到的菌株，命名为Escherichia coliRosetta/p-SUMO-SPA，简称Rosetta/p-SUMO-SPA。
利用大肠杆菌重组菌株Rosetta/p-SUMO-SPA生产重组蛋白A的具体方法可以：
1、种子液的制备：将菌种划线培养后获得单菌落，将单菌落接种于10mlLB培养基中37℃培养12小时。LB培养基中加入100mg/L卡那霉素。
2、发酵：将获得的种子液按1：100接种于发酵培养基中，当培养至O.D600为0.4左右时加入IPTG诱导终浓度为5mM，37℃培养3小时左右收菌。
本发明还提供一种制备重组葡萄球菌蛋白A的方法，包括以下步骤：
构建含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的重组表达质粒；培养用该重组表达质粒所转化的宿主细胞，得重组菌株；培养重组菌株，诱导重组蛋白的表达，分离并纯化所表达的重组蛋白。
上述制备重组蛋白的方法中，优选的，所述的重组表达质粒优选是p-SUMO-SPA；所述的宿主细胞是大肠杆菌(Escherichiacoli)RosettaGS115，所述的重组菌株优选为Escherichia coliRosetta/p-SUMO-SPA。
上述制备重组蛋白的方法中，优选的，所述的重组蛋白的分离和纯化包括以下步骤：
(1)将收集的菌体用磷酸盐缓冲液悬浮，破碎后低温离心收集上清，利用Ni亲和柱和AKTA蛋白纯化系统进行蛋白粗提纯；
(2)将粗提纯的蛋白再利用AKTA系统进行分子筛的纯化，最终得到纯度达到90％以上的蛋白。
本发明将葡萄球菌蛋白A与小泛素融合表达，既利于蛋白的提纯又增加了蛋白的稳定性和活性，使得蛋白A的生产和应用得到了空前的发展。本发明的蛋白表达和纯化方法具有生产时间短、表达效率高、表达量大、易于纯化的优点，并且经实验证明，本发明所表达的重组蛋白A与天然蛋白A的生物活性无明显区别。
本发明说明书所涉及的名词或术语的解释：
1.葡萄球菌蛋白A：简称SPA或蛋白A(ProteinA)
2.p-SUMO-SPA：为含有本发明目的蛋白A基因的p-SUMO载体
3.p-SUMO：为一种大肠杆菌原核表达载体。
4.E.coli Rosetta：大肠杆菌菌株Rosetta。
5.E.coli Rosetta/p-SUMO-SPA：为转化了p-SUMO-SPA的E.coli Rosetta菌。
6.蛋白A抗体结合区域：在蛋白A全长基因中起到与抗体Fc端结合作用的核酸区域。
附图说明
图1本发明重组表达载体p-SUMO-SPA的构建示意图。
图2重组葡萄球菌蛋白A的SDS-PAGE凝胶电泳结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1葡萄球菌蛋白A抗体结合区基因的克隆
通过化学合成的方法合成所需的引物(上游5’GGTCTCAAGGTAATGCTGCGCAACACG 3’，下游5’CGCGGATCCTTAAGCATCGTTTAGCTTTTT 3’)；利用PCR方法获得葡萄球菌蛋白A抗体结合区域基因：
PCR体系： 25μl体系
10×Buffer 2.5μl
dNTP 2μl
引物 1.5μl×2
模板(DNA) 1μl
无菌水 16μl
rTaq酶 0.5μl
反应程序：1：95℃ 5min，2：95℃ 1min，3：57℃ 1min，4：72℃ 1min，5：2-4循环24次，6：72℃ 10min，4℃ 1h；
扩增到的序列长度为867bp，两端分别引入酶切位点BsaI和BamHI，包含终止密码子TAA。上述过程见图1。
实施例2葡萄球菌蛋白A抗体结合区基因与pSUMO载体的构建
用限制性内切酶BsaI和BamHI将实施例1所克隆的重组葡萄球菌蛋白A基因切下，同时与被相同酶切割之后的pSUMO载体(高效可溶性重组蛋白表达载体的构建，姜媛媛，刘铭瑶，任桂萍，朱慧萌，李德山。生物工程学报。2010，1，25；26(1)：121-129))相连接并转化大肠杆菌，筛选具有卡那霉素抗性的转化子，经质粒提取、酶切鉴定、测序后证明葡萄球菌蛋白A抗体结合区基因已克隆至pSUMO载体上。上述过程见图1。
实施例3能高效表达重组葡萄球菌蛋白A的大肠杆菌菌株E.coliRosetta/p-SUMO-SPA的构建
用化学转化方法将p-SUMO-SPA转化至E.coli Rosetta(购自北京全式金生物技术有限公司，商品代号CD801)，在含有卡那霉素的LB平板上筛选转化子，经质粒提取、酶切鉴定、测序分析获得的重组子E.coli Rosetta/p-SUMO-SPA。
实施例4利用大肠杆菌工程菌E.coli Rosetta/p-SUMO-SPA生产重组葡萄球菌蛋白A
1)菌种的培养发酵
挑取大肠杆菌工程菌E.coli Rosetta/p-SUMO-SPA，1％接种于 LB培养基中，37℃恒温培养12-14小时，次日1：100扩大培养至OD值为0.4，加IPTG至终浓度0.5mM继续培养3小时4000r/m 30m离心收集菌体。
取少量菌体加入10倍的上样缓冲液，煮沸5分钟后进行SDS-PAGE凝胶电泳结果见图2。
2)重组葡萄球菌蛋白A的纯化
将上述收集的菌体超声破碎离心后收集上清，将上清过滤后利用AKTA蛋白纯化系统进行纯化，先后进行亲和层析和分子筛层析得到纯化后的重组葡萄球菌蛋白A，电泳结果见图2。。
试验例1 Elisa检测表达的重组葡萄球菌蛋白A抗体结合试验
1)包被：将纯化后的重组葡萄球菌蛋白A在96孔板没孔包被100ul，4℃，12小时。
2)封闭：每孔加入100ul 5％脱脂奶粉进行封闭，37℃，1小时。
3)一抗孵育：每孔加入100ul兔抗体，37℃，1小时。
4)二抗孵育：没孔加入约100ul 1∶5000辣根标记抗体，37℃，1小时。
5)显色。
经Elisa检测本发明得到的重组葡萄球菌蛋白A与兔抗体具有很好的结合活性，与商业化的spa蛋白(spa蛋白购自本元正阳基 因技术股份有限公司，产品目录：R00013)相比活性相近。
实施例6 SUMO标签在不同条件下对spa抗体结合稳定性的作用
一、spa-SUMO-agarose和spa-agarose的制备：
(1)将spa-SUMO和spa两种蛋白分别制备5ml，溶剂为CouplingBuffer(0.1MNaHCO3，0.5MNaCl，ph＝9.0)，浓度均为5mg/ml。
(2)取活化好的agarose 1ml用WashBuffer(1mM HCl)反复冲洗凝胶15次以上每次WashBuffer的体积为1ml，WashBuffer应在冰上进行预冷并在洗涤过程中保持冰浴状态。
(3)将步骤(1)中制备好的5ml的两种蛋白分别与1ml洗涤完毕的凝胶进行混合，并将混合后的pH控制在9.0左右，将混合物置于4℃震荡条件下12小时。
(4)除去混合物中的液体，用5倍于凝胶体积的Coupling Buffer进行冲洗。
(5)将步骤(4)中清洗过后的凝胶置于5ml的Blocking Buffer(0.1MTris-HCl，pH 8.0)、4℃、震荡条件下2小时。
(6)除去Blocking Buffer，用溶液0.1MTris-HCl，0.5MNaCl，PH8-9清洗凝胶数次，每次为1ml，至少10次
(7)最后将两种凝胶分别保存在20％乙醇溶液中既得1ml的spa-SUMO-agarose和spa-agarose，备用。
二、试验方法和结果
1、分别将等量的spa-SUMO蛋白(本发明所制备的重组葡萄球菌蛋白A)和spa蛋白分别置于不同pH值或不同温度一段时间后，后利用ELISA方法测定两种蛋白与抗体结合的活性。
试验方法：分别将等重量的spa-SUMO蛋白和spa蛋白分别置于pH值2，4，6，8，10溶液中4个小时后利用ELISA方法测定两种蛋白与抗体结合的活性，由表1中可以看出，无SUMO标签的spa蛋白在pH值为2，4，10的时候其抗体结合活性有明显的下降，而有SUMO标签的spa-SUMO蛋白在pH值为2，4，10的时候很好的保持了其抗体结合的活性。
表1 SUMO标签在不同pH值下对spa抗体结合稳定性的作用
2、分别将等量的spa-SUMO蛋白和spa蛋白分别置于温度4℃，20℃，30℃，40℃，50℃，60℃的环境中12小时以上，之后利用ELISA的方法测定两种蛋白与抗体结合的活性，由表2中可以看出，无标签的spa蛋白在温度为30，40，50，60范围内活性呈逐步显著下降趋势，而拥有SUMO标签的spa-SUMO蛋白在温度为30，40，50，60范围内有效的保持了其抗体活性。
表2 SUMO标签在不同温度下对spa抗体结合稳定性的作用
3、分别制备等量的spa-SUMO-agarose和spa-agarose并利用相同的步骤进行重复抗体纯化的实验，每一种介质重复7次以上。从表3中可以看出没有SUMO标签的spa-agarose在第4至第7次实验中从每毫升兔血清中提取的抗体毫克数逐渐显著下降，而有zSUMO标签的spa-SUMO-agarose很好的保持了其纯化抗体的能力。
表3 SUMO标签在spa抗体纯化实验中对保持spa纯化能力的作用
Claims (1)
1.一种制备重组葡萄球菌蛋白A的方法，由以下步骤组成：
构建含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的重组表达质粒；培养用该重组表达质粒所转化的宿主细胞，得重组菌株；培养重组菌株，诱导重组蛋白的表达，分离并纯化所表达的重组蛋白;
其中，所述的重组表达质粒是p-SUMO-SPA，按照以下方法制备得到：将SEQ ID NO：3所示的葡萄球菌蛋白A抗体结合区基因与大肠杆菌表达载体pSUMO利用酶切位点BsaI和BamHI相连，命名为p-SUMO-SPA；
所述的宿主细胞是大肠杆菌Rosetta GS115，所述的重组菌株为Escherichia coliRosetta/p-SUMO-SPA，按照以下方法制备得到：将含有重组蛋白A基因的表达载体p-SUMO-SPA转化大肠杆菌Rosetta GS115得到，命名为Escherichia coliRosetta/p-SUMO-SPA;
其中，所述的诱导重组蛋白的表达由以下步骤组成：
挑取大肠杆菌工程菌Escherichia coli Rosetta/p-SUMO-SPA，1%接种于LB培养基中，37℃恒温培养12-14小时，次日1：100扩大培养至OD值为0.4，加IPTG至终浓度0.5mM继续培养3小时4000r/m30m离心收集菌体；
其中，所述的分离并纯化所表达的重组蛋白由以下步骤组成：
（1）将收集的菌体用磷酸盐缓冲液悬浮，破碎后低温离心收集上清，利用Ni亲和柱和AKTA蛋白纯化系统进行蛋白粗提纯；
（2）将粗提纯的蛋白再利用AKTA系统进行分子筛的纯化，最终得到纯度达到90%以上的带有SUMO标签的重组葡萄球菌蛋白A。
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Effective date of registration: 20181219 Address after: 222001 No. 58 Haichang South Road, Haizhou District, Lianyungang City, Jiangsu Province Patentee after: Jiangsu Kangyuan Ruiao Biomedical Technology Co., Ltd. Address before: Room 314, Science Park, Northeast Agricultural University, 59 Wood Street, Xiangfang District, Harbin, Heilongjiang Province, 150030 Patentee before: Harbin Boao Bio-Medical Technology Development Company |
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